JPH07151671A - 粒子分析装置 - Google Patents

粒子分析装置

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JPH07151671A
JPH07151671A JP5296936A JP29693693A JPH07151671A JP H07151671 A JPH07151671 A JP H07151671A JP 5296936 A JP5296936 A JP 5296936A JP 29693693 A JP29693693 A JP 29693693A JP H07151671 A JPH07151671 A JP H07151671A
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    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1404—Handling flow, e.g. hydrodynamic focusing

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Abstract

(57)【要約】 【構成】 蛍光を発することができる被検粒子を含む試
料液の周囲にシース液を流しシースフローを形成し、偏
平な試料液流を形成するフローセルと、偏平な試料液流
の幅の狭い側から試料液流に対して蛍光励起光を連続的
に照射するための蛍光励起用光源と、試料液流中を移動
する被検粒子が所定の撮像可能位置に達したとき被検粒
子の発する蛍光を試料液流の幅の広い側から受光しその
蛍光を２次元像として増倍して被検粒子の蛍光像を撮像
する撮像手段と、被検粒子からの蛍光を所定時間だけ受
光させるためのシャッター手段を備える。 【効果】 偏平な試料流の幅の狭い側から蛍光励起光を
入射し、粒子から励起される蛍光を試料流の幅の広い側
から撮像するようにしたので、励起光を細く絞ることが
でき励起光照射強度を強くすることができ、その分励起
される蛍光が強い。また、励起用光源の直接光が撮像素
子に入射しないので、Ｓ／Ｎの良い蛍光像を得ることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、粒子分析装置に関
し、特に、血液や尿のように粒子成分を含む液体を試料
液としてフローセルに流しその試料液流に光を照射して
粒子からの光を撮像することにより、粒子を分析する装
置に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来のこのような装置としては、粒子を
懸濁した試料流に光を照射し、粒子の透過光像をビデオ
カメラで撮像するようにしたものが知られている（例え
ば、特開平５−７９９７０号公報、特開平５−１４２１
３７号公報参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、蛍光を
発する粒子の蛍光像をこのような従来の装置を用いて撮
像すると、光源からの強力な直接光をカットしきれず、
Ｓ／Ｎの良い蛍光像を得るのが難しいという問題点があ
った。この発明は、このような事情を考慮してなされた
もので、蛍光を発する粒子の側面から蛍光励起光を照射
して、粒子から励起される蛍光を粒子の正面からビデオ
カメラで撮像するようにした粒子分析装置を提供するも
のである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この発明は、被検粒子を
含む試料液の周囲にシース液を流してシースフローを形
成し、偏平な試料液流を形成するフローセルと、偏平な
試料液流の幅の狭い側から試料液流に蛍光励起光を連続
的に照射する蛍光励起用光源と、試料液流中を移動する
被検粒子が所定の撮像可能位置に達したとき、被検粒子
の発する蛍光を試料液流の幅の広い側から受光し被検粒
子の蛍光像を撮像する撮像手段と、被検粒子からの蛍光
を所定時間だけ撮像手段に受光させるためのシャッター
手段を備えた粒子分析装置を提供するものである。
【０００５】この発明の粒子分析装置における被検粒子
は、主にヒトを含む哺乳動物の血液および尿など中に含
まれる血球、細胞のような粒子であり、予め蛍光染料や
