JPH07149651A - ウォートマンニンおよびその類似体を用いた骨喪失および軟骨退化の抑制方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 副作用がなく安価な骨喪失関連疾患の予防お
よび治療剤を提供する。 【構成】 ウォートマンニンおよびその類似体を活性成
分として含有することを特徴とするヒトの骨吸収または
軟骨退化の抑制剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウォートマンニン（wo
rtmannin）およびその類似体の治療学的使用を含む、骨
吸収または軟骨吸収の増加を伴う疾患を患う脊椎動物の
治療方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現
在、一般に関心の寄せられている骨に関する主要な疾患
または病的状態としては、閉経後の骨粗鬆症、子宮摘出
患者、老年性骨粗鬆症、コルチコステロイドの長期治療
を受けている患者、糖質コルチコイドまたはステロイド
治療の副作用、クッシング症候群を患う患者、性器発育
異常、慢性関節リウマチにおける関節周囲のびらん、変
形性関節症、ページェット病、骨灰分喪失、骨軟化症、
悪性の高カルシウム血症、骨の転移による骨減少症、歯
周疾患、および上皮小体機能亢進症が挙げられる。

【０００３】これら病的状態はすべて、骨の分解（骨吸
収）と新たな健康な骨の生成とのアンバランスによる骨
の喪失を特徴とする。この骨の代謝回転は通常、生涯を
通して継続し、骨再生のメカニズムとなっている。しか
しながら、上記病的状態では骨喪失の方へ平衡が傾き、
吸収された骨の量が新たな骨と不適切に置換され、その
結果、正味の骨の喪失をきたす。

【０００４】最も一般的な骨疾患の一つは閉経後の骨粗
鬆症であり、この疾患は米国だけでも推定２０００〜２
５００万人の婦人が罹っている。閉経後の婦人は、循環
しているエストロゲンレベルが減少するにつれて骨の代
謝回転速度が上昇し、その結果、骨の正味の喪失をきた
す。骨の代謝回転速度は骨によって異なり、椎骨や大腿
頭などの柱性骨（trabecular bone）に富む部位で最も
高い。これらの部位での月経直後の骨喪失の可能性は、
１年に４〜５％である。骨質量の低下と骨空間の増大の
結果、骨の機械的完全さが急速に悪化するので骨折の危
険性が増大する。

【０００５】現在、米国では１年当たり２０００万人の
骨粗鬆症による検出可能な椎骨骨折を有する人々および
骨粗鬆症による２５０,０００人の股関節骨折患者が存
在する。後者の場合、最初の２年以内に１２％の死亡率
を有し、患者の３０％が骨折後の療養所ケアを要するで
あろう。それゆえ、骨疾患は、顕著な死亡率、生存者の
生活の質の相当な低下、および家族への重大な経済的負
担を特徴とする。

【０００６】本質的に、上記病的状態はすべて、骨吸収
を抑制する薬剤で治療することにより改善が認められ
る。骨吸収は、破骨細胞と呼ばれる特別の細胞の働きに
より進行する。破骨細胞は、骨のヒドロキシアパタイト
無機物および有機マトリックスの両方を吸収する能力を
有する点で独特である。破骨細胞は軟骨吸収細胞と同じ
ものである。破骨細胞による骨吸収の強力な抑制剤が慢
性関節リウマチおよび骨粗鬆症において観察される軟骨
の該細胞に媒体された退化をも抑制するのはこの理由の
ためである。

【０００７】正味の骨の喪失を防ぐ治療にはエストロゲ
ンの使用が含まれる。エストロゲンは、閉経後に観察さ
れる骨喪失を阻止し、骨粗鬆症の進行を制限することが
明らかに示されている；しかしながら、エストロゲンの
副作用のために患者のコンプライアンスは悪かった。こ
れら副作用には、月経の再開、乳房痛、子宮癌の危険の
増大、およびおそらく乳癌の危険の増大が含まれる。

【０００８】別法としては、カルシトニンが骨粗鬆症患
者の治療に使われている。サケカルシトニンは哺乳動物
の破骨細胞の吸収作用を直接抑制することが示されてお
り、イタリアおよび日本で広く処方されている。しかし
ながら、カルシトニンは多くの人にとって非常に高価で
あり、効能も短期的であると思われる。すなわち、破骨
細胞はカルシトニンレセプターを下方制御することによ
ってカルシトニンの吸収抑制を「逃れる」ことができ
る。それゆえ、最近の臨床データは、カルシトニンを用
いた長期治療が閉経後の骨喪失を阻止するうえで有効で
ないことを示唆している。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、患者における
骨吸収、骨喪失および軟骨退化の抑制法であって、該患
者に式：

【化１２】 （式中、Ｒは水素またはアセトキシ、Ｒ'はＣ₁−Ｃ₆ア
ルキル）で示される化合物、式：

【化１３】 で示される化合物、式：

【化１４】 （式中、Ｒ”は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルまたは−Ｃ
（Ｏ）ＯＲ"'（式中、Ｒ"'は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキ
ル））で示される化合物、および式：

