JPH07155179A - アスコルビン酸オキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】アスコルビン酸オキシダーゼの製造法を提供す
る。 【構成】ペニシリウム（Penicillium）属に属する菌株
を培養し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産せしめ、
これを採取することを特徴とするアスコルビン酸オキシ
ダーゼの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アスコルビン酸オキシ
ダーゼ（以下、ＡＳＯという）の製造法に関する。より
詳細には、ペニシリウム属に属する菌株を培養し、ＡＳ
Ｏを製造する方法に関する。

【０００２】ＡＳＯは、アスコルビン酸を基質として酸
化反応によりデヒドロアスコルビン酸と水を生ずる反応
を触媒する酵素であり、国際生化学連合（I.U.B）の分
類によればEC 1.10.3.3に分類される。ＡＳＯは、食品
分野や試薬分野に広く使用されている。

【０００３】食品分野としては、例えばアスコルビン酸
と併用するなどして食品中の脱酸素に利用される。

【０００４】また臨床検査分野としては、例えばパーオ
キシダーゼを利用した過酸化水素と色原体との共役呈色
反応を強力に妨害するアスコルビン酸の影響回避のため
に用いられる。通常の血清アスコルビン酸の濃度は１mg
/dl以下であり余り問題とはならないが、例えば尿中ア
スコルビン酸濃度は高い値となる。また、点滴補液など
で大量のアスコルビン酸を投与するときなどは血中濃度
も上昇し、共存するアスコルビン酸の影響は非常に大き
い。

【０００５】アスコルビン酸の影響を除去するために
は、アルカリ処理、銅イオンや鉄イオンによる処
理、過ヨウ素酸による処理、ＡＳＯによる処理が行
われるが、通常はのＡＳＯを臨床検査用試薬に共存さ
せることによって解決している。

【０００６】

【従来の技術】ＡＳＯは、各種の植物に分布することが
知られており、カボチャ〔M. H. Leeand C. R. Dawson
（1973）J. Biol. Chem., 248, 6596頁〕及びキュウリ
〔T. Nakamura, N. Makino and Y. Ogura（1968）J. Bi
ochem., 64, 189頁〕から単離されている。

【０００７】一方、微生物由来のＡＳＯとしてミロセシ
ウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）の菌糸
〔G. A. White and R. M. Krupka（1965）Arch. Biochi
m. Biphys., 110, 448頁 〕や胞子〔舟木ら（1987）日
本栄養食糧学会誌, 40, 47頁〕、アエロバクター・アエ
ロゲネス（Acetobacter aerogenes）〔W. A. Volk and
J. L. Larssen（1963）Biochim. Biophys. Acta., 67,
576頁〕或いはアクレモニウム・エスピー（Acremonium
sp.）HI-25〔S. Murao et al.（1992）Biosci.Biotechn
ol. Biochem., 56, 847頁〕由来の報告がある。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記した植物由来のＡ
ＳＯはその給源に問題を有し、微生物由来のＡＳＯも生
産性などに問題を有していた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記のような
状況のもとでＡＳＯの新たな給源を探索したところ、従
来知られていなかった微生物がＡＳＯを生産することを
見いだし本発明を完成した。

【００１０】本発明に使用する微生物としてはペニシリ
ウムに属する菌株であれば何れも使用できる。より具体
的に示すと、例えば公的機関に寄託され何人も入手可能
な菌株としては、Penicillium purpurogenum IFO 568
8、Penicillium ruburm IFO 6580、Penicillium oxalic
um IFO 5748、Penicillium notatum IFO 4640、Penicil
lium chrysogenum IFO 4897、Penicillium urtica IFO
7011、Penicillium canescens IFO 7955、Penicillium
janthinellum IFO 7905、Penicillium caseicolum ATCC
24936等が挙げられる。

【００１１】ペニシリウム属に属する菌株を用いてＡＳ
Ｏを製造するための菌の培養法としては、液体培養、固
体培養のいずれでも良いが、より好ましくは液体培養が
利用できる。液体培養法としては例えば、以下のように
して行うことができる。

【００１２】使用できる培地としては、ペニシリウム属
に属する菌株が生育可能な培地であれば、如何なるもの
でも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グリセ
リン、デキストリン、糖蜜・有機酸等の炭素源、更に硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキ
ス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜
鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。

【００１３】培地のpHは例えば約３〜９、好ましくは約
5.5〜6.5程度に調製し、培養温度は通常約10〜50℃、好
ましくは約25〜37℃程度で、１〜20日間、好ましくは３
〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培養
法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利
用できる。また、通常の固体培養法により培養すること
もできる。

【００１４】得られた培養物より菌体を除去した培養ろ
液又は固体培養抽出液からＡＳＯを通常の手段で単離し
ＡＳＯを得ことができる。

【００１５】例えば培養ろ液から、ＡＳＯを単離精製す
るには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン交換樹脂を
用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒドロキシル
アパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフィー等を用
い常法により処理して、精製ＡＳＯを得ることができ
る。