蛍光標識試薬によって処理された粒子であることが好ま
しい。フローセルは、粒子を含む試料液をシース液で包
んで流すことにより流体力学的効果によって偏平な試料
液の流れを形成させることのできるセルであり、粒子を
常にピントの合った状態で撮像することができる。
【０００６】この発明に用いるフローセルは、試料液
を、厚さが粒子径にほぼ等しく、幅が粒子径の数十倍で
あるような偏平流にして５０〜２００mm/sec程度の速度
で流すことができるものであることが好ましい。
【０００７】蛍光励起用光源としては、連続的に発光す
る（パルス発光でないタイプのもの）レーザ光源に集光
用レンズ（コンデンサレンズ）を付加したものを用いる
ことができる。
【０００８】撮像手段には一般的な２次元画像を撮像す
るビデオカメラを使用してもよいが、その場合には、微
弱な蛍光像を増幅するイメージインテンシファイア（画
像増幅手段）を備えたものを用いることが好ましい。さ
らに、そのイメージインテンシファイアにシャッター手
段が備えられていてもよい。
【０００９】シャッター手段には、シャッター速度可変
範囲が１〜１０μsec 程度の電子シャッタを用いること
が好ましい。シャッター手段は、一定周期で（例えば１
／３０秒ごとに）作動（開閉）するようにしてもよい
が、試料流と共に移動する被検粒子が所定位置（撮像手
段の撮像可能位置）に到達したことを光学的に検出する
手段の出力に基づいて作動するようにすることが好まし
い。この発明においては、撮像手段、画像増幅手段、シ
ャッター手段は別々に設けられていてもよく、また一体
的に設けられていてもよい。
【００１０】また、この発明の分析装置は、蛍光励起光
が照射された被検粒子からの光（例えば、前方散乱光、
側方散乱光、前方蛍光又は側方蛍光）を検出する光検出
手段と、その光検出手段の検出信号をうけてシャッター
手段の作動タイミングを制御する制御手段と、撮像手段
の画像信号と検出手段の検出信号をうけて被検粒子を分
析する分析手段を、さらに備えてもよい。
【００１１】この発明の分析装置は、試料液流の巾の広
い側から試料液流に照明光を連続的に照射する照明用光
源と、被検粒子を透過した透過光を受光し、各被検粒子
を複数回走査して撮像する１次元イメージセンサと、１
次元イメージセンサの撮像信号をうけてシャッター手段
の作動タイミングを制御する制御手段と、撮像手段の画
像信号と１次元イメージセンサの撮像信号をうけて被検
粒子を分析する分析手段を、さらに備えてもよい。
【００１２】この発明の分析装置は、撮像手段が試料液
流の一方の幅の広い側へ発せられた蛍光像を撮像するも
のであって、光検出手段は試料液流の他方の幅の広い側
へ発せられた光を検出するものであってもよい。
【００１３】この発明の分析装置は、被検粒子を含む試
料液の周囲をシース液を流し偏平な試料液流を形成する
フローセルと、偏平な試料液流の幅の狭い側から試料液
流に蛍光励起光を連続的に照射する蛍光励起用光源と、
試料液流中を移動する被検粒子が所定の撮像可能位置に
達したとき被検粒子の発する蛍光を試料液流の一方の幅
の広い側から受光し被検粒子の蛍光像を撮像する撮像手
段と、被検粒子からの蛍光を所定時間だけ撮像手段に受
光させるためのシャッター手段と、蛍光励起光が照射さ
れた被検粒子の蛍光又は／および側方散乱光を試料液流
の他方の幅の広い側から受光して検出する光検出手段
と、試料液流の巾の広い側から前記試料液流に照明光を
連続的に照射する照明用光源と、被検粒子を透過した透
過光を受光し、各被検粒子を複数回走査して撮像する一
次元イメージセンサと、光検出手段の検出信号および一
次元イメージセンサの撮像信号の少くともいずれか一方
をうけてシャッター手段の作動タイミングを制御する制
御手段と、撮像手段および一次元イメージセンサの撮像
信号と光検出手段の検出信号をうけて被検粒子を分析す
る分析手段を備えた粒子分析装置であってもよい。
【００１４】
【作用】蛍光励起用光源は、フローセル内を流れる偏平
な試料流に対して幅の狭い側から光を照射するので、光
（ビーム）を細く絞ることができ、その部分の励起光照
射強度を高めることが可能となるため、ロスなく強力な
光を照射することができる。このことにより、粒子から
の蛍光発光量が増大し、Ｓ／Ｎの良い蛍光像を撮像する