【化１５】 （式中、Ｒ¹は水素、メチルまたはエチル、Ｒ²は水素ま
たはメチル）で示される化合物から選ばれる化合物また
は該化合物の薬理学的に許容し得る塩を治療学的有効量
で投与することを特徴とする方法、および該化合物また
は薬理学的に許容し得るその塩を活性成分として含有す
る骨吸収または軟骨退化の抑制剤を提供する。本発明は
また、新規化合物である１１−デスアセトキシ−１７α
−ジヒドロウォートマンニン（ＩＩＩｂ）をも提供す
る。

【００１０】本発明は、ウォートマンニンおよびその類
似体が骨喪失／吸収および軟骨退化の抑制に有用である
という発見に基づく。本発明は以下の化合物を包含す
る：

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【００１１】

【表１】表１：ウォートマンニンおよび類似体 式表示 Ｒ Ｒ^１ Ｒ² Ｒ” 慣用名 Ia アセトキシ ＮＡ* ＮＡ ＮＡ ウォートマンニン Ib Ｈ ＮＡ ＮＡ ＮＡ 11-テ゛スアセトキシウォートマンニン II ＮＡ ＮＡ ＮＡ ＮＡ Δ9,11-テ゛ヒト゛ロ-テ゛スアセトキシウォートマンニン IIIa アセトキシ ＮＡ ＮＡ Ｈ 17α-シ゛ヒト゛ロウォートマンニン IIIb Ｈ ＮＡ ＮＡ Ｈ 11-テ゛スアセトキシ-17α-シ゛ヒト゛ロウォートマンニン IVa ＮＡ Ｈ Ｈ ＮＡ ウォートマンニンの開環したＡ−環酸 IVb ＮＡ メチル Ｈ ＮＡ ウォートマンニンの開環したＡ−環メチルエステル （注）＊該当する基なし

【００１２】ウォートマンニン（Ｉａ）の生合成による
製造は当該技術分野でよく知られており、その類似体は
ウォートマンニンから合成される。一般に、ウォートマ
ンニンは、タラロミセス・ウォートマンニン（Ｔalarom
yces wortmannin）［ナカニシ（Ｎakanishi）ら、Ｊ.Ｂ
iol.Ｃhem.、２６７（４）：２１５７〜２１６３（１９
９２）］やペニシリウム・ウォートマンニイ（Ｐenicil
lium wortmannii）、ミロテシウム・ロリジウム（Ｍyro
thecium roridium）、およびフサリウム・オキシスポル
ム（Ｆusarium oxysporum）［アッバス（Ａbbas）ら、
Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol.、５４（５）：１２６７〜
１２７４（１９８８）］などのすでに開示された多くの
微生物のいずれかの発酵により製造される。発酵後、ウ
ォートマンニンを公知の方法で抽出および精製する。

【００１３】好ましくは、ウォートマンニンを微生物に
より合成し、Ａ２４６０３.１として同定される発酵培
養菌株から実質的に純粋な形態で単離する。この培養菌
株Ａ２４６０３.１はブダペスト条約に従って寄託して
あり、ミッドウエスト・エアリア・ノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・センター（Ｍidwest Ａrea Ｎorthern
Ｒegional Ｒesearch Ｃenter）、アグリカルチュラル
・リサーチ・サービス（Ａgricultural Ｒesearch Ｓer
vice）、米国農務省（イリノイ州６１６０４、ピオリ
ア、ノース・ユニバーシティー・ストリート、１８１５
番）のストックカルチャーコレクションの一部を形成し
ている。受託番号はＮＲＲＬ２１１２（ペニシリウム・
デュクラウキシイ（Ｐenicillium duclauxii））であ
る。

【００１４】ミッドウエスト・エアリア・ノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター（ピオリア、イリノイ
州）における上記培養菌株の寄託の永続性および公衆に
よる該寄託の容易な利用可能性は、特許が付与された場
合には該特許の有効期間を通じて与えられるであろう。
３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§１.１４および３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２
に基づき、本出願の継続中に該培養菌株を利用すること
ができるであろう。該培養菌株の公衆への利用可能性に
おけるすべての制限は、該特許の付与とともに非変更的
に取り除かれるであろう。ウォートマンニンの製造は、
回収可能な量のウォートマンニンが産生されるまで適当
な培地中、液内通気培養条件下で上記Ａ２４６０３.１
株を培養することによって行う。ウォートマンニンの回
収は、当該技術分野で公知の種々の単離および精製法を
用いて行う。

