ES2711364T3 - Sistemas y métodos de célula de flujo para el análisis de partículas en muestras de sangre - Google Patents

Sistemas y métodos de célula de flujo para el análisis de partículas en muestras de sangre Download PDF

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Abstract

Método para obtener imágenes de partículas usando un sistema de análisis de partículas configurado para hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometría de las partículas incluidas dentro de una muestra (25) de fluido sanguíneo, comprendiendo el método: inyectar un fluido (426) envolvente a lo largo de una trayectoria (422) de flujo de una célula (22, 33, 420) de flujo del analizador de partículas, teniendo el fluido (426) envolvente una viscosidad que es mayor que una viscosidad de la muestra (25) de fluido sanguíneo; inyectar la muestra (25) de fluido sanguíneo a partir de un tubo (29, 412, 400d) de inyección de fluido de muestra a una velocidad de flujo en el fluido (426) envolvente que fluye dentro de la célula (22, 33, 420) de flujo para proporcionar una corriente (32, 428) de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo (21, 412, 400d) de inyección, teniendo la trayectoria (422) de flujo de la célula (22, 33, 420) de flujo una disminución del tamaño (21, 419) de la trayectoria de flujo de modo que el grosor de la corriente (32, 428) de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio (432) de captura de imágenes; obtener imágenes de una primera pluralidad de las partículas de la muestra (25) en el sitio (432) de captura de imágenes de la célula (22, 33, 420) de flujo; en el que la disminución del tamaño (422) de la trayectoria de flujo se define por una porción (21a) de trayectoria de flujo proximal que tiene un grosor proximal, y porción (21b) de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor distal menor que el grosor proximal, estando la razón del grosor proximal con respecto al grosor distal en el intervalo de 10 a 200, en el que un extremo (427a) posterior del tubo (29, 412, 400d) de inyección de fluido de muestra se coloca de manera distal a la porción (21a) de trayectoria de flujo proximal, en el que una diferencia de viscosidad entre el fluido (426) envolvente y la muestra (25) de fluido sanguíneo, en combinación con la disminución del tamaño de la trayectoria de flujo y la velocidad de flujo de la muestra, es eficaz para suministrar células en la muestra (25) de fluido sanguíneo desde el tubo (29, 412, 400d) de inyección de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imágenes en un tiempo de tránsito distinto de cero que es de cuatro segundos o menos, mientras que un agente de viscosidad en el fluido (426) envolvente mantiene la viabilidad de las células que salen de la estructura y el contenido de las células intacto cuando las células se extienden desde la corriente de fluido de muestra al interior del fluido envolvente que fluye a medida que las células se desplazan desde el tubo (29, 412, 400d) de inyección de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imágenes.

Description

DESCRIPCION
Sistemas y metodos de celula de flujo para el analisis de particulas en muestras de sangre
Antecedentes de la invencion
Esta divulgacion se refiere al campo de aparatos, sistemas, composiciones y metodos para el analisis de particulas, incluyendo obtencion de imagenes de particulas en muestras de fluido, usando dispositivos total o parcialmente automatizados para discriminar y cuantificar particulas tales como celulas sanguineas en la muestra. La presente divulgacion tambien se refiere a un liquido de alineacion de particulas y/u organulos intracelulares (PIOAL) util para analizar particulas en una muestra de un sujeto, a metodos para producir el liquido, y a metodos para usar el liquido para detectar y analizar particulas. Tambien se dan a conocer composiciones, sistemas, dispositivos y metodos utiles para llevar a cabo analisis de muestras de fluidos biologicos basados en imagenes. Las realizaciones que se refieren a composiciones no son parte de la presente invencion reivindicada. Las composiciones, sistemas, dispositivos y metodos de la presente divulgacion tambien son utiles para detectar, contar y caracterizar particulas en fluidos biologicos tales como globulos rojos, reticulocitos, globulos rojos nucleados, plaquetas y para recuento diferencial, categorizacion, subcategorizacion, caracterizacion y/o analisis de globulos blancos basados en imagenes y morfologicamente.
El analisis de celulas sanguineas es una de las pruebas medicas mas comunmente realizadas para proporcionar una vision general del estado de salud de un paciente. Puede extraerse una muestra de sangre del cuerpo de un paciente y almacenarse en un tubo de ensayo que contiene un anticoagulante para evitar la coagulacion. Una muestra de sangre completa comprende normalmente tres clases principales de celulas sanguineas incluyendo globulos rojos (eritrocitos), globulos blancos (leucocitos) y plaquetas (trombocitos). Cada clase puede dividirse adicionalmente en subclases de miembros. Por ejemplo, cinco tipos o subclases principales de globulos blancos (WBC) tienen diferentes formas y funciones. Los globulos blancos pueden incluir neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos y basofilos. Tambien hay subclases de los tipos de globulos rojos. El aspecto de las particulas en una muestra puede diferir segun estados patologicos, madurez celular y otras causas. Las subclases de globulos rojos pueden incluir reticulocitos y globulos rojos nucleados.
Un recuento de celulas sanguineas que estima la concentracion de RBC, WBC o plaquetas puede realizarse manualmente o usando un analizador automatico. Cuando se realizan recuentos de celulas sanguineas manualmente, se aplica una gota de sangre a un portaobjetos de microscopio como un frotis delgado. De manera tradicional, se ha usado examen manual de un frotis de sangre seca y tenida sobre un portaobjetos de microscopio para determinar el numero o cantidades relativas de los cinco tipos de globulos blancos. Se han usado colorantes y tintes histologicos para tenir celulas o estructuras celulares. Por ejemplo, la tincion de Wright es una tincion histologica que se ha usado para tenir frotis de sangre para examen bajo un microscopio optico. Puede obtenerse un recuento de celulas sanguineas completo (CBC) usando un analizador automatizado, un tipo que cuenta el numero de particulas o celulas diferentes en una muestra de sangre basandose en la impedancia o dispersion de la luz dinamica a medida que las particulas o celulas pasan a traves de un area de deteccion a lo largo de un tubo pequeno. El CBC automatizado puede emplear instrumentos o metodos para diferenciar entre diferentes tipos de celulas que incluyen RBC, WBC y plaquetas (PLT), que pueden contarse por separado. Por ejemplo, puede usarse una tecnica de recuento que requiere un volumen o tamano de particula minimo para contar solo celulas grandes. Determinadas celulas tales como celulas anomalas en la sangre pueden no contarse o identificarse correctamente. Celulas pequenas que se adhieren entre si pueden contarse de manera erronea como una celula grande. Cuando se sospecha de recuentos erroneos, puede requerirse la revision manual de los resultados del instrumento para verificar e identificar celulas.
Las tecnicas de recuento de celulas sanguineas automatizadas pueden implicar citometria de flujo. La citometria de flujo implica proporcionar una trayectoria de flujo estrecha, y detectar y contar el paso de celulas sanguineas individuales. Se han usado metodos de citometria de flujo para detectar particulas suspendidas en un fluido, tales como celulas en una muestra de sangre, y para analizar las particulas en cuanto a tipo de particula, dimension y distribucion de volumen para inferir la concentracion del respectivo tipo de particula o volumen de particula en la muestra de sangre. Los ejemplos de metodos adecuados para analizar particulas suspendidas en un fluido incluyen sedimentacion, caracterizacion microscopica, recuento basado en impedancia y dispersion de la luz dinamica. Estas herramientas estan sujetas a errores de prueba. Por otro lado, la caracterizacion precisa de tipos y concentracion de particulas puede ser criticas en aplicaciones tales como diagnostico medico.
En tecnicas de recuento basadas en obtencion de imagenes, se capturan imagenes de datos de pixeles de una muestra preparada que pueden pasar a traves de un area de visualizacion usando una lente objetivo de microscopia acoplada a una camara digital. Los datos de imagenes de pixel pueden analizarse usando tecnicas de procesamiento de datos, y tambien presentadas en un monitor.
Se dan a conocer aspectos de sistemas de diagnostico automatizados con celulas de flujo en la patente estadounidense n.° 6.825.926 de Turner et al. y en las patentes estadounidenses n.os 6.184.978; 6.424.415; y 6.590.646, todas de Kasdan et al.
Se han usado sistemas automatizados que usan dispersion de la luz dinamica o impedancia para obtener un recuento de celulas sanguineas completo (CBC): recuento de globulos blancos total (WBC), volumen celular total de globulos rojos (de distribucion RBC), hemoglobina HGB (la cantidad de hemoglobina en la sangre); volumen celular medio (MCV) (volumen medio de los globulos rojos); MPV (volumen de PLT medio); hematocrito (HCT); MCH (HGB/RBC) (la cantidad promedio de hemoglobina por globulo rojo); y MCHC (HGB/HCT) (la concentracion promedio de hemoglobina en las celulas). Se han usado procesos automatizados o parcialmente automatizados para facilitar el recuento diferencial en cinco partes de globulos blancos y los analisis de muestras de sangre.
Aunque tales sistemas y metodos de analisis de particulas conocidos actualmente, junto con tecnicas de diagnostico medico relacionadas, pueden proporcionar beneficios reales a medicos, facultativos y pacientes, todavia son deseables mejoras adicionales. Las realizaciones de la presente invencion proporcionan disoluciones para al menos algunas de estas necesidades excepcionales.
El documento WO 01/48455 describe el uso de un fluido envolvente y una muestra con adicion de un agente de aumento de la viscosidad para dar una viscosidad mayor que la del agua, lo que garantiza que el flujo en la seccion previa al analisis es flujo laminar completamente desarrollado, y que el flujo en la seccion de analisis sera laminar. Se prefieren polimeros solubles en agua porque aumentan la velocidad de fluido con efectos osmoticos despreciables.
El documento WO 00/11449 se refiere a mecanismos de alta velocidad para identificar automaticamente y seleccionar fisicamente organismos multicelulares u otros objetos grandes con caracteristicas predeterminadas de poblaciones mixtas y depositarlos en ubicaciones diferenciadas.
El documento EP 0486747 se refiere a un citometro de obtencion de imagenes de flujo para obtener imagenes de las dimensiones y formas de componentes de particula en un flujo de una disolucion de muestra que tiene un filamento delgado que sirve como referencia de enfoque en una zona de obtencion de imagenes plana a traves de la cual fluye la disolucion de muestra para obtener imagenes de los componentes de particulas.
El documento EP 0468100 se refiere a citometria de obtencion de imagenes de flujo en la que se introduce una muestra tal como sangre u orina tenida de manera adecuada en una celula de flujo para formar un flujo plano y envolvente dentro de la celula, la zona de flujo envolvente se irradia con luz estroboscopica y se analiza una imagen de la celula obtenida mediante una camara de video mediante un procesador de imagenes. Mas particularmente, se refiere a un metodo de ajuste automatico del punto focal usado en tal citometria de obtencion de imagenes de flujo.
El documento US 5812419 da a conocer un metodo de analisis completamente automatizado con un sistema optico para un analizador de celulas sanguineas.
Breve sumario de la invencion
Las realizaciones de la presente invencion se refieren a aparatos, sistemas y metodos para analizar una muestra preparada que contiene particulas. Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para obtener imagenes de particulas usando un sistema de analisis de particulas configurado para hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria de las particulas incluidas dentro de una muestra de fluido sanguineo, tal como se establece en la reivindicacion 1. Segun un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un sistema de analisis de particulas que realiza hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria para obtener imagenes de particulas en una muestra de fluido sanguineo, tal como se establece en la reivindicacion 7. En algunos aspectos, el sistema comprende un analizador que puede ser un analizador visual. En algunos aspectos, el aparato contiene un analizador visual y un procesador. En un aspecto, esta divulgacion se refiere a un sistema de obtencion de imagenes de particulas automatizado en el que una muestra de liquido que contiene particulas de interes se hace fluir a traves de una celula de flujo que tiene una ventana de observacion mediante la cual un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica captura una imagen. En algunos aspectos, el dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica comprende una camara tal como una camara digital. En un aspecto, el dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica comprende una lente objetivo.
La celula de flujo se acopla a una fuente de fluido de muestra, tal como una muestra preparada, y a una fuente de liquido de alineacion de particulas y/u organulos intracelulares (PIOAL). El sistema permite la captura de imagenes enfocadas de particulas en una muestra en flujo. En algunas realizaciones, las imagenes pueden usarse en procesos automatizados ultrarrapidos para categorizar y subcategorizar particulas. Un analizador visual a modo de ejemplo puede incluir un procesador para facilitar el analisis automatizado de las imagenes. En algunos casos, el analizador visual puede usarse en metodos de esta divulgacion para proporcionar recuento diferencial automatizado de WBC basado en imagenes u otros protocolos de analisis de particulas de muestras de sangre. En algunos casos, los metodos de esta divulgacion se refieren a la identificacion automatizada de anomalias morfologicas para determinar, diagnosticar, pronosticar, predecir y/o respaldar un diagnostico de si un sujeto esta sano o tiene una enfermedad, estado, anomalia y/o infeccion y para monitorizar si un sujeto responde o no al tratamiento.
En un aspecto, las realizaciones de la presente invencion abarcan metodos para obtener imagenes de particulas usando un sistema de analisis de particulas que esta configurado para hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria. Las particulas pueden incluirse dentro de fluidos de muestra primero y segundo de una muestra de fluido sanguineo. Los metodos a modo de ejemplo pueden incluir hacer fluir un fluido envolvente a lo largo de una trayectoria de flujo de una celula de flujo del analizador de particulas, y el fluido envolvente puede tener una viscosidad que es diferente de una viscosidad de la muestra de fluido sanguineo. En algunos casos, el fluido envolvente tiene una viscosidad de fluido envolvente que difiere de la viscosidad de fluido de muestra en una diferencia de viscosidad, y la diferencia de viscosidad tiene un valor en un intervalo de diferencia de viscosidad predeterminado. Los metodos tambien pueden incluir inyectar el primer fluido de muestra de un tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye dentro de la celula de flujo para proporcionar una corriente de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo de inyeccion. La trayectoria de flujo de la celula de flujo puede tener una disminucion de la trayectoria de tamano de flujo de modo que el grosor de la corriente de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio de captura de imagenes. Los metodos de la divulgacion pueden incluir ademas obtener imagenes de una primera pluralidad de las particulas del primer fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo, e iniciar transitorios de fluido de muestra terminando la inyeccion del primer fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. Ademas, los metodos pueden incluir obtener imagenes de una segunda pluralidad de las particulas del segundo fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo. La obtencion de imagenes de la segunda pluralidad de particulas puede realizarse sustancialmente despues de los transitorios de fluido de muestra y en el plazo de 4 segundos de la obtencion de imagenes de la primera pluralidad de las particulas. En algunos casos, la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo se define por una porcion de trayectoria de flujo proximal que tiene un grosor proximal, y porcion de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor distal menor que el grosor proximal. Un extremo posterior del tubo de inyeccion de fluido de muestra puede colocarse de manera distal a la porcion de trayectoria de flujo proximal. La diferencia de viscosidad entre las muestras de fluido sanguineo y envolvente, en combinacion con la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo, puede ser eficaz para hidroenfocar los fluidos de muestra primero y segundo en el sitio de captura de imagenes, mientras que un agente de viscosidad en el fluido envolvente retiene la viabilidad de celulas en los fluidos de muestra primero y segundo que dejan la estructura y el contenido de las celulas intacto cuando las celulas se extienden desde la corriente de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye.
En algunos metodos, el tubo de inyeccion puede incluir un volumen interno basado en una razon de una seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a una seccion transversal de area de flujo de la celula de flujo, una razon de la seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a un diametro exterior de la celula de flujo, o una razon de la seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a una seccion transversal de area de flujo de la corriente de muestra. En algunos casos, la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo puede definirse por paredes opuestas de la trayectoria de flujo que se inclinan radialmente hacia dentro a lo largo de la trayectoria de flujo generalmente simetrica sobre un plano transversal que biseca los grosores primero y segundo de la corriente de fluido de muestra. En algunos casos, la simetria en la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo es eficaz para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 20%. En algunos casos, la muestra de fluido sanguineo incluye particulas esfericas, y una viscosidad diferencial entre el fluido de muestra y el fluido envolvente es eficaz para alinear organulos intracelulares de las particulas esfericas dentro de un plano focal en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo. En algunos casos, una porcion distal del tubo de inyeccion de fluido de muestra se coloca a una distancia de separacion axial del sitio de captura de imagenes, y la distancia de separacion axial tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 16 mm hasta aproximadamente 26 mm. En algunos casos, el tubo de inyeccion tiene un volumen interno de menos de aproximadamente 30 pl.
En algunos metodos, el tubo de inyeccion tiene una porcion proximal que tiene una primera area de seccion transversal de flujo y una porcion distal que tiene una segunda area de seccion transversal de flujo, y el area de seccion transversal de flujo de la porcion proximal es mayor de 1,5 veces el area de seccion transversal de flujo de la porcion distal. En algunos metodos, el tubo de inyeccion tiene una porcion distal dispuesta entre la porcion proximal y la porcion distal, la porcion distal tiene una tercera seccion transversal de flujo, y la tercera seccion transversal de flujo es mayor que las secciones transversales de flujo primera y segunda.
En algunos metodos, una porcion distal del tubo de inyeccion de fluido de muestra incluye un puerto de salida que tiene una altura y un ancho, y la altura puede ser menor que el ancho. En algunos casos, la altura es de aproximadamente 150 pm y el ancho es de aproximadamente 1350 pm. En algunos casos, la altura tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 50 pm hasta aproximadamente 250 pm y el ancho tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 500 pm hasta aproximadamente 3000 pm.
En algunos metodos, una razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido de muestra es de aproximadamente 70. En algunos casos, la razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido de muestra es de aproximadamente 200. En algunos casos, el fluido envolvente tiene una velocidad de flujo de aproximadamente 35 pl/s y el fluido de muestra tiene una velocidad de flujo de aproximadamente 0,5 pl/s. En algunos casos, el fluido de muestra tiene una velocidad de entre aproximadamente 20 y 200 mm/segundo en el sitio de captura de imagenes. En algunos casos, la velocidad de fluido envolvente y la velocidad de muestra de fluido pueden diferir en una posicion de trayectoria de flujo proxima al puerto de salida del tubo del tubo de inyeccion, y la velocidad de fluido envolvente y la velocidad de muestra de fluido pueden ser iguales en el sitio de captura de imagenes. En algunos casos, el primer grosor de la corriente de fluido de muestra es de aproximadamente 150 pm, por ejemplo cuando el fluido de muestra sale del tubo de inyeccion. En algunos casos, el segundo grosor de la corriente de fluido de muestra esta dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 pm hasta aproximadamente 10 pm, por ejemplo cuando la corriente de fluido de muestra fluye a traves del sitio de captura de imagenes. En algunos casos, el segundo grosor de la corriente de fluido de muestra esta dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 pm hasta aproximadamente 4 pm. En algunos casos, una razon del primer grosor de la corriente de fluido de muestra con respecto al segundo grosor de la corriente de fluido de muestra tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 70:1. En algunos casos, una razon del primer grosor de la corriente de fluido de muestra con respecto al segundo grosor de la corriente de fluido de muestra tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 5:1 hasta aproximadamente 200:1. En algunos casos, una razon del grosor proximal de la porcion de trayectoria de flujo proximal con respecto al grosor distal de la porcion de trayectoria de flujo distal tiene un valor de adelgazamiento geometrico seleccionado del grupo que consiste en 10:1, 15:1,20:1, 25:1, 30:1, 35:1,40:1,45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, y 200:1. En algunos casos, la celula de flujo tiene una razon de compresion minima de aproximadamente 50:1 y una razon de compresion maxima de aproximadamente 125:1.
En algunos metodos, la celula de flujo esta orientada de modo que el fluido de muestra y el fluido envolvente que fluyen dentro de la celula de flujo fluyen contra la gravedad. En algunos casos, la celula de flujo esta orientada de modo que el fluido de muestra y el fluido envolvente que fluyen dentro de la celula de flujo fluyen con la gravedad. Los metodos a modo de ejemplo tambien pueden incluir eliminar burbujas del fluido de muestra que fluye. En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de aproximadamente 1 a 3 segundos tras la inyeccion del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de menos de 1 segundo tras la inyeccion del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de aproximadamente 1,8 segundos desde la inyeccion del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 1 hasta 4 segundos. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 hasta 4 segundos. En algunos casos, el sitio de captura de imagenes tiene un campo de vision de entre aproximadamente 150 pm x 150 pm y 400 pm x 400 pm. En algunos casos, el primer fluido de muestra tiene un volumen un intervalo de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 pl. En algunos casos, una porcion proximal del tubo de inyeccion se acopla a un puerto de muestra de un accesorio de entrada de muestra.