ことができる。
【００１５】また、蛍光像撮像手段は、蛍光励起用光源
の光軸方向に対して直角方向、つまり、試料液流の幅の
広い側から被検粒子の蛍光像を撮像する。従って、光源
からの励起光は直接撮像側に出射しないため、撮像手段
は励起光の影響をあまり受けずＳ／Ｎの良い蛍光像を撮
像することができる。
【００１６】
【実施例】以下、図面に示す実施例１〜５を用いてこの
発明を詳述する。これによってこの発明が限定されるも
のではない。また、実施例１〜５を示す図面において、
共通の構成要素については、同じ参照番号を付して説明
の重複を避けている。
【００１７】実施例１ 図１はこの発明の実施例１を示す構成説明図であり、１
は蛍光染色処理した被検粒子を含む試料液の周囲にシー
ス液を流してシースフローを形成し偏平な試料液流（厚
さ約１０μｍ×幅約１５０μｍ）を形成するフローセル
（この図では試料液流は紙面の表から裏へ流れる）、２
は試料液流の幅の狭い側から試料液流に対して蛍光励起
光を連続的に照射するレーザ光源（例えば、波長４８８
nm、出射光束径１．０mmのＡｒレーザ）、３は試料液流
中を移動する被検粒子が所定の撮像可能位置に到達した
とき粒子の発する蛍光を試料液流の幅の広い側から受光
して粒子の蛍光像を撮像するビデオカメラである。
【００１８】なお、ビデオカメラ３は受光する光強度を
数万倍に増幅して撮像するためのイメージインテンシフ
ァイアと振れ無い画像を撮像するための電子シャッター
（シャッタ速度１〜１０μsec 可変）を内蔵している
（インテンシファイドビデオカメラと称す）。４はレー
ザ光源からのビーム（１．０mmφ）を約２０μｍの光束
に絞って試料流に照射させるためのコンデンサレンズ、
５は所定の撮像エリアにある被検粒子の蛍光像をビデオ
カメラ３の撮像面に結像する対物レンズ、６は干渉フィ
ルタである。
【００１９】７は画像処理装置であり、インテンシファ
イドビデオカメラ３からの画像記号Ｓ２を処理すると共
に、ゲート制御記号（電子シャッター駆動信号）Ｓ１を
インテンシファイドビデオカメラ３へ出力して、ビデオ
のフレームレート（1/30秒ごと）にゲート（電子シャッ
タ）を開けるようになっている。
【００２０】この実施例では、図１に示すようにレーザ
ビームの光軸方向に対して直角方向に蛍光像を撮像する
ための対物レンズ５を配置している。すなわち、フロー
セル１の偏平な試料流に対して幅の広い側から蛍光像を
撮像するようにしている。このようにすることによって
レーザ光（励起光）の直接光が対物レンズ５に入射しな
いので、励起光の影響による蛍光像のＳ／Ｎの低下を防
止できる。
【００２１】レーザ光源２からの光がコンデンサレンズ
４を介してフローセル１に入射し被検粒子を照射する
と、被検粒子から蛍光が励起される。励起された蛍光
は、対物レンズ５を通過しインテンシファイドビデオカ
メラ３の入力面に蛍光像として結像される。対物レンズ
５とビデオカメラ３との間の干渉フィルタ６は、側方側
に洩れてきた励起光をカットするとともに、ある波長範
囲の蛍光だけを選択して受光するためのものである。
【００２２】インテンシファイドビデオカメラ３は、粒
子（細胞）が励起光照射エリアにいる時の一瞬だけゲー
ト（シャッタ）を開くことによって、振れのない蛍光像
を得る。ゲートを開ける時間は粒子の移動速度が速いほ
ど短くする必要があるが、その分、蛍光蓄積時間が短く
なり、蛍光像のＳ／Ｎ比は低下する。この実施例におけ
る試料流速は、一般的なフローサイトメータに比してか
なり遅くしており、極力、蛍光蓄積時間を稼ぐようにし
ている。流速を遅くすることによって蛍光像のＳ／Ｎ比
は向上するが、単位時間当たりの試料分析量は低下す
る。そこで、この発明では試料液をフローセル内で偏平
な流れにすることによって分析量の低下を補うようにし
ている。
【００２３】インテンシファイドビデオカメラ３の入力
面に結像された微弱な蛍光像は、イメージインテンシフ
ァイアによって数千倍から数万倍の強度に増倍され、撮
像される。撮像された蛍光画像は、画像処理装置７によ
って処理され、蛍光発光強度や蛍光発光部位の局在等の
解析が行われる。図１に示す構成では、撮像エリア（レ
ーザ光照射エリア）を粒子が通過しているかどうかを監
