JPH07155183A - 組換えプラスミドベクター、バチルス属細菌、およびブタ成長ホルモンの製造方法 - Google Patents
組換えプラスミドベクター、バチルス属細菌、およびブタ成長ホルモンの製造方法Info
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- JPH07155183A JPH07155183A JP5339300A JP33930093A JPH07155183A JP H07155183 A JPH07155183 A JP H07155183A JP 5339300 A JP5339300 A JP 5339300A JP 33930093 A JP33930093 A JP 33930093A JP H07155183 A JPH07155183 A JP H07155183A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 天然型ブタ成長ホルモンを、簡単な工程で効
率よく、多量且つ安価に得る。 【構成】 枯草菌α−アミラーゼなどのバチルス属細菌
分泌蛋白質のシグナル配列をコードする遺伝子領域とそ
の下流側に位置するブタ成長ホルモン構造遺伝子領域と
からなる雑種ブタ成長ホルモン遺伝子と、前記雑種ブタ
成長ホルモン遺伝子の上流に枯草菌などのバチルス属細
菌で機能し得るプロモーターを含有する組換えプラスミ
ドベクター。前記ベクターにより、低プロテアーゼ枯草
菌などのバチルス属細菌を形質転換し、得られた形質転
換株を培養すると、多量のブタ成長ホルモンが得られ
る。
率よく、多量且つ安価に得る。 【構成】 枯草菌α−アミラーゼなどのバチルス属細菌
分泌蛋白質のシグナル配列をコードする遺伝子領域とそ
の下流側に位置するブタ成長ホルモン構造遺伝子領域と
からなる雑種ブタ成長ホルモン遺伝子と、前記雑種ブタ
成長ホルモン遺伝子の上流に枯草菌などのバチルス属細
菌で機能し得るプロモーターを含有する組換えプラスミ
ドベクター。前記ベクターにより、低プロテアーゼ枯草
菌などのバチルス属細菌を形質転換し、得られた形質転
換株を培養すると、多量のブタ成長ホルモンが得られ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ブタ成長ホルモンをコ
ードする遺伝子を含む組換えプラスミドベクター、この
ベクターで形質転換されたバチルス属細菌、およびこの
バチルス属細菌によるブタ成長ホルモンの製造方法に関
する。
ードする遺伝子を含む組換えプラスミドベクター、この
ベクターで形質転換されたバチルス属細菌、およびこの
バチルス属細菌によるブタ成長ホルモンの製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ブタ成
長ホルモンは、ブタの脳下垂体好酸球性細胞から分泌さ
れ、１９１個のアミノ酸残基からなる分子量約２２００
０のタンパク質である。ブタ成長ホルモンは、成長促進
作用、乳量増加作用などの生理活性を有することから、
ブタの成長促進剤として利用できる。
長ホルモンは、ブタの脳下垂体好酸球性細胞から分泌さ
れ、１９１個のアミノ酸残基からなる分子量約２２００
０のタンパク質である。ブタ成長ホルモンは、成長促進
作用、乳量増加作用などの生理活性を有することから、
ブタの成長促進剤として利用できる。
【０００３】一方、ブタ成長ホルモンを生産する方法と
して、ブタの脳下垂体から抽出する方法が知られてい
る。しかし、この方法は生産性が低い。
して、ブタの脳下垂体から抽出する方法が知られてい
る。しかし、この方法は生産性が低い。
【０００４】また、遺伝子組換え手法を用いた大腸菌に
よりブタ成長ホルモンを生産する方法も知られている。
しかし、この方法には、以下ような問題がある。すなわ
ち、遺伝子の５′領域に翻訳開始コドンＡＴＧを必要と
するため、産出するホルモン蛋白質のＮ末端に余分なメ
チオニン残基が結合し、天然型とは異なるメチオニル−
ブタ成長ホルモンが産出される。また、大腸菌では、菌
体内生産が行われるため、ブタ成長ホルモン分子内の２
か所のシステイン−システイン結合が形成されない。し
たがって、生産物をそのまま使用することができず、メ
チオニン残基を除去しシステイン−システイン結合を形
成させる反応工程が必要となる。さらに、大腸菌を宿主
とする方法では、多量の発熱物質がブタ成長ホルモンに
混入する。そのため、多大な精製設備を必要とする。
よりブタ成長ホルモンを生産する方法も知られている。
しかし、この方法には、以下ような問題がある。すなわ
ち、遺伝子の５′領域に翻訳開始コドンＡＴＧを必要と
するため、産出するホルモン蛋白質のＮ末端に余分なメ
チオニン残基が結合し、天然型とは異なるメチオニル−
ブタ成長ホルモンが産出される。また、大腸菌では、菌
体内生産が行われるため、ブタ成長ホルモン分子内の２
か所のシステイン−システイン結合が形成されない。し
たがって、生産物をそのまま使用することができず、メ
チオニン残基を除去しシステイン−システイン結合を形
成させる反応工程が必要となる。さらに、大腸菌を宿主
とする方法では、多量の発熱物質がブタ成長ホルモンに
混入する。そのため、多大な精製設備を必要とする。
【０００５】従って、本発明の目的は、ブタに対してそ
のまま適用できる安全な天然型のブタ成長ホルモンを直
接且つ多量に効率よく産出させることのできる組換えプ
ラスミドベクターを提供することにある。
のまま適用できる安全な天然型のブタ成長ホルモンを直
接且つ多量に効率よく産出させることのできる組換えプ
ラスミドベクターを提供することにある。
【０００６】本発明の他の目的は、前記ベクターで形質
転換され、天然型ブタ成長ホルモンを多量に分泌生産す
るバチルス属細菌を提供することにある。
転換され、天然型ブタ成長ホルモンを多量に分泌生産す
るバチルス属細菌を提供することにある。
【０００７】本発明のさらに他の目的は、天然型ブタ成
長ホルモンを、簡単な工程で効率よく、多量且つ安価に
得ることができるブタ成長ホルモンの製造方法を提供す
ることにある。
長ホルモンを、簡単な工程で効率よく、多量且つ安価に
得ることができるブタ成長ホルモンの製造方法を提供す
ることにある。
【０００８】
【発明の構成】本発明者らは、優れた安全性と、多量の
蛋白質を菌体外に分泌生産する能力を有するバチルス属
細菌に着目して鋭意検討した結果、バチルス属細菌が分
泌する蛋白質のシグナル配列（シグナルペプチド）をコ
ードする遺伝子とブタ成長ホルモンの成熟蛋白質をコー
ドする遺伝子とを有する組換えベクターを構築し、この
ベクターにより形質転換されたバチルス属細菌を培養す
ると、Ｎ末端に余分なメチオンニン残基が結合せず、分
子内にシステイン−システイン結合が形成された天然型
のブタ成長ホルモンが効率よく大量に分泌生産されるこ
とを見出し、本発明を完成した。
蛋白質を菌体外に分泌生産する能力を有するバチルス属
細菌に着目して鋭意検討した結果、バチルス属細菌が分
泌する蛋白質のシグナル配列（シグナルペプチド）をコ
ードする遺伝子とブタ成長ホルモンの成熟蛋白質をコー
ドする遺伝子とを有する組換えベクターを構築し、この
ベクターにより形質転換されたバチルス属細菌を培養す
ると、Ｎ末端に余分なメチオンニン残基が結合せず、分
子内にシステイン−システイン結合が形成された天然型
のブタ成長ホルモンが効率よく大量に分泌生産されるこ
とを見出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、(1) バチルス属細菌
分泌蛋白質のシグナル配列をコードする遺伝子領域とそ
の下流側に位置するブタ成長ホルモン構造遺伝子領域と
からなる雑種ブタ成長ホルモン遺伝子と、前記雑種ブタ
成長ホルモン遺伝子の上流にバチルス属細菌で機能し得
るプロモーターを含有する組換えプラスミドベクター、
(2) 前記組換えプラスミドベクターにより形質転換され
たバチルス属細菌、および(3) 前記バチルス属細菌を培
養し、産出されたブタ成長ホルモンを回収するブタ成長
ホルモンの製造方法を提供する。
分泌蛋白質のシグナル配列をコードする遺伝子領域とそ
の下流側に位置するブタ成長ホルモン構造遺伝子領域と
からなる雑種ブタ成長ホルモン遺伝子と、前記雑種ブタ
成長ホルモン遺伝子の上流にバチルス属細菌で機能し得
るプロモーターを含有する組換えプラスミドベクター、
(2) 前記組換えプラスミドベクターにより形質転換され
たバチルス属細菌、および(3) 前記バチルス属細菌を培
養し、産出されたブタ成長ホルモンを回収するブタ成長
ホルモンの製造方法を提供する。
【００１０】前記バチルス属細菌分泌蛋白質のシグナル
配列としては、枯草菌（バチルス・サブチリス）、バチ
ルス・アミロリキファシエンス、バチルス・リケニホル
ミスなどのバチルス属細菌が分泌する蛋白質のシグナル
配列であればよく、例えば、α−アミラーゼ、アルカリ
プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、レバンシュークラー
ゼなどのシグナル配列が挙げられる。前記シグナル配列
のうち、特に枯草菌のα−アミラーゼのシグナル配列が
好適に用いられる。
配列としては、枯草菌（バチルス・サブチリス）、バチ
ルス・アミロリキファシエンス、バチルス・リケニホル
ミスなどのバチルス属細菌が分泌する蛋白質のシグナル
配列であればよく、例えば、α−アミラーゼ、アルカリ
プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、レバンシュークラー
ゼなどのシグナル配列が挙げられる。前記シグナル配列
のうち、特に枯草菌のα−アミラーゼのシグナル配列が
好適に用いられる。
【００１１】前記シグナル配列をコードする遺伝子は、
バチルス属細菌において、効率的に機能する。これらの
遺伝子は、前記蛋白質をコードする遺伝子から調製して
もよく、また、前記蛋白質のシグナル配列部分のアミノ
酸配列からその塩基配列を決定し、化学合成してもよ
い。
バチルス属細菌において、効率的に機能する。これらの
遺伝子は、前記蛋白質をコードする遺伝子から調製して
もよく、また、前記蛋白質のシグナル配列部分のアミノ
酸配列からその塩基配列を決定し、化学合成してもよ
い。
【００１２】前記シグナル配列をコードする遺伝子は、
５′末端に翻訳開始コドンＡＴＧを有する。そして、前
記シグナル配列は、バチルス属細菌によりブタ成長ホル
モンが分泌生産される際、切断、除去される。そのた
め、本発明の組換えプラスミドベクターにより形質転換
されたバチルス属細菌を培養すると、Ｎ末端に余分なメ
チオニン残基が結合していない天然型のブタ成長ホルモ
ンが産出される。
５′末端に翻訳開始コドンＡＴＧを有する。そして、前
記シグナル配列は、バチルス属細菌によりブタ成長ホル
モンが分泌生産される際、切断、除去される。そのた
め、本発明の組換えプラスミドベクターにより形質転換
されたバチルス属細菌を培養すると、Ｎ末端に余分なメ
チオニン残基が結合していない天然型のブタ成長ホルモ
ンが産出される。
【００１３】前記ブタ成長ホルモン構造遺伝子は、ブタ
成長ホルモンをコードする遺伝子であればよく、ブタか
ら得られるブタ成長ホルモン遺伝子またはブタ成長ホル
モンのアミノ酸配列に基いて化学合成された遺伝子の何
れであってもよい。ブタ成長ホルモン構造遺伝子とし
て、例えば、下記の塩基配列を有する遺伝子が例示され
る。
成長ホルモンをコードする遺伝子であればよく、ブタか
ら得られるブタ成長ホルモン遺伝子またはブタ成長ホル
