JPH07149661A - カリジノゲナーゼ含有外用剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】安定なカリジノゲナーゼ外用剤を得る。 【構成】カリジノゲナーゼを水中油型乳剤基剤と均一に
混合する。好ましくは、カリジノゲナーゼとしてプロテ
アーゼを実質的に除いたカリジノゲナーゼを使用し、さ
らにプロテアーゼ阻害剤をさらに含ませる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カリジノゲナーゼ含有
外用剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カリジノゲナーゼは、ブタの膵又はヒト
の尿から抽出される、白色又は淡褐色の粉末で、匂はな
いか又は僅かに特異な匂を有する。水に溶け易く、エタ
ノール又はエーテルには、殆ど溶けない。そして、高血
圧症、メニエル症候群などの末梢循環障害の改善、脳環
境障害の随伴症状、更年期障害などの症状の改善に有効
であって、現在、経口剤、注射剤の剤型で使用されてい
る。このカリジノゲナーゼの薬理作用の一つとして、血
流増加作用がある。そのため、経口剤、注射剤の剤型と
は異なる外用剤の形にして、上記の適応の外に、皮膚の
潰瘍などの治療に使用しようとする試みが、二三なされ
てきている。例えば、中村敏郎らは、［東女医大誌」３
０巻、１１号、２６１４−１６１８ページ（昭和３５
年）に、難治性潰瘍に対してカリジノゲナーゼ軟膏を適
用した結果を示され、肉芽の形成及び表皮の再生に優れ
た効果を得たとされている。しかも、操作が簡単で、副
作用がなく、苦痛もないと述べられている。しかし、亜
鉛華軟膏を基剤に使用したため、「非常に変化しやす
く、使用直前に新しく作製本発明に使用されるカリジノ
ゲナーゼとしては、予め処理して実質的にプロテアーゼ
を除去したものが、安定性の点から好ましい。プロテア
ーゼの除去には、種々の方法があり、例えば陽・陰両イ
オン交換体による方法、ゲル漉過による方法、アフィニ
ティー技術による方法、カリジノゲナーゼを阻害するこ
となくプロテアーゼを阻害するもの例えば大豆、馬鈴薯
などのブロテアーゼ阻害剤を適当な手法で適当な不溶性
担体に結合させ、アフィニティー操作により精製する方
法が挙げられる。この場合、ハッチ法でもカラム法でも
良い。そして、これらの方法を組み合せて行っても良
い。本発明の外用剤に使用するには、活性成分であるカ
リジノゲナーゼの単位が、８００−１３００単位／ｍｇ
であるのが好ましい。

【０００６】本発明の外用剤は、カリジノゲナーゼ又は
プロテアーゼを実質的に除いたカリジノゲナーゼを、外
用剤の基剤と均一に混合することにより得られる。本発
明では、基剤としては、水中油型乳剤基剤を使用する。
外用剤の基剤としては、物理化学的な性状により分類す
れば、無水性基剤（親油性基剤、親水性基剤）、乳剤性
基剤（水中油性乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤）及び
懸濁性基剤に分けられるが、本発明では、水中湯性（Ｏ
／Ｗ型）乳剤性基剤を使用し、この基剤により、他の種
類の基剤では達成できない優れた安定性を得ることかで
きる。例えば、水中油性乳剤性基剤に極めて類似してい
る油中水型乳剤性基剤でも、以下の例に示されるよう
に、主成した製品の安定性が極めて悪い。本発明で使用
される基剤として 種々の組成のものが考えられるが、
以下の組成のものか好ましいものとして挙げられる。プ
ロピレングリコール０．５−５重量部好ましくは２−４
重量部、グリセリルモノステアレート０．０５−０．５
重量部好ましくは０．１−０．３重量部、セチルアルコ
ール１−６重量部好ましくは３−５重量部、ステアリル
アルコール３−１０重量部好ましくは５−７重量部、白
色ワセリン５−１５重量部好ましくは８−１２重量部、
流動パラフィン５−１５重量部好ましくは８−１２重量
部、ミリスチン酸イソプロピル２−６重量部好ましくは
４−６重量部、ソルビタンモノステアレート１−５重量
部好ましくは２．５−４．５重量部、ＰＯＥ（４０）モ
ノステアレート０．５−５重量部好ましくは１−３重量
部である。この組成に、保存料例えばメチルパラベン、
プロピルパラベン、着色剤、香料、顔料を加えることが
できる。本発明では、カリジノゲナーゼ及び上記の基剤
に、プロテアーゼ阻害剤を加えて製品を製造しても、目
的とする効果を挙げることができる。その際、阻害剤の
使用量は、カリジノゲナーゼ１０００単位当り０．１−
１０ｍｇ好ましくは０．５−１ｍｇである。

【０００７】本発明の外用剤の製造には、種々の方法を
使用することができるが、例えば上記の基剤とカリジノ
ゲナーゲとを十分に混合して目的物を得る。その際、カ
リジノゲナーゼの使用量は、得られる製品の１ｇ当り１
０−２０００単位好ましくは３０−１２００単位であ
る。