視する機能がないので、前述のように、インテンシファ
イドビデオカメラ３は、画像処理装置７から１／３０秒
ごとに一定周期で出力されるゲート制御信号Ｓ１により
そのゲートを開ける。ゲートが開かれた時にちょうど粒
子がレーザ光照射エリアにあれば、その粒子の蛍光像が
撮像される。
【００２４】次に詳述する実施例２〜５は、粒子がレー
ザ光照射エリア（インテンシファイドビデオカメラ３の
撮像エリア）を通過しているかどうかの監視系を付加し
ており、その監視系から得られる情報を用いて、ある特
徴的な粒子だけを選別して撮像する、あるいはごみとか
小片に対しては撮像しないようにする機能を有してお
り、撮像対象である粒子がレーザ光照射エリアに来た時
にインテンシファイドビデオカメラ３のゲートを開ける
ようにしている。このような細胞通過監視系を持たせる
ことによって、測定したい粒子だけを見落とすことなく
効率良く撮像することができるようになる。
【００２５】実施例２ 図２はこの発明の実施例２を示す構成説明図であり、実
施例２は、実施例１（図１）に対して粒子の通過監視
系、蛍光強度検出系および／または側方散乱光強度検出
系を付加したものである。
【００２６】蛍光染色された細胞を励起するためのレー
ザ光源２からの光は、実施例１と同様に、図２に示すよ
うにコンデンサレンズ４によって細く絞られて試料流に
照射される。蛍光染色された粒子が、そのレーザ光照射
エリアを通過すると、蛍光が励起され、レーザ光軸方向
と直角方向に配置された対物レンズ５，８によって側方
蛍光が集光される。
【００２７】対物レンズ８によって捉えられた蛍光は、
ダイクロイックミラー９を透過し、結像レンズ１０によ
ってスリット１１の位置で結像される。スリット１１
は、蛍光を検出するエリアを限定するためのものであ
る。スリット１１を透過した蛍光の内、赤色の波長の光
は、ダイクロイックミラー１２によって反射され、フォ
トマルチプライヤ１４によって光電変換される。緑色の
波長の蛍光または側方散乱光は、ダイクロイックミラー
１２を透過し、ダイクロイックミラー１３によって反射
され、フォトマルチプライヤ１５によって光電変換され
る。
【００２８】このようにして得られた赤蛍光、緑蛍光ま
たは側方散乱光検出信号は、信号処理装置１６に渡さ
れ、その信号強度がＡ／Ｄ変換され、従来のフローサイ
トメータと同様の光強度情報が得られる。
【００２９】一方、対物レンズ５によって捉えられた蛍
光は、ダイクロイックミラー１７を透過し、フィルタ６
によって選択された波長の蛍光が、インテンシファイド
ビデオカメラ３の入力面に蛍光像として結像される。
【００３０】フローセル１では、試料流は周りがシース
液で囲われ、流体力学的に偏平な流れになっているの
で、レーザ光照射エリアを同時に２つ以上の粒子が通過
する確率が増し、この時に得られる蛍光強度情報は、２
つ以上の粒子からの蛍光の合されたものとなり、１個１
個の粒子に対する正確な蛍光強度は得られない。
【００３１】そこで、図６に示すように試料流Ｌにおけ
るレーザ光照射エリアＢを同時に２つ以上の細胞が通過
していないかを監視する機能が必要となる。この機能を
実現するために、図２に示すように、レーザとは別の光
源１８およびラインセンサカメラ（一次元イメージセン
サ）１９を付加している。
【００３２】光源１８は、レーザ光や蛍光の波長領域と
重ならない領域の波長、例えば近赤外光を出力する光源
とする。光源１８の光は、コリメータレンズ２０によっ
て平行光に変換された後、ダイクロイックミラー９によ
って反射され、対物レンズ８によって絞られ、試料流に
照射される。図６に示すように、光源１８による照射エ
リアＡは、レーザ光照射エリアＢの少し上流側とし、照
射エリアＡに一致するように、ラインセンサ１９による
検出エリアが設定される。照射エリアＡを透過した光
は、対物レンズ５によって集光され、ダイクロイックミ
ラー１７によって反射され、ラインセンサ１９の受光面
に結像される。ダイクロイックミラー９，１７は光源１
８の波長の光を反射する特性を有するミラーである。な
お、図６において、Ｃはインテンシファイドビデオカメ
ラ３の撮像エリアを示している。
【００３３】図９に２つの粒子が同時に照射エリア、つ
まりラインセンサ検出エリアＡを通過している時の様子