モンのアミノ酸配列に基いて化学合成された遺伝子の何
れであってもよい。ブタ成長ホルモン構造遺伝子とし
て、例えば、下記の塩基配列を有する遺伝子が例示され
る。
【００１４】 １ ＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡ ＴＧＣＣＧＣＴＧＴＣ ＡＴＣＣＣＴＴＴＴＣ ＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴ ＡＣＧＧＣＧＡＣＡＧ ＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧ ３１ ＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧ ＴＴＴＴＡＣＧＴＧＣ ＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡ ＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣ ＡＡＡＡＴＧＣＡＣＧ ＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴ ６１ ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧ ＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣ ＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡ ＧＴＧＧＴＣＧＡＡＣ ＧＴＣＧＣＣＴＡＴＧ ＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴ ９１ ＴＴＴＧＡＡＡＧＡＧ ＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣ ＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡ ＡＡＡＣＴＴＴＣＴＣ ＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧ ＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴ １２１ ＣＧＣＴＡＴＴＣＴＡ ＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣ ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＴＡＡＧＡＴ ＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧ ＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡ １５１ ＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡ ＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＡＡＧＡＣＧＡＡＡＴ ＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣ １８１ ＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧ ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡ ＧＣＡＡＣＧＴＴＣＴ ＴＧＴＣＣＧＴＴＴＣ ＴＡＣＴＴＣＧＡＧＴ ＣＧＴＴＧＣＡＡＧＡ ２１１ ＧＡＣＧＴＴＧＡＡＣ ＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴ ＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧ ＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧ ＡＣＧＡＡＴＣＴＡＡ ＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣ ２４１ ＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡ ＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧ ＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧ ＧＡＡＴＡＧＧＴＴＴ ＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣ ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＣ ２７１ ＴＴＣＴＴＡＴＣＴＣ ＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣ ＴＡＡＴＡＧＣＴＴＧ ＡＡＧＡＡＴＡＧＡＧ ＣＴＣＡＴＡＡＡＴＧ ＡＴＴＡＴＣＧＡＡＣ ３０１ ＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡ ＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧ ＴＧＴＣＴＡＣＧＡＧ ＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣ ＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣ ３３１ ＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧ ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡ ＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡ ＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣ ＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴ ＴＣＣＧＴＡＡＧＴＴ ３６１ ＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣ ＧＴＧＡＧＴＴＡＧＡ ＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣ ＣＧＴＡＡＴＴＡＣＧ ＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴ ＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧ ３９１ ＣＣＴＣＧＴＧＣＡＧ ＧＣＣＡＡＡＴＣＴＴ ＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴ ＧＧＡＧＣＡＣＧＴＣ ＣＧＧＴＴＴＡＧＡＡ ＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡ ４２１ ＴＡＣＧＡＣＡＡＡＴ ＴＣＧＡＣＡＣＧＡＡ ＣＣＴＴＣＧＣＴＣＴ ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡ ＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴ ＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡ ４５１ ＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣ ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡ ＣＴＡＴＧＧＡＴＴＡ ＣＴＡＣＴＡＣＧＣＧ ＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴ ＧＡＴＡＣＣＴＡＡＴ ４８１ ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴ ＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡ ＴＣＴＴＣＡＴＡＡＡ ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡ ＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴ ＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴ ５１１ ＧＣＣＧＡＡＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴ ＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴ ＣＧＧＣＴＴＴＧＴＡ ＴＡＡＡＣＧＣＡＣＡ ＴＴＡＣＴＴＴＡＣＡ ５４１ ＣＧＴＣＧＣＴＴＣＧ ＴＴＧＡＧＡＧＣＴＣ ＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴ ＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣ ＡＡＣＴＣＴＣＧＡＧ ＧＡＣＧＣＧＡＡＡＡ このような塩基配列では、枯草菌において使用頻度が多
く発現効率の高い遺伝子コドンが用いられているため、
ブタ成長ホルモンの生産量を著しく向上させることがで
きる。
く発現効率の高い遺伝子コドンが用いられているため、
ブタ成長ホルモンの生産量を著しく向上させることがで
きる。
【００１５】前記雑種ブタ成長ホルモン遺伝子は、ブタ
成長ホルモン構造遺伝子が前記シグナル配列をコードす
る遺伝子の下流側に位置する遺伝子であれば特に限定さ
れない。
成長ホルモン構造遺伝子が前記シグナル配列をコードす
る遺伝子の下流側に位置する遺伝子であれば特に限定さ
れない。
【００１６】前記バチルス属細菌で機能し得るプロモー
ターとしては、上記枯草菌などのバチルス属細菌が分泌
する蛋白質、例えば、α−アミラーゼ、アルカリプロテ
アーゼ、中性プロテアーゼ、レバンシュークラーゼ等を
コードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。これら
のプロモーターは、バチルス属細菌において効率的に機
能できる。前記プロモーターとして、特に、枯草菌のα
−アミラーゼ遺伝子のプロモーターなどが好適に用いら
れる。
ターとしては、上記枯草菌などのバチルス属細菌が分泌
する蛋白質、例えば、α−アミラーゼ、アルカリプロテ
アーゼ、中性プロテアーゼ、レバンシュークラーゼ等を
コードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。これら
のプロモーターは、バチルス属細菌において効率的に機
能できる。前記プロモーターとして、特に、枯草菌のα
−アミラーゼ遺伝子のプロモーターなどが好適に用いら
れる。
【００１７】プロモーターは、公知の方法によりクロー
ニングしたり、プラスミドから調製して得ることができ
るが、アミノ酸配列に基いて化学合成して得ることもで
きる。プロモーターは、例えば、プラスミドｐＵＣ１１