【００１５】Ａ２４６０３.１培養菌株を増殖させるの
に用いる培地は、多くの培地のいずれであってもよい。
しかしながら、製造における経済性、最適収量、および
生成物の単離の容易さのため、大スケールの発酵におけ
る好ましい炭素源はグルコースおよび可溶性デンプン
（コーンスターチなど）である。マルトース、リボー
ス、キシロース、フルクトース、ガラクトース、マンノ
ース、マンニトール、じゃがいもデキストリン、オレイ
ン酸メチル、油（大豆油など）などを用いることもでき
る。好ましい窒素源は、酵素加水分解したカゼインおよ
び綿実粉であるが、ペプシン処理したミルク、消化した
大豆粉、フィッシュミール、コーンスチープリッカー、
酵母エキス、酸加水分解カゼイン、牛肉エキスなどを用
いることもできる。

【００１６】培地中に添加することのできる栄養無機塩
としては、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、ア
ンモニウム、クロライド、カーボネート、サルフェー
ト、ナイトレート、亜鉛などのイオンを生成し得る通常
の可溶性塩が挙げられる。生物の成長および発達に必要
な必須微量元素も培地中に添加すべきである。そのよう
な微量元素は、通常、該生物の増殖要求を満たすに充分
な量で培地の他の置換分中の不純物として存在する。

【００１７】実質的な量のウォートマンニンを製造する
ため、撹拌バイオリアクター中の液内通気発酵が好まし
い。少量のウォートマンニンはシェークフラスコ培養で
得ることができる。大きなバイオリアクターに胞子の形
態の生物を接種した場合に通常伴う産生における時間の
ずれのため、増殖型の接種物を用いるのが好ましい。増
殖型の接種物は、該生物の胞子形態または菌糸断片を有
する小容量の培地を接種して該生物の新たな活発に増殖
する培養菌株を得ることにより調製する。増殖型接種物
の培地は大発酵に用いる培地と同じであってよいが、他
の培地も適している。

【００１８】ウォートマンニンはＡ２４６０３.１微生
物を約２３〜２９℃の温度で増殖させたときに産生され
る。ウォートマンニン産生のための最適温度は約２５℃
であるように思われる。液内通気培養工程の通例に従
い、培地を通常のタービン回転翼で撹拌しながら滅菌空
気を底部から容器中に吹き込む。一般に、通気速度およ
び撹拌速度は、約５気圧の容器内圧で空気飽和の少なく
とも４５％の溶解酸素レベルを維持するのに充分なもの
でなければならない。製造後、当該技術分野で用いる方
法により発酵培地からウォートマンニンを回収すること
ができる。Ａ２４６０３.１微生物の発酵のウォートマ
ンニンの製造は、主としてブロス中で起こる。

【００１９】一般に、ウォートマンニンはバイオマスか
ら種々の方法により回収することができる。好ましい方
法には、全発酵ブロスをセラミックフィルターで濾過す
ることが含まれる。濾液を酢酸エチルなどの有機溶媒で
溶出し、濃縮する。結晶化が起こるまで濃縮物をアルコ
ール中に懸濁し、溶液を濾過、洗浄、および乾燥させ
る。確認のため、結晶性物質を有機溶媒中に溶解し、逆
相シリカゲル吸着剤（Ｃ₈またはＣ₁₈）上のクロマトグ
ラフィーにかける。フラクションを６０％アセトニトリ
ルなどの有機−水性緩衝液中で溶出する。

【００２０】１１−デアセトキシウォートマンニン（式
（Ｉｂ））も当該技術分野で知られており、その調製法
も知られている。一般に、この化合物はペニシリウム・
フニクロスム・トム（Ｐenicillium funiculosum Ｔho
m）の培養菌株を発酵させることにより生合成的に製造
することができる［たとえば、バッゴリーニ（Ｂaggoli
ni）ら、Ｅxp.Ｃell Ｒes.、１６９：４０８〜４１８
（１９８７）を参照］；しかしながら、ハフリンガー
（Ｈaeflinger）らのＨelv.Ｃhem.Ａcta、５６（８）：
２９０１〜２９０４（１９７３）に開示された方法によ
りウォートマンニンから化学的に誘導するのが好まし
い。

【００２１】同様に、Δ９,１１−デヒドロ−デスアセ
トキシウォートマンニン（式（ＩＩ））は当該技術分野
で知られており、上記ハフリンガーらにより記載されて
いる。式（ＩＶ）の化合物の調製はマクミラン（ＭacＭ
illan,Ｊ.）らにより記載されている（Ｊ.Ｃhem.Ｓo
c.、Ｐerkin Ｉ：２８９２〜２８９８（１９７２））。
式（ＩＩＩ）の化合物の調製は当該技術分野で公知の方
法によって行うことができ、以下の製造例で例示する。
Ｒ”が−Ｃ（Ｏ）ＯＲ"'である場合は、該化合物はオッ
ト（Ｏtt）らによって記載された方法(Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓ
oc.、７４、１２３９頁（１９５２）)と同様にして調製
することができる。