とラインセンサ１９の検出信号Ｓ３および走査信号Ｓｃ
の例を示す。ラインセンサ１９が走査信号Ｓｃ（周期Ｔ
＝数十μsec)を信号処理装置１６ａからうける毎にライ
ンセンサ検出信号Ｓ３は信号処理装置１６に渡され、２
値化等の処理が施されて、同時に２つ以上の粒子が通過
しているかどうかが判定され、同時通過したと判定され
た場合には、フォトマルチプライア１４，１５の出力Ｓ
４，Ｓ５から得られる蛍光強度あるいは側方散乱光強度
情報は無視されるようになっている。
【００３４】上述の粒子監視系は、粒子の同時通過を監
視するためだけでなく、その検出信号Ｓ３を処理するこ
とによって、個々の粒子の面積、円形度、吸光度といっ
た情報を得ることもできる。また、これらの情報と、蛍
光検出信号Ｓ４，Ｓ５をＡ／Ｄ変換して得られる蛍光強
度情報とを組み合わせて、ある特定の群の粒子かどうか
を実時間で判定することもできる。例えば、被検粒子を
増殖期（Ｓ期）の細胞に限定して、その核の形態を蛍光
像より解析するということが容易にできる。図１０は、
その例を示すもので、横軸をＤＮＡ量を表わす赤蛍光強
度、縦軸をＢｒｄＵ，Ｋｉ−６７等の増殖抗原量を表わ
す緑蛍光強度としたスキャッタグラムであり、図１０に
示すウィンドウＷ内の細胞を増殖期の細胞として、実時
間で判定できる回路を設ければ、増殖期の細胞に限定し
た蛍光像を得ることができる。
【００３５】ラインセンサ検出エリアＡを粒子が通過し
ている時に得られる検出信号Ｓ３は、図７に示すように
周期Ｔ（数十μsec)のスキャンニングに対応し、１個の
粒子に対して複数回スキャンされ、複数個の検出信号
（パルス）が得られる（図７では、走査信号は図示して
いない）。図８は信号処理装置１６の詳細ブロック図で
あり、検出信号Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５は、信号処理装置１６
によって処理され、個々の粒子に対する最後のスキャン
による検出信号が得られてから、粒子の面積や吸光度の
情報が求められる。
【００３６】ラインセンサ検出信号Ｓ３は、まずその絵
素クロックに同期してサンプリングされ、Ａ／Ｄ変換器
１０１でＡ／Ｄ変換される。その波形データは、バック
グランド補正部１０２でバックグランド補正された後
に、２値化器１０３で２値化される。ここで言うバック
グランド補正とは、ラインセンサ検出エリアＡに対する
照射むら（シェーディング）やラインセンサ１９の各絵
素の感度ばらつきを補正することである。具体的には、
粒子が通過していない時の１スキャン分の検出信号波形
をあらかじめ記憶しておき、その波形データから測定時
の検出波形データを引き算することで補正する。
【００３７】このように補正されたデータは、粒子を検
出するための基準のレベルと比較され、２値化される。
この２値化された信号をもとに、信号処理部１０６で個
々の粒子に対応する検出信号の範囲を弁別するための領
域分割処理や、同時に２つ以上の粒子が通過したかどう
かの同時通過判定処理が行われる。そして、面積演算器
１０４において、ある１個の粒子に対する全ての２値化
信号パルスの幅を足し合わせることで、その粒子の投影
面積が求められる。また、吸光度演算器１０５では、あ
る１個の粒子に対応する全ての補正データを足し合わ
せ、それを面積で割ることによって、その細胞の吸光度
が求められる。
【００３８】一方、蛍光検出信号Ｓ４，Ｓ５について
は、その信号波形のピークをピーク検知器１０９が検知
してピーク検知信号Ｓｐ（図７）を出力した時点ですぐ
にその高さがＡ／Ｄ変換器１０７，１０８でＡ／Ｄ変換
される。この時点では既に、上述した面積、吸光度等の
データは出そろっており、これらのデータと蛍光強度デ
ータの組合せによって、目的とする特定の粒子かどうか
が粒子選別判定回路１１０によって瞬時に（数百nsec）
判定される。ただし、ラインセンサ検出信号処理によっ
て、２つ以上の粒子が同時通過したと判定されている時
は、蛍光強度データに信頼性が無いので、粒子の選別判
定は行わない。
【００３９】目的とする特定の粒子であると判定されれ
ば、すぐにゲート制御信号Ｓ１を出力してインテンシフ
ァイドビデオカメラ３のシャッターを数μsec だけ開放
させる。蛍光検出信号Ｓ４，Ｓ５のピーク点から、この