【０００８】本発明の外用剤は、各種の皮膚疾患例えば
皮膚潰瘍（じょく創、熱傷潰瘍、外傷性潰瘍、下腿潰瘍
（静脈瘤症候群を含む）、その他の皮膚潰瘍（放射線潰
瘍、薬物潰瘍、糖尿病性潰瘍 術後潰瘍など） 外傷後
の腫れ・腱鞘炎・筋肉痛・関節炎、血栓性静脈炎、凍
傷、血行障害に基づく疼痛と炎症性疾患、進行性指掌角
皮症などの治療に有効である。

【０００９】本発明の外用剤の投与に当っては、１日数
回例えば１、２又は３回患部に塗布するか、又はパッ
チ、プラスター或はパップの形で適用する。

【００１０】本発明の外用剤の毒性は、上記の組成では
認められない。

【００１１】

【実施例】次に、本発明の実施例を示す。 実施例 １ （１）本発明の外用剤の製造に、以下の組成の基剤を用
いた。プロピレングリコール１５ｇ、グリセリルモノス
テアレート１ｇ、セチルアルコール２０ｇ、ステアリル
アルコール３２．５ｇ、白色ワセリン５０ｇ、流動パラ
フィン５０ｇ、ミリスチン酸イソプロピル２０ｇ、ソル
ビタンモノステアレート１７．５ｇ、ＰＯＥ（４０）モ
ノステアレート１０ｇ、メチルパラベン１．１５ｇ、プ
ロピルパラベン０．１５ｇ、カリジノゲナーゼ原体、１
／３０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８）を加えて５００ｇとし
た。カリジノゲナーゼ原体は、５４６単位／ｍｇを使用
して、１０００単位／ｇの軟膏とした。これらの成分を
均一に混合して目的物を得た。 （２） 一方、対照として、以下の組成で、油中水型乳
酸剤性の製品を製造した。モノステアリン酸アルミニウ
ム６ｇ、オクチルドデカノール２５ｇ、流動パラフィン
１６０ｇ、固形パラフィン５ｇ、白色ワセリン３５ｇ、
鯨ロウ２０ｇ、セチルアルコール１５ｇ、ステアリルア
ルコール１０ｇ、サラシミツロウ４０ｇ、ソルビタンモ
ノステアレート１７．５ｇ、エマレック１０２．５ｇ、
プロピルパラベン０．２５ｇ、エチルパラベン０．３５
ｇ、ＰＯＥ（４０）モノステアレート１０ｇ、７０％ソ
ルビトール１５ｇ、メチルパラベン０．９ｇ、カリジノ
ゲナーゼ原体、１／３０Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８）を加え
て５００ｇとした。カリジノゲナーゼ原体は、前記と同
じであった。これらの成分を均一に混合して、対照とす
る目的物を得た。

【００１２】安定性のテストは、以下の通りであった。
得られた製品をアルミニウムチューブに入れ、２５℃及
び４０℃の恒温室に保存し、加速試験を行った。適時一
定量のサンプルを採り、クロロホルム存在下の０．０５
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）により繰返し抽出後、
Ｎ、α−ベンゾイルアルギニンエチルエステル塩酸塩
（ＢＡＥＥ）を基質として定量した。残存活性は、本発
明の製品では、２５℃、６ヵ月で９５．７％、４０℃、
１ヵ月で８５．７％であったが、対照の製品では、２５
℃、６ヵ月で６８．０％、４０℃、１ヵ月で７２．２％
であった。さらに、親水ワセリンを基剤に使用した場合
には、残存活性は、２５℃、１ヵ月で１６．１％に過ぎ
なかった。

【００１３】実施例 ２ 実施例１の組成において、５４６単位／ｍｇのカリジノ
ゲナーゼ原体の代りに、９１３単位／ｍｇのものを使用
した以外は、実施例１（１）の基剤を用い、実施例１の
方法を行った。残存活性は、本発明の製品では、２５
℃、６ヵ月で１００％ ４０℃、１ヵ月で９３．５％で
あったが、対照の製品では、２５℃、６ヵ月で５４．０
％、４０℃３１ヵ月で７８．１％であった。