【００２２】特定の適応症を治療するため、式（Ｉ）、
（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物をそのま
まで投与することもできるし、または非経口、皮下、直
腸経由、経鼻または静脈内投与、好ましくは経口投与の
ための単位投与剤型にて医薬組成物に調合することがで
きる。そのような医薬組成物は当該技術分野でよく知ら
れた仕方で調製され、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）
および（ＩＶ）の化合物よりなる群から選ばれる少なく
とも１種の活性化合物と薬理学的に許容し得る担体を含
む。本明細書を通して用いる「活性化合物」なる語は、
上記式の化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物ま
たは薬理学的に許容し得るその塩をいう。

【００２３】本発明の化合物は広範囲の投与量にわたっ
て有効であり、たとえば、１日当たりの投与量は通常
０.００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに普通には０.０１〜
１ｍｇ／ｋｇの範囲である。しかしながら、投与する有
効量は、治療しようとする病的状態、投与する化合物の
選択および選択した投与経路を含む関連する状況に照ら
して医者によって決定されることが理解されるであろ
う。それゆえ、上記投与量範囲は本発明の範囲を限定す
るものでは決してない。

【００２４】そのような組成物において、活性化合物は
「活性成分」として知られる。該組成物の調製に際し
て、活性成分を通常、担体と混合するか、または担体で
希釈するか、またはカプセル、サシェ（sachet）、紙ま
たは他の容器の形態にした担体内に包含させる。担体を
希釈剤として用いる場合は、活性成分の賦形剤として働
く固体、半固体または液体材料であってよい。それゆ
え、組成物は錠剤、丸薬、散剤、トローチ、サシェ剤
（sachets）、カシェ剤、エリキシル剤、乳剤、液剤、
シロップ、懸濁剤、ソフトおよびハードゼラチンカプセ
ル、滅菌注射液、および滅菌封入散剤の形態であってよ
い。

【００２５】適当な担体、賦形剤および希釈剤の例とし
ては、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビト
ール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸
アルギン酸カルシウム（calcium phosphate alginat
e）、サリチル酸カルシウム（calcium salicate）、微
結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、
トラガカント、ゼラチン、糖蜜、メチルセルロース、メ
チル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、水、および鉱油が挙げ
られる。本発明の組成物はまた、滑沢剤、湿潤剤、乳化
剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤または芳香剤をさらに含
んでいてよい。本発明の組成物はまた、当該技術分野で
よく知られた手順を用いることにより、患者への投与後
に活性成分の迅速な放出、徐放または遅効性の放出をも
たらすように調合することができる。

【００２６】経口投与用には、本発明の化合物を担体お
よび希釈剤と混合し、錠剤に成型し、またはゼラチンカ
プセル中に封入することができる。別法として、これら
混合物を１０％グルコース水溶液、等張食塩水、滅菌水
などの液体中に溶解し、静脈内投与または注射により投
与することができる。本発明の組成物は単位投与剤型に
調合するのが好ましく、各剤型は約０.０４〜約９００
ｍｇ、さらに頻繁には約１〜約５００ｍｇの活性成分を
含有する。「単位投与剤型」なる語は、ヒト患者および
他の哺乳動物に対する単位剤型として適した物理的に区
別された単位をいい、各単位は必要とされる薬理学的に
許容される担体とともに所望の治療効果を得るべく計算
して前以て決定した量の活性物質を含有する。「薬理学
的に許容し得る」とは、担体、希釈剤または賦形剤が調
合物の他の成分と適合性を有するものでなくてはなら
ず、それを摂取する者に対して有害であってはならない
ことを意味する。

【００２７】

【実施例】つぎに調合例、製造例および実施例に基づい
て本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに
限られるものではない。「活性成分」の意味は上記と同
じである。調合例１ 下記成分を用いてハードゼラチンカプセルを調製する。 量（ｍｇ／カプセル） 活性成分 ２５０ 乾燥したデンプン ２００ ステアリン酸マグネシウム １０ 全量 ４６０ｍｇ

【００２８】調合例２ 下記成分を用いて錠剤を調製する。 量（ｍｇ／錠） 活性成分 ２５０ 微結晶セルロース ４００ 燻蒸した（fumed）二酸化ケイ素 １０ ステアリン酸 ５ 全量 ６６５ｍｇ 上記成分を混合し、打錠してそれぞれ６６５ｍｇの重さ
の錠剤を得る。

【００２９】調合例３ 下記成分を含有するエアゾル剤溶液を調製する。 活性化合物をエタノールと混合し、混合物を噴射剤２２
の一部に加え、−３０℃に冷却し、充填装置に移す。つ
いで、必要な量をステンレス鋼の容器に入れ、残りの噴
射剤で希釈する。ついで、バルブ部分を容器に適合させ
る。