En otro aspecto, las realizaciones de la presente invencion abarcan sistemas de analisis de particulas que realizan hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria para obtener imagenes de particulas en una muestra de fluido sanguineo. Las particulas pueden incluirse dentro de los fluidos de muestra primero y segundo. Los sistemas a modo de ejemplo pueden incluir una celula de flujo que tiene una trayectoria de flujo configurada para transmitir un flujo del fluido envolvente. El fluido envolvente puede tener una viscosidad que es mayor que la viscosidad de la muestra de fluido sanguineo. Los sistemas tambien pueden incluir un sistema de inyeccion de fluido de muestra en comunicacion de fluido con la trayectoria de fluido. El sistema de inyeccion de fluido de muestra puede configurarse para inyectar los fluidos de muestra en el fluido envolvente que fluye dentro de la celula de flujo para proporcionar una corriente de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo de inyeccion. La trayectoria de flujo de la celula de flujo puede tener una disminucion de la trayectoria de tamano de flujo de modo que el grosor de la corriente de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio de captura de imagenes. Ademas, los sistemas pueden incluir un dispositivo de captura de imagenes alineado con el sitio de captura de imagenes para obtener imagenes de una primera pluralidad de las particulas del primer fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo. Ademas, los sistemas pueden incluir un procesador acoplado con el sistema de inyector de fluido de muestra y el dispositivo de captura de imagenes. El procesador puede configurarse para terminar la inyeccion del primer fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye e inyectar el segundo fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye de modo que se inician transitorios de fluido de muestra, y para obtener imagenes de una segunda pluralidad de las particulas del segundo fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo despues de los transitorios de fluido de muestra y en el plazo de 4 segundos de la obtencion de imagenes de la primera pluralidad las particulas. En sistemas a modo de ejemplo, la diferencia de viscosidad entre las muestras de fluido sanguineo y envolvente, en combinacion con la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo, es eficaz para hidroenfocar los fluidos de muestra primero y segundo en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo, mientras que un agente de viscosidad en el fluido envolvente retiene la viabilidad de celulas en los fluidos de muestra primero y segundo que dejan la estructura y el contenido de las celulas intacto cuando las celulas se extienden desde la corriente de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye.
En algunos sistemas, el tubo de inyeccion incluye un volumen interno basado en una razon de una seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a una seccion transversal de area de flujo de la celula de flujo, una razon de la seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a un diametro exterior de la celula de flujo, o una razon de la seccion transversal del area de flujo del tubo de inyeccion con respecto a una seccion transversal de area de flujo de la corriente de muestra. En algunos casos, la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo se define por paredes opuestas de la trayectoria de flujo que se inclinan radialmente hacia dentro a lo largo de la trayectoria de flujo generalmente simetrica sobre un plano transversal que biseca los grosores primero y segundo de la corriente de fluido de muestra. En algunos casos, la simetria en la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo es eficaz para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 20%. En algunos casos, una porcion distal del tubo de inyeccion de fluido de muestra se coloca a una distancia de separacion axial del sitio de captura de imagenes, y la distancia de separacion axial tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 16 mm hasta aproximadamente 26 mm. En algunos casos, el tubo de inyeccion incluye una porcion proximal que tiene una primera area de seccion transversal de flujo y una porcion distal que tiene una segunda area de seccion transversal de flujo, y el area de seccion transversal de flujo de la porcion proximal es mayor de 1,5 veces el area de seccion transversal de flujo de la porcion distal. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 1 hasta 4 segundos. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 hasta 4 segundos. En algunos casos, la celula de flujo esta configurada para recibir el fluido envolvente de una fuente de fluido envolvente en la trayectoria de flujo en una primera direccion de flujo que es perpendicular a segunda direccion de flujo del fluido envolvente a lo largo de la trayectoria de flujo en el sitio de obtencion de imagenes. En algunos casos, la celula de flujo incluye una diana de autoenfoque para el dispositivo de captura de imagenes.
Las caracteristicas descritas anteriormente y muchas otras caracteristicas y ventajas acompanantes de las realizaciones de la presente invencion se haran evidentes y se comprenderan mejor haciendo referencia a la siguiente descripcion detallada cuando se considera junto con los dibujos adjuntos.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es una ilustracion esquematica, parcialmente en seccion y no a escala, que muestra aspectos operativos de una celula de flujo, sistema de autoenfoque y dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica a modo de ejemplo para analisis de imagenes de muestras usando procesamiento de imagenes digital.
La figura 2 es una ilustracion en perspectiva de una celula de flujo segun una realizacion a modo de ejemplo.
La figura 3 es una vista en seccion longitudinal mediana a lo largo de las lineas 3-3 de la celula de flujo mostrada en la figura 2.
Las figuras 3A y 3B proporcionan vistas de seccion adicionales de celulas de flujo segun realizaciones de la presente invencion.
La figura 4 representa aspectos de un sistema de analizador segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 4A, 4B-1 y 4B-2 representan aspectos de celulas de flujo segun realizaciones de la presente invencion. Las figuras 4A-1 y 4A-2 representan vistas en seccion transversal de las dimensiones de la envoltura del fluido envolvente (por ejemplo, PIOAL) y de la corriente del fluido de muestra dentro de una celula de flujo en un puerto de salida de canula y un sitio de captura de imagenes, respectivamente, segun realizaciones de la presente invencion. Las figuras 4C-4G, 4C-1 y 4D-1 representan aspectos de configuraciones de canula segun realizaciones de la presente invencion.
La figura 4H representa aspectos de una celula de flujo segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 4I y 4J representan aspectos de flujo de fluido en una celula de flujo en relacion con la gravedad segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 4K y 4L representan aspectos de flujo de muestra y fluido envolvente dentro de una celula de flujo en un sitio de captura de imagenes, segun realizaciones de la presente invencion.
La figura 4L-1 representa aspectos de la velocidad de flujo de fluido dentro de una celula de flujo segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 4M y 4N representan aspectos de obtencion de imagenes y alineacion intracelular, segun realizaciones de la presente invencion.
La figura 4O representa aspectos del efecto de PIOAL sobre la obtencion de imageries y alineacion de particulas y/o particulas intracelulares segun realizaciones de la presente invencion. En esta comparacion de imagenes obtenidas usando PIOAL frente a imagenes obtenidas usando un fluido envolvente distinto de PIOAL, puede observarse que el uso de PIOAL dio como resultado mas contenido celular enfocado tal como lobulos, citoplasma y/o granulo.
La figura 4R ilustra determinados resultados de alineacion de particulas obtenidos usando configuraciones de celula de flujo y composiciones de fluido envolvente segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 4P y 4Q muestran una comparacion de imagenes obtenidas usando PIOAL frente a imagenes obtenidas usando fluido envolvente convencional. Puede observarse que el uso de PIOAL dio como resultado una alineacion de RBC mejorado.
La figura 5 representa aspectos de los metodos de obtencion de imagenes de particulas segun realizaciones de la presente invencion.
La figura 6 representa aspectos de los metodos de obtencion de imagenes de particulas segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 7 y 8 representan aspectos de la velocidad de deformacion de la corriente de flujo segun realizaciones de la presente invencion.
Las figuras 9A y 9B representan aspectos de dianas de autoenfoque segun los ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion.
Las figuras 10 y 11 representan aspectos de dianas de autoenfoque segun los ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion.
Las figuras 12A y 12B representan aspectos de dianas de autoenfoque segun los ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion.
Las figuras 13A, 13B, y 13C representan aspectos de sensores de temperatura de la celula de flujo segun los ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion. La figura 13D representa aspectos de las tecnicas de eliminacion de burbujas de la celula de flujo segun los ejemplos, no siendo parte de la invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion.
Descripcion detallada de la invencion
La presente divulgacion se refiere a aparatos, sistemas, composiciones y metodos para analizar una muestra que contiene particulas. Las realizaciones que se refieren a composiciones no son parte de la invencion reivindicada por la presente. En una realizacion, la invencion se refiere a un sistema de obtencion de imagenes de particulas automatizado que comprende un analizador que puede ser, por ejemplo, un analizador visual. En algunas realizaciones, el analizador visual puede comprender ademas un procesador para facilitar el analisis automatizado de las imagenes.
Segun esta divulgacion, se proporciona un sistema que comprende un analizador visual para obtener imagenes de una muestra que comprende particulas suspendidas en un liquido. El sistema puede ser util, por ejemplo, en la caracterizacion de particulas en fluidos biologicos, tales como deteccion y cuantificacion de eritrocitos, reticulocitos, globulos rojos nucleados, plaquetas y globulos blancos, incluyendo recuento diferencial, categorizacion y subcategorizacion y analisis de globulos blancos. Tambien se contemplan otros usos similares tales como caracterizacion de celulas sanguineas de otros fluidos.
La discriminacion de celulas sanguineas en una muestra de sangre es una aplicacion a modo de ejemplo para la que la materia es particularmente adecuada. La muestra se prepara mediante tecnicas automatizadas y se presenta a un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica como una corriente de muestra en forma de cinta delgada de la que se van a obtener imagenes periodicamente mientras que la corriente de muestra en forma de cinta fluye a traves de un campo de vision. Las imagenes de las particulas (tales como celulas sanguineas) pueden distinguirse entre si, categorizarse, subcategorizarse y contarse, usando tecnicas de procesamiento programado de datos de imagenes de pixeles, o bien exclusivamente de manera automatica o bien con asistencia humana limitada, para identificar y contar celulas o particulas. Ademas de las imagenes celulares, que pueden almacenarse y hacerse disponibles en el caso de caracteristicas de particulas inusuales o criticas, los datos de salida incluyen un recuento de las apariciones de cada categoria y/o subcategoria particular de celula o particula distinguida en las imagenes de muestra registradas.
Los recuentos de las diferentes particulas encontradas en cada imagen pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo, usarse para acumular razones precisas y estadisticamente significativas de celulas de cada categoria y/o subcategoria distinguida en la muestra como un todo. La muestra usada para discriminacion visual puede diluirse, pero las proporciones de celulas en cada categoria y/o subcategoria se representan en la muestra diluida, particularmente despues de que se hayan procesado varias imagenes.
El aparato y metodos dados a conocer en el presente documento son utiles en la discriminacion y cuantificacion de celulas en muestras basadas en distinciones visuales. La muestra puede ser un muestra biologica, por ejemplo, una muestra de fluido corporal que comprende globulos blancos, incluyendo sin limitacion, sangre, suero, medula osea, liquido de lavado, derrames, exudados, liquido cefalorraquideo, liquido pleural, liquido peritoneal y liquido amniotico. En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra de tejido solido, por ejemplo, una muestra de biopsia que se ha tratado para producir una suspension celular. La muestra tambien puede ser una suspension obtenida del tratamiento de una muestra fecal. Una muestra tambien puede ser una muestra de laboratorio o de linea de produccion que comprende particulas, tales como una muestra de cultivo celular. El termino muestra puede usarse para referirse a una muestra obtenida de un paciente o laboratorio o cualquier fraccion, porcion o alicuota de la misma. La muestra puede diluirse, dividirse en porciones, o tenirse en algunos procesos.
En un aspecto, los sistemas y metodos de esta divulgacion proporcionan imagenes de sorprendentemente alta calidad de celulas en un flujo. En un aspecto, el analizador visual puede usarse en metodos de esta divulgacion para proporcionar recuento diferencial automatizado de WBC basado en imagenes. En determinadas realizaciones, los metodos de esta divulgacion se refieren a la identificacion automatizada de distinciones visuales, incluyendo caracteristicas y/o anomalias morfologicas para determinar, diagnosticar, pronosticar, predecir y/o respaldar un diagnostico de si un sujeto esta sano o tiene una enfermedad, estado, anomalia y/o infeccion y/o responde o no al tratamiento. El sistema puede comprender ademas un contador de particulas en algunas realizaciones. Las aplicaciones incluyen categorizar y/o subcategorizar, y contar celulas en una muestra de fluido, tal como una muestra de sangre. Tambien se contemplan otros usos similares para contar tipos de particulas y/o particulas adicionales en otras muestras de fluido. El sistema, las composiciones y los metodos de esta invencion pueden usarse para categorizacion y subcategorizacion en tiempo real y visualizacion de imagenes usando cualquier algoritmo de reconocimiento de particulas automatizado adecuado. Las imagenes capturadas para cada muestra pueden almacenarse para visualizarse en una fecha posterior.
En otro aspecto, el aparato, las composiciones y los metodos de esta invencion proporcionan sorprendentemente categorizacion y subcategorizacion mas precisa de celulas basadas en imagenes y marcaje que reduce la tasa de revision manual en comparacion con la tasa de revision manual cuando se usan analizadores automatizados actuales. Los sistemas, las composiciones y los metodos reducen la tasa de revision manual y permiten que la revision manual se realice en el instrumento. Ademas, los sistemas, las composiciones y los metodos de esta divulgacion tambien reducen el porcentaje de muestras marcadas durante el analisis automatizado como que requieren revision manual.
La presente divulgacion se refiere ademas a sistemas, metodos y composiciones para combinar un contador de recuento de celulas sanguineas completo (CBC) con un analizador, tal como un analizador visual, con el fin de obtener un CBC y un recuento diferencial de globulos blancos expandidos basado en imagenes y un recuento de plaquetas expandidas basado en imagenes, extendiendo de ese modo el rango de deteccion eficaz para contar plaquetas.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un aparato y un metodo para analizar una muestra que contiene particulas, por ejemplo, celulas sanguineas. Segun esta divulgacion, se proporciona un analizador visual para obtener imagenes de una muestra que comprende particulas suspendidas en un liquido. En algunos ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion, el analizador visual comprende una celula de flujo y un componente de autoenfoque, en el que una muestra de liquido que contiene particulas de interes se hace fluir a traves de una celula de flujo que tiene una ventana de observacion mediante la cual una camara acoplada a una lente objetivo captura imagenes digitales de particulas. La celula de flujo se acopla a una fuente de fluido de muestra, tal como una muestra de sangre diluida y/o tratada u otra muestra de fluido corporal tal como se describe en el presente documento, y a una fuente de un fluido envolvente transparente, o liquido de alineacion de particulas y/u organulos intracelulares (PIOAL).
En un ejemplo, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante util para entender la presente invencion, el aparato tambien comprende un contador de particulas que tiene al menos un rango de deteccion, asi como un analizador, y un procesador. El analizador y el procesador estan configurados para proporcionar informacion adicional para corregir los errores de recuento, categorizacion y subcategorizacion asociados con el contador de particulas, y determinan ademas un recuento de particulas preciso o concentracion de diferentes categorias y/o subcategorias de particulas en la muestra.
La presente divulgacion proporciona metodos y composiciones utiles para el alineamiento de particulas y/u organulos intracelulares en la realizacion de analisis de muestras basado en imagenes. En algunos ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion, esta divulgacion se refiere a metodos y composiciones para un sistema de recuento y obtencion de imagenes combinado con la capacidad de realizar un recuento de celulas sanguineas completo (CBC) y un recuento diferencial de globulos blancos expandido basado en imagenes (WBC) capaz de identificar y contar tipo celulares, tales como WBC, RBC y/o plaquetas, incluyendo, por ejemplo, neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos, basofilos, reticulocitos, RBC nucleados, blastos, promielocitos, mielocitos o metamielocitos, y para proporcionar informacion basada en imagenes para morfologias y recuentos de WBC, morfologias y recuentos de globulos rojos (RBC) y morfologias y recuentos de plaquetas (PLT).
En otros ejemplos, no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante utiles para entender la presente invencion, esta divulgacion se refiere a un PlOAL que puede usarse en analisis de particulas basado en imagenes tal como se describe en el presente documento. Se usa recuento de categoria y/o subcategoria celular en muestras de sangre en esta divulgacion como ejemplos no limitativos del tipo de muestras que puede analizarse. En algunas realizaciones, las celulas presentes en muestras tambien pueden incluir celulas bacterianas o fungicas asi como globulos blancos, globulos rojos y/o plaquetas. En algunas realizaciones, pueden analizarse suspensiones de particulas obtenidas de tejidos o aspirados.
La discriminacion de celulas sanguineas en una muestra de sangre es una aplicacion a modo de ejemplo para la que la materia es particularmente adecuada. La muestra se prepara mediante tecnicas automatizadas y se presenta a un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica como una corriente de muestra en forma de cinta de la que van a obtenerse imagenes periodicamente mientras la muestra fluye a traves de un campo de vision. Las imagenes de las particulas (tales como celulas sanguineas) pueden distinguirse entre si, categorizarse, subcategorizarse y/o contarse, usando tecnicas de procesamiento programado de datos de imagenes de pixeles, o bien de manera exclusivamente automatica o bien con asistencia humana limitada, para identificar y contar celulas o particulas. Ademas de las imagenes celulares, que pueden almacenarse y hacerse disponibles en el caso de caracteristicas inusuales o criticas, los datos de salida incluyen un recuento de las apariciones de cada categoria y/o subcategoria particular de celula o particula distinguida en las imagenes de muestra registradas. Los recuentos de las diferentes particulas encontradas en cada imagen pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo usarse para acumular razones proporcionales precisas y estadisticamente significativas, o funciones de las mismas de celulas de cada categoria y/o subcategoria distinguida en la muestra como un todo. La muestra usada para discriminacion visual tambien puede estar muy diluida, pero las proporciones de celulas en cada categoria y/o subcategoria se representan en la distribucion para la muestra diluida, particularmente despues de que se hayan procesado varias imagenes.
En algunos aspectos, las muestras se presentan, se les obtienen imagenes y se analizan de manera automatizada. En el caso de muestras de sangre, la muestra puede diluirse sustancialmente con un diluyente o disolucion salina adecuados, que reduce el grado al que la vision de algunas celulas puede estar escondida por otras celulas en una muestra no diluida o menos diluida. Las celulas pueden tratarse con agentes que potencian el contraste de algunos aspectos celulares, por ejemplo usando agentes de permeabilizacion para hacer las membranas celulares permeables, y que los tintes histologicos se adhieran y para revelar caracteristicas, tales como granulos y el nucleo. En algunas realizaciones, puede ser deseable tenir una alicuota de la muestra para contar y caracterizar particulas que incluyen reticulocitos, globulos rojos nucleados y plaquetas, y para caracterizacion y analisis diferencial de globulos blancos. En otras realizaciones, las muestras que contienen globulos rojos pueden diluirse antes de la introduccion en la celula de flujo y obtencion de imagenes.
Los detalles de los aparatos y metodos de preparacion de muestra para dilucion, permeabilizacion y tincion histologica de muestras, se logran generalmente usando valvulas y bombas de precision operadas por uno o mas controladores programables, y no son fundamentales para esta divulgacion. Pueden encontrarse ejemplos en patentes asignadas a International Remote Imaging Systems, Inc., tales como el documento US 7.319.907, que se refiere a controladores programables. Asimismo, pueden encontrarse tecnicas para distinguir entre determinadas categorias y/o subcategorias celulares por sus atributos tales como tamano relativo y color en el documento US 5.436.978 en relacion con globulos blancos.
Para facilitar la capacidad, velocidad y efectividad por las que particulas tales como celulas se categorizan y/o subcategorizan, resulta ventajoso proporcionar imagenes nitidas de alta calidad de las celulas sanguineas para analisis automatizado mediante el sistema de procesamiento de datos. Segun la presente divulgacion, una corriente de muestra preparada se dispone en una cinta delgada que tiene una posicion estable entre paredes opuestas de una celula de flujo. La colocacion de la corriente de muestra y su aplanamiento para dar una forma de cinta delgada pueden lograrse mediante flujo entre capas de un PlOAL introducido en la celula de flujo que difiere en viscosidad del fluido de muestra y se hace fluir a traves de un canal de flujo simetrico.
El PlOAL tiene una viscosidad y densidad adecuadas, y las velocidades de flujo en el punto de introduccion en la celula de flujo de la muestra son tales que el fluido de muestra se aplana para dar una cinta delgada. La corriente de muestra en forma de cinta se transporta con el PlOAL, para pasar en frente de un puerto de visualizacion en el que estan dispuestas una lente objetivo y una fuente de luz para permitir visualizar la corriente de muestra en forma de cinta. El fluido de muestra se introduce, por ejemplo, inyectado en un punto en el que la trayectoria de flujo del PlOAL se estrecha de manera simetrica. Como resultado, la corriente de fluido de muestra se aplana y se estira para dar una cinta delgada. Puede usarse un PlOAL como fluido envolvente con cualquier analizador visual de esta divulgacion. En una realizacion, el PlOAL puede introducirse en un extremo de la celula de flujo para transportar el fluido de muestra hacia la descarga.
La dimension de la corriente de muestra en forma de cinta en la zona de visualizacion esta afectada por adelgazamiento geometrico de la trayectoria de flujo de PIOAL y velocidad lineal diferencial del fluido de muestra y PIOAL que da como resultado adelgazamiento y estiramiento de la corriente de muestra en forma de cinta. La velocidad lineal diferencial inicial de la muestra con respecto a PIOAL puede oscilar entre 0,5:1 y 5:1. La seccion transversal de la trayectoria de flujo de PIOAL puede adelgazarse reduciendo la profundidad en un factor de aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 115:1, 125:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 o 200:1. En una realizacion, el adelgazamiento geometrico es de 40:1. En una realizacion, el adelgazamiento geometrico es de 30:1. Factores tenidos en cuenta son tiempo de transito a traves de la celula de flujo, tasa deseada de rendimiento de muestra, lograr un grosor de corriente de muestra en forma de cinta comparable con el tamano de particula, obtener un alineamiento de particulas y organulos, lograr contenido de enfoque de particulas, equilibrar la presion, flujo y viscosidad dentro de limites operativos, optimizar el grosor de corriente de muestra en forma de cinta, obtener una velocidad lineal deseada, consideraciones de fabricacion y volumenes de muestra y PIOAL requeridos.
La longitud y el volumen de la canula y el aplanamiento de la seccion transversal pueden seleccionarse para reducir el periodo de inestabilidad de flujo de muestra, aumentando de ese modo el rendimiento. En algunas realizaciones, el periodo de inestabilidad de flujo puede ser inferior a aproximadamente 3, 2,75, 2,5, 2,25, 2, 1,75, 1,5 1,25, o inferior a aproximadamente 1 segundo. Un volumen de canula mas pequeno tambien puede reducir el tiempo y el volumen del diluyente necesario para limpiar la canula entre ejecuciones de muestra. En algunas realizaciones, el tiempo de transito a traves de la celula de flujo es de 1, 2, 3 o 4 segundos, o cualquier intervalo entre dos de esos tiempos cualesquiera. En algunas realizaciones, el tiempo de transito puede ser inferior a 4, 3 o 2 segundos.