８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間に挿入しておき、ブタ成長
ホルモン遺伝子の発現ベクターへの連結の際、前記プラ
スミドから、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切断回収
して用いることができる。
ニングしたり、プラスミドから調製して得ることができ
るが、アミノ酸配列に基いて化学合成して得ることもで
きる。プロモーターは、例えば、プラスミドｐＵＣ１１
８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ間に挿入しておき、ブタ成長
ホルモン遺伝子の発現ベクターへの連結の際、前記プラ
スミドから、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切断回収
して用いることができる。
【００１８】前記雑種ブタ成長ホルモン遺伝子を、前記
プロモーターの下流に連結させることにより、バチルス
属細菌でのブタ成長ホルモンの生産が可能となる。
プロモーターの下流に連結させることにより、バチルス
属細菌でのブタ成長ホルモンの生産が可能となる。
【００１９】本発明の組換えプラスミドベクターには、
ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列が連結されているのが好ま
しい。ＳＤ配列は、通常、前記雑種ブタ成長ホルモン遺
伝子と前記プロモーターとの間に連結される。ＳＤ配列
は、特に制限されず、例えば、枯草菌の１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａの塩基配列に対応して合成したＳＤ配列を用いること
ができる。ＳＤ配列は、リボソーム結合部位として機能
する。
ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列が連結されているのが好ま
しい。ＳＤ配列は、通常、前記雑種ブタ成長ホルモン遺
伝子と前記プロモーターとの間に連結される。ＳＤ配列
は、特に制限されず、例えば、枯草菌の１６Ｓ−ｒＲＮ
Ａの塩基配列に対応して合成したＳＤ配列を用いること
ができる。ＳＤ配列は、リボソーム結合部位として機能
する。
【００２０】また、本発明の組換えプラスミドベクター
において、前記雑種ブタ成長ホルモン遺伝子の下流に、
ターミネーターが連結されていてもよい。ターミネータ
ーは、特に限定されず、例えば、枯草菌のアルカリプロ
テアーゼ遺伝子のターミネーターや、これに対応して化
学合成したターミネーターなどであってもよい。ターミ
ネーターを連結することによって、構造遺伝子の発現を
高めることができる。
において、前記雑種ブタ成長ホルモン遺伝子の下流に、
ターミネーターが連結されていてもよい。ターミネータ
ーは、特に限定されず、例えば、枯草菌のアルカリプロ
テアーゼ遺伝子のターミネーターや、これに対応して化
学合成したターミネーターなどであってもよい。ターミ
ネーターを連結することによって、構造遺伝子の発現を
高めることができる。
【００２１】本発明の組換えプラスミドベクターの構築
のために用いるベクターとしては、枯草菌などのバチル
ス属細菌内で安定に複製可能なベクターであれば何れで
あってもよく、例えば、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ
１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６やその
誘導体等が挙げられる。
のために用いるベクターとしては、枯草菌などのバチル
ス属細菌内で安定に複製可能なベクターであれば何れで
あってもよく、例えば、プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＣ
１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６やその
誘導体等が挙げられる。
【００２２】本発明の組換えプラスミドベクターの構築
は、「モレキュラークローニング」（“Molecular Clon
ing ”）、「ア ラボラトリーマニュアル」（“A Labo
ratory Mannual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1
989)などに記載された公知の方法により行うことができ
る。例えば、前記プロモーター、ＳＤ配列、シグナル配
列遺伝子、ブタ成長ホルモン構造遺伝子およびターミネ
ーターを大腸菌のベクター上で連結した後、前記遺伝子
断片を全て含む切断断片を、バチルス属細菌内で安定に
複製可能なプラスミド内に導入することにより、本発明
の組換えプラスミドベクターを構築できる。
は、「モレキュラークローニング」（“Molecular Clon
ing ”）、「ア ラボラトリーマニュアル」（“A Labo
ratory Mannual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1
989)などに記載された公知の方法により行うことができ
る。例えば、前記プロモーター、ＳＤ配列、シグナル配
列遺伝子、ブタ成長ホルモン構造遺伝子およびターミネ
ーターを大腸菌のベクター上で連結した後、前記遺伝子
断片を全て含む切断断片を、バチルス属細菌内で安定に
複製可能なプラスミド内に導入することにより、本発明
の組換えプラスミドベクターを構築できる。
【００２３】より具体的には、例えば以下に示すような
方法により組換えプラスミドベクターの構築を行うこと
ができる。
方法により組換えプラスミドベクターの構築を行うこと
ができる。
【００２４】(1) 上流側にシグナル配列遺伝子との連結
部位を有するブタ成長ホルモン構造遺伝子（ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片）を調製し、適当な大腸菌プラスミド
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に連結する。このプラスミ
ドにより適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換株
からブタ成長ホルモン構造遺伝子の導入されたプラスミ
ドを調製する。
部位を有するブタ成長ホルモン構造遺伝子（ＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ断片）を調製し、適当な大腸菌プラスミド
のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に連結する。このプラスミ
ドにより適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換株
からブタ成長ホルモン構造遺伝子の導入されたプラスミ
ドを調製する。
【００２５】この際、前記ブタ成長ホルモン構造遺伝子
は、複数のフラグメントとして合成し、各フラグメント
を複数のプラスミドに導入してもよい。
は、複数のフラグメントとして合成し、各フラグメント
を複数のプラスミドに導入してもよい。
【００２６】例えば、ブタ成長ホルモン構造遺伝子を２
６本のＤＮＡフラグメント（第１〜第２６フラグメン
ト）として合成し、最も上流に位置するフラグメント
（第２５フラグメントおよび第２６フラグメント）の上
流側にシグナル配列遺伝子との連結部位を設ける。常法
によりキネーション、アニーリング等の処理を行った
後、下流の第１〜第１２フラグメント部分（ＢａｍＨＩ
−ＫｐｎＩ断片）を、例えば大腸菌のプラスミドｐＵＣ
１９のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ間に、上流の第１３〜第２
６フラグメント部分（ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をプ
ラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ間に連結
し、例えば、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。アン
ピシリン耐性の形質転換株から、前記構造遺伝子のうち
第１〜第１２フラグメントの導入されたプラスミド、お
よび第１３〜第２６フラグメントの導入されたプラスミ
ドを調製することができる。
６本のＤＮＡフラグメント（第１〜第２６フラグメン
ト）として合成し、最も上流に位置するフラグメント
（第２５フラグメントおよび第２６フラグメント）の上
流側にシグナル配列遺伝子との連結部位を設ける。常法
によりキネーション、アニーリング等の処理を行った
後、下流の第１〜第１２フラグメント部分（ＢａｍＨＩ
−ＫｐｎＩ断片）を、例えば大腸菌のプラスミドｐＵＣ
１９のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ間に、上流の第１３〜第２
６フラグメント部分（ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をプ
ラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ間に連結
し、例えば、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換する。アン
ピシリン耐性の形質転換株から、前記構造遺伝子のうち
第１〜第１２フラグメントの導入されたプラスミド、お
よび第１３〜第２６フラグメントの導入されたプラスミ
ドを調製することができる。
【００２７】(2) 一方、前記のような方法で、プロモー
ター、ＳＤ配列、シグナル配列遺伝子およびターミネー
ターを調製する。
ター、ＳＤ配列、シグナル配列遺伝子およびターミネー
ターを調製する。
【００２８】(3) バチルス属細菌内で安定に複製可能な
プラスミド、例えば枯草菌プラスミドｐＵＢ１１０のＳ
ｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、大腸菌のベクター、例えば
プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカーサイトＳｐｈＩ−
ＥｃｏＲＩ間に導入する。得られたプラスミドのＢａｍ
ＨＩ切断部位に、前記プロモーター、ＳＤ配列、シグナ
ル配列遺伝子、前記(1) で得られたプラスミドから切り
出したブタ成長ホルモン構造遺伝子およびターミネータ
ーを順次または同時に連結し、例えば大腸菌を形質転換
する。得られた形質転換株から、前記遺伝子断片を全て
含有する大腸菌系のプラスミドを得る。
プラスミド、例えば枯草菌プラスミドｐＵＢ１１０のＳ
ｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、大腸菌のベクター、例えば
プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカーサイトＳｐｈＩ−
ＥｃｏＲＩ間に導入する。得られたプラスミドのＢａｍ
ＨＩ切断部位に、前記プロモーター、ＳＤ配列、シグナ
ル配列遺伝子、前記(1) で得られたプラスミドから切り
出したブタ成長ホルモン構造遺伝子およびターミネータ
ーを順次または同時に連結し、例えば大腸菌を形質転換
する。得られた形質転換株から、前記遺伝子断片を全て
含有する大腸菌系のプラスミドを得る。