シャッタが開けられるまでの時間は、数μsec 以内であ
り、シャッターが開いている時の粒子の位置は、まだレ
ーザ光照射エリアＡのほぼ中心付近にある。この時、発
せられる蛍光が、蛍光像としてインテンシファイドビデ
オカメラ３のイメージインテンシファイヤによって増倍
された上で撮像される。
【００４０】インテンシファイドビデオカメラ３から出
力されるビデオ信号Ｓ２は、データ解析・画像処理装置
７ａに渡される。データ解析・画像処理装置７ａでは、
粒子像の部分だけを切り出して記憶したり、形態学的情
報を得るための処理が行われる。また、信号処理装置１
６で求められた蛍光強度、面積、吸光度等のデータは、
データ解析・画像処理装置７ａに渡され、１次元ヒスト
グラムや図１０に示すようなスキャッタグラムが表示さ
れる。このデータ解析・画像処理装置７ａの他の機能と
して、ある特定の群の粒子の蛍光像だけを撮像するため
のウィンドウの設定や、得られたスキャッタグラムのそ
のウィンドウ内の点をプロットして、その粒子の蛍光像
を表示するというような機能を持たせることも可能であ
る。
【００４１】実施例３ 図３はこの発明の実施例３を示す構成説明図であり、実
施例３は、実施例２（図２）から蛍光強度検出系を除去
したものである。光源１８からの光は、コリメータレン
ズ２０によって平行光にされた後、図６に示すようにコ
ンデンサーレンズ８によって試料流Ｌの幅の広い方向か
らエリアＡを照射する。試料流Ｌにおける光源１８の照
射エリアＡは、実施例２と同様に、蛍光励起用レーザ光
の照射位置Ｂに対して少し上流側の位置に設定される。
【００４２】エリアＡを透過してきた光は、対物レンズ
５を介してダイクロイックミラー１７で反射され、ライ
ンセンサ１９の受光面に結像される。照射エリアＡを粒
子が通過すると、ラインセンサ１９の受光面に対する光
蓄積が抑制されるので、図７に示すような検出信号Ｓ３
が得られる。１個の粒子がエリアＡを通過する間に、ラ
インセンサ１９によって複数回走査（スキャン）され
る。
【００４３】ラインセンサ１９による検出信号Ｓ３は、
信号処理装置１６ａによって処理され、粒子がエリアＡ
を通り過ぎた時点で、その粒子の大きさ（面積）、円形
度、吸光度等の情報が求められる。信号処理装置１６ａ
はそれらの情報を基にして撮像対象とする粒子であると
判定すれば、粒子がレーザ光照射エリアＢに移動してい
るタイミングを見計らってゲート制御信号Ｓ１を出力
し、インテンシファイドビデオカメラ３のゲート（シャ
ッター）を開ける。試料流の流速が１００mm/secの時に
は、約５μsec だけゲートを開けるようにすれば、振れ
の少ない蛍光像が撮像される（例えば直径１０μの粒子
であれば撮像ブレは粒子径の５％に抑制される）。
【００４４】実施例４ 図４はこの発明の実施例４を示す構成説明図であり、実
施例４は、実施例１（図１）に対して、レーザ光照射エ
リアＢ（図６）を通過する粒子からの前方散乱光の強度
を検出するためのフォトダイオード２１とその検出信号
を処理するための信号処理装置１６ｂを付加したもので
ある。粒子からの前方散乱光は、対物レンズ２２とピン
ホール２３を介してフォトダイオード２１で受光され
る。ピンホール２３は、粒子による散乱光だけを受光す
るために設けており、フローセルのガラス壁面等で反
射、屈折してくる光を極力受光しないようにするための
ものである。前方散乱光の代りに前方蛍光を検出するよ
うに工夫することもできる。
【００４５】前方散乱光検出信号Ｓ６は、信号処理装置
１６ｂに送られ、その振幅（高さ）が、実時間で求めら
れる。そして、前方散乱光検出信号Ｓ６のピークの高さ
がある範囲内である時、測定対象とする粒子であると判
定され、ゲート制御信号Ｓ１がインテンシファイドビデ
オカメラ３へ出力され、即座にインテンシファイドビデ
オカメラ３はゲートを開けて粒子の蛍光像を撮像する。
粒子による散乱光の強度がピークに達してから、インテ
ンシファイドビデオカメラ３のゲートを開けるまでの時
間は非常に短く粒子がレーザ光照射エリアＢ（図６）内
に位置している間に、蛍光像が撮像される。
【００４６】さらに、信号処理装置１６ｂは、前方散乱
光検出信号Ｓ６を受けて、粒子分析に必要な信号処理を
行う。データ解析・画像処理装置７ｃはインテンシファ