Las viscosidades y las velocidades de flujo del fluido de muestra y el PIOAL y el contorno de la celula de flujo estan dispuestos de modo que el flujo de PIOAL aplana y estira el flujo de muestra para dar una cinta plana de manera constante a traves de la zona de visualizacion en una ubicacion fiable. La corriente de fluido de muestra puede comprimirse hasta de aproximadamente 2 a 3 pm en grosor de flujo de fluido. Varios tipos de celulas sanguineas tienen diametros mayores que el grosor de corriente. Fuerzas de corte en la direccion paralela a la direccion del flujo provocan un aumento de una proyeccion de imagen de las particulas en condiciones de obtencion de imagenes en el plano focal del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica y/o provocan que las estructuras intraparticulares, por ejemplo, estructuras, organulos o lobulos intracelulares se posicionen, se reposicionen y se posicionen mejor para ser sustancialmente paralelos a la direccion de flujo. La profundidad de campo del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica es de hasta 7 pm, por ejemplo, 1 -4 pm.
La seccion transversal del PIOAL, con la corriente de muestra en forma de cinta transportada, es constante a traves de una zona de visualizacion frente a un puerto de visualizacion a traves del cual se dirige la lente objetivo. La lente objetivo puede ser el componente de objetivo de un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica o el dispositivo de captura de imagenes digital. La corriente de muestra en forma de cinta sigue una trayectoria a lo largo de la zona de visualizacion en una posicion conocida y repetible dentro de la celula de flujo, por ejemplo, a una distancia conocida y repetible de dos paredes de la celula de flujo, que se descarga a aguas abajo.
La informacion optica de las particulas en la muestra se detecta mediante una seccion de deteccion en el analizador, cuando la corriente de muestra en forma de cinta se transporta a traves de la zona de visualizacion delante del puerto de visualizacion, generando de ese modo datos a partir de las particulas/celulas contenidas en la muestra. El uso de este analizador permite la captura, el procesamiento, la categorizacion y la subcategorizacion y el recuento de celulas y/o particulas contenidas en muestras. El liquido PIOAL puede prepararse mediante la adicion de agente de modificacion de la viscosidad, agente de tampon, agente de ajuste del pH, agente antimicrobiano, modificador de la fuerza ionica, tensioactivo y/o un agente quelante. Los componentes y/o caracteristicas funcionales a modo de ejemplo del analizador en la presente divulgacion pueden incluir, por ejemplo, la capacidad de adquirir y/o procesar datos a partir de analisis de imagenes, procesamiento de tincion de muestras, procesamiento de imagenes y/o identificacion de imagenes de particulas, recuento, y/o categorizacion y subcategorizacion.
En una realizacion, esta divulgacion se basa en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que la adicion de una cantidad adecuada de un agente de viscosidad en el PIOAL mejora significativamente la alineacion de particulas/celulas en una celula de flujo, lo que conduce a un mayor porcentaje de celulas enfocadas, o componentes celulares, e imagenes de mayor calidad de celulas y/o particulas en flujo. La adicion del agente de viscosidad aumenta las fuerzas de corte en celulas como RBC, lo que mejora la alineacion de las celulas en un plano sustancialmente paralelo a la direccion de flujo, lo que da como resultado optimizacion de imagenes. Esto tambien da como resultado colocacion, recolocacion y/o colocacion mejor de estructuras intraparticulares tales como estructuras, organulos o lobulos intracelulares sustancialmente paralelos a la direccion de flujo, lo que da como resultado optimizacion de imagenes. El agente de viscosidad tambien reduce la desalineacion de celulas, generalmente, pero sin limitarse a celulas que son mas pequenas en diametro que la corriente de flujo.
La alineacion de celulas que son mas pequenas en diametro que la corriente de flujo, por ejemplo, pueden obtenerse globulos rojos, por ejemplo, aumentando la viscosidad del PIOAL, o aumentado la razon de velocidad de flujo. Esto da como resultado la alineacion de los RBC paralela a la direccion del flujo y al plano focal FP (por ejemplo, tal como se representa en la figura 4K). En algunas realizaciones, se logra una reduccion en la desalineacion de RBC y/o aumento en la alineacion de RBC aumentando la viscosidad del PIOAL.
El grosor de la corriente de muestra en forma de cinta puede verse afectado por las viscosidades relativas y velocidades de flujo del fluido de muestra y el PIOAL. La fuente de la muestra y/o la fuente del PIOAL, por ejemplo que comprende bombas de desplazamiento de precision, pueden configurarse para proporcionar la muestra y/o el PlOAL a velocidades de flujo controlables para optimizar las dimensiones de la corriente de muestra en forma de cinta, concretamente como una cinta delgada al menos tan ancha como el campo de vision del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica o el dispositivo de captura de imagenes digital.
La seccion transversal del PIOAL, con la corriente de muestra en forma de cinta que se transporta, es constante a traves de una zona de visualizacion delante de un puerto de visualizacion a traves del cual el dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica se dirige. La corriente de muestra en forma de cinta sigue una trayectoria a lo largo de la zona de visualizacion a una distancia conocida y repetible de cualquiera de las paredes delantera y trasera de la celula de flujo, que se descarga aguas abajo de esa.
El termino dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica puede incluir dispositivos que pueden obtener imagenes de particulas con suficientes distinciones visuales para diferenciar caracteristicas y/o cambios morfologicos. Los dispositivos de obtencion de imagenes de alta resolucion optica a modo de ejemplo pueden incluir dispositivos con una resolucion optica de 1 um o menos, incluyendo, por ejemplo, de 0,4 a 0,5 um, tal como por ejemplo, 0,46 um.
En algunas realizaciones, las imagenes obtenidas en cualquiera de las composiciones y/o metodos de esta invencion pueden ser imagenes digitalizadas. En algunas realizaciones, las imagenes obtenidas son imagenes de microscopia. En determinadas realizaciones, las imagenes pueden obtenerse manualmente. En otras realizaciones, al menos parte del procedimiento para obtener las imagenes esta automatizado. En algunas realizaciones, las imagenes pueden obtenerse usando un analizador visual que comprende una celula de flujo, un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica o el dispositivo de captura de imagenes digital, opcionalmente con una caracteristica de autoenfoque.
En una realizacion, las imagenes proporcionan informacion relacionada con los componentes citosolicos, de nucleo celular y/o nucleares de la celula. En una realizacion, las imagenes proporcionan informacion relacionada con el componente granular y/u otras caracteristicas morfologicas de la celula. En una realizacion, las imagenes proporcionan informacion relacionada con componentes citosolicos, nucleares y/o granulares de la celula. Las imagenes y/o caracteristicas granulares y/o nucleares son determinantes para la categorizacion y subcategorizacion celular tanto independientemente o en combinacion entre si.
En un aspecto de los metodos de esta invencion, las celulas puestas en contacto con una composicion de agente de contraste de particulas y/o de las que se han obtenido imagenes son globulos rojos nucleados. En aun otro aspecto, los metodos de esta invencion se refieren a un metodo para realizar categorizacion y subcategorizacion de globulos rojos basados en imagenes que comprende: a) obtener imagenes de una porcion de los globulos rojos; y b) determinar la morfologia de los globulos rojos de los que se han obtenido imagenes. Tal como se usa en el presente documento, los globulos rojos (RBC) pueden incluir, por ejemplo, celulas infectadas por malaria, globulos rojos nucleados, reticulocitos, y/o globulos rojos normales u anomalos. En algunas realizaciones, la obtencion de imagenes se realiza usando el aparato de esta divulgacion tal como un aparato que comprende un contador de particulas, un analizador visual y un procesador.
Tal como se usa en el presente documento, un recuento de celulas sanguineas completo (CBC) a modo de ejemplo puede incluir un panel de prueba solicitado normalmente por un medico u otro profesional medico que proporciona informacion sobre las particulas y/o celulas en una muestra de sangre del paciente. Las celulas a modo de ejemplo que circulan en el torrente sanguineo pueden dividirse generalmente en tres tipos: incluyendo pero sin limitarse, por ejemplo, globulos blancos (por ejemplo, leucocitos), globulos rojos (por ejemplo, eritrocitos) y plaquetas (por ejemplo, trombocitos).
Tal como se usa en el presente documento, recuentos anomalamente altos o bajos pueden indicar la presencia de enfermedad, trastorno y/o estado. Por tanto, un CBC es uno de los analisis de sangre comunmente realizados en medicina, ya que puede proporcionar una vision general del estado de salud general de un paciente. Por consiguiente, un CBC se realiza rutinariamente durante examenes fisicos anuales.
Tal como se usa en el presente documento, normalmente un flebotomista recoge la muestra de sangre del sujeto, la sangre se extrae generalmente a un tubo de ensayo que contiene normalmente un anticoagulante (por ejemplo, EDTA, a veces citrato) para evitar que se coagule. La muestra se transporta entonces a un laboratorio. A veces la muestra se extra de un pinchazo en el dedo usando una pipeta Pasteur para procesamiento inmediato mediante un contador automatico. En una realizacion, la imagen de particulas se adquiere mientras que la particula se envuelve en un fluido envolvente o PIOAL. En determinadas realizaciones, la muestra de sangre puede visualizarse sobre un portaobjetos preparado con una muestra de la sangre del paciente bajo un microscopio (una pelicula de sangre, o frotis periferico). En determinadas realizaciones, el recuento de celulas sanguineas completo se realiza mediante un analizador automatizado.
Tal como se usa en el presente documento, en general, los analizadores de sangre pueden aspirar una cantidad muy pequena de la muestra a traves de un tubo estrecho. Los sensores pueden detectar el recuento y/o el numero de celulas que pasan a traves del tubo, y pueden identificar el tipo de celula. Los sensores a modo de ejemplo pueden incluir detectores de luz (por ejemplo, visible, UV o IR) y/o impedancia electrica. Los parametros de deteccion a modo de ejemplo pueden incluir tamano, volumen y/o caracteristicas celulares. En determinadas realizaciones, los sensores pueden detectar luz visible y no visible en un espectro de longitud de onda que oscila entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 10000 nm. En determinadas realizaciones, los sensores pueden detectar una longitud de onda de entre 380 nm y aproximadamente 760 nm,
Tal como se usa en el presente documento, los datos/parametros de un recuento sanguineo puede incluir, por ejemplo, globulos rojos totales; hemoglobina, la cantidad de hemoglobina en la sangre; hematocrito o volumen de eritrocitos (PCV); volumen corpuscular medio (MCV), el volumen promedio de los globulos rojos (la anemia se clasifica como microcitica o macrocitica basandose en si este valor esta por encima o por debajo del intervalo normal esperado. Otros estados que afectan al MCV incluyen talasemia, reticulocitosis y alcoholismo); hemoglobina corpuscular media (MCH), la cantidad promedio de hemoglobina por globulo rojo, en picogramos; concentracion de hemoglobina corpuscular media (MCHC), la concentracion promedio de hemoglobina en las celulas; amplitud de distribucion de globulos rojos (RDW), la variacion en el volumen celular de la poblacion de RBC; globulos blancos totales; granulocitos neutrofilos (puede indicar infeccion bacteriana, normalmente aumentada en infecciones virales agudas). Debido al aspecto segmentado del nucleo, los neutrofilos a veces se denominan “segs”. El nucleo de neutrofilos menos maduros no esta segmentado, pero tiene una banda o forma alargada. Los neutrofilos menos maduros, aquellos que se han liberado recientemente de la medula osea al torrente sanguineo, se conocen como “bandas”. Otros datos/parametros para un recuento sanguineo tambien pueden incluir, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, aumentados con algunas infecciones virales tales como fiebre glandular, y en leucemia linfocitica cronica (LLC), o disminuidos por infeccion por VIH); monocitos (pueden aumentarse en infeccion bacteriana, tuberculosis, malaria, fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, leucemia monocitica, colitis ulcerosa cronica y enteritis regional; granulocitos eosinofilos (por ejemplo, aumentados en infecciones parasitarias, asma o reaccion alergica); granulocitos basofilos (por ejemplo, aumentados en estados relacionados con la medula osea tales como leucemia o linfoma).
Tal como se usa en el presente documento, los datos/parametros de un recuento sanguineo tambien pueden incluir, por ejemplo, datos asociados con plaquetas, incluyendo numeros de plaquetas, informacion sobre su tamano y el intervalo de tamanos en la sangre; volumen plaquetario medio (MPV), una medicion del tamano promedio de plaquetas.
En otro aspecto de los metodos de esta invencion, las celulas puestas en contacto con una composicion de agente de contraste de particulas y/o de las que se han obtenido imagenes son celulas anomalas, tales como celulas infectadas por malaria, linfocitos atipicos. En algunos aspectos de esta invencion, las celulas son celulas anomalas que pueden usarse para identificar, predecir, diagnosticar, pronosticar o respaldar un diagnostico de un estado, enfermedad, infeccion y/o sindrome.
En otro aspecto de los metodos de esta invencion, las celulas son plaquetas.
A menos que se indique expresamente lo contrario, las referencias a “particula” o “particulas” realizadas en esta divulgacion, se entendera que abarcan cualquier objeto diferenciado o formado disperso en un fluido. Tal como se usa en el presente documento, “particula” puede incluir cualquier componente medible y detectable (por ejemplo, mediante imagen y/u otros parametros medibles) en fluidos biologicos. Las particulas son de cualquier material, cualquier forma y cualquier tamano. En determinadas realizaciones, las particulas pueden comprender celulas. Los ejemplos de particulas incluyen pero no se limitan a celulas, incluyendo celulas sanguineas, celulas fetales, epiteliales, celulas madre, celulas tumorales, o bacterias, parasitos, o fragmentos de cualquiera de lo anterior u otros fragmentos en un fluido biologico. Las celulas sanguineas puede ser cualquier celula sanguinea, incluyendo cualquier celula normal o anomala, madura o inmadura que existe potencialmente en un fluido biologico, por ejemplo, globulos rojos (RBC), globulos blancos (WBC), plaquetas (PLT) y otras celulas. Los miembros tambien incluyen celulas inmaduras o anomalas. Los WBC inmaduros pueden incluir metamielocitos, mielocitos, promielocitos y blastos. Ademas de RBC maduros, los miembros de RBC pueden incluir RBC nucleados (NRBC) y reticulocitos. Las PLT pueden incluir PLT “gigantes” y grupos de PLT. Celulas sanguineas y elementos formados se describen adicionalmente en otra parte en esta divulgacion.
Las particulas a modo de ejemplo pueden incluir elementos formados en muestras de fluidos biologicos, incluyendo por ejemplo, particulas esfericas y no esfericas. En determinadas realizaciones, las particulas pueden comprender componentes no esfericos. La proyeccion de imagenes de componentes no esfericos puede maximizarse en el plano focal del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica. En determinadas realizaciones, las particulas no esfericas se alinean en el plano focal del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica (alineado en un plano sustancialmente paralelo a la direccion del flujo). En algunas realizaciones, se cuentan y se analizan plaquetas, reticulocitos, RBC nucleados y WBC, incluyendo neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos, basofilos, e WBC inmaduros incluyendo blastos, promielocitos, mielocitos, o metamielocitos como particulas.
Tal como se usa en el presente documento, los parametros de particulas detectables y medibles pueden incluir, por ejemplo, indices visuales y/o no basados en imagenes de tamano, forma, simetria, contorno y/u otras caracteristicas.
La muestra puede ser una muestra biologica aislada y/o preparada, incluyendo por ejemplo, una muestra de fluido corporal, sangre, suero, liquido cefalorraquideo, liquido pleural, liquido peritoneal, saliva, semen, lagrimas, sudor, sangre, liquido amniotico, liquido de lavado, aspirado de medula osea, derrames, exudados, u otra muestra obtenida de un sujeto (por ejemplo, muestra de biopsia que se ha tratado para producir una suspension celular, o una muestra de laboratorio o de linea de produccion que comprende particulas). En algunas realizaciones, la muestra puede ser una muestra de tejido solido, por ejemplo, una muestra de biopsia que se ha tratado para producir una suspension celular. La muestra tambien puede ser una suspension obtenida del tratamiento de una muestra fecal. Una muestra tambien puede ser una muestra de laboratorio, quimica, industrial o de linea de produccion que comprende particulas, tales como una muestra de cultivo celular. El termino muestra puede usarse para referirse a una muestra obtenida de un paciente o laboratorio o cualquier fraccion, porcion o alicuota de la misma. La muestra puede diluirse, dividirse en porciones, o tratarse con un agente de contraste en algunos procesos.
Los metodos dados a conocer en el presente documento pueden aplicarse a muestras de una amplia variedad de organismos, incluyendo mamiferos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos), caballos, vacas u otro ganado, perros, gatos u otros mamiferos mantenidos como mascotas, ratas, ratones, u otros animales de laboratorio; aves, por ejemplo, pollos; reptiles, por ejemplo, caimanes; peces, por ejemplo, salmon y otras especies de piscifactoria; y anfibios.
Las muestras pueden obtenerse mediante cualquier metodo convencional, por ejemplo, excrecion, extraccion, recogida, aspirado, o una biopsia. La muestra puede ser de un sujeto que se considera que es sano, por ejemplo, una muestra recogida como parte de un examen fisico de rutina. La muestra tambien puede ser de un sujeto que padece, que corre el riesgo o que se sospecha que padece un trastorno. El trastorno puede ser el resultado de una enfermedad, una anomalia genetica, una infeccion, una lesion u otras causas desconocidas. Alternativamente o ademas, los metodos pueden ser utiles para monitorizar un sujeto durante el transcurso de tratamiento para un trastorno. Cuando existen signos de no respuesta a tratamiento y/o terapia, un medico puede escoger un agente alternativo o complementario. Segun el estado del sujeto y el trastorno particular, si lo hay, pueden recogerse muestras una vez (o dos veces, tres veces, etc.) al dia, a la semana, al mes o al ano.
Las particulas pueden variar segun la muestra. Las particulas pueden ser celulas biologicas, por ejemplo, celulas sanguineas, celulas fetales, celulas madre, celulas tumorales o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, las particulas pueden ser un agente infeccioso, por ejemplo, un virus o bacteria.
La referencia a “celulas sanguineas” realizada en esta divulgacion se entendera que abarca cualquier celula normal o anomala, madura o inmadura que existe potencialmente en un fluido biologico, por ejemplo, globulos rojos (RBC), globulos blancos (WBC), plaquetas (PLT) y otras celulas. En general, RBC, PLT y WBC normales tienen un diametro de particula en el intervalo de 6-8 pm, 2-3 pm y 8-15 pm, respectivamente. Estan presentes RBC, PLT y WBC normales en muestras de sangre completa de pacientes normales en un intervalo de concentracion aproximado de 3,9-5,7 x 1012 celulas/l, 1,4-4,5 x 1011 celulas/l, 3,5-11 x 109 celulas/l, respectivamente. Vease, Barbara J. Bain, Blood Cells, A Practical Guide, 4a ed., Blackwell Publishing, 2007, 34-36.
La referencia a un “elemento formado” se entendera que abarca elementos no fluidos presentes en muestras de fluidos biologicos. Los elementos formados incluyen, por ejemplo, clases de celulas sanguineas basadas en clasificacion cientifica o funcion fisiologica incluyendo eritrocitos (RBC), leucocitos (WBC) y plaquetas (PLT), grupos de WBC, subclases de leucocitos, que incluyen linfocitos maduros, y leucocitos inmaduros tales como monocitos, neutrofilos, eosinofilos, basofilos. Los “elementos formados” para su uso en el presente documento tambien incluiran particulas tales como microorganismos, bacterias, hongos, parasitos, o fragmentos de los mismos u otros fragmentos celulares. Los miembros principales de WBC incluyen pero no se limitan a neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos y basofilos. Los miembros tambien incluyen celulas inmaduras o anomalas. Por ejemplo, los WBC inmaduros pueden incluir metamielocitos, mielocitos, promielocitos. Ademas de RBC maduros, los miembros de RBC pueden incluir RBC nucleados (NRBC) y reticulocitos. Las PLT pueden incluir PLT normales, y PLT “gigantes” cuyo tamano es proximo al de WBC normales. La referencia a un “miembro” o “miembros” de una categoria y/o subcategoria de particulas realizada en esta divulgacion se entendera que abarca particulas individuales dentro de una categoria o subcategoria de particulas.
A menos que se indique expresamente lo contrario, la referencia a una “categoria” de particulas realizada en esta divulgacion, se entendera que abarca un grupo de particulas detectado usando al menos un criterio de deteccion medido, detectado o derivado tal como tamano, forma, textura, o color. En algunas realizaciones, los miembros de al menos una categoria y/o subcategoria de particulas contadas por el aparato de esta divulgacion seran el mismo tipo de elemento formado.
Tales particulas pueden detectarse en un “canal.” La referencia a “canal” realizada en esta divulgacion, se entendera que abarca una porcion del contador de particulas que comprende un detector acoplado a una fuente de senal, proporcionando una salida que varia con mayor o menor deteccion de particulas que cumplen al menos un criterio de deteccion de canal. Por ejemplo, un criterio de deteccion de canal puede basarse en el tamano o volumen de las particulas. En algunas realizaciones, el numero de canales en un contador de particulas es uno. En algunas otras realizaciones, el numero de los canales en un contador de particulas es dos o mas.
Una categoria y/o subcategoria de particulas detectadas en un canal de contador de particulas puede comprender diferentes clases y subclases de particulas, y miembros agrupados de particulas en dos o mas subclases. La referencia a una “categoria” de particulas realizada en esta divulgacion se entendera que abarca un agrupamiento de particulas correspondiente a criterios medidos, detectados o derivados tales como tamano, forma, textura o color. En algunas realizaciones, los miembros de al menos una categoria y/o subcategoria de particulas contadas por el aparato de esta divulgacion seran el mismo tipo de elemento formado.