【００３０】調合例４ それぞれ活性成分６０ｍｇを含有する錠剤を以下のよう
にして調製する。 活性成分 ６０ｍｇ デンプン ４５ｍｇ 微結晶セルロース ３５ｍｇ ポリビニルピロリドン （水中の１０％溶液として） ４ｍｇ カルボキシメチルデンプンナトリウム ４.５ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ０.５ｍｇ タルク １ｍｇ 全量 １５０ｍｇ

【００３１】活性成分、デンプンおよびセルロースをＮ
ｏ.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、充分に混合す
る。ポリビニルピロリドンを含有する水溶液を上記で得
た粉末と混合し、ついで得られた混合物をＮｏ.１４メ
ッシュＵ.Ｓ.シーブに通す。かくして得られた顆粒を５
０℃で乾燥させ、Ｎｏ.１８メッシュＵ.Ｓ.シーブに通
す。ついで、Ｎｏ.６０メッシュＵ.Ｓ.シーブに前以て
通したカルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリ
ン酸マグネシウムおよびタルクを上記顆粒に加え、これ
を混合後、打錠機で打錠してそれぞれ１５０ｍｇの重さ
の錠剤を得る。

【００３２】調合例５ それぞれ８０ｍｇの活性成分を含有するカプセル剤を以
下のようにして調製する。 活性成分 ８０ｍｇ デンプン ５９ｍｇ 微結晶セルロース ５９ｍｇ ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ 全量 ２００ｍｇ 活性成分、セルロース、デンプンおよびステアリン酸マ
グネシウムを混合し、Ｎｏ.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブ
に通し、ハードゼラチンカプセル中に２００ｍｇの量で
充填する。

【００３３】調合例６ それぞれ２２５ｍｇの活性成分を含有する座剤を以下の
ようにして調製する。 活性成分 ２２５ｍｇ 飽和脂肪酸グリセライド ２,０００ｍｇ 全量 ２.２２５ｍｇ 活性成分をＮｏ.６０メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、必
要な最小量の熱で前以て溶解させた飽和脂肪酸グリセラ
イド中に懸濁する。ついで、この混合物を約２ｇ容量の
座剤型に注ぎ、冷却させる。

【００３４】調合例７ ５ｍｌの投与量当たりそれぞれ５０ｍｇの活性成分を含
有する懸濁剤を以下のようにして調製する。 活性成分 ５０ｍｇ カルボキシメチルセルロースナトリウム ５０ｍｇ 糖蜜 １.２５ｍＬ 安息香酸溶液 ０.１０ｍＬ 芳香剤 適量 着色剤 適量 精製水で全量 ５ｍＬ 活性成分をＮｏ.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウムおよび糖蜜と混合
して滑らかなペーストを得る。安息香酸溶液、芳香剤お
よび着色剤を水の一部で希釈し、撹拌しながら加える。
ついで、充分な量の水を加えて必要な容量を得る。

【００３５】調合例８ 静脈内調合物を以下のようにして調製することができ
る。 活性成分 １００ｍｇ 等張食塩水 １,０００ｍＬ

【００３６】製造例１ 培養液Ａ２４６０３.１の発酵 Ａ．シェークフラスコ 凍結乾燥したペレットかまたは液体窒素中に保持した懸
濁液としての培養菌株Ａ２４６０３.１を用い、下記組
成を有する増殖用培地に接種する。 非調節ｐＨ＝６.３；調節せず ａ：プロフロ（ＰＲＯＦＬＯ）粉（トレイダーズ・プロ
テイン（Ｔraders Ｐrotein）、メンフィス、テネシ
ー） 接種した増殖用培地を、２インチ（５.０８ｃｍ）の円
で２５０ｒｐｍにて旋回するシェーカー上、２５０ｍＬ
容の広口エーレンマイヤーフラスコ中で２５℃にて約７
２時間インキュベートした。

【００３７】Ｂ．培養菌株Ａ２４６０３.１のタンク発
酵 一層大容量の接種物を得るため、１０ｍＬのインキュベ
ートしたシェーク−フラスコ培地（項目Ａと同様にして
調製）を用い、上記と同じ組成を有する４００ｍＬの第
二ステージ増殖用培地を接種した。この第二ステージ培
地を、２インチ（５.０８ｃｍ）の円で２５０ｒｐｍに
て旋回するシェーカー上、２Ｌ容の広口エーレンマイヤ
ーフラスコ中で２５℃にて約２３時間インキュベートし
た。この第二ステージ培地（４００ｍＬ）を用い、下記
組成を有する滅菌産生培地（１１５Ｌ）を接種した。