【００２９】(4) 前記大腸菌系のプラスミドのＳｐｈＩ
−ＡｖａＩ断片を、バチルス属細菌内で安定に複製可能
なプラスミド、例えば上記の枯草菌プラスミドｐＵＢ１
１０のＳｐｈＩおよびＡｖａＩによる切断部位に連結す
ることにより本発明の組換えプラスミドベクターを得る
ことができる。前記ＳｐｈＩ−ＡｖａＩ断片は、複数の
断片、例えばＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ断片およびＫｐｎＩ−
ＡｖａＩ断片として回収して用いてもよい。
−ＡｖａＩ断片を、バチルス属細菌内で安定に複製可能
なプラスミド、例えば上記の枯草菌プラスミドｐＵＢ１
１０のＳｐｈＩおよびＡｖａＩによる切断部位に連結す
ることにより本発明の組換えプラスミドベクターを得る
ことができる。前記ＳｐｈＩ−ＡｖａＩ断片は、複数の
断片、例えばＳｐｈＩ−ＫｐｎＩ断片およびＫｐｎＩ−
ＡｖａＩ断片として回収して用いてもよい。
【００３０】前記のようにして得られた組換えプラスミ
ドベクターにより、宿主バチルス属細菌を形質転換する
ことにより、ブタ成長ホルモンを多量に生産する微生物
が得られる。前記ベクターによるバチルス属細菌の形質
転換は、慣用の方法、例えば、ＰＥＧ６０００によるプ
ロトプラスト形質転換法［Chang, S., et al., Mol.Ge
n. Genet., 168, 111-115 (1979)］などを利用して行う
ことができる。
ドベクターにより、宿主バチルス属細菌を形質転換する
ことにより、ブタ成長ホルモンを多量に生産する微生物
が得られる。前記ベクターによるバチルス属細菌の形質
転換は、慣用の方法、例えば、ＰＥＧ６０００によるプ
ロトプラスト形質転換法［Chang, S., et al., Mol.Ge
n. Genet., 168, 111-115 (1979)］などを利用して行う
ことができる。
【００３１】前記宿主微生物は、バチルス（Bacillus）
属の微生物であり、その菌株は、遺伝子産物が安定であ
る限り特に制限されない。バチルス属細菌は、大腸菌な
どとは異なり、エンドトキシンを生産しないこと、人体
に寄生しないことなどの理由から極めて安全性の高い微
生物である。また、蛋白質を菌体外に分泌生産する能力
を有しており、日本においては古くから納豆の製造に用
いられている他、酵素、アミノ酸、抗生物質などの工業
的な生産菌としても用いられており、極めて利用し易い
微生物である。
属の微生物であり、その菌株は、遺伝子産物が安定であ
る限り特に制限されない。バチルス属細菌は、大腸菌な
どとは異なり、エンドトキシンを生産しないこと、人体
に寄生しないことなどの理由から極めて安全性の高い微
生物である。また、蛋白質を菌体外に分泌生産する能力
を有しており、日本においては古くから納豆の製造に用
いられている他、酵素、アミノ酸、抗生物質などの工業
的な生産菌としても用いられており、極めて利用し易い
微生物である。
【００３２】バチルス属細菌の中でも好ましい宿主は、
安全性が高く、菌体外に蛋白質を多量に分泌する枯草菌
［バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）］であ
る。さらに、枯草菌の中でも、突然変異などの手法によ
り菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が好ま
しい。このような菌株を形質転換する場合には、宿主由
来のプロテアーゼによる分解を抑制できるため、ブタ成
長ホルモンの生産に特に有利である。
安全性が高く、菌体外に蛋白質を多量に分泌する枯草菌
［バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）］であ
る。さらに、枯草菌の中でも、突然変異などの手法によ
り菌体外へのプロテアーゼ活性を低下させた菌株が好ま
しい。このような菌株を形質転換する場合には、宿主由
来のプロテアーゼによる分解を抑制できるため、ブタ成
長ホルモンの生産に特に有利である。
【００３３】プロテアーゼ活性の低い枯草菌としては、
例えば、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼである中性
プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼの両者を欠失
したバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）, 128;
601-606, 1985］；バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株
にpap 遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＤＹ−１
６株（微工研菌寄第９４８８号）；アルカリプロテアー
ゼおよび中性プロテアーゼの生産能を欠き、且つプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下の枯草菌に、spo OA△67
7 変異遺伝子を導入した菌株などが挙げられる。特に好
ましい菌株には、例えば、バチルス・サブチリス１０４
ＨＬ株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・
サブチリスＳＰＯ１１株（微工研菌寄第１０９８７
号）、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株にspo OA△67
7 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰＬ１
４株（微工研菌寄第１０９８８号）などが含まれる（特
開平３−１４３３８７号参照）。
例えば、枯草菌の主たる菌体外プロテアーゼである中性
プロテアーゼおよびアルカリプロテアーゼの両者を欠失
したバチルス・サブチリス１０４ＨＬ株［バイオケミカ
ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケ
ーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.）, 128;
601-606, 1985］；バチルス・サブチリス１０４ＨＬ株
にpap 遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＤＹ−１
６株（微工研菌寄第９４８８号）；アルカリプロテアー
ゼおよび中性プロテアーゼの生産能を欠き、且つプロテ
アーゼ活性が野生株の３％以下の枯草菌に、spo OA△67
7 変異遺伝子を導入した菌株などが挙げられる。特に好
ましい菌株には、例えば、バチルス・サブチリス１０４
ＨＬ株にspo OA△677 変異遺伝子を導入したバチルス・
サブチリスＳＰＯ１１株（微工研菌寄第１０９８７
号）、バチルス・サブチリスＤＹ−１６株にspo OA△67
7 変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスＳＰＬ１
４株（微工研菌寄第１０９８８号）などが含まれる（特
開平３−１４３３８７号参照）。
【００３４】特にバチルス・サブチリスＳＰＬ１４株
は、野生株に比べプロテアーゼ活性が１／５０００以下
であり、生産物の安定性が極めて良好であること、アミ
ノ酸要求性を２種類有し、胞子を形成しないため、自然
界における生育が不可能と考えられることから、ブタ成
長ホルモンの工業生産のための宿主として極めて有用な
菌である。
は、野生株に比べプロテアーゼ活性が１／５０００以下
であり、生産物の安定性が極めて良好であること、アミ
ノ酸要求性を２種類有し、胞子を形成しないため、自然
界における生育が不可能と考えられることから、ブタ成
長ホルモンの工業生産のための宿主として極めて有用な
菌である。
【００３５】ブタ成長ホルモンは、前記形質転換された
バチルス属細菌を培養することにより得られる。形質転
換されたバチルス属細菌の培養は、慣用の液体培養に準
じて行うことができる。すなわち、形質転換株の培養
は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増
殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養または通気
攪拌培養法により行うことができる。培地のｐＨは、例
えば７〜８程度である。培養は、微生物の培養に通常採
用される条件、例えば、温度１５〜４５℃、好ましくは
２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で行う
ことができる。
バチルス属細菌を培養することにより得られる。形質転
換されたバチルス属細菌の培養は、慣用の液体培養に準
じて行うことができる。すなわち、形質転換株の培養
は、慣用の成分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増
殖因子成分などを含む液体培地で、振盪培養または通気
攪拌培養法により行うことができる。培地のｐＨは、例
えば７〜８程度である。培養は、微生物の培養に通常採
用される条件、例えば、温度１５〜４５℃、好ましくは
２５〜４０℃、培養時間６〜６０時間程度の条件で行う
ことができる。
【００３６】こうして、Ｎ末端に余分なメチオニン残基
が結合しておらず、分子内にシステイン−システイン結
合が形成された天然型のブタ成長ホルモンが産出され
る。
が結合しておらず、分子内にシステイン−システイン結
合が形成された天然型のブタ成長ホルモンが産出され
る。
【００３７】なお、宿主微生物が生産したブタ成長ホル
モンの分離精製は、慣用の方法、例えば、遠心分離、塩
析、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、Ｓ
ＤＳ−アガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法、電気溶出法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー
法、逆相高速液体クロマトグラフィー法やこれらを組合
わせた方法で行うことができる。ブタ成長ホルモンが菌
体内やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方
法、例えば、菌体を粉砕し、前記分離精製に供すること
により、ブタ成長ホルモンを得ることができる。
モンの分離精製は、慣用の方法、例えば、遠心分離、塩
析、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、Ｓ
ＤＳ−アガロースゲル電気泳動法、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法、電気溶出法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー
法、逆相高速液体クロマトグラフィー法やこれらを組合
わせた方法で行うことができる。ブタ成長ホルモンが菌
体内やペリプラズムに蓄積される場合には、慣用の方
法、例えば、菌体を粉砕し、前記分離精製に供すること
により、ブタ成長ホルモンを得ることができる。
【００３８】
【発明の効果】本発明のブタ成長ホルモン発現ベクター
は、ブタ成長ホルモン構造遺伝子と、バチルス属細菌で
効率的に機能できるシグナル配列およびプロモーターと
を含有するため、ブタに対してそのまま有効で安全な天