Tal como se usa en el presente documento, el termino dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica puede incluir dispositivos que pueden obtener imagenes de particulas con suficientes distinciones visuales para diferenciar caracteristicas y/o cambios morfologicos. Los dispositivos de obtencion de imagenes de alta resolucion optica a modo de ejemplo pueden incluir dispositivos con una resolucion optica de 1 um o menos, incluyendo, por ejemplo, de 0,4 a 0,5 um, tal como por ejemplo, 0,46 um.
Tal como se usa en el presente documento, las composiciones de agente de contraste de particulas pueden adaptarse para su uso en combinacion con un liquido de alineacion de particulas y/u organulos intracelulares (PIOAL) en un analizador visual para analizar particulas en una muestra de un sujeto. El PIOAL a modo de ejemplo es util, como ejemplo, en metodos para reconocimiento automatizado de diferentes tipos de particulas en una muestra de un sujeto.
En otro aspecto, las celulas pueden envolverse en PIOAL cuando se obtienen imagenes. En el presente documento se describen liquidos de alineacion de organulos intracelulares a modo de ejemplo adecuados.
Tal como se usa en el presente documento, “alineacion” puede caracterizarse en parte por la alineacion de particulas esfericas y/o no esfericas. Por ejemplo, particulas tales como particulas no esfericas pueden alinearse en un plano sustancialmente paralelo a la direccion del flujo. En determinadas realizaciones, la alineacion de las particulas no esfericas se caracteriza porque la orientacion de las particulas aumenta una proyeccion de imagen de las particulas no esfericas en condiciones de obtencion de imagenes en el plano focal del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica. Particulas tales como particulas esfericas pueden tener un aumento en la cantidad del contenido intraarticular enfocado de las particulas y celulas que es eficaz para generar distinciones visuales para la categorizacion y subcategorizacion de particulas. Las estructuras intraparticulares de particulas tales como particulas esfericas pueden posicionarse, reposicionarse y/o posicionarse mejor para ser sustancialmente paralelas a la direccion de flujo. Por ejemplo, tambien pueden posicionarse, reposicionarse y/o posicionarse mejor estructuras, organulos o lobulos intracelulares para ser sustancialmente paralelos a la direccion de flujo.
La referencia a una “clase” de particulas realizada en esta divulgacion se entendera que abarca un grupo de particulas basadas en clasificacion cientifica. Por ejemplo, existen tres clases principales de celulas sanguineas en una muestra de sangre completa, incluyendo RBC, WBC y PLT.
La referencia a un “miembro” o “miembros” de particulas realizada en esta divulgacion se entendera que abarca particulas en una categoria o subcategoria de particulas. Por ejemplo, cada categoria de celulas sanguineas puede dividirse adicionalmente en subcategorias o miembros. Los miembros principales de WBC incluyen pero no se limitan a neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos y basofilos. Los miembros tambien incluyen celulas inmaduras o anomalas. Por ejemplo, los WBC inmaduros pueden incluir metamielocitos, mielocitos y promielocitos. Ademas de RBC maduros, los miembros de RBC pueden incluir RBC nucleados (NRBC) y reticulocitos. Las PLT pueden incluir PLT normales, y PLT “gigantes” cuyo tamano es proximo al de WBC normales.
La referencia a “celulas inmaduras” se entendera que abarca celulas en una fase de desarrollo determinada, por ejemplo, dentro de la medula osea o justo despues de la liberacion de la medula osea pero antes del desarrollo completo en una celula madura.
La referencia a “celulas anomalas” se entendera que abarca celulas con caracteristicas morfologicas irregulares o celulas asociadas con una determinada enfermedad o estado, o irregularidades asociadas que pueden, en algunos casos, asociarse con determinadas enfermedades o estados. Los ejemplos de enfermedad determinada incluyen pero no se limitan a eritrocitosis, policitemia, anemia, eritroblastopenia, leucocitosis, leucopenia, linfocitosis, linfocitopenia, granulocitosis, granulocitopenia o agranulocitosis, neutrofilia, neutropenia, eosinofilia, eosinopenia, basofilia, basopenia, trombocitosis, trombocitopenia y pancitopenia. Una clase de celulas puede aumentar o disminuir en el torrente sangumeo. En algunos estados, existen celulas anomalas mucho mayores que globulos blancos normales a una pequena concentracion en una muestra de sangre. Variaciones en tamano, forma, color y/o estructuras intracelulares pueden asociarse con determinadas enfermedades o estados.
La referencia a “recuento” de partfculas o “recuento de partfculas” realizada en esta divulgacion se entendera que abarca los numeros de partfculas obtenidos de un canal de un contador de partfculas. La referencia a “concentracion” de una clase o un miembro de partfculas realizada en esta divulgacion se entendera que significa los numeros de las partfculas por unidad de volumen (por ejemplo, por litro) o por muestra de un volumen conocido. Por ejemplo, un contador de partfculas puede proporcionar recuentos o concentraciones u otra funcion basada en recuento para categonas de partfculas, mientras que un analizador visual puede proporcionar recuentos, concentraciones, razones u otros parametros basados en concentracion para cada categona o subcategona de partfculas.
La referencia a una “razon” elaborada en esta divulgacion se entendera que abarca cualquier razon cuantitativa y/o proporcional de dos categonas/subcategonas, clases o miembros de partfculas. Los ejemplos de una razon de este tipo incluyen pero no se limitan a una razon en concentracion, peso, y/o en numeros de partfculas. Normalmente, la razon se refiere a la fraccion numerica del recuento de una categona, clase o miembro a lo largo del recuento de otra categona, clase o miembro de este tipo. En algunas realizaciones, tambien pueden realizarse determinaciones usando recuentos ponderados o razones ponderadas y/o proporcionales.
Hematologia - sistema de analisis de particulas
Volviendo ahora a los dibujos, la figura 1 muestra esquematicamente una celula 22 de flujo a modo de ejemplo para transportar un fluido de muestra a traves de una zona 23 de visualizacion de un dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica en una configuracion para obtener imagenes de partfculas microscopicas en una corriente 32 de flujo de muestra usando procesamiento de imagenes digital. La celula 22 de flujo se acopla a una fuente 25 de fluido de muestra que puede haberse sometido a procesamiento, tal como contacto con una composicion de agente de contraste de partfculas y calentamiento. La celula 22 de flujo tambien se acopla a una o mas fuentes 27 de un lfquido de alineacion de partfculas y/u organulos intracelulares (PIOAL), tales como una disolucion de glicerol transparente que tiene una viscosidad que es mayor que la viscosidad del fluido de muestra. El fluido de muestra se inyecta a traves de una abertura aplanada en un extremo 28 distal de un tubo 29 de alimentacion de muestra, y en el interior de la celula 22 de flujo en un punto donde el flujo de PIOAL se ha establecido sustancialmente dando como resultado un flujo estable y laminar simetrico del PIOAL por encima y por debajo de (o en lados opuestos de) la corriente de muestra en forma de cinta. Las corrientes de muestra y PIOAL pueden suministrarse mediante bombas de medicion de precision que mueven el PIOAL con el fluido de muestra inyectado a lo largo de una trayectoria de flujo que se estrecha sustancialmente. El PIOAL envuelve y comprime el fluido de muestra en la zona 21 en donde la trayectoria de flujo se estrecha. Por tanto, la disminucion del grosor de la trayectoria de flujo en la zona 21 puede contribuir a un enfoque geometrico de la corriente 32 de muestra. La cinta 32 de fluido de muestra se envuelve y se transporta con el PIOAL aguas abajo de la zona 21 de estrechamiento, por delante o por el contrario, a traves de la zona 23 de visualizacion del dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica donde se recogen las imagenes, por ejemplo, usando un CCD 48. El procesador 18 puede recibir, como entrada, datos de pfxeles de CCD 48. La cinta de fluido de muestra fluye junto con el PIOAL a una descarga 33.
Tal como se muestra en este caso, la zona 21 de estrechamiento puede tener una porcion de trayectoria de flujo proximal 21a que tiene un grosor proximal PT y una porcion 21b de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor distal DT, de modo que el grosor distal DT es menor que el grosor proximal PT. El fluido de muestra puede, por tanto, inyectarse a traves del extremo 28 distal de tubo 29 de muestra en una ubicacion que es distal a la porcion proximal 21a y proximal a la porcion distal 21 b. Por tanto, el fluido de muestra puede entrar en la envoltura de PIOAL puesto que la corriente de PIOAL esta comprimida por la zona 21, en el que el tubo de inyeccion de fluido de muestra tiene un puerto de salida distal a traves del que se inyecta un fluido de muestra en un fluido envolvente que fluye, el puerto de salida distal limitado por la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo de la celula de flujo. El dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica digital con una lente 46 objetivo se dirige a lo largo de un eje optico que interseca la corriente 32 de muestra en forma de cinta. La distancia relativa entre el objetivo 46 y la celula 33 de flujo es variable por la operacion de un accionamiento 54 de motor, para resolver y recoger una imagen digitalizada enfocada en una matriz de fotosensor.
Segun algunas realizaciones, el sistema puede operar hidroenfocando la cinta 32 de fluido de muestra. El termino hidroenfoque o hidroenfocar puede referirse a un efecto de enfoque que esta influido por una diferencia de viscosidad entre los fluidos envolvente y de muestra, una zona de transicion de estrechamiento geometrico de la celula de flujo, y una diferencia de velocidad entre los fluidos envolvente y de muestra. El flujo hidrodinamico resulta de la diferencia de velocidad entre las corrientes de fluido envolvente y de muestra, que al afecta al grosor y forma de la cinta de flujo.
Celula de flujo
Una realizacion practica de la celula 22 de flujo se representa adicionalmente en las figuras 2 y 3. Tal como se muestra en este caso, la celula 22 de flujo puede acoplarse con una fuente 25 de muestra y tambien con una fuente 27 de material de PIOAL. El fluido de muestra se inyecta en la celula 22 de flujo por medio de la canula 29, por ejemplo a traves de un puerto 31 de salida distal de la canula 29. Normalmente, el fluido envolvente de PIOAL no esta en un estado de flujo laminar segun se desplaza a traves de una seccion 41 de canal curvada en la celula de flujo desde la fuente 27 hacia la zona 23 de visualizacion. Sin embargo, la celula 22 de flujo puede configurarse de modo que el fluido envolvente de PIOAL es o se vuelve laminar, o presenta un perfil de velocidad plano, segun fluye pasado el puerto 31 de salida distal donde el fluido de muestra se introduce en el fluido envolvente que fluye. El fluido de muestra y el PIOAL pueden fluir a lo largo de la celula 22 de flujo en una direccion generalmente indicada por la flecha A, y despues fuera de la celula 22 de flujo por medio de la descarga 33. La celula 22 de flujo define una trayectoria 20 de flujo interna que se estrecha de manera simetrica (por ejemplo en la zona 21 de transicion) en la direccion de flujo A. La simetria de la trayectoria de flujo contribuye a un flujo robusto y centrado de la corriente de muestra. La celula 22 de flujo esta configurada para dirigir un flujo 32 de la muestra envuelta con el PIOAL a traves de una zona 23 de visualizacion en la celula de flujo, concretamente detras del puerto 57 de visualizacion. Un patron 44 de autoenfoque esta asociado con la ventana 57 de observacion. La celula 22 de flujo tambien tiene un asiento 58 redondeado o rebajado que esta configurado para aceptar o recibir un objetivo de microscopio (no mostrado).
Segun algunas realizaciones, el patron 44 de autoenfoque puede tener una posicion que esta fija en relacion con la celula 22 de flujo, y que se ubica a una distancia de desplazamiento desde el plano de la corriente 32 de muestra en forma de cinta. En la realizacion mostrada en este caso, el patron de autoenfoque (diana 44) se aplica directamente a la celula 22 de flujo en una ubicacion que esta visible en una imagen recogida a traves de la ventana 57 de observacion mediante un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica (no mostrado). La celula 22 de flujo puede construirse a partir de un unico trozo de material. Alternativamente, la celula 22 de flujo puede construirse de una seccion primera o superior o capa 22a y una seccion segunda o inferior o capa 22b. Tal como se muestra en este caso, un panel 60 de vidrio o ventana transparente se une a o se integra con la primera seccion 22a. El panel 60 puede definir al menos una porcion de la trayectoria de muestra de flujo dentro de la celula de flujo. La luz de la fuente 42 de luz puede desplazarse a traves de una apertura o paso del patron 44 de autoenfoque para iluminar particulas de muestra que fluyen dentro de la corriente 32 de flujo.
En algunos casos, el grosor del panel 60 puede tener un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 150 pm hasta aproximadamente 170 pm. Tal como se indico anteriormente, el panel 60 puede definir o formar parte del envolvente o de la trayectoria de flujo (por ejemplo, PIOAL). Al usar un panel 60 delgado, es posible colocar el objetivo de microscopio muy proximo a la cinta de fluido de muestra, y por tanto obtener imagenes muy aumentadas de particulas que fluyen a lo largo de la trayectoria de fluido.
La figura 3A representa aspectos de una realizacion de celula de flujo, donde una distancia entre el eje 355 de obtencion de imagenes y la porcion 316 de zona de transicion distal es de aproximadamente 8,24 mm. Una distancia entre la porcion 316 de zona de transicion distal y el puerto 331 de salida de canula es de aproximadamente 12,54 mm. Una distancia entre el puerto 331 de salida de canula y la entrada 301 de fluido envolvente es de aproximadamente 12,7 mm. Una distancia entre el puerto 331 de salida de canula y una porcion 318 de zona de transicion proximal es de aproximadamente 0,73 mm. La figura 3B representa aspectos de una realizacion de celula de flujo donde el puerto de salida de canula se ha movido hasta una ubicacion mas distal relativa a la zona de transicion, en comparacion con la realizacion de la figura 3A. Tal como se muestra en este caso, el extremo distal de canula se hace avanzar dentro de la zona de transicion de estrechamiento de la celula de flujo, y una distancia entre el eje 355 de obtencion de imagenes y la porcion 316 de zona de transicion distal esta dentro de un intervalo de desde aproximadamente 16 mm hasta aproximadamente 26 mm. En algun caso, la distancia entre el eje 355 de obtencion de imagenes y la porcion 316 de zona de transicion distal es de aproximadamente 21 mm.
Volviendo a la referencia a la figura 1, el contorno interno de celula de flujo (por ejemplo, en la zona 21 de transicion) y las velocidades de flujo de PIOAL y muestra pueden ajustarse de modo que la muestra se forma dando una corriente 32 en forma de cinta. Esta corriente puede ser aproximadamente tal delgada como o incluso mas delgada que las particulas que estan envueltas en la corriente de muestra en forma de cinta. Los globulos blancos pueden tener un diametro de aproximadamente 10 pm, por ejemplo. Al proporcionar una corriente de muestra en forma de cinta con un grosor de menos de 10 pm, las celulas pueden orientarse cuando la corriente de muestra en forma de cinta se estira mediante el fluido envolvente, o PIOAL. Sorprendentemente, el estiramiento de la corriente de muestra en forma de cinta a lo largo de una trayectoria de flujo de estrechamiento dentro de capas de PIOAL de diferente viscosidad que la corriente de muestra en forma de cinta, tal como mayor viscosidad, tiende ventajosamente a alinear particulas no esfericas en un plano sustancialmente paralelo a la direccion de flujo, y aplicar fuerzas en las celulas, mejorando el contenido enfocado de estructuras intracelulares de celulas. El eje optico del dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica es sustancialmente normal (perpendicular) al plano de la corriente de muestra en forma de cinta. La velocidad lineal de la corriente de muestra en forma de cinta en el punto de obtencion de imagenes puede ser, por ejemplo, de 20-200 mm/segundo. En algunas realizaciones, la velocidad lineal de la corriente de muestra en forma de cinta puede ser, por ejemplo, de 50-150 mm/segundo.
El grosor de la corriente de muestra en forma de cinta puede verse afectado por las viscosidades relativas y velocidades de flujo del fluido de muestra y el PIOAL. La fuente 25 de la muestra y/o la fuente 27 del PIOAL, por ejemplo que comprende bombas de desplazamiento de precision, puede configurarse para proporcionar la muestra y/o el PlOAL a velocidades de flujo controlables para optimizar las dimensiones de la corriente 32 de muestra en forma de cinta, concretamente como una cinta delgada al menos tan ancha como el campo de vision del dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica.
En una realizacion, la fuente 27 del PIOAL esta configurada para proporcionar el PIOAL a una viscosidad predeterminada. Esa viscosidad puede ser diferente que la viscosidad de la muestra, y puede ser mayor que la viscosidad de la muestra. La viscosidad y densidad del PIOAL, la viscosidad del material de muestra, la velocidad de flujo del PIOAL y la velocidad de flujo de la muestra material se coordinan para mantener la corriente de muestra en forma de cinta a la distancia de desplazamiento del patron de autoenfoque, y con caracteristicas dimensionales predeterminadas, tales como un grosor de corriente de muestra en forma de cinta ventajoso.
En una realizacion practica, el PIOAL tiene una velocidad lineal mayor que la muestra y una viscosidad mayor que la muestra, estirando de ese modo la muestra para dar la cinta plana. La viscosidad de PIOAL puede ser de hasta 10 centipoise.
En referencia tambien a las figuras 2 y 3, la trayectoria de flujo interna de la celula de flujo se estrecha aguas abajo del punto de inyeccion de la corriente de muestra en forma de cinta en el PIOAL, para producir un grosor de corriente de muestra en forma de cinta, por ejemplo, de hasta 7 pm, y/o la trayectoria de flujo interna produce un ancho de corriente de muestra en forma de cinta de 500 - 3.000 pm. En realizaciones a modo de ejemplo, tal como se representa en la figura 1, la trayectoria de flujo interna de la celula de flujo comienza una zona de transicion de estrechamiento aguas arriba del punto de inyeccion de la corriente de muestra en el PIOAL.
En otra realizacion, la trayectoria de flujo interna se estrecha para producir un grosor de la corriente de muestra en forma de cinta de 2 - 4 pm de grosor, y/o la trayectoria de flujo interna de la corriente de muestra en forma de cinta de 2000 pm de ancho. Estas dimensiones son particularmente utiles para hematologia. El grosor de la corriente en este caso es menor que el diametro de algunas particulas, tales como globulos rojos en su estado relajado. Por consiguiente, esas particulas pueden volver a orientarse para enfrentarse a su dimension mas amplia con respecto al eje de obtencion de imagenes, que es util para revelar caracteristicas distintivas.
La velocidad lineal de la corriente de muestra en forma de cinta puede limitarse suficientemente para evitar el desenfoque por movimiento de la imagen digitalizada en el tiempo de exposicion de imagen de la matriz de fotosensor. La fuente de luz puede ser opcionalmente una luz electroboscopica que se enciende para aplicar amplitud de amplia incidencia durante un breve periodo de tiempo. Dado que el patron 44 de autoenfoque y la imagen estan en el mismo campo de vision, la fuente de luz esta configurada para iluminar la corriente de muestra en forma de cinta y el patron de autoenfoque simultaneamente. Sin embargo en otras realizaciones, el campo de vision para la obtencion de imagenes y para autoenfoque pueden ser diferentes, por ejemplo, iluminarse y/u obtenerse imagenes por separado.
Los desarrollos del objeto tienen aspectos de metodo asi como de aparato. Un metodo de enfocar un analizador visual no siendo parte de la presente invencion, pero no obstante util para entender la presente invencion comprende enfocar un dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica, que puede ser un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica digital o el dispositivo de captura de imagenes digital, en un patron 44 de autoenfoque fijado en relacion con una celula 22 de flujo, en el que el patron 44 de autoenfoque se ubica a una distancia 52 de desplazamiento desde una corriente 32 de muestra en forma de cinta. El dispositivo 24 de obtencion de imagenes de alta resolucion optica digital tiene un objetivo con un eje optico que interseca la corriente 32 de muestra en forma de cinta. Se varia una distancia relativa entre el objetivo y la celula 22 de flujo mediante operacion de un accionamiento 54 de motor, mientras que la distancia a lo largo del eje optico entre el dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica y el punto de enfoque optimo se conoce. El dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica digital esta configurado para resolver y recoger una imagen digitalizada en una matriz de fotosensor. El accionamiento de motor se opera enfocandose en el patron de autoenfoque en un proceso de autoenfoque. El accionamiento de motor se opera entonces a lo largo de la distancia de desplazamiento, enfocando de ese modo el dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica sobre la corriente de muestra en forma de cinta.
El metodo puede incluir ademas formar la corriente de muestra en forma de cinta para dar una forma de cinta. La forma de cinta se presenta de manera tal que el eje optico del dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica es sustancialmente perpendicular a la corriente de muestra en forma de cinta, concretamente normal al plano de la corriente en forma de cinta.