【００３８】 非調節ｐＨ＝６.８；調節せず 消泡剤を添加：ＳＡＧ４７１^b（０.２ｇｍ／Ｌ） （注）ａ：ＮＺアミンＡ（シェフィールド・ケミカル
（Ｓheffield ＣhemicalＣo.）、ノーウィッチ、ニュー
ヨーク） ｂ：ＳＡＧ４７１（ユニオン・カーバイド（Ｕnion Ｃa
rbide）、シスターズビル、ウエストバージニア） 接種した産生培地を１１５Ｌ容の撹拌発酵タンク中、約
２５℃の温度にて４〜５日発酵させた。約４５％の空気
飽和の溶解酸素レベルを保持し、撹拌容器中の低ｒｐｍ
（１８０〜３３０）も保持した。

【００３９】製造例２ ウォートマンニンの単離および精製 製造例１の発酵ブロスをセラミックフィルター（メンブ
ラロックス・システムズ（Ｍembralox Ｓystems）、イ
リノイ・ウオーター・トリートメント（Ｉllinois Ｗat
er Ｔreatment）、ロックフォード、イリノイ）で濾過
してウォートマンニンを含有する濾液（１７５Ｌ）を得
た。濾液のｐＨを５Ｎ ＨＣｌを用いて約３.９に調節し
た。ついで、濾液を１／２の容量の酢酸エチルで３回溶
出して全部で２０７Ｌの容量を得、これを６Ｌに真空濃
縮した。上記６Ｌの酢酸エチル濃縮液をさらに真空濃縮
して暗褐色の粘性油状物とし、これに５００ｍＬのメタ
ノールを加えた。この混合物を結晶化が完了するまで渦
巻かせ、濾過し、冷メタノールで簡単に洗浄し、真空乾
燥させてウォートマンニン（２０.４ｇ）を得た。

【００４０】上記メタノール上澄み液を真空下で再濃縮
して粘性の油状物を得、クロロホルム（１８０ｍＬ）中
に溶解し、ウルム（Ｗoelm）グレード６２シリカの１２
×２０ｃｍカラムにクロロホルム中にて適用した。５.
０Ｌのクロロホルム洗浄液を真空濃縮して褐色の油状物
を得、ついでこれを２５０ｍＬの熱メタノール中に溶解
した。１８時間後に得られた結晶を濾過により回収し、
４.２ｇのウォートマンニンを得た。残りの上澄み液に
も結晶化手順を繰り返してさらに１.９ｇのウォートマ
ンニンを得た。ウォートマンニンの同一性をＨＰＬＣに
より確認した。

【００４１】製造例３ １７α−ジヒドロウォートマンニン

【化２３】 −７８℃のＴＨＦ中で撹拌したウォートマンニン（１０
０ｍｇ）の溶液にジイソブチルアルミニウムハイドライ
ド（トルエン中の１.０Ｍ溶液を０.４ｍＬ、０.４ミリ
モル）を加えた。０.５時間後、飽和水性ＮａＨＣＯ₃で
反応停止させた。ついで、この混合物を室温に温め、Ｃ
Ｈ₂Ｃｌ₂で抽出した。コンバインした有機抽出物を食塩
水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ₄）。得られた粗製
の物質をラジカルクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、４ｍ
ｍ、９：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して１
７α−ジヒドロウォートマンニンをオフホワイトの粉末
として得た。

【００４２】¹Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）
８.２２（ｓ、１Ｈ）、６.１０（ｍ、１Ｈ）、４.７６
（ｄｄ、１Ｈ）、３.８８（ｔ、１Ｈ）、３.４４（ｄ
ｄ、１Ｈ）、３.２０（ｓ、３Ｈ）、２.９５（１／２
ＡＢｑ、１Ｈ）、２.７５（ｍ、１Ｈ）、２.６２（１／
２ＡＢｑ、１Ｈ）、２.５２（ｍ、１Ｈ）、２.１０〜
２.３０（ｍ、４Ｈ）、１.４〜１.７（ｍ）、０.８５
（ｓ、３Ｈ）、ＭＳ ＦＤ⁺ ４３１、ＩＲ（セル、ＣＤ
Ｃｌ₃）、１７５１、１６８０（ｃｍ^-1）

【００４３】製造例４ １１−デスアセトキシ−１７α−ジヒドロウォートマン
ニン

【化２４】 −７８℃のＴＨＦ中で撹拌した化合物（Ｉｂ）（１５ｍ
ｇ）（ハフロガー（Ｈaefloger,Ｗ.）；ハウザー（Ｈau
ser,Ｄ.）、Ｈelv.Ｃhim.Ａcta、５６、２９０１）（１
９７３）の方法により調製）の溶液にジイソブチルアル
ミニウムハイドライド（トルエン中の１.０Ｍ溶液を０.
１ｍＬ）を加えた。１時間後、飽和水性ＮａＨＣＯ₃で
反応停止させた。ついで、この混合物を室温に温め、Ｃ
Ｈ₂Ｃｌ_２で抽出した。コンバインした有機抽出物を食
塩水で洗浄し、乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。得られた粗
製の物質をラジカルクロマトグラフィー（ＳｉＯ₂、１
ｍｍ、９：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して
標記生成物を黄褐色の粉末として得た。¹ Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）８.１９
（ｓ、Ｈ）、４.８１（ｔ、Ｈ）、３.８０（ｔ、１
Ｈ）、３.１５（ｓ、３Ｈ）、１.７（ｓ、３Ｈ）、０.
７（ｓ、３Ｈ）、ＭＳ ＦＡＢ⁺ ３７３.３