然型のブタ成長ホルモンを直接且つ多量に効率よく産出
させることができる。
は、ブタ成長ホルモン構造遺伝子と、バチルス属細菌で
効率的に機能できるシグナル配列およびプロモーターと
を含有するため、ブタに対してそのまま有効で安全な天
然型のブタ成長ホルモンを直接且つ多量に効率よく産出
させることができる。
【００３９】本発明のバチルス属細菌は、前記のような
優れたベクターにより形質転換されているため、天然型
ブタ成長ホルモンが多量に分泌生産される。
優れたベクターにより形質転換されているため、天然型
ブタ成長ホルモンが多量に分泌生産される。
【００４０】本発明の製造方法は、前記のようなバチル
ス属細菌を培養するため、天然型ブタ成長ホルモンを、
簡単な工程で効率よく多量且つ安価に得ることができ
る。
ス属細菌を培養するため、天然型ブタ成長ホルモンを、
簡単な工程で効率よく多量且つ安価に得ることができ
る。
【００４１】
【実施例】以下に、実施例に基いて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。
説明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。
【００４２】実施例 (1) α−アミラーゼ遺伝子のプロモーターの合成 下記に示す塩基配列を有する枯草菌α−アミラーゼ遺伝
子のプロモーターの相補鎖を、それぞれ、ＤＮＡ合成装
置（ＡＢＩ社製）を用いて化学合成し、両遺伝子の５′
領域をリン酸化後アニーリングし、ｐＵＣ１１８のＥｃ
ｏＲＩ−ＸｂａＩの間に挿入し、プラスミドｐＭＤ３０
０３を得た。ｐＭＤ３００３の構築図を図１に示す。
子のプロモーターの相補鎖を、それぞれ、ＤＮＡ合成装
置（ＡＢＩ社製）を用いて化学合成し、両遺伝子の５′
領域をリン酸化後アニーリングし、ｐＵＣ１１８のＥｃ
ｏＲＩ−ＸｂａＩの間に挿入し、プラスミドｐＭＤ３０
０３を得た。ｐＭＤ３００３の構築図を図１に示す。
【００４３】 ５′−ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴＴＣ ＡＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＡ ＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡＡＧＣＧＴＧＡＡ ＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴ−３′ ５′−ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＴＡＣ ＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＣＴＡＴＣＡ ＡＡＡＣＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣ ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧ−３′ (2) ＳＤ配列の合成 枯草菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の配列を
参考として、下記の塩基配列で表されるＳＤ配列を合成
した。なお、遺伝子の５′側にはプロモーターとの連結
部位であるＸｂａＩ部位を、３′領域にはα−アミラー
ゼ遺伝子のシグナル配列との連結部位であるＮｒｕＩ部
位を導入した。下記配列の下線部はＳＤ配列を示す。
参考として、下記の塩基配列で表されるＳＤ配列を合成
した。なお、遺伝子の５′側にはプロモーターとの連結
部位であるＸｂａＩ部位を、３′領域にはα−アミラー
ゼ遺伝子のシグナル配列との連結部位であるＮｒｕＩ部
位を導入した。下記配列の下線部はＳＤ配列を示す。
【００４４】常法にしたがって精製した後、５′領域を
Ｔ４ポリヌクオチドキナーゼを用いてリン酸化しアニー
リングした。次いで、ポリアクリルアミド電気泳動に供
し、目的のバンドを切り出し、電気泳動溶出法によりＤ
ＮＡ断片を回収し、ＳＤ配列断片とした。
Ｔ４ポリヌクオチドキナーゼを用いてリン酸化しアニー
リングした。次いで、ポリアクリルアミド電気泳動に供
し、目的のバンドを切り出し、電気泳動溶出法によりＤ
ＮＡ断片を回収し、ＳＤ配列断片とした。
【００４５】 ＣＴＡＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＣＧ ＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣ (3) α−アミラーゼシグナル配列遺伝子の合成 枯草菌α−アミラーゼのシグナル配列部分のアミノ酸配
列［Yamazaki, H., etal., J. Bacteriol., 156 ,327
(1984)］に従って、下記の塩基配列を有するα−アミラ
ーゼシグナル配列遺伝子の相補鎖をそれぞれ合成した。
なお、遺伝子の５′末端に上記ＳＤ配列との連結部位で
あるＮｒｕＩ部位を、３′側にブタ成長ホルモン構造遺
伝子との連結部位であるＨｐａＩＩ部位を導入した。
列［Yamazaki, H., etal., J. Bacteriol., 156 ,327
(1984)］に従って、下記の塩基配列を有するα−アミラ
ーゼシグナル配列遺伝子の相補鎖をそれぞれ合成した。
なお、遺伝子の５′末端に上記ＳＤ配列との連結部位で
あるＮｒｕＩ部位を、３′側にブタ成長ホルモン構造遺
伝子との連結部位であるＨｐａＩＩ部位を導入した。
【００４６】常法に従って精製した後、リン酸化しアニ
ーリングした。次いで、電気泳動に供した後、回収して
合成ＤＮＡリンカーとした。
ーリングした。次いで、電気泳動に供した後、回収して
合成ＤＮＡリンカーとした。
【００４７】 ５′−ＣＧＡＡＡＣＧＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＡＣＴ ＧＣＣＧＴＴＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧ ＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＧＡＣ−３′ ５′−ＣＧＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣ ＡＧＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＣＡ ＧＴＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＴＣＧＴＴＴＣＧ−３′ (4) ターミネーターの作製 枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子のターミナーター
を参考として、下記の塩基配列を有するターミネーター
の相補鎖をそれぞれ合成した。なお５′末端側には、Ｂ
ｇｌＩＩ部位を、３′末端側にはＢａｍＨＩ部位を設け
た。合成した後、両合成遺伝子の５′領域をリン酸化し
アニーリングした。次いで、電気泳動に供した後、回収
し、ターミネーター断片とした。
を参考として、下記の塩基配列を有するターミネーター
の相補鎖をそれぞれ合成した。なお５′末端側には、Ｂ
ｇｌＩＩ部位を、３′末端側にはＢａｍＨＩ部位を設け
た。合成した後、両合成遺伝子の５′領域をリン酸化し
アニーリングした。次いで、電気泳動に供した後、回収
し、ターミネーター断片とした。
【００４８】 ５′−ＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣＣＴ ＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＧＣ ＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧ−３′ ５′−ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＡＣＡ ＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣＣ ＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＡ−３′ (5) ｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築 プラスミドｐＵＢ１１０のＳｐｈＩからＥｃｏＲＩまで
の小さな約１キロ塩基対の断片を切り出し、プラスミド
ｐＵＣ１９のポリリンカーサイトのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ間に導入して、ｐＵＣ１９−１１０Ｂを構築した。ｐ
ＵＣ１９−１１０Ｂの構築図を図２に示す。
の小さな約１キロ塩基対の断片を切り出し、プラスミド
ｐＵＣ１９のポリリンカーサイトのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ間に導入して、ｐＵＣ１９−１１０Ｂを構築した。ｐ
ＵＣ１９−１１０Ｂの構築図を図２に示す。
【００４９】(6) ブタ成長ホルモン遺伝子の合成 枯草菌の遺伝子コドン使用頻度および大腸菌のコドン使
用頻度を考慮して、合成する遺伝子を計画した。すなわ
ち、枯草菌において使用頻度の高い遺伝子コドンを用
い、遺伝子の両ストランドを、各々約５０塩基対を形成
し得る２６本のＤＮＡフラグメントとして合成した。図
３に、合成したブタ成長ホルモン構造遺伝子のＤＮＡフ
ラグメントを示す。
用頻度を考慮して、合成する遺伝子を計画した。すなわ
ち、枯草菌において使用頻度の高い遺伝子コドンを用
い、遺伝子の両ストランドを、各々約５０塩基対を形成
し得る２６本のＤＮＡフラグメントとして合成した。図
３に、合成したブタ成長ホルモン構造遺伝子のＤＮＡフ
ラグメントを示す。
【００５０】なお、ブタ成長ホルモン遺伝子の５′末端
を枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列遺伝子と
連結させるため、前記ＤＮＡフラグメントのうち、断片
２５と２６は、上流に下記の配列を付加したものとして
合成した。
を枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列遺伝子と
連結させるため、前記ＤＮＡフラグメントのうち、断片
２５と２６は、上流に下記の配列を付加したものとして
合成した。
【００５１】 ＡＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＣＡ ＧＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴ また、ブタ成長フルモン遺伝子の３′末端をベクターの
ＢａｍＨＩ部位に連結させるため、前記ＤＮＡフラグメ
ントのうち、断片１と２の下流にＢａｍＨＩ認識部位を
含む配列を付加して合成した。
ＢａｍＨＩ部位に連結させるため、前記ＤＮＡフラグメ
ントのうち、断片１と２の下流にＢａｍＨＩ認識部位を
含む配列を付加して合成した。
【００５２】合成したＤＮＡフラグメントを、アンモニ
アにより脱保護した後、ＯＰＣカートリッジ（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて精製した。精製した
ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４−ＤＮＡ Ｋｉｎａｓｅを