La figura 4 representa aspectos de un sistema 400 para obtener imagenes de particulas en una muestra de fluido sanguineo. Tal como se muestra en este caso, el sistema 400 incluye un sistema 410 de inyeccion de fluido de muestra, una celula 420 de flujo, y dispositivo 430 de captura de imagenes, y un procesador 440. La celula 420 de flujo proporciona una trayectoria 422 de flujo que transmite un flujo del fluido envolvente, opcionalmente en combinacion con el fluido de muestra. Segun algunas realizaciones, el sistema 410 de inyeccion de fluido de muestra puede incluir o acoplarse con una canula o tubo 412. El sistema 410 de inyeccion de fluido de muestra puede estar en comunicacion de fluido con la trayectoria 422 de flujo (por ejemplo por medio de la entrada 402 de fluido de muestra), y puede operar inyectando el fluido 424 de muestra a traves de un puerto 413 de salida distal de la canula 412 y en un fluido 426 envolvente que fluye dentro de la celula 420 de flujo para proporcionar una corriente 428 de fluido de muestra. Por ejemplo, el procesador 440 puede incluir o estar en asociacion operativa con un medio de almacenamiento que tiene una aplicacion informatica que, cuando se ejecuta por el procesador, esta configurada para hacer que el sistema 410 de inyeccion de fluido de muestra inyecte el fluido 424 de muestra en el fluido 426 envolvente que fluye. Tal como se muestra en este caso, el fluido 426 envolvente puede introducirse en la celula 420 de flujo mediante un sistema 450 de inyeccion de fluido envolvente (por ejemplo por medio de la entrada 401 de fluido envolvente). Por ejemplo, el procesador 440 puede incluir o esta en asociacion operativa con un medio de almacenamiento que tiene una aplicacion informatica que, cuando se ejecuta por el procesador, esta configurada para hacer que el sistema 450 de inyeccion de fluido envolvente inyecte el fluido 426 envolvente en la celula 420 de flujo.
La corriente 428 de fluido de muestra tiene un primer grosor T1 adyacente al tubo 412 de inyeccion. La trayectoria 422 de flujo de la celula de flujo que tiene una disminucion de la trayectoria de tamano de flujo de manera tal que el grosor de la corriente 428 de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial T1 hasta un segundo grosor T2 adyacente a un sitio 432 de captura de imagenes. El dispositivo 430 de captura de imagenes esta alineado con el sitio 432 de captura de imagenes para obtener imagenes de una primera pluralidad de las particulas del primer fluido de muestra en el sitio 432 de captura de imagenes de la celula 420 de flujo.
El procesador 440 esta acoplado con el sistema 410 inyector de fluido de muestra, el dispositivo 430 de captura de imagenes, y opcionalmente el sistema 450 de inyeccion de fluido envolvente. El procesador 440 esta configurado para terminar la inyeccion del primer fluido de muestra en el fluido 426 envolvente que fluye y empezar la inyeccion del segundo fluido de muestra en el fluido 426 envolvente que fluye de modo que se inician transitorios de fluido de muestra. Por ejemplo, el procesador 440 puede incluir o estar en asociacion operativa con un medio de almacenamiento que tiene una aplicacion informatica que, cuando se ejecuta por el procesador, esta configurada para hacer que el sistema 410 de inyeccion de fluido de muestra inyecte el segundo fluido de muestra en el fluido 426 envolvente que fluye de modo que se inician transitorios de fluido de muestra.
Ademas, el procesador 440 esta configurado para iniciar la captura de una imagen de una segunda pluralidad de las particulas del segundo fluido de muestra en el sitio 432 de captura de imagenes de la celula 420 de flujo despues de los transitorios de fluido de muestra y en el plazo de 4 segundos de la obtencion de imagenes de la primera pluralidad de las particulas. Por ejemplo, el procesador 440 tambien puede incluir o estar en asociacion operativa con un medio de almacenamiento que tiene una aplicacion informatica que, cuando se ejecuta por el procesador, esta configurada para hacer que el dispositivo 430 de captura de imagenes inicie la captura de una imagen de una segunda pluralidad de las particulas del segundo fluido de muestra en el sitio 432 de captura de imagenes de la celula 420 de flujo despues de los transitorios de fluido de muestra y en el plazo de cuatro segundos de la obtencion de imagenes de la primera pluralidad de las particulas.
Tal como se muestra en la realizacion de celula de flujo representada en la figura 4A, una disminucion del tamano de la trayectoria de flujo (por ejemplo en una zona 419a de transicion) puede definirse por paredes 421a, 423a opuestas de la trayectoria 422a de flujo. Las paredes 421a, 423a opuestas pueden inclinarse radialmente hacia dentro a lo largo de la trayectoria 422a de flujo, generalmente simetrica sobre un plano 451a transversal que biseca la corriente 428a de fluido de muestra. El plano 451a puede bisecar la corriente 428a de muestra donde la corriente de muestra tiene un primer grosor T1, en una ubicacion donde la corriente 428a de muestra sale de una porcion 427a distal de la canula o tubo 412a de inyeccion de muestra. De manera similar, el plano 451a puede bisecar la corriente 428a de muestra donde la corriente de muestra tiene un segundo grosor T2, en una ubicacion en la que la corriente 428a de muestra pasa por el sitio 432a de captura de imagenes. Segun algunas realizaciones, el primer grosor T1 tiene un valor de aproximadamente 150 pm y el segundo grosor T2 tiene un valor de aproximadamente 2 pm. En tales casos, la razon de compresion de la corriente de cinta de muestra es de 75:1. Segun algunas realizaciones, el primer grosor T1 tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 50 pm hasta aproximadamente 250 pm y el segundo grosor T2 tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 pm hasta aproximadamente 10 pm. Dado que el fluido de corriente de muestra fluye a traves de la celula de flujo, la cinta se afina a medida que se acelera y se estira. Dos caracteristicas de la celula de flujo pueden contribuir al afinamiento de la cinta de fluido de muestra. En primer lugar, una diferencia de velocidad entre la envoltura de fluido envolvente y la cinta de fluido de muestra puede funcionar reduciendo el grosor de la cinta. En segundo lugar, la geometria de seccion transversal decreciente de la zona de transicion puede funcionar reduciendo el grosor de la cinta.
Tal como se representa en la figura 4A (asi como en las figuras 4 y 4B-1), la zona 419a de transicion puede definirse por transiciones angulares en las porciones proximal (415a) y distal (416a). Tambien se entiende que la zona 419a de transicion puede en su lugar presentar transiciones lisas o curvas en las porciones proximal (415a) y distal (416a), similar a las transiciones lisas o curvas tal como se representa en las figuras 1,3, 3A, 3B y 4B-2).
Normalmente, el primer grosor T1 es mucho mayor que el tamano de las particulas de muestra, y por tanto las particulas estan contenidas completamente dentro de la corriente de cinta de muestra. Sin embargo, el segundo grosor T2 puede ser mas pequeno que el tamano de determinadas particulas de muestra, y por tanto esas particulas pueden extenderse fuera del fluido de muestra y al interior del fluido envolvente circundante. Tal como se muestra en la figura 4A, la corriente de cinta de muestra puede fluir generalmente a lo largo del mismo plano a medida que sale de la canula y se desplaza hacia el sitio de captura de imagenes.
La celula de flujo tambien puede proporcionar una distancia 430a de separacion entre la porcion 427a de la canula distal y el sitio 432a de captura de imagenes. Segun algunas realizaciones, la porcion 427a distal del tubo 412a de inyeccion de fluido de muestra puede colocarse a una distancia 430a de separacion axial desde el sitio 432a de captura de imagenes, donde la distancia 432a de separacion axial tiene un valor de aproximadamente 21 mm. En algunos casos, la distancia 430a de separacion axial tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 16 mm hasta aproximadamente 26 mm.
La distancia 430a de separacion axial entre el puerto de salida de canula y el sitio de captura de imagenes puede tener un impacto en el tiempo de transicion para el fluido de muestra a medida que el fluido se desplaza desde el puerto de salida hasta el sitio de captura de imagenes. Por ejemplo, una distancia 430 de separacion axial relativamente mas corta puede contribuir a un tiempo de transicion mas corto, y una distancia 430 de separacion axial relativamente mas larga puede contribuir a un tiempo de transicion mas largo.
La posicion del puerto de salida en la porcion 427a de canula distal en relacion con la zona 419a de transicion de trayectoria de flujo, o en relacion con la porcion 415a proximal de la zona 419a de transicion de trayectoria de flujo, puede influir tambien en el tiempo de transicion para el fluido de muestra a media que el fluido se desplaza desde el puerto de salida hasta el sitio de captura de imagenes. Por ejemplo, el fluido envolvente puede tener una velocidad relativamente mas lenta en la porcion 415a proximal, y una velocidad relativamente mas rapida en una ubicacion entre la porcion 415a proximal y la porcion 416a distal. Por tanto, si el puerto de salida de canula en la porcion 427a distal se coloca en la porcion 415a proximal, el fluido de muestra tardara mas tiempo en alcanzar el sitio de captura de imagenes, no solo porque la distancia de desplazamiento es mayor, sino tambien porque la velocidad inicial del fluido de muestra despues de que salga del puerto de la canula distal es menor (debido a la velocidad de fluido envolvente mas lenta). Dicho de otra forma, cuanto mas tiempo este presente el fluido de muestra en la porcion mas gruesa (por ejemplo cerca de la porcion 415a proximal) de la celula de flujo, mas tiempo tardara la muestra en alcanzar el sitio de captura de imagenes. A la inversa, si el puerto de salida de canula en la porcion 427a distal se coloca de manera distal a la porcion 415a proximal (por ejemplo en una ubicacion central entre la porcion 415a proximal y la porcion 416a distal, tal como se representa en la figura 4A), el fluido de muestra tardara menos tiempo en alcanzar el sitio de captura de imagenes, no solo porque la distancia de desplazamiento es menor, sino tambien porque la velocidad inicial del fluido de muestra despues de que salga del puerto de la canula distal es mas rapida (debido a la velocidad de fluido envolvente mas rapida). Tal como se comenta en otra parte en el presente documento, el fluido envolvente se acelera a medida que fluye a traves de la zona 419a de transicion, debido al estrechamiento del area de seccion transversal de la zona 419a.
Segun algunas realizaciones, con un tiempo de transicion mas corto, hay mas tiempo disponible para la recogida de imagenes en el sitio de captura de imagenes. Por ejemplo, a medida que disminuye la duracion del tiempo de transicion desde la punta distal de la canula hasta el area de obtencion de imagenes, es posible procesar mas muestras en una cantidad especifica de tiempo, y de manera relacionada es posible obtener mas imagenes en una cantidad especifica de tiempo (por ejemplo, imagenes por minuto).
Aunque existen ventajas asociadas con la colocacion del puerto de salida de la porcion 427a de canula distal mas cerca del sitio 432a de captura de imagenes, tambien es deseable mantener una determinada distancia entre el puerto y el sitio de captura. Por ejemplo, tal como se representa en la figura 3, un objetivo optico o lente frontal de un dispositivo de obtencion de imagenes puede colocarse en el asiento 58 de la celula 22 de flujo. Si el puerto 31 de salida de la canula esta demasiado cerca del asiento 58, entonces el fluido de muestra puede no estabilizarse lo suficiente despues de que se inyecte en el fluido envolvente para proporcionar las propiedades de obtencion de imagenes deseadas en el sitio de captura de imagenes. De manera similar, puede ser deseable mantener la region 21 de transicion de seccion transversal decreciente a una distancia de la zona 23 de visualizacion, de modo que la region de seccion transversal decreciente no interfiera con la colocacion del asiento 58 que recibe el objetivo del dispositivo de captura de imagenes.
Continuando con la referencia a la figura 4A, el extremo 427a posterior del tubo 412a de inyeccion de fluido de muestra puede colocarse distal a una porcion 415a proximal de la zona 419a de transicion de trayectoria de flujo. De manera relacionada, el extremo 427a posterior del tubo 412a de inyeccion de fluido de muestra puede colocarse proximal a una porcion 416a distal de la zona 419a de transicion de trayectoria de flujo. Por tanto, segun algunas realizaciones, el fluido de muestra puede inyectarse desde la canula 412a de inyeccion y en la celula de flujo en una ubicacion dentro de la zona 419a de transicion.
Segun algunas realizaciones, la simetria en la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo (por ejemplo en la zona 419a de transicion de trayectoria de flujo) funciona limitando la desalineacion de particulas en la muestra de fluido sanguineo. Por ejemplo, tal simetria puede ser eficaz para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 20%.
Segun algunas realizaciones, los metodos dados a conocer en el presente documento pueden funcionar a la tasa de senalizacion durante el analisis de recuento sanguineo hasta por debajo del 30%, el 29%, el 28%, el 27%, el 26%, el 25%, el 24%, el 23%, el 22%, el 21%, el 20%, el 19%, el 18%, el 17%, el 16%, el 15%, el 14%, el 13%, el 12%, el 11%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6% o el 5% de las muestras.
Segun algunas realizaciones, el sitio 432a de captura de imagenes tiene un campo 433a de vision de entre aproximadamente 150 pm x 150 pm y 400 pm x 400 pm. En algunos casos, el sitio 432a de captura de imagenes tiene un campo 433a de vision de aproximadamente 275 pm x 275 pm. En algunos casos, el campo de vision puede definirse en cuanto a longitud por ancho. Si se expresa como area superficial, un campo de vision de 275 pm x 275 pm tiene un area de 75,625 pm2. Segun algunas realizaciones, el campo de vision puede determinarse mediante el objetivo del dispositivo de obtencion de imagenes y su aumento. En algunos casos, el campo de vision puede corresponderse con la extension del campo (area) de la que se obtienen imagenes mediante la optica de recogida (por ejemplo objetivo, lente tubular y camara). En algunos casos, el campo de vision es mucho mas pequeno que el puerto de visualizacion de area transparente en el sitio de captura de imagenes.
Las figuras 4A-1 y 4A-2 ilustran los efectos del hidroenfoque sobre la corriente de muestra a medida que se desplaza desde el puerto de salida de canula hasta el sitio de captura de imagenes. Tal como se muestra en la figura 4A-1, la corriente de muestra puede tener una altura H(S) de aproximadamente 150 pm y un ancho W(S) de aproximadamente 1350 pm. Ademas, la corriente envolvente de PIOAL puede tener una altura H(P) de aproximadamente 6000 pm y un ancho W(P) de aproximadamente 4000 pm. Posteriormente al hidroenfoque, tal como se muestra en la figura 4A-2, la corriente de muestra puede tener una altura H(S) de aproximadamente 2 pm y un ancho W(S) de aproximadamente 1350 pm. Ademas, la corriente envolvente de PIOAL puede tener una altura H(P) de aproximadamente 150 pm y un ancho W(P) de aproximadamente 4000 pm. En una realizacion, el area de seccion transversal de la corriente envolvente de PIOAL en la salida de canula es 40 veces mayor que el area de seccion transversal proxima al sitio de captura de imagenes.
Segun algunas realizaciones, puede ser util determinar la seccion transversal del canal de celula de flujo en el sitio de captura de imagenes. Esto puede corresponderse con la altura de corriente envolvente de PIOAL H(P) de aproximadamente 150 pm y un ancho W(P) de aproximadamente 4000 pm tal como se representa en la figura 4A-2. Tambien puede ser util determinar la velocidad de flujo volumetrico del fluido de muestra y envolvente combinados que fluyen a traves de la celula de flujo en el sitio de captura de imagenes. Cuando el area de seccion transversal y la velocidad de flujo se conocen, es posible determinar la velocidad del fluido de muestra y envolvente combinados en el sitio de captura de imagenes.
Segun algunas realizaciones, el flujo de los fluidos de muestra y envolvente a traves de la celula de flujo puede aproximarse con un modelo de perfil de placa paralela. De manera relacionada, la velocidad de flujo en el centro de la corriente de fluido de muestra (por ejemplo tal como se representa en la figura 4A-2), puede ser de aproximadamente 1,5 veces la velocidad de flujo promedio de la corriente de fluido de muestra y envolvente combinados.
Segun algunas realizaciones, el area de seccion transversal del flujo de muestra en la salida de canula (por ejemplo W(S) x H(S) en la figura 4A-1) es 40 veces mayor que el area de seccion transversal del flujo de muestra en el sitio de obtencion de imagenes (por ejemplo W(S) x H(S) en la figura 4A-2). La velocidad de flujo volumetrico de fluido envolvente en el area de obtencion de imagenes puede ser de aproximadamente 45 pl/segundo. La velocidad de flujo volumetrico de fluido de muestra en el area de obtencion de imagenes puede ser de aproximadamente 0,232 pl/segundo. En algunos casos, el area de seccion transversal de las corrientes de muestra y envolventes combinadas en el sitio de obtencion de imagenes es de 600.000 pm2. En algunos casos, la velocidad de corriente de flujo promedio en el sitio de obtencion de imagenes es de 75 mm/segundo.
La velocidad o tasa de flujo puede determinarse como la velocidad que da como resultado imagenes celulares nitidas y enfocadas. Las velocidades y tasas de flujo a modo de ejemplo se descubrieron basandose en velocidades de flujo de las dos muestras que se observo que lograban determinadas formas o caracteristicas de cinta de corriente de flujo de muestra en el sitio de obtencion de imagenes. Por ejemplo, a una velocidad de flujo de aproximadamente 75 mm/s (o dentro de un intervalo de 20-200 mm/s), las celulas no fluyen demasiado lento de modo que hay superposiciones de celulas en imagenes consecutivas, y las celulas no fluyen demasiado rapido de modo que se crean efectos de imagen fantasma (imagen borrosa). De manera relacionada, evitando velocidades de flujo excesivamente altas, es posible conservar mas reactivo y muestra. Segun algunas realizaciones, puede lograrse una velocidad lineal deseada u optima o bien cambiando el flujo volumetrico (velocidad de bombeo) o bien la forma de la canula.
La velocidad de flujo de la corriente de muestra a traves de la zona de captura de imagenes tambien puede estar relacionada con el rendimiento del dispositivo de captura de imagenes en relacion con la funcion de la celula de flujo. Por ejemplo, si la corriente de muestra fluye demasiado rapido, puede ser dificil obtener imagenes nitidas de particulas contenidas en la muestra (por ejemplo la velocidad de obturacion del dispositivo de captura de imagenes puede ser demasiado baja, produciendo de ese modo una imagen borrosa). De manera similar, si la corriente de muestra fluye demasiado lento, el dispositivo de captura de imagenes puede obtener imagenes consecutivas de la misma particula (por ejemplo, la misma particula permanece en el fotograma de captura durante dos capturas de imagen). En algunas realizaciones, la velocidad de la cinta de muestra puede modularse (por ejemplo, ajustando cualquiera de una variedad de los parametros operativos de la celula de flujo) en relacion con la velocidad de captura de imagenes, de modo que existe un flujo minimo entre capturas de fotogramas, y por tanto, se obtienen imagenes de un alto porcentaje de la muestra.
Segun algunas realizaciones, el sistema de analisis de particulas y los componentes asociados pueden estar configurados de modo que a medida que el fluido envolvente y la muestra de fluido fluyen a traves de la celula de flujo, el fluido envolvente puede fluir a una velocidad volumetrica de fluido envolvente de 45 pl/s y la muestra de fluido puede fluir a una velocidad de flujo volumetrico de muestra de flujo de 0,232 pl/s (o dentro de un intervalo de desde 0,2 hasta 0,35 pl/s). En algunos casos, la razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido de muestra es de aproximadamente 200. En algunos casos, la razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido de muestra tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 70 hasta 200. En algunos casos, la razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido muestra es de aproximadamente 193. En algunos casos, la razon de la velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a la velocidad de flujo de fluido de muestra es de aproximadamente 70. En algunos casos, una razon de volumen de fluido envolvente con respecto a volumen de muestra de fluido que fluye dentro de la celula de flujo puede estar dentro de un intervalo de desde 25:1 hasta 250:1.
Segun algunas realizaciones, el sistema y los componentes asociados pueden estar configurados de modo que a medida que el fluido envolvente y la muestra de fluido fluyen a traves de la celula 420 de flujo, el fluido envolvente puede fluir a una velocidad de fluido envolvente de 75 mm/s antes del area de obtencion de imagenes y la muestra de fluido puedan fluir a una velocidad de muestra de fluido de 130 mm/s antes del area de obtencion de imagenes. En algunos casos, una razon de volumen de fluido envolvente con respecto a volumen de muestra de fluido que fluye dentro de la celula de flujo puede estar dentro de un intervalo de desde 100:1 hasta 200:1.
En algunos casos, una celula de flujo puede tener una razon de compresion minima de aproximadamente 50:1 y una razon de compresion maxima de aproximadamente 125:1. En algunos casos, la razon de compresion minima puede ser de aproximadamente 30:1 o 20:1. Esta razon de compresion se refiere a la razon de los grosores de corriente de flujo H(S):H(S) cuando se compara la figura 4A-1 con la figura 4A-2. Esta razon de compresion puede estar influida por una combinacion de compresion geometrica (por ejemplo, la razon de los grosores de fluido envolvente H(P):H(P) cuando se compara la figura 4A-1 con la figura 4A-2, que tambien puede corresponder generalmente con las dimensiones de la zona 419a de transicion de seccion transversal decreciente que se estrecha de la celula de flujo mostrada en la figura 4A) y una compresion hidrodinamica (por ejemplo, que tambien se corresponde con una diferencia en la velocidad). Segun algunas realizaciones, la razon de compresion geometrica es de aproximadamente 40:1.
La disminucion del tamano de la trayectoria de flujo, correspondiente a la zona de transicion, puede definirse por una porcion de trayectoria de flujo proximal que tiene un grosor o altura proximal, y una porcion de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor o altura distal que es menor que el grosor o altura proximal. Por ejemplo, tal como se muestra en las vistas parciales de las figuras 4B-1 y 4B-2, la zona 419b de transicion de la trayectoria de flujo puede tener una longitud L entre una porcion 415b proximal y una porcion 416b distal, donde la porcion 415b proximal tiene una altura 417b proximal, y la porcion 416b distal tiene una altura 418b distal. Tal como se representa en la figura 4B-2, y tal como se indica en otra parte en el presente documento, la forma o contorno de la zona de transicion puede ser curva o lisa, y por ejemplo puede proporcionarse en forma de una curva en S, una curva sigmoidea o una curva de tangente. Segun algunas realizaciones, la altura 417b proximal tiene un valor de aproximadamente 6000 pm. En algunos casos, la altura 417b proximal tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 3000 pm hasta aproximadamente 8000 pm. Segun algunas realizaciones, la altura 418b distal tiene un valor de aproximadamente 150 pm. En algunos casos, la altura 418b distal tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 50 pm hasta aproximadamente 400 pm.