【００４４】薬剤の骨喪失を防ぎ、および／または喪失
した骨を回復する効果を卵巣摘出したラットで評価する
ことができる。この動物モデルは当該技術分野で充分に
確立されている（たとえば、ウロンスキー（Ｗronski）
ら、（１９８５）Ｃalcif.Ｔissue Ｉnt ３７；３２４
〜３２８；キメル（Ｋimmel）ら、（１９９０）Ｃalci
f.Ｔissue Ｉnt.４６：１０１〜１１０；およびダーブ
リッジ（Ｄurbridge）ら、（１９９０）Ｃalcif.Ｔissu
e Ｉnt.４７：３８３〜３８７を参照）。ウロンスキー
ら（（１９８５）Ｃalcif.Ｔissue Ｉnt.４３：１７９
〜１８３）は卵巣摘出したラットモデルにおける骨喪失
と骨代謝回転との間の関係を記載している。

【００４５】急性ラットインビボモデルアッセイもまた
当該技術分野で確立されている（トンプソン（Ｔhompso
n）ら、Ｅndocrinology、９７、２８３〜２８９（１９
７５）；ラスムッセン（Ｒasmussen）、Ｃalc.Ｔiss.Ｒ
es.、２３、８７〜９４（１９７７）；サモン（Ｓammo
n）ら、Ａm.Ｊ.of Ｐhysiology；２１８、Ｎo.２、４７
９〜４８５（１９７０）；ハーギス（Ｈargis）ら、Ｅn
do.９４、Ｎo.６、１６４４〜１６４９（１９７４）；
トーマス（Ｔhomas）ら、Ｂone and Ｍineral、４、７
３〜８２（１９８８）；およびオー（Ａu）ら、Ａm.Ｊ.
Ｐhysiol.２０９、Ｎo.３、６３７〜６４２（１９６
５））。

【００４６】実施例１ ウォートマンニンは、表２ａおよび２ｂに示すように、
ニワトリ破骨細胞のインビトロでの骨吸収活性をＩＣ₅₀
＝３００ｎＭ（サトー（Ｓato）ら、「エキスタチンは
培養液における骨吸収の強力な抑制剤である」、Ｊ.Ｃe
ll Ｂiol.１１１、１７１３〜１７２３（１９９０）に
従って行う）にて抑制し、ラット破骨細胞のインビトロ
での骨吸収活性をＩＣ₅₀＝５０ｎＭ（サトーおよびグラ
ッサー（Ｇrasser）、「反射光学顕微鏡で調べた単離ラ
ット破骨細胞に対するビスホスホネートの作用」、Ｊ.
Ｂone and Ｍineral Ｒesearch、５、３１〜４０（１９
９０）に従って行う」）にて抑制することがわかった。
データはコントロールの骨吸収に対するパーセントで示
した（ｎ＝３〜６、平均±ＳＥ）。コントロールの骨吸
収は、培養４日目〜６日目の間で吸収された骨量が１７
〜４７ｍｇの範囲であった（表２ａ）。表２ｂのコント
ロール吸収は、骨薄片当たりの１２〜６２のハウシップ
小窩に対応する（ｎ＝４〜９、平均±ＳＥ）。

【００４７】

【表２】 表２ａ コントロール骨吸収（％） ウォートマンニン濃度（Ｍ） ９０±７ １×１０^-8 ７９±２ ５×１０^-8 ５８±６ １×１０^-7 ５２±３ ５×１０^-7 ５４±４ １×１０^-6 １９±１ ５×１０^-6 ２３±７ １×１０^-5

【表３】 表２ｂ コントロール骨吸収（％） ウォートマンニン濃度（Ｍ） ９３±１１ １×１０^-10 ７９±２２ １×１０^-9 ３２±１３ １×１０^-8 ３０± ６ １×１０^−７ ３± ３ １×１０^−６

【００４８】実施例２ 表３にまとめて示すように、種々の類似体はニワトリの
破骨細胞の吸収を抑制した（式（ＩＩＩａ）の化合物の
ＩＣ₅₀＝１０ｎＭ；式（ＩＩＩｂ）の化合物のＩＣ₅₀＝
１００ｎＭ；式（Ｉｂ）の化合物のＩＣ₅₀＝５００ｎ
Ｍ）。データはコントロールの骨吸収に対するパーセン
トで示した（ｎ＝３〜６、平均±ＳＥ）。コントロール
の吸収レベルは、培養４日目〜６日目の間で吸収された
骨量が２６〜４９ｍｇの範囲であった。