用いて５′部位をそれぞれリン酸化した。
アにより脱保護した後、ＯＰＣカートリッジ（アプライ
ドバイオシステムズ社製）を用いて精製した。精製した
ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４−ＤＮＡ Ｋｉｎａｓｅを
用いて５′部位をそれぞれリン酸化した。
【００５３】(7) ブタ成長ホルモン遺伝子の構築 リン酸化した前記ＤＮＡフラグメントをその相補鎖とア
ニーリングした後、１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）を行い、目的の大きさのバンドを切り
出し、電気泳動溶出法で回収した。回収した２本鎖ＤＮ
Ａを２本または３本ずつ混ぜ、Ｔ４−ＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｓｅを用いて連結した。次いで、１２％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、目的の大きさのバンドを切り
出し、同様に電気泳動溶出法で回収した。
ニーリングした後、１５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ）を行い、目的の大きさのバンドを切り
出し、電気泳動溶出法で回収した。回収した２本鎖ＤＮ
Ａを２本または３本ずつ混ぜ、Ｔ４−ＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｓｅを用いて連結した。次いで、１２％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、目的の大きさのバンドを切り
出し、同様に電気泳動溶出法で回収した。
【００５４】回収した各２本鎖ＤＮＡのうち、上記(6)
で合成したＤＮＡフラグメントの断片１〜１２を含むＤ
ＮＡを、プラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ
間に、断片１３〜２６を含むＤＮＡを、プラスミドｐＵ
Ｃ１９のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ間にそれぞれ連結し、大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製し、電
気泳動を行ったところ、目的のプラスミドと思われるク
ローンがそれぞれ得られた。得られた形質転換株からプ
ラスミドＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミドができ
ているかを調べた。また、目的通りの大きさのフラグメ
ントが得られたプラスミドについては、挿入部分をＤＮ
Ａシークエンサー ３７３Ａ（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて塩基配列を確認した。その結果、目
的としたプラスミドｐＤＰＧＨ１１、およびｐＤＰＧＨ
１２を得た。図４に、プラスミドｐＤＰＧＨ１１および
ｐＤＰＧＨ１２の構築図を示す。
で合成したＤＮＡフラグメントの断片１〜１２を含むＤ
ＮＡを、プラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ
間に、断片１３〜２６を含むＤＮＡを、プラスミドｐＵ
Ｃ１９のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ間にそれぞれ連結し、大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換株からプラスミドＤＮＡを調製し、電
気泳動を行ったところ、目的のプラスミドと思われるク
ローンがそれぞれ得られた。得られた形質転換株からプ
ラスミドＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で切断後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、目的のプラスミドができ
ているかを調べた。また、目的通りの大きさのフラグメ
ントが得られたプラスミドについては、挿入部分をＤＮ
Ａシークエンサー ３７３Ａ（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて塩基配列を確認した。その結果、目
的としたプラスミドｐＤＰＧＨ１１、およびｐＤＰＧＨ
１２を得た。図４に、プラスミドｐＤＰＧＨ１１および
ｐＤＰＧＨ１２の構築図を示す。
【００５５】(8) ブタ成長ホルモン遺伝子の発現ベクタ
ーへの連結 ブタ成長ホルモン（ＰＧＨ）遺伝子の発現ベクターへの
連結を、まず大腸菌系で行った。
ーへの連結 ブタ成長ホルモン（ＰＧＨ）遺伝子の発現ベクターへの
連結を、まず大腸菌系で行った。
【００５６】ブタ成長ホルモン遺伝子を、前記ｐＤＰＧ
Ｈ１２およびｐＤＰＧＨ１１から、それぞれＨｐａＩＩ
−ＫｐｎＩ断片およびＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片として
切断回収した。この際、ｐＤＰＧＨ１１からのＢａｍＨ
Ｉ切断点はアルカリホスファターゼ処理を行い脱リン酸
した。
Ｈ１２およびｐＤＰＧＨ１１から、それぞれＨｐａＩＩ
−ＫｐｎＩ断片およびＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片として
切断回収した。この際、ｐＤＰＧＨ１１からのＢａｍＨ
Ｉ切断点はアルカリホスファターゼ処理を行い脱リン酸
した。
【００５７】一方、前記(1) で構築したｐＭＤ３００３
からプロモーター部分をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とし
て切断回収した。また、前記(5) で構築したｐＵＣ１９
−１１０Ｂをベクターとして用いるため、ＢａｍＨＩで
切断し、切断点をアルカリホスファターゼ処理し脱リン
酸した。
からプロモーター部分をＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とし
て切断回収した。また、前記(5) で構築したｐＵＣ１９
−１１０Ｂをベクターとして用いるため、ＢａｍＨＩで
切断し、切断点をアルカリホスファターゼ処理し脱リン
酸した。
【００５８】上記ＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ１９−１
１０Ｂ、上記プロモーターＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片、
前記(2) で調製したＳＤ配列断片、前記(3) で調製した
α−アミラーゼシグナル配列遺伝子断片、上記ｐＤＰＧ
Ｈ１２から得たＨｐａＩＩ−ＫｐｎＩ断片、上記ｐＤＰ
ＧＨ１１から得たＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片、および前
記(4) で調製したターミネーター断片の合計７断片をＴ
４リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換した。得られたアンピシリン耐性の形質転換株から
プラスミドＤＮＡを調製し検討したところ、目的のプラ
スミドｐＤＰＧＨ１３を一株得た。得られたプラスミド
ＤＮＡの合成ＤＮＡ部分について、塩基配列を確認し
た。図５に、プラスミドｐＤＰＧＨ１３の構築図を示
す。
１０Ｂ、上記プロモーターＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片、
前記(2) で調製したＳＤ配列断片、前記(3) で調製した
α−アミラーゼシグナル配列遺伝子断片、上記ｐＤＰＧ
Ｈ１２から得たＨｐａＩＩ−ＫｐｎＩ断片、上記ｐＤＰ
ＧＨ１１から得たＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片、および前
記(4) で調製したターミネーター断片の合計７断片をＴ
４リガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換した。得られたアンピシリン耐性の形質転換株から
プラスミドＤＮＡを調製し検討したところ、目的のプラ
スミドｐＤＰＧＨ１３を一株得た。得られたプラスミド
ＤＮＡの合成ＤＮＡ部分について、塩基配列を確認し
た。図５に、プラスミドｐＤＰＧＨ１３の構築図を示
す。
【００５９】(9) 枯草菌プラスミドベクターへのＰＧＨ
遺伝子の連結 次に、ブタ成長ホルモン遺伝子を、枯草菌プラスミドベ
クターｐＵＢ１１０へ連結した。
遺伝子の連結 次に、ブタ成長ホルモン遺伝子を、枯草菌プラスミドベ
クターｐＵＢ１１０へ連結した。
【００６０】まず、ｐＵＢ１１０をＳｐｈＩとＡｖａＩ
で切断し、ベクター部分を回収した。一方、前記(8) で
得られたｐＤＰＧＨ１３から、ブタ成長ホルモン遺伝子
をＡｖａＩ−ＫｐｎＩとＳｐｈＩ−ＫｐｎＩの２つの断
片として回収した。これらの３つの断片を連結し、低プ
ロテアーゼ枯草菌宿主ＳＰＬ１４株を形質転換した。得
られたカナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを
回収し検討したところ、目的のプラスミドｐＤＰＧＨ３
０が得られた。図６に、プラスミドｐＤＰＧＨ３０の構
築図を示す。
で切断し、ベクター部分を回収した。一方、前記(8) で
得られたｐＤＰＧＨ１３から、ブタ成長ホルモン遺伝子
をＡｖａＩ−ＫｐｎＩとＳｐｈＩ−ＫｐｎＩの２つの断
片として回収した。これらの３つの断片を連結し、低プ
ロテアーゼ枯草菌宿主ＳＰＬ１４株を形質転換した。得
られたカナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを
回収し検討したところ、目的のプラスミドｐＤＰＧＨ３
０が得られた。図６に、プラスミドｐＤＰＧＨ３０の構
築図を示す。
【００６１】(10)枯草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）
によるブタ成長ホルモンの分泌生産 枯草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）を以下のように培
養し、培養上清中へのブタ成長ホルモンの分泌生産を行
った。
によるブタ成長ホルモンの分泌生産 枯草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）を以下のように培
養し、培養上清中へのブタ成長ホルモンの分泌生産を行
った。
【００６２】まず、ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）を１
０ｍＬのＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ ｐＨ７．２ １５μｇ／ｍＬカ
ナマイシン）に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液
１ｍＬを採取し、遠心分離による集菌と、０．８５％Ｎ
ａＣｌ水溶液への懸濁を繰返し（２回）、洗菌した。次
に、０．８５％ＮａＣｌ水溶液に懸濁した菌を、１００
ｍＬのＬＳ培地（２％トリプトン、１．０％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ １％可溶性デンプン ０．５Ｍ
コハク酸ナトリウム ｐＨ７．３ １５０μｇ／ｍＬカ