La geometria de la zona 419a de transicion puede proporcionar un primer angulo a1 entre el primer limite 403b de trayectoria de flujo y el plano 451b transversal de biseccion, y un segundo angulo a2 entre el segundo limite 404b de trayectoria de flujo y el plano 451b transversal de biseccion. En algunos casos, el angulo a1 es de aproximadamente 45 grados y el angulo a2 es de aproximadamente 45 grados. En algunos casos, el angulo a1 tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 10 grados hasta aproximadamente 60 grados. En algunos casos, el angulo a2 tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 10 grados hasta aproximadamente 60 grados. Segun algunas realizaciones, los angulos a1 y a2 tienen el mismo valor. Los angulos a1 y a2 pueden seleccionarse de modo que mantienen un flujo laminar o minimizan la turbulencia del fluido de muestra a medida que se desplaza desde la porcion 415b proximal hasta la porcion 416b distal, lo que a su vez puede potenciar la alineacion de particulas dentro de la muestra a lo largo del plano 451b transversal. Tal como se indico anteriormente con la referencia a la figura 4A, los limites o porciones distales y proximales de la zona de transicion pueden ser curvos o lisos, en lugar de en angulo.
La figura 4C representa caracteristicas de un tubo 400c de alimentacion de muestra o canula a modo de ejemplo segun realizaciones de la presente invencion, donde la canula tiene una longitud L. La figura 4D representa una seccion transversal longitudinal de la canula 400d. Tal como se muestra en este caso, la canula 400d incluye una seccion 410d aplanada distal, una seccion 420d de seccion transversal decreciente central y una porcion 430d tubular proximal. Tal como se representa en la figura 4C-1, un tubo 400c-1 de alimentacion de muestra o canula a modo de ejemplo puede tener una porcion 410c-1 distal y una porcion 430c-1 proximal. En algunos casos, la porcion 410c-1 distal tiene una longitud de aproximadamente 1,359 mm y un ancho de aproximadamente 1,43 mm. En algunos casos, el puerto de salida del extremo distal tiene un ancho de salida W(E) de aproximadamente 1,359 mm. Segun algunas realizaciones, una canula puede tener una geometria de trayectoria de flujo interna que es diferente de lo que se representa en las figuras 4C y 4D. Por ejemplo, tal como se ilustra en la figura 4D-1, la canula 400d-1 no incluye una seccion central de seccion transversal decreciente que tiene una seccion transversal de area de flujo expandida. Tal como se representa en la figura 4D-1, la canula 400d-1 tiene una seccion 410d-1 distal, una seccion 420d-1 de seccion transversal decreciente central que tiene un diametro interno de seccion transversal decreciente y una seccion 430d-1 proximal. Correspondiente al diametro interno de seccion transversal decreciente de la seccion 420d-1 central, el area interna de seccion transversal de 410d-1 es mas pequena que el area interna de seccion transversal de 430d-1.
La figura 4E ilustra una seccion transversal de una seccion 410e aplanada distal. Tal como se muestra en este caso, la seccion 410e distal tiene un ancho interno W(I) y una altura interna H(I), a traves de la cual fluye una corriente de muestra. Ademas, la seccion 410e distal tiene un ancho externo W(O) y una altura externa H(O). Tal como se representa en las figuras 4D y 4E tomadas en combinacion, la porcion 410e distal del tubo de inyeccion de fluido de muestra tiene un puerto de salida P que tiene una altura H(I) y un ancho W(I), donde la altura H(I) es menor que el ancho W(I). Segun algunas realizaciones, la altura H(I) del puerto de salida P de la porcion 410e distal (o la altura interna de la porcion 410d distal) puede tener un valor de aproximadamente 150 ^m. En algunos casos, la altura H(I) puede estar dentro de un intervalo de desde aproximadamente 50 ^m hasta aproximadamente 250 ^m. Segun algunas realizaciones, el ancho W(I) del puerto de salida P de la porcion 410e distal (o el ancho interno de la porcion 410d distal) puede tener un valor de aproximadamente 1350 ^m. En algunos casos, el ancho es de aproximadamente 1194 ^m. En algunos casos, el ancho W(I) puede tener un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 500 ^m hasta aproximadamente 3000 ^m. En algunos casos, la seccion 410d aplanada distal puede fabricarse aplicando una fuerza de cierre a un tubo o conducto.
La figura 4F ilustra una seccion transversal de una seccion 420f de seccion transversal decreciente central. Tal como se muestra en este caso, la seccion 420f de seccion transversal decreciente central tiene un diametro interno D(I) a traves del cual fluye una corriente de muestra. Ademas, la seccion 420f de seccion transversal decreciente central tiene un diametro exterior D(O). La figura 4G ilustra una seccion transversal de una seccion 430g proximal. Tal como se muestra en este caso, la seccion 430g proximal tiene un diametro interno D(I) a traves del cual fluye una corriente de muestra. Ademas, la seccion 430g distal tiene un diametro exterior D(O).
Tal como se representa en la figura 4D, el tubo o canula 400d de inyeccion puede tener una porcion 430d proximal que tiene una primera area de seccion transversal de flujo (por ejemplo n*(D/2)2 mostrada en la figura 4G), una porcion 410d distal que tiene una segunda area de seccion transversal de flujo (por ejemplo W(I)*H(I) mostrada en la figura 4E) que es menor que la primera area de seccion transversal de flujo y una tercera porcion 420d dispuesta entre la porcion 430d proximal y la porcion 410d distal. La tercera porcion 420d puede tener una tercera seccion transversal de flujo (por ejemplo n*(D/2)2 mostrada en la figura 4F) que es mayor que las secciones transversales de flujo primera y segunda. En algunos casos, el diametro exterior D(O) de la porcion 430g proximal es de aproximadamente 1067 ^m y el diametro interno D(I) de la porcion 430g proximal es de aproximadamente 813 ^m.
Segun algunas realizaciones, una porcion proximal de un tubo de inyeccion puede acoplarse con un puerto de muestra de un accesorio de entrada de muestra. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 4H, una porcion 405h proximal de una canula 400h puede acoplarse directamente a un puerto 410h de muestra en una salida de un accesorio 420h de entrada de muestra.
Una celula de flujo de un sistema para obtener imagenes de particulas en una muestra de fluido sanguineo puede orientarse en cualquier angulo o direccion deseado en relacion con la direccion de la fuerza de gravedad. Por ejemplo, una celula de flujo puede orientarse en una direccion hacia arriba, de modo que el fluido que fluye dentro de la celula de flujo (por ejemplo fluido envolvente, opcionalmente en combinacion con fluido de muestra) puede desplazarse en una direccion hacia arriba, contra la fuerza de gravedad. Asimismo, una celula de flujo puede orientarse en una direccion hacia abajo, de modo que el fluido que fluye dentro de la celula de flujo (por ejemplo fluido envolvente, opcionalmente en combinacion con fluido de muestra) puede desplazarse en una direccion hacia abajo, con la fuerza de gravedad. La figura 4I representa una celula 420i de flujo orientada en una direccion hacia arriba, de modo que el fluido 424i de muestra y el fluido 426i envolvente que fluyen dentro de la celula 420i de flujo fluyen contra la gravedad G. La figura 4J representa una celula 420j de flujo orientada en una direccion hacia abajo, de modo que el fluido 424j de muestra y el fluido 426j envolvente que fluyen dentro de la celula 420j de flujo no fluyen contra la gravedad G, sino que mas bien fluyen con la gravedad G.
Tal como se muestra en la figura 4K, una cinta de corriente de muestra R que fluye a traves de un sitio 432k de captura de imagenes de una celula 420k de flujo puede tener un grosor T de aproximadamente 2 pm. En algunos casos, el grosor T de la cinta de corriente de muestra puede ser de hasta aproximadamente 3 pm. Normalmente, las celulas o particulas que son mas pequenas que el grosor de corriente de muestra, estaran contenidas dentro de la cinta. Un globulo rojo (RBC) a modo de ejemplo puede estar presente como un disco biconcavo y puede tener un diametro D de entre aproximadamente 6,2 pm y aproximadamente 8,2 pm. Ademas, un globulo rojo a modo de ejemplo puede tener un grosor maximo T1 de entre aproximadamente 2 pm y aproximadamente 2,5 pm y un grosor minimo T2 de entre aproximadamente 0,8 pm y aproximadamente 1 pm. En algunos casos, los globulos rojos pueden tener un grosor de hasta aproximadamente 3 pm. Las plaquetas humanas a modo de ejemplo pueden variar en tamano, y tambien pueden tener un grosor o diametro de aproximadamente 2 pm. Aunque no se muestra a escala en este caso, la celula de flujo puede definir un grosor de trayectoria de flujo F que tiene un valor de aproximadamente 150 pm, en el sitio de captura de imagenes. En algunos casos, el grosor de trayectoria de flujo F tiene un valor de entre 50 pm y 400 pm. Este grosor de trayectoria de flujo F tambien se corresponde con la altura 418b distal de la porcion 461 b distal representada en las figuras 4B-1 y 4B-2.
Tal como se muestra en la figura 4K, la razon del grosor T de la corriente de fluido de muestra con respecto al grosor de la particula (globulo rojo) es de aproximadamente 1:1. Segun algunas realizaciones, una razon del grosor T de la corriente de fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes con respecto a un tamano de una de las particulas esta dentro de un intervalo de desde 0,25 hasta 25. En algunos casos, el grosor T puede tener un valor dentro de un intervalo de desde 0,5 pm hasta 5 pm.
Tal como se comento en otra parte en el presente documento, las diferencias de viscosidad entre el fluido de la cinta de muestra R y el fluido envolvente pueden funcionar alineando u orientando particulas en la corriente de muestra, por ejemplo globulos rojos, a lo largo de la direccion del flujo. Cuando estan asi alineados, tal como se muestra en la figura 4K, el dispositivo de obtencion de imagenes o camara puede obtener imagenes de los globulos rojos de manera que aparecen redondos, debido a que la superficie principal de la celula sanguinea esta orientada hacia la camara. De este modo, el globulo rojo asume una alineacion que presenta una baja resistencia en relacion con el flujo. Por tanto, las caracteristicas de viscosidad relativa del fluido envolvente y el fluido de muestra pueden contribuir a un alto porcentaje o numero de globulos rojos que se orientan hacia la camara, potenciando por tanto la capacidad de evaluacion del sistema de analisis de particulas.
Segun algunas realizaciones, las caracteristicas de viscosidad del fluido envolvente funcionan limitando la desalineacion de particulas en la muestra de fluido sanguineo. Por ejemplo, los diferenciales de viscosidad pueden ser eficaces para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 10%. Es decir, 90 o mas globulos rojos de 100 globulos rojos en una muestra pueden alinearse de modo que sus superficies principales se orientan hacia el dispositivo de obtencion de imagenes. Una zona de transicion en estrechamiento simetrica puede proporcionar un valor del 20%. Tal como se comenta en otra parte en el presente documento, por ejemplo con referencia a la figura 4R, es posible comparar los resultados de alineacion obtenidos a partir de una configuracion de analizador que implica una zona de transicion de celulas de flujo en estrechamiento simetrica y un fluido envolvente viscoso con los resultados de alineacion obtenidos a partir de una configuracion de analizador que implica una zona de transicion de celulas de flujo en estrechamiento simetrica sin el uso de un fluido envolvente viscoso. El uso de un fluido envolvente viscoso puede reducir el porcentaje de celulas desalineadas. Segun algunas realizaciones, el fluido envolvente tiene un indice de refraccion similar al del agua (es decir n=1,3330). En algunos casos, el fluido envolvente tiene un contenido en agua de aproximadamente el 89%. Ademas de los efectos de alineacion observados como resultado del diferencial de viscosidad, tambien se observan efectos de alineacion como resultado de una zona de transicion de seccion transversal decreciente bilateral. En algunos casos, se observa que una zona de transicion de seccion transversal decreciente bilateral (es decir, simetrica) es dos veces mas eficaz alineando particulas que en comparacion con un diseno de zona de transicion de seccion transversal decreciente asimetrica.
La alineacion eficaz de los globulos rojos puede contribuir a un diagnostico mejorado. En algunos casos, la forma de los globulos rojos de los que se han obtenido imagenes puede usarse para determinar si un paciente del que se obtiene la muestra tiene una enfermedad o estado fisiologico particular. Por ejemplo, pacientes con drepanocitosis presentan celulas sanguineas que tienen una forma anomala (es decir, en la forma de un drepanocito). Por tanto, obteniendo imagenes de alta calidad de globulos rojos alineados, es posible garantizar un diagnostico preciso. Pueden obtenerse imagenes eficazmente de otras variaciones de forma de los globulos rojos, por ejemplo globulos rojos que tienen un area periferica delgada y un area centrar plana grande, mediante lo cual el globulo rojo parece tener el perfil de un neumatico de bicicleta, usando las presentes tecnicas de alineacion. De manera similar, pueden obtenerse imagenes de globulos rojos que tienen una porcion central pequena y un area periferica gruesa, mediante lo cual el globulo rojo parece tener un perfil de un neumatico de camion, para fines de diagnostico. Las tecnicas de obtencion de imagenes mejoradas dadas a conocer en el presente documento son tambien utiles para evaluar otras caracteristicas de globulos rojos, tales como contenido en hemoglobina, contenido en hierro, y similares.
Sin querer restringirse a ninguna teoria particular, se cree que un alto diferencial de viscosidad entre la viscosidad del fluido envolvente y la viscosidad del fluido de muestra produce un perfil parabolico modificado, en el que el perfil es generalmente parabolico y tiene una protuberancia central correspondiente a un area central del flujo en donde la aceleracion aumenta, y la protuberancia central contribuye a la alineacion de particulas de muestra o organulos dentro de las particulas. Segun algunas realizaciones, la diferencia de velocidad entre la cinta de muestra y envolvente y la diferencia de viscosidad generan fuerzas de corte que aumentan la alineacion de los organulos o particulas intracelulares.
Los globulos blancos son normalmente mas grandes que los globulos rojos y las plaquetas. Por ejemplo, neutrofilos y eosinofilos a modo de ejemplo pueden tener un diametro de entre aproximadamente 10 pm y aproximadamente 12 pm. Basofilos a modo de ejemplo pueden tener un diametro de entre aproximadamente 12 pm y aproximadamente 15 pm. Linfocitos a modo de ejemplo (pequenos) pueden tener un diametro de entre aproximadamente 7 pm y aproximadamente 8 pm, y linfocitos a modo de ejemplo (grandes) pueden tener un diametro de entre aproximadamente 12 pm y aproximadamente 15 pm. Monocitos a modo de ejemplo pueden tener un diametro de entre aproximadamente 12 pm y aproximadamente 20 pm. La configuracion del sistema de analisis de particulas, incluyendo la interaccion entre el fluido envolvente y la cinta de muestra de fluido a medida que pasa a traves de la celula de flujo, puede funcionar comprimiendo los globulos blancos a medida que se desplazan a traves del sitio 4321 de captura de imagenes, tal como se indica en la figura 4L. Por tanto, por ejemplo, una porcion distal del globulo blanco (WBC) puede situarse dentro del cinta de fluido de muestra R, y porciones perifericas del globulo blanco pueden situarse dentro del fluido envolvente. Por tanto, a medida que el globulo blanco se transporta a traves de la celula de flujo mediante la cinta, los lados del globulo blanco pueden extenderse dentro del fluido envolvente. Los valores numericos o intervalos para el grosor T de la cinta de corriente de muestra R, y el grosor F de la trayectoria de flujo tal como se comento anteriormente con respecto a la figura 4K son de manera similar aplicables a la figura 4L.
Segun algunas realizaciones, las diferencias de viscosidad entre el fluido envolvente y el fluido de muestra pueden funcionar alineando los organulos u otras caracteristicas intracelulares que estan presentes dentro de celulas tales como globulos blancos. Sin querer restringirse a ninguna teoria particular, se cree que fuerzas de corte asociadas con el diferencial de viscosidad entre el fluido envolvente y el fluido de muestra pueden actuar sobre los globulos blancos para alinear las caracteristicas intracelulares. En algunos casos, fuerzas de corte asociadas con diferenciales de velocidad entre el fluido envolvente y fluido de muestra pueden contribuir a tal alineacion. Estos efectos de alineacion pueden verse afectados por un diferencial de tamano entre las particulas y la cinta de fluido de muestra tambien. Por ejemplo, cuando porciones de las particulas se extienden fuera de la cinta de fluido de muestra y dentro del fluido envolvente circundante, las fuerzas de corte asociadas con la diferencia de viscosidad pueden tener un efecto pronunciado sobre la alineacion de caracteristicas intracelulares.
Con referencia a las figuras 4K y 4L, en algunos, casos porciones de la celula o particula pueden extenderse fuera de la cinta de fluido de muestra delgada R y dentro del fluido envolvente circundante. El fluido envolvente puede contener protectores celulares que inhiben o impiden que el fluido envolvente rompa o lise las celulas o particulas. Por ejemplo, el fluido envolvente puede contener protectores celulares que conservan la integridad estructural de las paredes celulares a medida que las celulas se exponen al entorno quimico del fluido envolvente. De manera similar, los protectores celulares pueden funcionar tambien conservando la integridad estructural de las paredes celulares a medida que las celulas experimentan cualquier fuerza de corte inducida por la geometria de la celula de flujo, y una diferencia de velocidad y/o viscosidad entre el fluido de muestra y el fluido envolvente. De manera relacionada, los protectores pueden proteger a las celulas o particulas de fuerzas resultantes de la diferencia de velocidad entre el fluido de muestra y fluido envolvente. De este modo, las celulas conservan su viabilidad cuando alcanzan el sitio de captura de imagenes.
Las fuerzas de corte pueden ser significativas en la superficie de contacto entre la cinta de fluido de muestra y la envoltura de fluido envolvente. Segun algunas realizaciones, el flujo dentro de la trayectoria de flujo de la celula de flujo puede caracterizarse por un perfil de flujo parabolico. La figura 4L-1 representa aspectos a modo de ejemplo de perfiles 4001-1a y 4001 -1 b de flujo parabolicos. El perfil 4001-1a parabolico en el panel superior es un perfil de velocidad tipico encontrado en flujos dentro de determinadas realizaciones de celula de flujo de la presente invencion (por ejemplo, cuando hay poco o ningun diferencial de viscosidad entre una corriente de flujo de fluido de muestra que esta envuelta dentro de una corriente de flujo de fluido envolvente). Tal como puede observarse, se observa la velocidad lineal mas alta en el medio de la corriente de fluido y se observan velocidades lineales mas lentas cerca de la pared de celula de flujo. El perfil 4001-1a tambien puede observarse en una corriente de fluido con una ligera diferencia de viscosidad entre los fluidos envolvente y de muestra. En un caso en el que hay un alto diferencial de viscosidad entre las corrientes de fluido y envolvente, se observa una protuberancia central tal como se muestra en el perfil 4001 -1 b, en donde hay un area central localizada con velocidades lineales amplificadas. Segun algunas realizaciones, las particulas que tienen un tamano suficientemente grande se someteran a la misma cantidad de fuerza de corte, incluso cuando tales particulas estan completamente contenidas dentro de una unica fase de fluido (es decir, o bien dentro de la envoltura de fluido envolvente, o bien alternativamente dentro de la cinta de fluido de muestra).
En algunos casos, la velocidad del fluido envolvente puede ser diferente de la velocidad del fluido de muestra. Por ejemplo, el fluido envolvente puede desplazarse a 80 mm/segundo y el fluido de muestra puede desplazarse a 60 mm/segundo. Por tanto, en algunos casos, el fluido de muestra sale del puerto de canula distal a una velocidad de fluido de muestra que es mas lenta que la velocidad de fluido envolvente de la envoltura circundante. Por tanto, el fluido envolvente puede funcionar arrastrando el fluido de muestra a lo largo de la trayectoria de flujo de la canula, acelerando asi el fluido de muestra y reduciendo el grosor de la cinta de fluido de muestra. La cinta de fluido de muestra mantiene la masa y volumen globales, de modo que a medida que se desplaza mas rapido se vuelve mas delgada. Segun algunas realizaciones, tanto el fluido envolvente como el fluido de muestra tienen una velocidad de entre aproximadamente 20 y 200 mm/segundo en el sitio de captura de imagenes.
Normalmente, la velocidad del fluido de muestra aumenta a medida que el fluido de muestra se desplaza desde el puerto de salida de la canula hasta el sitio de captura de imagenes. En algunos casos, la velocidad del fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes es 40 veces la velocidad del fluido de muestra cuando sale del puerto de la canula en la porcion distal de la canula. Segun algunas realizaciones, la disminucion en el area de seccion transversal de la cinta de muestra es lineal para el aumento de velocidad. Segun algunas realizaciones, si la velocidad de la cinta envolvente a la salida de la canula es mayor que la velocidad de cinta de muestra, esto aumentara tambien la velocidad final de la cinta de muestra en el area de obtencion de imagenes.