イドビデオカメラ３からのビデオ信号Ｓ２と信号処理装
置１６ｂからの散乱光強度情報をうけて、粒子分析に必
要なデータ解析処理および画像処理を行う。
【００４７】実施例５ 図５はこの発明の実施例５を示す構成説明図であり、実
施例５は、実施例１（図１）に対して、レーザ光照射エ
リアＢ（図６）を粒子が通過する時の側方散乱光の強度
を検出するためのフォトマルチプライヤ２３とその検出
信号Ｓ７を処理するための信号処理装置１６ｃを付加し
たものである。粒子からの側方散乱光は対物レンズ５に
よって集光された後、ダイクロイックミラー２４で反射
され、スリット２５を介してフォトマルチプライヤ２３
で受光される。このスリット２５は、粒子による側方散
乱光だけを受光するために設けており、フローセル１の
ガラス壁面等で反射、屈折してくる光を極力受光しない
ようにするためのものである。側方散乱光の代りに側方
蛍光を検出することも容易である。その場合には蛍光像
撮像側とは異なる方向（反対側）で検出するのが好まし
い。
【００４８】側方散乱光検出信号Ｓ７は、信号処理装置
１６ｃに送られ、その振幅（高さ）が、実時間で求めら
れる。そして、側方散乱光強度信号Ｓ７のピークの高さ
がある範囲内である時、測定対象とする粒子であると判
定され、ゲート制御信号Ｓ１がインテンシファイドビデ
オカメラ３へ出力され、即座にインテンシファイドビデ
オカメラ３はゲートを開けて粒子の蛍光像を撮像する。
粒子による散乱光の強度がピークに達してから、インテ
ンシファイドビデオカメラ３のゲートを開けるまでの時
間は非常に短く粒子がレーザ光照射エリアＢ（図６）内
に位置している間に、蛍光像が撮像される。
【００４９】さらに、信号処理装置１６ｃは、側方散乱
光検出信号Ｓ７を受けて、粒子分析に必要な信号処理を
行う。データ解析・画像処理装置７ｄはインテンシファ
イドビデオカメラ３からのビデオ信号Ｓ２と信号処理装
置１６ｃからの側方散乱光強度情報をうけて、粒子分析
に必要なデータ解析処理および画像処理を行う。
【００５０】以上において説明した粒子分析装置は、次
のような特徴を有する。 １．粒子を含む試料をフローセル内で偏平な試料流にす
ることにより、試料流の流速を上げることなく、単位時
間当たりの試料分析量を確保することができる。 ２．偏平な試料流に対して、幅の狭い方向からレーザ光
を照射することにより、レーザ光を細く絞ることがで
き、励起光照射強度を上げることができ、従来よりＳ／
Ｎの良い蛍光像が撮像できる。 ３．粒子が細胞の場合、核を蛍光染色することにより、
撮像された蛍光像より核の形態情報を得ることができ
る。 ４．散乱光検出系あるいはラインセンサ検出系を付加す
ることにより、蛍光像撮像エリアに粒子が通過している
ことを検知でき、撮像したい粒子だけを選択することに
より効率良い蛍光像の撮像が可能となる。 ５．ラインセンサによる検出信号を処理することによ
り、粒子の大きさ（面積）円形度、吸光度等の情報も同
時に得ることができる。 ６．蛍光像撮像機能に加えて、蛍光／側方散乱光強度検
出機能を付加することで、下記に示すような解析を容易
に実施でき、特に癌細胞等の動態についての生物学的な
研究の支援装置として、あるいは細胞診断の補助診断装
置として有用である。
【００５１】１）癌細胞の核の形態とＤＮＡ量との関係 ２）Ｓ期の細胞における増殖抗原の発現（局在）位置 ３）癌遺伝子産物（腫瘍マーカ）の発現、動態の解析 ４）細胞表面抗原の発現、動態の解析 ５）癌細胞と接着分子の関係 ６）ウィルス感染と癌化との関連 ７）医薬品の安全性試験（小核試験） ８）蛍光標識されたＤＮＡプローブを用いての染色体検
査（ＦＩＳＨ） ９）微小プランクトンの計測（種類、数、サイズ、形
態、クロロフィル量等）
【００５２】
【発明の効果】この発明によれば、偏平な試料流の幅の
狭い側から蛍光励起光を入射し、粒子から励起される蛍
光を試料流の幅の広い側から撮像するようにしたので、
励起光を細く絞ることができ励起光照射強度を強くする
ことができ、その分励起される蛍光が強い。また、励起
用光源の直接光が撮像素子に入射しないので、Ｓ／Ｎの
良い蛍光像を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例１を示す構成説明図である。
【図２】この発明の実施例２を示す構成説明図である。