【表４】 表３ 濃度 ＩＩＩａ ＩＩＩｂ Ｉｂ ＩＶａ １×１０^-9 ９４±５ １２４±２３ １０６±１０ ９３±１４ １×１０^-8 ６７±５ ８８±１９ ９７±１７ ９９±１５ １×１０^-7 ２９±４ ５０±４ ９０±１５ １１０±１３ １×１０^-6 ８±１ ２６±３ ４２±３ １０５±１０

【００４９】実施例３ インビボでの破骨細胞による骨吸収を抑制する能力を調
べるため、トーマスら（Ｂone and Ｍineral、４、７３
〜８２頁（１９８８））と同様の方法に従って続発性上
皮小体機能亢進症のラットモデルにおいて本発明の化合
物を調べた。血清カルシウムレベル（ｍｇ／ｄｌ）は、
カルシウムの欠失した食餌で２週間維持したスプラーグ
ドーリーラット（４００ｇの雄）において骨吸収に依存
することが以前に示されている。麻酔したラットの頚静
脈に挿入したカニューレを通して０.０８ｍｌ／時の速
度で化合物を注入する前（Ｔ＝０）および注入６時間後
（Ｔ＝６）に血清カルシウムレベルを比色的に調べた
（シグマ、セントルイス）。Ｔ＝０ではコントールラッ
トの血清カルシウムは１２ｍｇ／ｄｌであった。ウォー
トマンニンおよび式（ＩＩＩａ）の化合物は、血清カル
シウムを９ｍｇ／ｄｌに下げたサケカルシトニンの陽性
コントール（１２μｇ／ｋｇ／日）に比べ（Ｐ＜０.０
５）、１ｍｇ／ｋｇ／日（４００ｇのラットに対して１
６μｇ／時）にて６時間注入した後に血清カルシウムを
それぞれ約９および５ｍｇ／ｄｌに有意に（Ｐ＜０.０
５）下げた。

【００５０】実施例４ 表４にまとめて示すように、化合物（ＩＩＩａ）を６カ
月齢の卵巣摘出ラットでも調べた。左近位脛骨の骨無機
密度（ｍｇ／ｃｍ³）および骨無機含量（ｍｇ）を、グ
リフィン（Ｇriffin）らの方法（「ラットの二重エネル
ギーＸ線吸光測光：骨喪失の正確さ、精度および測
定」、Ｊ.Ｂone Ｍiner.Ｒes.８、７９５〜８００（１
９９３））と同様にして、経口で５週間毎日投与した後
にノーランド９６０ｐＱＣＴを用いたコンピューター断
層撮影により定量した。各群ｎ＝６のラットの５つの群
を用いた：シャム（Ｓham）、ＯＶＸ、１日当たり０.０
０１、０.０１および０.１ｍｇの化合物（ＩＩＩａ）／
ｋｇ経口。インビボデータは、卵巣摘出から５週間後の
左近位脛骨の２ｍｍ薄片について示す（平均±標準偏
差）。

【表５】 表４：近位脛骨 群（ｎ＝６） 全骨無機密度（ｍｇ／ｃｍ³） 骨含量（ｍｇ） シャム ５９０±２６ １４±１.５ ＯＶＸ ４９４±２９ １０.４±１.２ ０.００１ｍｇ／ｋｇ／日 ５２８±３３ １３.６±６ ０.０１ｍｇ／ｋｇ／日 ５４５±２６ １３.５±１ ０.１ｍｇ／ｋｇ／日 ４９４±１８ １１.５±７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 マサヒコ・サトー アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、ホーソーン・ドライブ96番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 活性成分として式： 【化１】 （式中、Ｒは水素またはアセトキシ、Ｒ’はＣ₁−Ｃ₆ア
   ルキル）で示される化合物、式： 【化２】 で示される化合物、式： 【化３】 （式中、Ｒ”は水素、Ｃ₁−Ｃ₆アルキルまたは−Ｃ(Ｏ)
   ＯＲ"'（式中、Ｒ"'は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキル））
   で示される化合物、および式： 【化４】 （式中、Ｒ¹は水素、メチルまたはエチル；Ｒ²は水素ま
   たはメチル）で示される化合物よりなる群から選ばれた
   化合物またはこれら化合物の薬理学的に許容し得る塩を
   含有することを特徴とする、ヒトの骨吸収または軟骨退
   化の抑制剤。
2. 【請求項２】 化合物が式： 【化５】 で示される化合物、式： 【化６】 で示される化合物、式： 【化７】 で示される化合物、式： 【化８】 で示される化合物、式： 【化９】 で示される化合物、式： 【化１０】 で示される化合物、または薬理学的に許容し得るその塩
   から選ばれる、請求項１に記載の抑制剤。
3. 【請求項３】 式： 【化１１】 で示される化合物または薬理学的に許容し得るその塩。