El fluido envolvente puede funcionar aplicando fuerzas de corte significativas sobre la cinta de fluido de muestra y sobre particulas dentro de la cinta de fluido de muestra. Algunas fuerzas son paralelas a la direccion de flujo, y las particulas pueden encontrar tambien fuerzas que son perpendiculares a la direccion de flujo. A menudo, a medida que el fluido envolvente y el fluido de muestra se aproximan al sitio o zona de captura de imagenes, los fluidos de muestra y envolvente estan desplazandose a o casi la misma velocidad. Por tanto, el limite o superficie de contacto entre los fluidos de muestra y envolvente cuando pasan por el sitio de captura de imagenes pueden presentar fuerzas de corte inferiores, en comparacion con el limite o superficie de contacto en el puerto de salida de la canula distal o en la zona de transicion de seccion transversal decreciente. Por ejemplo, en la zona de transicion de seccion transversal decreciente, el limite o superficie de contacto entre la envoltura de fluido envolvente y la cinta de fluido de muestra puede estar en transicion, de manera que la cinta de muestra que es inicialmente mas lenta y mas gruesa se convierte en mas rapida y mas delgada, y las particulas en el fluido de muestra quedan mas alineadas. Dicho de otro modo, las fuerzas de corte pueden ser relevantes en la zona de transicion de seccion transversal decreciente, y pueden disiparse hacia el sitio de captura de imagenes. Las fuerzas de corte en el sitio de captura de imagenes pueden estar representadas por un perfil parabolico, y pueden ser mucho menores que las fuerzas de corte en la zona de transicion de seccion transversal decreciente. Por tanto, las celulas o particulas pueden experimentar mayores fuerzas de corte cuando pasan a traves de la zona de transicion, y menores fuerzas de corte cando pasan a trasves del sitio de captura de imagenes. Segun algunas realizaciones, la diferencia de viscosidad entre los fluidos de muestra y envolvente puede hacer que los globulos rojos se alineen y se enfoquen. Segun algunas realizaciones, la diferencia de viscosidad entre los fluidos de muestra y envolvente puede hacer que los organulos de globulos blancos se alineen y de ese modo se enfoquen. De manera relacionada, pueden obtenerse resultados de obtencion de imagenes potenciados para componentes celulares y de organulos que se alinean y se enfocan, que resultan del estrechamiento geometrico de la corriente y la diferencia de velocidad entre los fluidos de muestra y envolvente.
La figura 4M representa un neutrofilo 400m a modo de ejemplo (un tipo de globulo blanco) que tiene organulos internos tales como lobulos 410m. Como resultado del diferencial de viscosidad entre el fluido de muestra y el fluido envolvente, los organulos internos pueden alinearse dentro de la celula, tal como se indica mediante la figura 4N. Por tanto, pueden obtenerse imagenes eficazmente de los organulos intracelulares con un dispositivo 430m de captura de imagenes, sin que los organulos se solapen entre si. Es decir, en lugar de que los lobulos se apilen uno encima de otro tal como se representa en la figura 4M, cuando se observan desde el eje de obtencion de imagenes u optico del dispositivo de captura de imagenes, los lobulos se alinean y se asientan lado a lado tal como se representa en la figura 4N. Por tanto, los lobulos pueden visualizarse en la imagen capturada mas eficazmente. La alineacion de organulos internos es un resultado sorprendente e inesperado del diferencial de viscosidad entre los fluidos de muestra y envolvente.
Puede realizarse cualquiera de una variedad de tecnicas de analisis de particulas de sangre o hematologia usando imagenes del fluido de muestra que fluye a traves de la celula de flujo. A menudo, el analisis de imagenes puede implicar la determinacion de determinados parametros de celulas o particulas, o medir, detectar o evaluar determinadas caracteristicas de celulas o particulas. Por ejemplo, el analisis de imagenes puede implicar evaluar el tamano de particulas o celulas, caracteristicas de nucleo celular, caracteristicas del citoplasma celular, caracteristicas de organulos intracelulares, y similares. De manera relacionada, las tecnicas de analisis pueden abarcar determinados metodos de recuento o clasificacion o pruebas de diagnostico, incluyendo diferenciales de globulos blancos (WBC). En algunos casos, las imagenes obtenidas usando la celula de flujo pueden soportar una prueba de diferenciales de WBC de 5 partes. En algunos casos, las imagenes obtenidas usando la celula de flujo pueden soportar una prueba de diferenciales de WBC de 9 partes. De manera relacionada, con la referencia a la figura 4, el procesador 440 puede incluir o estar en asociacion operativa con un medio de almacenamiento que tiene una aplicacion informatica que, cuando la ejecuta el procesador, esta configurada para hacer que el sistema 400 diferencie diferentes tipos de celulas basandose en imagenes obtenidas del dispositivo de captura de imagenes. Por ejemplo, pueden usarse tecnicas de diagnostico o de prueba para diferenciar diversas celulas (por ejemplo neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos, basofilos, metamielocitos, mielocitos, promielocitos y blastocitos).
La figura 4O muestra una comparacion de imagenes obtenidas usando PIOAL frente a imagenes obtenidas usando un fluido envolvente distinto de PIOAL. El uso del PIOAL dio como resultado un contenido celular mas enfocado tal como lobulos, citoplasma y/o granulo. En este ejemplo, se uso un PIOAL que comprende un agente de viscosidad (glicerol a aproximadamente el 30%) para procesar la muestra. Se ajusto el pH a un pH de aproximadamente 6,8 a 7,2 y se hizo la mezcla de muestra isotonica mediante (cloruro de sodio al 0,9%). Los resultados mostrados en el presente documento demuestran la eficacia de un PIOAL a modo de ejemplo usado en un analizador de imagenes para alinear celulas y organulos intracelulares.
Las figuras 4P y 4Q muestran una comparacion de las imagenes obtenidas usando un fluido envolvente convencional (figura P, paneles superior e inferior) frente a las imagenes obtenidas usando un fluido de PIOAL a modo de ejemplo (figura 4Q, paneles superior e inferior). Tal como se muestra en el presente documento, el uso de PIOAL dio como resultado una alineacion de RBC mejorada. Se analizo la muestra usando un protocolo de enfoque del instrumento (en una diana 44 a modo de ejemplo tal como se representa en la figura 1) y se enfoco la diana mediante un analizador visual. Entonces se desvio el sistema de enfoque por la distancia 52 de desplazamiento, dando como resultado que las particulas en la corriente de muestra en forma de cinta estuvieran enfocadas. La muestra de sangre se diluyo previamente usando un diluyente de muestra. La muestra fluyo a traves de una canula y a lo largo de una trayectoria de flujo de una celula de flujo, generando de ese modo una corriente de muestra con forma de cinta (por ejemplo, 2 micrometros de grosor) que estaba entre dos capas de PIOAL o fluido envolvente convencional (en controles). El analizador visual genera entonces imagenes enfocadas de las particulas en la corriente de muestra en forma de cinta (por ejemplo, a aproximadamente 60 fotogramas por segundo) que van a usarse para el analisis. La muestra de sangre se obtiene de un sujeto y se procesa para su analisis por el analizador de sangre. Se capturan imagenes de RBC en una celula de flujo mientras que la muestra se procesa usando un fluido envolvente convencional o un PIOAL. Los porcentajes relativos demuestran una mejora significativa en el numero de RBC alineados basandose en los datos de obtencion de imagenes (por ejemplo 4P y 4Q). El resultado demostro que el PIOAL era eficaz en el aumento del porcentaje de alineacion de RBC mientras estaba en flujo en la corriente de muestra en forma de cinta usando el instrumento/protocolos de enfoque tal como se describe en el presente documento.
Tambien se observo que la implementacion de PIOAL da como resultado una alineacion mejorada basandose en el uso de niveles crecientes de glicerol (gly) en celulas de flujo simetricas y asimetricas.
El grafico de la figura 4R muestra el porcentaje de celulas no alineadas obtenidas usando glicerol al 0% - 30% en el PIOAL con celulas de flujo simetricas frente a asimetricas. El uso de glicerol al 30%en el PIOAL y una celula de flujo simetrica da como resultado una reduccion del porcentaje de celulas desalineadas hasta solo el 8%. Observese que sin glicerol en el PIOAL, y con una celula asimetrica, el porcentaje de celulas desalineadas aumento hasta el 87%. Por tanto, este grafico demuestra el efecto del porcentaje de glicerol y la geometria de la celula de flujo sobre la alineacion de particulas (por ejemplo, RBC). La adicion de glicerol disminuye el porcentaje de celulas RBC desalineadas usando una geometria de celula de flujo o bien simetrica o bien asimetrica. El % de RBC desalineados se redujo desde el 87% hasta el 15% en las celulas asimetricas y del 46% al 8% en las simetricas. Por tanto, el grafico proporciona una comparacion entre los resultados de desalineacion (8%) obtenidos a partir de una configuracion de analizador que implica una zona de transicion de celulas de flujo en estrechamiento simetrica y un fluido envolvente viscoso y los resultados de desalineacion (46%) obtenidos a partir de una configuracion de analizador que implica una zona de transicion de celulas de flujo en estrechamiento simetrica sin el uso de un fluido envolvente viscoso.
Estos resultados proporcionan pruebas para el descubrimiento sorprendente e inesperado de que determinadas composiciones de PIOAL tienen propiedades inesperadas que alinean celulas y reposicionan estructuras intracelulares cuando se usan para realizar analisis de celulas/particulas basado en imagenes.
A modo de ejemplo, se desarrollaron varias formulaciones de PIOAL a modo de ejemplo y metodos de uso de las mismas. Lo siguiente son algunos ejemplos de formulaciones de PIOAL con las propiedades deseadas. El PIOAL comprende un diluyente y al menos un agente de modificacion de la viscosidad.
La formulacion de PIOAL A a modo de ejemplo incluye una disolucion de glicerol al 30% (v/v) que tiene 300 ml de glicerol y CS (cantidad suficiente o para llevar el volumen final hasta) para 1 l con diluyente que contiene 9,84 g de sulfato de sodio, 4,07 g de cloruro de sodio, 0,11 g de procaina HCl, 0,68 g de fosfato de potasio monobasico, 0,71 g de fosfato de sodio dibasico y 1,86 g EDTA de disodio. La mezcla inicial se siguio mediante CS hasta 1 l con agua desionizada mientras se ajustaba el pH a 7,2 con hidroxido de sodio.
La formulacion de PIOAL B a modo de ejemplo incluye una disolucion de glicerol al 6,5% (v/v) que tiene 65 ml de glicerol y CS hasta 1 l con diluyente a modo de ejemplo adecuado que contiene 9,84 g de sulfato de sodio, 4,07 g de cloruro de sodio, 0,11 g de procaina HCl, 0,68 g de fosfato de potasio monobasico, 0,71 g de fosfato de sodio dibasico y 1,86 g de EDTA de disodio. La mezcla inicial se siguio mediante CS hasta 1 l con agua desionizada mientras se ajustaba el pH a 7,2 con hidroxido de sodio.
La formulacion de PIOAL C a modo de ejemplo incluye una disolucion de glicerol al 5% (v/v) con el 1% de PVP (p/v) en tampon que tenia 50 ml de glicerol, 10 g de PVP (PM: 360.000), 1 paquete de polvo de PBS de Sigma, a pH 7,4 (solucion salina tamponada con fosfato 0,01 M; cloruro de sodio 0,138 M; cloruro de potasio 0,0027 M) y CS hasta 1 l con agua desionizada.
La formulacion de PIOAL D a modo de ejemplo incluye una disolucion de PVP al 1,6% (p/v) que tenia 16 g de PVP (PM: 360.000) y 1 paquete de polvo de PBS de Sigma, a pH 7,4 (solucion salina tamponada con fosfato 0,01 M; cloruro de sodio 0,138 M; cloruro de potasio 0,0027 M) y CS hasta 1 l con agua desionizada.
Rendimiento
La figura 5 representa un cronograma 500 correspondiente a la inyeccion de uno o mas fluidos de muestra en una celula de flujo. Tal como se muestra en el presente documento, la inyeccion de un primer fluido de muestra puede iniciarse en una celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 510. Despues de eso, pueden obtenerse imagenes de las particulas del primer fluido de muestra en la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 515. Segun algunas realizaciones, el primer fluido de muestra puede tener un volumen en un intervalo de desde aproximadamente 5 pl hasta aproximadamente 150 pl. En algunos casos, el flujo es de 0,232 pl/s (o dentro de un intervalo de desde 0,2 pl/s hasta 0,35 pl/s) en el area de obtencion de imagenes. La inyeccion del primer fluido de muestra puede terminarse, tal como se indica mediante la etapa 520, y puede iniciarse la inyeccion de un segundo fluido de muestra dentro de la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 530. Pueden iniciarse transitorios de fluido de muestra, tal como se indica mediante la etapa 535, como resultado de la terminacion de la inyeccion del primer fluido de muestra y el inicio de la inyeccion del segundo fluido de muestra. Posteriormente, pueden disiparse los transitorios de fluido de muestra en la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 445. Pueden obtenerse imagenes de particulas del segundo fluido de muestra en la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 550. La inyeccion del segundo fluido de muestra puede terminarse, tal como se indica mediante la etapa 560. En algunos casos, los procedimientos de inyeccion y flujo se realizan a temperaturas dentro de un intervalo de desde aproximadamente 18°C hasta aproximadamente 40°C.
Normalmente, la corriente del fluido envolvente permanece fluyendo dentro de la celula de flujo cuando la muestra se inyecta, y cuando la inyeccion se termina. Por tanto, segun algunas realizaciones, se mantiene un flujo continuo de fluido envolvente mientras se pulsan inyecciones de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. El flujo continuo del fluido envolvente puede contribuir a la conservacion de una forma de cinta en el fluido de muestra cuando el fluido de muestra fluye a lo largo de la celula de flujo.
Segun algunas realizaciones, la captura de imagenes asociada con la etapa 550 puede realizarse en el plazo de cuatro segundos de la captura de imagenes asociada con la etapa 515. Segun algunas realizaciones, el tiempo entre las inyecciones de fluido de muestra primera y segunda (por ejemplo entre las etapas 510 y 530) es de aproximadamente 30 segundos. De manera relacionada, segun algunas realizaciones, el tiempo entre el inicio de la obtencion de imagenes de los fluidos de muestra primero y segundo (por ejemplo entre el inicio de la etapa 515 y el inicio de la etapa 550) es de aproximadamente 30 segundos. De este modo, es posible procesar 120 fluidos de muestra por hora. En algunos casos, un dispositivo de captura de imagenes funciona a una velocidad de fotogramas de 180 fotogramas por segundo (FPS), produciendo por tanto multiples fotogramas o imagenes consecutivas unicas a una alta frecuencia o velocidad. Tal como se muestra en el presente documento, la duracion de una etapa de obtencion de imagenes (por ejemplo 515 o 550) puede ser de 15 segundos, produciendo por tanto 2.700 imagenes por fluido de muestra.
En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de aproximadamente 1 a 3 segundos tras la inyeccion (por ejemplo etapa 510) del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de menos de 1 segundo tras la inyeccion (por ejemplo etapa 510) del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. La inyeccion de la muestra en la celula de flujo puede ser un proceso de dos etapas. Segun esta realizacion, la primera etapa es un empuje de alta velocidad que extrae todo el diluyente de la canula, y tras el empuje inicial la velocidad de flujo de la muestra se reduce significativamente. El tiempo de transicion puede definirse como el tiempo que tarda la muestra (por ejemplo una celula) en desplazarse desde la salida de la canula hasta el area de obtencion de imagenes en las condiciones de flujo de obtencion de imagenes (velocidad de flujo de la muestra mas lenta). En algunos casos, el fluido de muestra puede tardar aproximadamente 4 segundos en desplazarse desde la salida de la canula hasta el area de obtencion de imagenes. En algunos casos, el primer fluido de muestra alcanza un estado estabilizado en el plazo de aproximadamente 1,8 segundos desde la inyeccion (por ejemplo etapa 510) del primer fluido de muestra del tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo (por ejemplo desde un puerto de salida de la canula hasta un sitio de captura de imagenes) dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 hasta 4 segundos. En algunos casos, el fluido de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 1 hasta 4 segundos.
Segun algunas realizaciones, el flujo tarda entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 segundos en estabilizarse, o en desplazarse desde el puerto de salida distal de la canula hasta el area de obtencion de imagenes. En algunos casos, el periodo de duracion de la captura de imagenes puede ser de aproximadamente 20 segundos. Un sistema de hematologia segun realizaciones de la presente invencion puede procesar una muestra de sangre que tiene un volumen de aproximadamente 150 pl. El volumen de sangre aspirada puede ser de aproximadamente 120-150 pl. En algunos casos, el volumen de sangre disponible minimo en el tubo de muestra es de aproximadamente 500 pl para un modo de muestreo automatico y de aproximadamente 250 pl para modo de muestreo manual. La canula o tubo 400d de de inyeccion mostrado en la figura 4D tiene un volumen interno de aproximadamente 13 ul. Segun algunas realizaciones, la canula o tubo de inyeccion tiene un volumen interno de menos de aproximadamente 30 ul. El volumen de la muestra de sangre es eficaz para lavar la canula antes de comenzar la recogida de imagenes, y por tanto puede evitar periodos prolongados de tiempo en donde el flujo de muestra no es estable. Por ejemplo, el uso de una canula que tiene un volumen interno de aproximadamente 13 ul puede corresponder a un periodo de inestabilidad del flujo de muestra de aproximadamente 2 a 3 segundos. Segun algunas realizaciones, el volumen interno de la canula puede no tener un impacto sobre la estabilidad del flujo de muestra. Segun algunas realizaciones, el volumen interno de la canula puede tener un impacto sobre la estabilidad de la concentracion de celulas en la propia cinta de muestra si el empuje de muestra de alta velocidad inicial es insuficiente para reemplazar a todo el diluyente dentro de la canula. De manera relacionada, la canula puede limpiarse entre las muestras en una corta duracion de tiempo usando una pequena cantidad de diluyente. De este modo, es posible lograr un flujo de muestra estable que facilita la captura de una imagen de alta calidad, y al mismo tiempo lograr un alto rendimiento, con un bajo arrastre. Segun algunas realizaciones, una canula con un alto volumen interno puede requerir un empuje de alta velocidad inicial de alto volumen de la muestra para extraer todo el diluyente en las lineas y la canula. Realizaciones de la presente invencion abarcan la implementacion de volumenes de canula internos inferiores, que son adecuados para aplicaciones hematologicas en donde los volumenes de muestra disponibles son bajos, y donde puede lograrse un empuje de volumen inferior en una duracion de tiempo mas corta.
Segun algunas realizaciones, pueden configurarse sistemas de hematologia para limitar los transitorios y la contaminacion cruzada de muestras secuenciales para acelerar la adquisicion de imagenes de muestras de fluido sanguineo.
Metodos
La figura 6 representa aspectos de un metodo 600 a modo de ejemplo para obtener imagenes de particulas en una muestra de fluido sanguineo, segun realizaciones de la presente invencion. Tal como se muestra en el presente documento, la muestra 610 de sangre incluye particulas, y puede repartirse en uno o mas fluidos de muestra, tales como un primer fluido 612 de muestra que contiene particulas y un segundo fluido 614 de muestra que contiene particulas. El metodo puede incluir hacer fluir un fluido envolvente a lo largo de una trayectoria de flujo de una celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 620. Ademas, el metodo puede incluir inyectar el primer fluido 612 de muestra de un tubo de inyeccion de fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye dentro de la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 630, para proporcionar una corriente de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo de inyeccion. La trayectoria de flujo de la celula de flujo puede tener una disminucion del tamano de la trayectoria de flujo, de manera que el grosor de la corriente de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio de captura de imagenes. El metodo 600 puede incluir ademas obtener imagenes de una primera pluralidad de las particulas del primer fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 640.
El metodo 600 tambien puede incluir iniciar transitorios de fluido de muestra. Por ejemplo, pueden iniciarse transitorios de fluido de muestra terminando la inyeccion del primer fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye, e inyectando el segundo fluido de muestra en el fluido envolvente que fluye tal como se indica mediante la etapa 650. Ademas, el metodo 600 puede incluir obtener imagenes de una segunda pluralidad de las particulas del segundo fluido de muestra en el sitio de captura de imagenes de la celula de flujo, tal como se indica mediante la etapa 660. Segun algunas realizaciones, la obtencion de imagenes de la segunda pluralidad de particulas puede realizarse sustancialmente despues de los transitorios de fluido de muestra y en el plazo de 4 segundos de la obtencion de imagenes de la primera pluralidad de las particulas.
Velocidad de deformacion por corte
Las figuras 7 y 8 representan aspectos de los valores de velocidad de deformacion por corte para determinadas condiciones de flujo en una celula de flujo segun realizaciones de la presente invencion. En cada uno de estos dibujos, se usa un fluido envolvente de glicerol al 30%. En algunos casos, la viscosidad puede tener un valor 2,45 x 10-3. Un valor de deformacion por corte puede ser igual al producto obtenido multiplicando un valor de viscosidad por un valor de velocidad de deformacion. Con respecto a la figura 7, la muestra puede tener una velocidad de flujo de 0,3 pl/s y el fluido envolvente puede tener una velocidad de flujo de 21 pl/s. Con respecto a la figura 8, la muestra puede tener una velocidad de flujo de 1 pl/s y el fluido envolvente puede tener una velocidad de flujo de 70 pl/s. En cada una de estas figuras, puede observarse que el flujo presenta un valor de deformacion inferior hacia el centro (C) y un valor de deformacion superior hacia la periferia (P). Tales valores de deformacion pueden corresponderse con una configuracion de celula de flujo asimetrica, en algunas realizaciones.