【図３】この発明の実施例３を示す構成説明図である。
【図４】この発明の実施例４を示す構成説明図である。
【図５】この発明の実施例５を示す構成説明図である。
【図６】試料流レーザ光照射エリア検出エリアを示す説
明図である。
【図７】実施例２の各種信号のタイミングチャートであ
る。
【図８】実施例２の信号処理装置を示すブロック図であ
る。
【図９】実施例２のラインセンサ検出信号を示す波形図
である。
【図１０】実施例２における蛍光強度スキャッタグラム
である。
【符号の説明】
１ フローセル ２ レーザ光源 ３ インテンシファイドビデオカメラ ４ コンデンサレンズ ５ 対物レンズ ６ 干渉フィルタ ７ 画像処理装置

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 被検粒子を含む試料液の周囲にシース液
    を流し偏平な試料液流を形成するフローセルと、偏平な
    試料液流の幅の狭い側から試料液流に蛍光励起光を連続
    的に照射する蛍光励起用光源と、試料液流中を移動する
    被検粒子が所定の撮像可能位置に達したとき、被検粒子
    の発する蛍光を試料液流の幅の広い側から受光し、被検
    粒子の蛍光像を撮像する撮像手段と、被検粒子からの蛍
    光を所定時間だけ撮像手段に受光させるためのシャッタ
    ー手段を備えた粒子分析装置。
  2. 【請求項２】 蛍光励起光が照射された被検粒子からの
    光を検出する光検出手段と、光検出手段の検出信号をう
    けてシャッター手段の作動タイミングを制御する制御手
    段と、撮像手段の画像信号と光検出手段の検出信号をう
    けて被検粒子を分析する分析手段を、さらに備えた請求
    項１記載の粒子分析装置。
  3. 【請求項３】 光検出手段が、被検粒子からの前方散乱
    光、側方散乱光、前方蛍光又は側方蛍光を検出するもの
    である、請求項２記載の粒子分析装置。
  4. 【請求項４】 試料液流の巾の広い側から試料液流に照
    明光を連続的に照射する照明用光源と、被検粒子を通過
    した透過光を受光し、各被検粒子を複数回走査して撮像
    する１次元イメージセンサと、１次元イメージセンサの
    撮像信号をうけてシャッター手段の作動タイミングを制
    御する制御手段と、撮像手段の画像信号と１次元イメー
    ジセンサの撮像信号をうけて被検粒子を分析する分析手
    段を、さらに備えた請求項１記載の粒子分析装置。
  5. 【請求項５】 撮像手段は、試料液流の一方の巾の広い
    側へ発せられた蛍光を撮像するものであって、光検出手
    段は、試料液流の他方の巾の広い側へ発せられた光を検
    出するものである、請求項２記載の粒子分析装置。
  6. 【請求項６】 被検粒子を含む試料液の周囲にシース液
    を流し偏平な試料液流を形成するフローセルと、偏平な
    試料液流の幅の狭い側から試料液流に蛍光励起光を連続
    的に照射する蛍光励起用光源と、試料液流中を移動する
    被検粒子が所定の撮像可能位置に達したとき被検粒子の
    発する蛍光を試料液流の一方の幅の広い側から受光し被
    検粒子の蛍光像を撮像する撮像手段と、被検粒子からの
    蛍光を所定時間だけ撮像手段に受光させるためのシャッ
    ター手段と、蛍光励起光が照射された被検粒子からの蛍
    光又は／および側方散乱光を試料液流の他方の幅の広い
    側から受光して検出する光検出手段と、試料液流の巾の
    広い側から前記試料液流に照明光を連続的に照射する照
    明用光源と、被検粒子を透過した透過光を受光し、各被
    検粒子を複数回走査に撮像する一次元イメージセンサ
    と、光検出手段の検出信号および一次元イメージセンサ
    の撮像信号の少くともいずれか一方をうけてシャッター
    手段の作動タイミングを制御する制御手段と、撮像手段
    および一次元イメージセンサの撮像信号と光検出手段の
    検出信号とをうけて被検粒子を分析する分析手段を備え
    た粒子分析装置。
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