【００１４】実施例 ３ （１）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社製）
１５０ｍＬに、水１５０ｍＬ、２Ｍ炭酸ナトリウム溶液
３００ｍｌを加え、撹拌しながら臭化シアン３０ｇのア
セトニトリル溶液１５ｍＬを加え、活性化した。次に、
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（０．５Ｍ塩化ナトリウム
中）のカップリング緩衝液により洗浄後、大豆プロテア
ーゼ阻害剤（シグマ社製、タイプＩ−Ｓ）１ｇのカップ
リング緩衝液５００ｍＬに移し、室温で２時間反応させ
た。反応終了後、１Ｍエタノールアミンで残存活性基を
ブロックし、カップリング緩衝液及び０．１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４、０．５Ｍ塩化ナトリウム中）により繰返し
洗浄して、大豆プロテアーゼ阻害剤結合Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂ１５０ｍＬを得た。この際、ゲル１ｍＬ当り
約６ｍｇの大豆プロテアーゼ阻害剤が結合した。 （２）パンクレアチンの酸性抽出液を、ＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ Ａ５０により一次精製し、次にＤＥＡＥ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムにより二次精製し、
脱塩、凍結乾燥して、３４９単位／ｍｇのカリジノゲナ
ーゼ原体を得た。 （３）（２）の原体を使用して、前記の大豆プロテアー
ゼ阻害剤結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂのカラムにより
精製して、５４６単位／ｍｇの精製カリジノゲナーゼ原
体を得た。得られた精製カリジノゲナーゼ原体（５４６
単位／ｍｇ）を、実施例１（１）で使用した基剤を用い
て軟膏を製造した。そして、実施例１で行った安定性テ
ストを行い、残存活性を測定した。２５℃、６ヶ月後で
９５．７％、４０℃、１ヵ月後で８５．７％、４０℃、
３ヵ月後で６４．０％、４０℃、６ヵ月後で４５．１％
であった。一方、３４９単位／ｍｇのカリジノゲナーゼ
原体を、実施例１（１）で使用した基剤を用いて軟膏を
製造し、実施例１で使用した安定性テストを行い、残存
活性を測定した。２５℃、６ヶ月後で８９．２％、４０
℃、１ヵ月後で３３．５％であった。

【００１５】実施例 ４ 実施例３（２）で得られた３４９単位／ｍｇのカリジノ
ゲナーゼ原体、実施例１（１）で使用した基剤を使用し
て、軟膏を製造した。このとき、さらに大豆プロテアー
ゼ阻害剤（シグマ社製、タイプＩ−Ｓ）をカリジノゲナ
ーゼ１０００単位当り０．５ｍｇを加えた。得られた軟
膏に、実施例１で行った安定性テストを行い、残存活性
を測定した。２５℃、３ヵ月後で９０．８％、２５℃、
６ヵ月後で９８．２％、４０℃、１ヵ月後で７９．２
％、４０℃、３ヵ月後で５９．３％、４０℃、６ヵ月後
で４０．５％であった。

【００１６】実施例 ５ 実施例３（２）と同様な方法により、１７０単位／ｍｇ
のカリジノゲナーゼ原体を得た。これを、さらにＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムより精製した後、
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲカラムによりゲル
漉過し、次に実施例３（１）により得られたカラムに通
した。その後、脱塩、凍結乾燥して、９１３単位／ｍｇ
のカリジノゲナーゼ原体を得た。得られたカリジノゲナ
ーゼ原体を、実施例１（１）で使用した基剤を用いて軟
膏を製造した。そして、実施例１で行った安定性テスト
を行い、残存活性を測定した。２５℃、６ヵ月後で１０
０％、４０℃、１ヵ月後で９３．５％、４０℃、３ヵ月
後で７３．７％、４０℃、６ヵ月後で６９．５％であっ
た。一方、２４２単位／ｍｇのカリジノゲナーゼ原体
を、実施例１（１）で使用した基剤を用いて軟膏を製造
し、実施例１で使用した安定性テストを行い、残存活性
を測定した。２５℃、１ヵ月後で９０．５％、２５℃、
６ヵ月後で４４．６％、４０℃、１ヵ月後で３４．５
％、４０℃、３ヵ月後で１６．２％、４０℃、６ヵ月後
で８．９％であった。

【００１７】実施例 ６ 実施例５で使用した２４２単位／ｍｇのカリジノゲナー
ゼ原体、実施例１（１）で使用した基剤を使用して、軟
膏を製造した。このとき、さらに大豆プロテアーゼ阻害
剤（シグマ社製 タイプＩ−Ｓ）をカリジノゲナーゼ１
０００単位当り０．５ｍｇを加えた。得られた軟膏に、
実施例１で行った安定性テストを行い、残存活性を測定
した。２５℃、１ヵ月後で９９．７％、２５℃、６ヵ月
後で８３．０％、４０℃、１ヵ月後で８０．１％、４０
℃、３ヵ月後で５９．７％、４０℃、６ヵ月後で４４．
２％であった。

【００１８】実施例 ６ ウサギ（雄、体重２．５−３ｋｇ）の背部を剃り、２５
×２５ｍｍの大きさに電気メスにより、潰瘍を形成させ
た。実施例３で得られた本発明の軟膏を、１日２回患部
に塗布した。その結果、８日後、潰瘍は完全に治癒し
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 9/107 Ｓ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カリジノゲナーゼ及び水中油型乳剤基剤を
   含むカリジノゲナーゼ含有外用剤。
2. 【請求項２】カリジノゲナーゼとしてプロテアーゼを実
   質的に除いたカリジノゲナーゼを使用する請求項１のカ
   リジノゲナーゼ含有外用剤。
3. 【請求項３】プロテアーゼ阻害剤をさらに含む請求項１
   又は２のカリジノゲナーゼ含有外用剤。