【００１６】パーオキシダーゼを用いた過酸化水素と色
原体との共役反応を用いて生体成分の測定を行う臨床検
査用試薬において、本発明のＡＳＯを用い、試料中のア
スコルビン酸の影響を回避することができる。

【００１７】例えばコレステロール、中性脂肪、遊離脂
肪酸、リン脂質、尿酸、クレアチニン、無機リン、シア
ル酸の測定など、パーオキシダーゼの存在下で過酸化水
素との酸化縮合反応を利用する測定系にはすべてに適用
できる。その場合、本発明のＡＳＯの使用量は対象とす
る試料中のアスコルビン酸の濃度によるが通常0.1〜100
単位／assay使用される。

【００１８】尚、本発明においてＡＳＯ活性の測定方法
は以下に示す通りである。10mM Na₂HPO₄ 0.5ml，１mM E
DTAを含む0.2M KH₂PO₄ 0.45ml、試料 0.1mlを混合し、3
0℃，５分間プレインキュベートする。１mM EDTAを含む
0.001N HClにＬ−アスコルビン酸を10mMになるように溶
解した基質 0.05mlを添加し、30℃，10分間インキュベ
ーションを行った。0.2Ｎ HCl 3.0mlの添加で反応を停
止し、245nmにおける吸光度の減少を測定する。ＡＳＯ
の１単位は、１分間にＬ−アスコルビン酸を１μmol分
解する酵素量である。

【００１９】以下実施例をあげて、本発明をより具体的
に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００２０】

【実施例】

実施例１ グリセロール ２％（W/V）、ポリペプトン １％（W/
V）、魚肉エキス ２％（W/V）、K₂HPO₄ 0.2％（W/V）、
MgSO₄・７H₂O 0.01％（W/V）、アデカノール 0.001％（W
/V）、pH6.0よりなる培地20Ｌを30Ｌ容のジャーファメ
ンターに仕込み、121℃で30分間殺菌した。他方、同組
成培地を用い、500ml容坂口フラスコで30℃，３日間予
め振盪培養しておいたPenicillium canescens IFO 7955
の培養液100mlを前記培地に無菌的に植菌し、30℃で６
日間通気攪拌培養（200rpm、１vvm）した。培養ろ液の
ＡＳＯ活性は0.03単位／mlであった。

【００２１】実施例２ 実施例１のPenicillium canescens IFO 7955に代えてそ
の他の菌株を同様にして培養したところ表１に示すよう
な結果となった。

【００２２】

【表１】

【００２３】実施例３ 実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙 No.２を用いてろ
別し、培養ろ液12Ｌを得た。限外ろ過のモジュールを用
いて１Ｌ迄濃縮し、この濃縮液に同量の冷エタノールを
添加し、冷蔵室で一晩攪拌した。遠心分離により、沈殿
を回収し、10mM酢酸バッファー（pH5.0）で溶解した。

【００２４】予め、同バッファーで平衡化させたDEAE-S
epharoseに沈殿溶解液を供し、同バッファーで洗浄し
て、DEAE-Sepharose未吸着画分を集めた。この画分を限
界ろ過モジュールで脱塩濃縮し、凍結乾燥し粉末を得
た。得られた精製ＡＳＯ粉末の比活性は10.0単位／mgタ
ンパク質であった。また、実施例２で得られた培養物か
らも同様にしてＡＳＯを濃縮精製することができた。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、ＡＳＯを新たにペニシ
リウム属菌株から得ることができ、臨床検査試薬、食品
分野に広く使用することができる。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年２月１５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】一方、微生物由来のＡＳＯとしてミロセシ
ウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒ
ｕｃａｒｉａ）の菌糸（Ｇ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ
Ｒ．Ｍ．Ｋｒｕｐｋａ（１９６５）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．，１１０，４４８頁〕や胞子
〔舟木ら（１９８７）日本栄養食糧学会誌，４０，４７
頁〕、アエロバクター・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）〔Ｗ．Ａ．Ｖｏｌｋ ａ
ｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｌａｒｓｓｅｎ（１９６３）Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，６７，５７６頁〕
或いはアクレモニウム・エスピー（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍ ｓｐ．）ＨＩ−２５〔Ｓ．Ｍｕｒａｏｅｔ ａｌ．
（１９９２）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，５６，８４７頁〕由来の報告がある。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】使用できる培地としては、ペニシリウム属
に属する菌株が生育可能な培地であれば、如何なるもの
でも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グリセ
リン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキ
ス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜
鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ペニシリウム（Penicillium）属に属する
   菌株を培養し、アスコルビン酸オキシダーゼを生産せし
   め、これを採取することを特徴とするアスコルビン酸オ
   キシダーゼの製造法。