ナマイシン）を入れた５００ｍｌ容のひだ付き三角フラ
スコに植菌し、ロータリーシェーカーを用いて１５時間
振盪培養した（１２５ｒｐｍ、３７℃）。培養液を遠心
分離し、ブタ成長ホルモンを含む培養上清を得た。
０ｍＬのＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ ｐＨ７．２ １５μｇ／ｍＬカ
ナマイシン）に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液
１ｍＬを採取し、遠心分離による集菌と、０．８５％Ｎ
ａＣｌ水溶液への懸濁を繰返し（２回）、洗菌した。次
に、０．８５％ＮａＣｌ水溶液に懸濁した菌を、１００
ｍＬのＬＳ培地（２％トリプトン、１．０％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ １％可溶性デンプン ０．５Ｍ
コハク酸ナトリウム ｐＨ７．３ １５０μｇ／ｍＬカ
ナマイシン）を入れた５００ｍｌ容のひだ付き三角フラ
スコに植菌し、ロータリーシェーカーを用いて１５時間
振盪培養した（１２５ｒｐｍ、３７℃）。培養液を遠心
分離し、ブタ成長ホルモンを含む培養上清を得た。
【００６３】(11)枯草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）
のブタ成長ホルモン分泌生産性 ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）の培養上清中に分泌され
たブタ成長ホルモン量を、抗ブタ成長ホルモン抗体を用
いたスロットブロット法により測定した。スロットブロ
ッティングには、バイオドットＳＦ装置（日本バイオラ
ット（株）製）を用い、装置付属のマニュアルに従い、
ニトロセルロースメンブレン（以下メンブレンと略す）
にサンプルをブロッティングした。サンプルは、ＳＰＬ
１４（ｐＤＰＧＨ３０）の培養上清をＴＢＳバッファー
（２０ｍＭＴｒｉｓ ５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．
５）で１／２０−１／１６０倍に希釈した溶液、および
スタンダードとしてブタ脳下垂体より抽出したブタ成長
ホルモンをＴＢＳバッファーに溶かした溶液を用いた。
のブタ成長ホルモン分泌生産性 ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）の培養上清中に分泌され
たブタ成長ホルモン量を、抗ブタ成長ホルモン抗体を用
いたスロットブロット法により測定した。スロットブロ
ッティングには、バイオドットＳＦ装置（日本バイオラ
ット（株）製）を用い、装置付属のマニュアルに従い、
ニトロセルロースメンブレン（以下メンブレンと略す）
にサンプルをブロッティングした。サンプルは、ＳＰＬ
１４（ｐＤＰＧＨ３０）の培養上清をＴＢＳバッファー
（２０ｍＭＴｒｉｓ ５００ｍＭＮａＣｌ ｐＨ７．
５）で１／２０−１／１６０倍に希釈した溶液、および
スタンダードとしてブタ脳下垂体より抽出したブタ成長
ホルモンをＴＢＳバッファーに溶かした溶液を用いた。
【００６４】次に、メンブレン上のブタ成長ホルモンの
検出を行った。まず、サンプルをブロッティングしたメ
ンブレンをブロッティング溶液（３％ゼラチン／ＴＢＳ
バッファー）に浸侵し、室温で１時間穏やかに振盪し
た。メンブレンをＴＴＢＳバッファー（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＴＢＳ）中に移し、２回洗浄（５分×２）
した後、一次抗体液（抗ブタ成長ホルモン抗体（ＵＣＢ
社製）１／５００ｖｏｌｕｍｅ／１％ゼラチン／ＴＴＢ
Ｓバッファー）に浸侵した。室温で１時間振盪した後、
ＴＴＢＳバッファー中に移し２回洗浄（５分×２）し、
メンブレンを二次抗体液（ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
標識抗ウサギＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）１／３０
００ｖｏｌｕｍｅ／１％ゼラチン／ＴＴＢＳバッファ
ー）中に移した。１時間振盪したメンブレンをＴＴＢＳ
バッファーで２回（５分×２）およびＴＢＳバッファー
中で５分間洗浄した後，ＨＲＰを発色させメンブレン上
に固定化されたブタ成長ホルモンを検出した。ＨＲＰの
発色はイムノステインＨＲＰキットＩＳ−５０Ｂコニカ
（コニカ（株）製）を用いて行った。
検出を行った。まず、サンプルをブロッティングしたメ
ンブレンをブロッティング溶液（３％ゼラチン／ＴＢＳ
バッファー）に浸侵し、室温で１時間穏やかに振盪し
た。メンブレンをＴＴＢＳバッファー（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０／ＴＢＳ）中に移し、２回洗浄（５分×２）
した後、一次抗体液（抗ブタ成長ホルモン抗体（ＵＣＢ
社製）１／５００ｖｏｌｕｍｅ／１％ゼラチン／ＴＴＢ
Ｓバッファー）に浸侵した。室温で１時間振盪した後、
ＴＴＢＳバッファー中に移し２回洗浄（５分×２）し、
メンブレンを二次抗体液（ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
標識抗ウサギＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）１／３０
００ｖｏｌｕｍｅ／１％ゼラチン／ＴＴＢＳバッファ
ー）中に移した。１時間振盪したメンブレンをＴＴＢＳ
バッファーで２回（５分×２）およびＴＢＳバッファー
中で５分間洗浄した後，ＨＲＰを発色させメンブレン上
に固定化されたブタ成長ホルモンを検出した。ＨＲＰの
発色はイムノステインＨＲＰキットＩＳ−５０Ｂコニカ
（コニカ（株）製）を用いて行った。
【００６５】メンブレン上の各スポットのＨＲＰ発色強
度を画像解析装置（アトー（株）製、モデル ＡＥ−６
９００）を用いて数値化した。ブタ脳下垂体より抽出し
たブタ成長ホルモンの発色強度から検量線を作成し、枯
草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）のブタ成長ホルモン
分泌量を測定した。その結果ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３
０）株は、約１０ｍｇ／Ｌのブタ成長ホルモンを培養上
清中に分泌生産していた。
度を画像解析装置（アトー（株）製、モデル ＡＥ−６
９００）を用いて数値化した。ブタ脳下垂体より抽出し
たブタ成長ホルモンの発色強度から検量線を作成し、枯
草菌ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）のブタ成長ホルモン
分泌量を測定した。その結果ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３
０）株は、約１０ｍｇ／Ｌのブタ成長ホルモンを培養上
清中に分泌生産していた。
【００６６】ＳＰＬ１４（ｐＤＰＧＨ３０）株の培養上
清１０μＬを、常法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分離した後、転写装置を用いてニ
トロセルロースメンブレンに転写した。メンブレン上に
転写されたブタ成長ホルモンを前記(11)の手法に従って
検出した結果、ブタ脳下垂体より抽出したブタ成長ホル
モンと同じ位置にバンドが検出された。
清１０μＬを、常法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により分離した後、転写装置を用いてニ
トロセルロースメンブレンに転写した。メンブレン上に
転写されたブタ成長ホルモンを前記(11)の手法に従って
検出した結果、ブタ脳下垂体より抽出したブタ成長ホル
モンと同じ位置にバンドが検出された。
【００６７】
配列番号：１ 配列の長さ：５７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．５７０ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TTTCCTGCCA TGCCGCTGTC ATCCCTTTTC GCTAACGCAG TTTTACGTGC TCAACATTTA 60 CACCAGCTTG CAGCGGATAC ATATAAAGAA TTTGAAAGAG CTTACATTCC AGAAGGCCAA 120 CGCTATTCTA TCCAGAACGC ACAAGCGGCT TTCTGCTTTA GCGAGACGAT TCCTGCACCG 180 ACAGGCAAAG ATGAAGCTCA GCAACGTTCT GACGTTGAAC TGCTTAGATT CTCTTTACTG 240 CTTATCCAAA GCTGGCTGGG TCCAGTACAG TTCTTATCTC GAGTATTTAC TAATAGCTTG 300 GTGTTTGGTA CCAGTGACCG TGTCTACGAG AAATTAAAGG ATCTGGAAGA AGGCATTCAA 360 GCATTAATGC GTGAGTTAGA AGATGGAAGC CCTCGTGCAG GCCAAATCTT GAAACAGACT 420 TACGACAAAT TCGACACGAA CCTTCGCTCT GATGATGCGC TGTTGAAGAA CTATGGATTA 480 CTCTCCTGTT TTAAAAAGGA TCTTCATAAA GCCGAAACAT ATTTGCGTGT AATGAAATGT 540 CGTCGCTTCG TTGAGAGCTC CTGCGCTTTT 570
【００６８】
配列番号：２ 配列の長さ：９５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：１．．９５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AATTCAGGAT CCTTGATTTG TATTCACTCT GCCAAGTTGT TTTGATAGAG TGATTGTGAT 60 AATTTAAAAT GTAAGCGTGA ACAAAATTCT CCAGT 95
【００６９】
配列番号：３ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：binding-site 存在位置：３．．１７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTAGAAAGGA GGTGATCTAG AATTCATGTT CG 32
【００７０】
配列番号：４ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：１．．７５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CGAAACGATT CAAAACCTCT TTACTGCCGT TATTTGCTGG ATTTTTATTG CTGTTTTATT 60 TGGTTCTGGC AGGAC 75
【００７１】
配列番号：５ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：terminator 存在位置：１．．７５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GATCTATAAA AAGAAGCAGG TTCCTCCATA CCTGCTTCTT TTTATTTGTC AGCATCCTGA 60 TGTTGGATCC GCATG 75