Tal como se representa en la figura 7, segun algunas realizaciones, la velocidad de deformacion inferior hacia la porcion central (C) de la corriente de flujo puede tener un valor de aproximadamente 500 (1/s) o inferior y la velocidad de deformacion superior hacia la periferia (P) de la corriente de flujo puede tener un valor de aproximadamente 3000 (1/s) o superior. Tal como se representa en la figura 8, segun algunas realizaciones, la velocidad de deformacion inferior hacia la porcion central (C) de la corriente de flujo puede tener un valor de aproximadamente 1000 (1/s) o inferior y la velocidad de de deformacion superior hacia la periferia (P) de la corriente de flujo puede tener un valor de aproximadamente 9000 (1/s) o superior.
Por tanto, puede observarse que velocidades de fluido envolvente y de muestra inferiores (por ejemplo, la figura 7) se corresponden con velocidades de deformacion inferiores, y velocidades de fluido envolvente y de muestra superiores (por ejemplo, la figura 8) se corresponden con velocidades de deformacion superiores. Se entiende que las realizaciones de la presente invencion abarcan el uso de fluidos envolventes y/o de muestra correspondientes a diversos valores de viscosidad, diversos valores de velocidad de deformacion y/o diversos valores de deformacion por corte.
Objetivo de autoenfoque
Volviendo la referencia a la figura 1, los sistemas de obtencion de imagenes de particulas pueden incluir una diana 44 o patron de autoenfoque que esta fija en relacion con la celulas 22 de flujo. La diana 44 de autoenfoque puede usarse para lograr imagenes enfocadas de particulas de fluido sanguineo que fluyen a traves de la celula de flujo. La figura 9A representa una diana 900 de autoenfoque a modo de ejemplo que no es parte de la presente invencion, pero no obstante es util para entender la presente invencion. Tal como se muestra en el presente documento, la diana 900 incluye una banda 910 anular opaca y una abertura 920 o centro transparente. En funcionamiento, el dispositivo de obtencion de imagenes se enfoca sobre la banda 910, y captura la imagen a traves de la abertura. Tal como se comenta en otra parte en el presente documento, un proceso de captura de imagenes puede implicar en primer lugar enfocar (o autoenfocar) sobre la banda 910, y luego ajustar una distancia entre el dispositivo de captura de imagenes y la corriente de fluido de muestra antes de obtener la imagen a traves de la abertura 920. Por consiguiente, la banda 910 puede presentar una diana que un sistema de autoenfoque del dispositivo de captura de imagenes puede detectar y enfocar, y determinadas porciones de la diana (por ejemplo bordes o segmentos) pueden incluirse en la imagen. En algunos casos, la diana puede proporcionarse como un disco cromatico que tiene una abertura central. Una diana a modo de ejemplo puede estar dotada de una perforacion central, que tiene un diametro de aproximadamente 0,5 mm, que esta pegada o fijada a la celula de flujo. El tamano de la abertura 920 o perforacion central puede seleccionarse de modo que solo cuatro porciones 930 de borde de la banda 910 anular opaca son visibles en la imagen 940 capturada, tal como se ilustra en la figura 9B. Por tanto, la banda 910 anular no interfiere con la captura de imagenes celulares (por ejemplo, la luz puede pasar a traves de la abertura 920 para iluminar las particulas de muestra, y el campo de vision no esta sustancialmente impedido por la banda anular). De este modo, la banda 910 aparece solo en las esquinas de la imagen.
La figura 10 representa una diana 1000 de autoenfoque a modo de ejemplo que no es parte de la presente invencion, pero no obstante es util para entender la presente invencion. La diana 1000 incluye una banda o borde 1010 y una abertura 1020 central. La figura 11 muestra otra diana 1100 de autoenfoque a modo de ejemplo que no es parte de la presente invencion, pero no obstante es util para entender la presente invencion. La diana 1100 incluye una banda o borde 1110 y una abertura 1120 central. Segun algunas realizaciones, la diana 1100 de autoenfoque proporciona una imagen que tiene 50 pixeles de negro sobre la parte superior y la inferior. En algunos casos, la diana 1100 de autoenfoque proporciona una desviacion de enfoque de celula de flujo (FCFO) de aproximadamente 65,3 pm.
La figura 12A representa una diana 1200 de autoenfoque a modo que ejemplo que no es parte de la presente invencion, pero no obstante es util para entender la presente invencion. La diana 1200 se presenta como un diseno de buzon, e incluye un primer borde 1210 o superior y un segundo borde 1220 o inferior. La diana 1200 tambien incluye una abertura o paso 1230 transparente entre los bordes primero y segundo. Segun algunos ejemplos, que no son parte de la presente invencion, pero no obstante son utiles para entender la presente invencion, la diana tiene un diametro de aproximadamente 4 mm, y la altura del buzon es de 265 pm. En algunos casos, los bordes superior e inferior pueden estar presentes como medios circulos, y pueden producirse como un metal depositado tal como oxido de cromo o algun otro material opaco.
La figura 12B muestra una vista ampliada de la porcion distal de la diana 1200 de autoenfoque. Tal como se muestra en el presente documento, el primer borde 1210 incluye una escala numerica negativa/positiva, con un valor cero centrado. El segundo borde 1220 incluye una escala similar. En algunos casos, los incrementos de escala son de 100 pm. Segun algunos ejemplos, que no son parte de la presente invencion, pero no obstante son utiles para entender la presente invencion, las escalas pueden usarse para facilitar la colocacion de la celula de flujo de modo que el campo de vision del dispositivo de obtencion de imagenes o camara pueda centrarse sobre la corriente de muestra. Tal como se muestra en el presente documento, la corriente 1240 de muestra fluye en una direccion perpendicular a las escalas de los bordes primero y segundo. Como parte de un protocolo de enfoque, el dispositivo de captura de imagenes puede funcionar enfocando los numeros u otros caracteres u objetos de los que pueden obtenerse imagenes presentes en los bordes 1210, 1220.
Ejemplos que no son parte de la presente invencion, pero no obstante son utiles para entender la presente invencion abarcan tecnicas para abordar la deriva termica asociada con el uso del sistema de analisis de particulas, mediante lo cual tales efectos termicos pueden comprometer por lo demas la calidad de las imagenes obtenidas con el dispositivo de obtencion de imagenes. La figura 13A representa una vista lateral parcial de una celula 1320 de flujo que tiene un sensor 1370 termico, un reflector 1380 y una diana 1344 de autoenfoque. Durante el funcionamiento de un sistema de analisis de particulas, efectos termicos pueden provocar que la corriente de muestra se desvie lentamente del foco del dispositivo de obtencion de imagenes. Por ejemplo, los efectos termicos pueden provocarse por la expansion termica de la celula de flujo a traves del calor irradiado procedente de la lampara. Ademas, los efectos termicos pueden provocarse por la expansion termica de la celula de flujo y el conjunto de conjunto de banco optico (OBA) a traves de calentamiento por conduccion y radiacion. En algunas realizaciones, determinados componentes del OBA pueden expandirse, lo que puede contribuir a errores de enfoque. Por ejemplo, tales componentes pueden incluir placas de metal que mantienen la camara 24 junta, una placa de metal que mantiene o esta conectada a la celula de flujo o una placa de metal que mantiene tanto la celula de flujo como la camara 24 juntas. La figura 13B representa una vista en perspectiva parcial de la celula 1320 de flujo que tienen un sensor 1370 termico y diana 1344 de autoenfoque. Ademas, la figura 13C representa otra vista en perspectiva de la celula 1320 de flujo que tiene un sensor 1370 termico, reflector 1380 y diana 1344 de autoenfoque.
El reflector 1380 puede funcionar reduciendo o limitando la cantidad de calor absorbido por la celula 1320 de flujo. Por ejemplo, el reflector 1380 puede bloquear el calor irradiado por una lampara 1342 de centelleo tal como se indica en la figura 13A. Por tanto, el reflector 1380 puede minimizar el impacto termico de la lampara. El reflector 1342 puede reducir tambien el resplandor y la dispersion de luz generados por la lampara, dando como resultado por tanto una calidad de imagen mejorada. El sensor 1370 termico se coloca cerca del canal de flujo de fluido y adyacente al sitio de captura de imagenes, de modo que pueden obtenerse lecturas de temperatura precisas. Puede usarse la informacion del sensor de temperatura para enfocar el dispositivo de captura de imagenes sobre la corriente de cinta de fluido de muestra.
Tal como se representa en la figura 13D, una celula 1300d de flujo puede incluir una trayectoria 1322d de flujo que tiene un puerto u orificio 1301 d de ventilacion a traves del cual pueden liberarse o eliminarse las burbujas 1302d. Tal como se representa en el presente documento, un tubo 1303d, a traves del cual puede aplicarse vacio, puede estar en contacto con el puerto 1301 d para retirar las burbujas 1302d de la corriente de flujo. Un mecanismo de eliminacion de burbujas de este tipo es adecuado para eliminar burbujas del fluido que fluye dentro de la celula de flujo, y puede funcionar impidiendo que se depositen o atasquen burbujas o microburbujas dentro de la celula de flujo.
Cada uno de los calculos u operaciones descritos en el presente documento puede realizarse usando un ordenador u otro procesador que tiene hardware, software y/o firmware. Las diversas etapas del metodo pueden realizarse por modulos, y los modulos pueden comprender cualquiera de una amplia variedad de hardware y/o software de procesamiento de datos digitales y/o analogicos para realizar las etapas del metodo descritas en el presente documento. Los modulos comprenden opcionalmente hardware de procesamiento de datos adaptado para realizar una o mas de estas etapas al tener un codigo de programacion de maquinas apropiado asociado con el mismo, estando integrados los modulos para dos o mas etapas (o porciones de dos o mas etapas) en una unica placa de procesador o separados en diferentes placas de procesador en una cualquiera de una amplia variedad de arquitecturas de procesamiento integradas y/o distribuidas. Estos metodos y sistemas emplearan a menudo un medio tangible que incorpora un codigo legible por maquina con instrucciones para realizar las etapas del metodo descritas anteriormente. El medio legible adecuado puede comprender una memoria (incluyendo una memoria volatil y/o una memoria no volatil), un medio de almacenamiento (tal como una grabacion magnetica en un disco flexible, un disco duro, una cinta, o similar; en una memoria optica tal como un CD, un CD-R/W, un CD-ROM, un DVD, o similar; o cualquier otro medio de almacenamiento digital o analogico), o similar.
Son posibles diferentes disposiciones de los componentes representados en los dibujos o descritos anteriormente, asi como componentes y etapas no mostrados ni descritos. De manera similar, algunas caracteristicas y subcombinaciones son utiles y pueden emplearse sin la referencia a otras caracteristicas y subcombinaciones. Se han descrito realizaciones de la invencion para fines ilustrativos y no restrictivos, y les resultaran evidentes realizaciones alternativas a los lectores de esta patente. En determinados casos, las etapas u operaciones del metodo pueden realizarse o ejecutarse en orden diferente, o pueden anadirse, eliminarse o modificarse operaciones. Puede apreciarse que, en determinados aspectos de la invencion, un unico componente puede reemplazarse por multiples componentes, y multiples componentes pueden reemplazarse por un unico componente, para proporcionar un elemento o estructura o para realizar una funcion o funciones dadas. Excepto cuando tal sustitucion no fuera operativa para poner en practica determinadas realizaciones de la invencion, tal sustitucion se considera dentro del alcance de la invencion. Por consiguiente, la presente invencion no se limita a las realizaciones descritas anteriormente o representadas en los dibujos, y pueden hacerse diversas realizaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones a continuacion.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Metodo para obtener imageries de particulas usando un sistema de analisis de particulas configurado para hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria de las particulas incluidas dentro de una muestra (25) de fluido sanguineo, comprendiendo el metodo:
    inyectar un fluido (426) envolvente a lo largo de una trayectoria (422) de flujo de una celula (22, 33, 420) de flujo del analizador de particulas, teniendo el fluido (426) envolvente una viscosidad que es mayor que una viscosidad de la muestra (25) de fluido sanguineo;
    inyectar la muestra (25) de fluido sanguineo a partir de un tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra a una velocidad de flujo en el fluido (426) envolvente que fluye dentro de la celula (22, 33, 420) de flujo para proporcionar una corriente (32, 428) de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo (21, 412, 400d) de inyeccion, teniendo la trayectoria (422) de flujo de la celula (22, 33, 420) de flujo una disminucion del tamano (21,419) de la trayectoria de flujo de modo que el grosor de la corriente (32, 428) de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio (432) de captura de imagenes;
    obtener imagenes de una primera pluralidad de las particulas de la muestra (25) en el sitio (432) de captura de imagenes de la celula (22, 33, 420) de flujo;
    en el que la disminucion del tamano (422) de la trayectoria de flujo se define por una porcion (21a) de trayectoria de flujo proximal que tiene un grosor proximal, y porcion (21b) de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor distal menor que el grosor proximal, estando la razon del grosor proximal con respecto al grosor distal en el intervalo de 10 a 200,
    en el que un extremo (427a) posterior del tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra se coloca de manera distal a la porcion (21 a) de trayectoria de flujo proximal,
    en el que una diferencia de viscosidad entre el fluido (426) envolvente y la muestra (25) de fluido sanguineo, en combinacion con la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo y la velocidad de flujo de la muestra, es eficaz para suministrar celulas en la muestra (25) de fluido sanguineo desde el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imagenes en un tiempo de transito distinto de cero que es de cuatro segundos o menos, mientras que un agente de viscosidad en el fluido (426) envolvente mantiene la viabilidad de las celulas que salen de la estructura y el contenido de las celulas intacto cuando las celulas se extienden desde la corriente de fluido de muestra al interior del fluido envolvente que fluye a medida que las celulas se desplazan desde el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imagenes.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el fluido (426) envolvente se inyecta a lo largo de la trayectoria (422) de flujo a una velocidad de flujo de fluido envolvente, en el que la velocidad de flujo del fluido (426) envolvente y la seccion transversal del area de flujo de la celula de flujo se corresponden con una velocidad de fluido envolvente, en el que la velocidad de flujo de la muestra (25) de fluido sanguineo y la seccion transversal del area de flujo de un puerto de salida del tubo (P, 331,431) de inyeccion se corresponden con una velocidad de muestra, y en el que hay una diferencia de velocidad entre la velocidad de fluido envolvente y la velocidad de muestra.
    Metodo segun la reivindicacion 2, en el que las diferencias de viscosidad y velocidad y la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo son eficaces para el hidroenfoque de celulas en la muestra (25) de fluido sanguineo en el sitio (432) de captura de imagenes.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que o bien:
    la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo se define por paredes (421a, 423a) opuestas de la trayectoria (422) de flujo que se inclinan radialmente hacia dentro a lo largo de la trayectoria (422) de flujo generalmente simetrica sobre un plano (451a) transversal que biseca los grosores primero y segundo de la corriente de fluido de muestra; o bien:
    la simetria en la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo es eficaz para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra (25) de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 20%.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que o bien:
    la muestra (25) de fluido sanguineo comprende particulas esfericas, y la diferencia de viscosidad entre el fluido (25) de muestra y el fluido (426) envolvente es eficaz para alinear organulos intracelulares de las particulas esfericas dentro de un plano focal en el sitio (432) de captura de imagenes de la celula (22,33, 420) de flujo; o bien:
    el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion comprende una porcion (21a) proximal que tiene una primera area de seccion transversal de flujo y una porcion (21b) distal que tiene una segunda area de seccion transversal de flujo, y en el que el area de seccion transversal de flujo de la porcion (21 a) proximal es mayor de 1,5 veces el area de seccion transversal de flujo de la porcion (21b) distal.
    Metodo segun la reivindicacion 1, en el que o bien:
    una razon de velocidad de flujo de fluido envolvente con respecto a velocidad de flujo de fluido de muestra es de aproximadamente 200; o bien:
    el segundo grosor de la corriente (32, 428) de fluido de muestra esta dentro de un intervalo de desde aproximadamente 2 ^m hasta aproximadamente 10 |^m; o bien:
    una razon del primer grosor de la corriente (32, 428) de fluido de muestra con respecto al segundo grosor de la corriente (32, 428) de fluido de muestra tiene un valor dentro de un intervalo de desde aproximadamente 20:1 hasta aproximadamente 70:1.
    Sistema de analisis de particulas que realiza hidroenfoque combinado de la viscosidad y geometria para obtener imagenes de particulas en una muestra (25) de fluido sanguineo, comprendiendo el sistema:
    una celula (22, 33, 420) de flujo que tiene una trayectoria (422) de flujo configurada para transmitir un flujo de fluido (426) envolvente, teniendo el fluido (426) envolvente una viscosidad que es mayor que una viscosidad de la muestra (25) de fluido sanguineo;
    un sistema de inyeccion de fluido de muestra en comunicacion de fluido con la trayectoria (420) de flujo y configurado para inyectar la muestra (25) al interior del fluido (426) envolvente que fluye dentro de la celula (22, 33, 420) de flujo para proporcionar una corriente (32, 428) de fluido de muestra que tiene un primer grosor adyacente al tubo (29, 412, 400d) de inyeccion, teniendo la trayectoria de flujo de la celula de flujo una disminucion del tamano (21, 419) de la trayectoria de flujo de modo que el grosor de la corriente de fluido de muestra disminuye desde el grosor inicial hasta un segundo grosor adyacente a un sitio (432) de captura de imagenes; en el que la disminucion del tamano (422) de la trayectoria de flujo se define por una porcion (21a) de trayectoria de flujo proximal que tiene un grosor proximal, y una porcion (21b) de trayectoria de flujo distal que tiene un grosor distal menor que el grosor proximal, estando la razon del grosor proximal con respecto al grosor distal en el intervalo de 10 a 200, y un extremo (427a) posterior del tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra se coloca de manera distal a la porcion (21 a) de trayectoria de flujo proximal;
    un dispositivo (430) de captura de imagenes alineado con el sitio de captura de imagenes para obtener imagenes de una pluralidad de las particulas del fluido (25) de muestra en el sitio (432) de captura de imagenes de la celula (22,33, 420) de flujo; y
    un procesador (440) y un medio tangible no transitorio legible por ordenador, el procesador acoplado con el sistema de inyector de fluido de muestra y el dispositivo (430) de captura de imagenes, el medio legible por ordenador programado con una aplicacion informatica que, cuando la ejecuta el procesador (440), hace que el procesador (440) inicie la inyeccion del fluido (25) de muestra al interior del fluido (426) envolvente que fluye a una velocidad de flujo de muestra, de modo que la diferencia de viscosidad entre las muestras de fluido sanguineo y envolvente, en combinacion con la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo y la velocidad de flujo de la corriente (32, 428) de fluido de muestra, es eficaz para suministrar celulas en la muestra (25) de fluido sanguineo desde el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imagenes en un tiempo de transito distinto de cero que es de cuatro segundos o menos, mientras que un agente de viscosidad en el fluido (426) envolvente mantiene la viabilidad de las celulas que salen de la estructura y el contenido de las celulas intacto cuando las celulas se extienden desde la corriente (32, 428) de fluido de muestra al interior del fluido (426) envolvente que fluye a medida que las celulas se desplazan desde el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imagenes.
    Sistema segun la reivindicacion 7,
    la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo se define por paredes (421a, 423a) opuestas de la trayectoria de flujo que se inclinan radialmente hacia dentro a lo largo de la trayectoria de flujo generalmente simetrica sobre un plano (451a) transversal que biseca los grosores primero y segundo de la corriente de fluido de muestra.
    Sistema segun la reivindicacion 7, en el que o bien:
    la simetria en la disminucion del tamano de la trayectoria de flujo es eficaz para limitar la desalineacion de la orientacion de la obtencion de imagenes de globulos rojos en la muestra (25) de fluido sanguineo hasta menos de aproximadamente el 20%; o bien:
    el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion comprende una porcion (21a) proximal que tiene una primera area de seccion transversal de flujo y una porcion (21b) distal que tiene una segunda area de seccion transversal de flujo, y en el que el area de seccion transversal de flujo de la porcion (21 a) proximal es mayor de 1,5 veces el area de seccion transversal de flujo de la porcion (21b) distal.
    Sistema segun la reivindicacion 7, en el que o bien:
    el fluido (32, 428) de muestra tiene un tiempo de transito a traves de la celula (22, 33, 420) de flujo dentro de un intervalo de desde aproximadamente 1 hasta 4 segundos; o bien:
    la celula (22, 33, 420) de flujo esta configurada para recibir el fluido (426) envolvente desde una fuente de fluido envolvente en la trayectoria (422) de flujo en una primera direccion de flujo que es perpendicular a la segunda direccion de flujo del fluido (426) envolvente a lo largo de la trayectoria (422) de flujo en el sitio (432) de obtencion de imagenes.
    11. Sistema segun la reivindicacion 7, en el que la celula (22,33, 420) de flujo comprende una diana de autoenfoque para el dispositivo de captura de imagenes.
    12. Sistema segun la reivindicacion 7, que comprende ademas una diana (44, 900, 1000, 1200, 1344) de autoenfoque que tiene una posicion fija en relacion con la celula (22, 33, 420) de flujo.
    13. Sistema segun la reivindicacion 7, en el que la diferencia de viscosidad entre el fluido (426) envolvente y la muestra (428) de fluido sanguineo, en combinacion con la disminucion del tamano (21, 419) de la trayectoria de flujo y la velocidad de flujo de la corriente (32, 428) de fluido de muestra, es eficaz para suministrar celulas en la muestra (25) de fluido sanguineo desde el tubo (29, 412, 400d) de inyeccion de fluido de muestra hasta el sitio (432) de captura de imagenes en de 1 segundo a 4 segundos.
    14. Sistema segun la reivindicacion 7, en el que el dispositivo (432) de captura de imagenes comprende un dispositivo de obtencion de imagenes de alta resolucion optica o un dispositivo de captura de imagenes digital.
    15. Sistema segun la reivindicacion 7, en el que el dispositivo (432) de captura de imagenes tiene una resolucion optica de 1 pm o menos.
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