【図１】プラスミドｐＭＤ３００３の構築図である。
【図２】プラスミドｐＵＣ１９−１１０Ｂの構築図であ
る。
る。
【図３】ブタ成長ホルモン構造遺伝子のＤＮＡフラグメ
ントを示す図である。
ントを示す図である。
【図４】プラスミドｐＤＰＧＨ１１およびプラスミドｐ
ＤＰＧＨ１２の構築図である。
ＤＰＧＨ１２の構築図である。
【図５】プラスミドｐＤＰＧＨ１３の構築図である。
【図６】プラスミドｐＤＰＧＨ３０の構築図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (5)
- 【請求項１】 バチルス属細菌分泌蛋白質のシグナル配
列をコードする遺伝子領域とその下流側に位置するブタ
成長ホルモン構造遺伝子領域とからなる雑種ブタ成長ホ
ルモン遺伝子と、前記雑種ブタ成長ホルモン遺伝子の上
流にバチルス属細菌で機能し得るプロモーターを含有す
る組換えプラスミドベクター。 - 【請求項２】 バチルス属細菌分泌蛋白質が枯草菌α−
アミラーゼである請求項１記載の組換えプラスミドベク
ター。 - 【請求項３】 ブタ成長ホルモン構造遺伝子が、下記の
塩基配列を有する請求項１記載の組換えプラスミドベク
ター。 １ ＴＴＴＣＣＴＧＣＣＡ ＴＧＣＣＧＣＴＧＴＣ ＡＴＣＣＣＴＴＴＴＣ ＡＡＡＧＧＡＣＧＧＴ ＡＣＧＧＣＧＡＣＡＧ ＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧ ３１ ＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧ ＴＴＴＴＡＣＧＴＧＣ ＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡ ＣＧＡＴＴＧＣＧＴＣ ＡＡＡＡＴＧＣＡＣＧ ＡＧＴＴＧＴＡＡＡＴ ６１ ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧ ＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣ ＡＴＡＴＡＡＡＧＡＡ ＧＴＧＧＴＣＧＡＡＣ ＧＴＣＧＣＣＴＡＴＧ ＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴ ９１ ＴＴＴＧＡＡＡＧＡＧ ＣＴＴＡＣＡＴＴＣＣ ＡＧＡＡＧＧＣＣＡＡ ＡＡＡＣＴＴＴＣＴＣ ＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧ ＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴ １２１ ＣＧＣＴＡＴＴＣＴＡ ＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣ ＡＣＡＡＧＣＧＧＣＴ ＧＣＧＡＴＡＡＧＡＴ ＡＧＧＴＣＴＴＧＣＧ ＴＧＴＴＣＧＣＣＧＡ １５１ ＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡ ＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴ ＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＡＡＧＡＣＧＡＡＡＴ ＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡ ＡＧＧＡＣＧＴＧＧＣ １８１ ＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧ ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＡ ＧＣＡＡＣＧＴＴＣＴ ＴＧＴＣＣＧＴＴＴＣ ＴＡＣＴＴＣＧＡＧＴ ＣＧＴＴＧＣＡＡＧＡ ２１１ ＧＡＣＧＴＴＧＡＡＣ ＴＧＣＴＴＡＧＡＴＴ ＣＴＣＴＴＴＡＣＴＧ ＣＴＧＣＡＡＣＴＴＧ ＡＣＧＡＡＴＣＴＡＡ ＧＡＧＡＡＡＴＧＡＣ ２４１ ＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡ ＧＣＴＧＧＣＴＧＧＧ ＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧ ＧＡＡＴＡＧＧＴＴＴ ＣＧＡＣＣＧＡＣＣＣ ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＣ ２７１ ＴＴＣＴＴＡＴＣＴＣ ＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣ ＴＡＡＴＡＧＣＴＴＧ ＡＡＧＡＡＴＡＧＡＧ ＣＴＣＡＴＡＡＡＴＧ ＡＴＴＡＴＣＧＡＡＣ ３０１ ＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡ ＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧ ＴＧＴＣＴＡＣＧＡＧ ＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴ ＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣ ＡＣＡＧＡＴＧＣＴＣ ３３１ ＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧ ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡ ＡＧＧＣＡＴＴＣＡＡ ＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣ ＴＡＧＡＣＣＴＴＣＴ ＴＣＣＧＴＡＡＧＴＴ ３６１ ＧＣＡＴＴＡＡＴＧＣ ＧＴＧＡＧＴＴＡＧＡ ＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣ ＣＧＴＡＡＴＴＡＣＧ ＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴ ＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧ ３９１ ＣＣＴＣＧＴＧＣＡＧ ＧＣＣＡＡＡＴＣＴＴ ＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴ ＧＧＡＧＣＡＣＧＴＣ ＣＧＧＴＴＴＡＧＡＡ ＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡ ４２１ ＴＡＣＧＡＣＡＡＡＴ ＴＣＧＡＣＡＣＧＡＡ ＣＣＴＴＣＧＣＴＣＴ ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡ ＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴ ＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡ ４５１ ＧＡＴＧＡＴＧＣＧＣ ＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡ ＣＴＡＴＧＧＡＴＴＡ ＣＴＡＣＴＡＣＧＣＧ ＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴ ＧＡＴＡＣＣＴＡＡＴ ４８１ ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴ ＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡ ＴＣＴＴＣＡＴＡＡＡ ＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡ ＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴ ＡＧＡＡＧＴＡＴＴＴ ５１１ ＧＣＣＧＡＡＡＣＡＴ ＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴ ＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴ ＣＧＧＣＴＴＴＧＴＡ ＴＡＡＡＣＧＣＡＣＡ ＴＴＡＣＴＴＴＡＣＡ ５４１ ＣＧＴＣＧＣＴＴＣＧ ＴＴＧＡＧＡＧＣＴＣ ＣＴＧＣＧＣＴＴＴＴ ＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣ ＡＡＣＴＣＴＣＧＡＧ ＧＡＣＧＣＧＡＡＡＡ - 【請求項４】 請求項１〜３の何れかの項に記載の組換
えプラスミドベクターにより形質転換されたバチルス属
細菌。 - 【請求項５】 請求項４記載のバチルス属細菌を培養
し、産出されたブタ成長ホルモンを回収するブタ成長ホ
ルモンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5339300A JPH07155183A (ja) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | 組換えプラスミドベクター、バチルス属細菌、およびブタ成長ホルモンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5339300A JPH07155183A (ja) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | 組換えプラスミドベクター、バチルス属細菌、およびブタ成長ホルモンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07155183A true JPH07155183A (ja) | 1995-06-20 |
Family
ID=18326157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5339300A Pending JPH07155183A (ja) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | 組換えプラスミドベクター、バチルス属細菌、およびブタ成長ホルモンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07155183A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142235A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-09-08 | 江西嘉博生物工程有限公司 | 一种表达猪生长激素基因的重组短短芽孢杆菌及构建方法与应用 |
-
1993
- 1993-12-02 JP JP5339300A patent/JPH07155183A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107142235A (zh) * | 2017-06-20 | 2017-09-08 | 江西嘉博生物工程有限公司 | 一种表达猪生长激素基因的重组短短芽孢杆菌及构建方法与应用 |
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