JPH07155197A - クレアチニンの検出方法及び検出具 - Google Patents
クレアチニンの検出方法及び検出具Info
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- JPH07155197A JPH07155197A JP6258077A JP25807794A JPH07155197A JP H07155197 A JPH07155197 A JP H07155197A JP 6258077 A JP6258077 A JP 6258077A JP 25807794 A JP25807794 A JP 25807794A JP H07155197 A JPH07155197 A JP H07155197A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 強塩基性物質を用いない、クレアチニンの検
出方法及び検出具を提供する。 【構成】 本発明は、水溶液中、特に尿中のクレアチニ
ンの検出方法であり、ヒドロペルオキシド、及び酸素フ
リーラジカルとプソイドペルオキシダーゼの存在下に検
出可能な応答を示す酸化され得る指示薬の存在下に、そ
の溶液を可溶性銅（II）塩と接触させる工程を含む。本
発明は、銅（II）イオンが、クレアチニンと、ペルオキ
シダーゼのような活性を示す錯体を形成するという発見
に基づく。
出方法及び検出具を提供する。 【構成】 本発明は、水溶液中、特に尿中のクレアチニ
ンの検出方法であり、ヒドロペルオキシド、及び酸素フ
リーラジカルとプソイドペルオキシダーゼの存在下に検
出可能な応答を示す酸化され得る指示薬の存在下に、そ
の溶液を可溶性銅（II）塩と接触させる工程を含む。本
発明は、銅（II）イオンが、クレアチニンと、ペルオキ
シダーゼのような活性を示す錯体を形成するという発見
に基づく。
Description
【０００１】ペルオキシダーゼは、ペルオキシドによる
フェノール類やアミン類のような種々の化合物の酸化を
触媒する酵素である。さらに、特定の化合物は、それら
がヒドロペルオキシドから酸素を放出させ、その酸素を
ある受容体化合物に転移させることによってペルオキシ
ダーゼ酵素と同様に振る舞うため、プソイドペルオキシ
ダーゼと称されている。したがって、プソイドペルオキ
シダーゼは、ペルオキシドと酸化され得る化合物間の反
応を触媒し、又は関与するという点で、酵素類似であ
る。ヘモグロビンやその誘導体を含むプソイドペルオキ
シダーゼは、ペルオキシド活性化物質（peroxidatively
active substance)とみなされている。
フェノール類やアミン類のような種々の化合物の酸化を
触媒する酵素である。さらに、特定の化合物は、それら
がヒドロペルオキシドから酸素を放出させ、その酸素を
ある受容体化合物に転移させることによってペルオキシ
ダーゼ酵素と同様に振る舞うため、プソイドペルオキシ
ダーゼと称されている。したがって、プソイドペルオキ
シダーゼは、ペルオキシドと酸化され得る化合物間の反
応を触媒し、又は関与するという点で、酵素類似であ
る。ヘモグロビンやその誘導体を含むプソイドペルオキ
シダーゼは、ペルオキシド活性化物質（peroxidatively
active substance)とみなされている。
【０００２】例えば、尿中のグルコース検定において、
グルコースオキシダーゼ酵素は、酸素の存在下に、尿中
のグルコースを、グルコン酸と過酸化水素に変換し、そ
の後検定システム中に含有されるペルオキシダーゼ酵素
が、過酸化水素（ヒドロペルオキシド）と酸化され得る
染料化合物、例えばｏ−トリジンやテトラメチルベンジ
ジンとの間の相互作用を触媒し、その結果還元状態では
無色の染料が、検出可能な応答を示す有色になる。有色
応答の度合と強度は、染料の酸化を触媒するのに十分な
ペルオキシダーゼが存在するならば、直接的には、グル
コース変換によって生成した過酸化水素の量に比例す
る。
グルコースオキシダーゼ酵素は、酸素の存在下に、尿中
のグルコースを、グルコン酸と過酸化水素に変換し、そ
の後検定システム中に含有されるペルオキシダーゼ酵素
が、過酸化水素（ヒドロペルオキシド）と酸化され得る
染料化合物、例えばｏ−トリジンやテトラメチルベンジ
ジンとの間の相互作用を触媒し、その結果還元状態では
無色の染料が、検出可能な応答を示す有色になる。有色
応答の度合と強度は、染料の酸化を触媒するのに十分な
ペルオキシダーゼが存在するならば、直接的には、グル
コース変換によって生成した過酸化水素の量に比例す
る。
【０００３】同様に、ヘモグロビンやその誘導体のよう
なペルオキシド活性化物質は、ヒドロペルオキシドと酸
化され得る染料間の相互作用を触媒し得る。この相互作
用において、ペルオキシド活性化物質は、ペルオキシダ
ーゼに似せて、酸化され得る染料とヒドロペルオキシド
間の相互作用を触媒する。その結果生ずる相互作用は、
色変化のような検出可能な応答を示し、応答の強度は、
ペルオキシド活性化物質の濃度を示す。
なペルオキシド活性化物質は、ヒドロペルオキシドと酸
化され得る染料間の相互作用を触媒し得る。この相互作
用において、ペルオキシド活性化物質は、ペルオキシダ
ーゼに似せて、酸化され得る染料とヒドロペルオキシド
間の相互作用を触媒する。その結果生ずる相互作用は、
色変化のような検出可能な応答を示し、応答の強度は、
ペルオキシド活性化物質の濃度を示す。
【０００４】クレアチニンは、クレアチンがクレアチン
リン酸になり、筋肉収縮のためのエネルギー源として利
用されるときの最終代謝物質である。生成したクレアチ
ニンは、腎臓の糸球体によってろ過され、その後再吸収
なしに尿中へ排泄される。体液中のクレアチニンの検出
は、筋肉の病気又は腎炎や腎不全のような種々の腎臓の
病気を診断する上で有効である。
リン酸になり、筋肉収縮のためのエネルギー源として利
用されるときの最終代謝物質である。生成したクレアチ
ニンは、腎臓の糸球体によってろ過され、その後再吸収
なしに尿中へ排泄される。体液中のクレアチニンの検出
は、筋肉の病気又は腎炎や腎不全のような種々の腎臓の
病気を診断する上で有効である。
【０００５】ヤッフェ法として知られている、尿中のク
レアチニンを検出するための最初の実用的な試験は、ア
ルカリ溶液中におけるピクリン酸とクレアチニンの結合
によって、赤黄色がかった茶色のクレアチニンピクレー
トの生成を伴う。クレアチニンの検出のためのより最近
の方法は、J.Biol.Chem.,113:515(1936)中でBenedict及
びBehre によって報告されており、その方法はアルカリ
媒体中において３，５−ジニトロ安息香酸とクレアチニ
ンの反応を伴う。これらの反応のいずれもがクレアチニ
ンを脱プロトン化するために、高いpH、すなわち１２〜
１３のオーダーを要求し、それによりその系が適切に働
く。アルカリやアルカリ土類金属の水酸化物のような強
塩基性物質は、典型的にこれらの試薬系において好適な
高いpHを維持するために用いられる。このような高いpH
で操作することは種々の難点があり、特に、ろ過紙又は
多孔性フィルムのような吸収体が試薬系のための支持体
として用いられるときに、アルカリの取り込みにおい
て、その支持体が砕け、支持体マトリックス全体にアル
カリを均一に分布させることの困難性がある。さらに、
試薬を溶液の形態で支持体に塗布し、かつ乾燥残渣を残
すために溶媒を蒸発させるとき、乾燥したアルカリは、
クレアチニン濃度が試験される尿のような液体と接触さ
せるとき容易には溶解しない。
レアチニンを検出するための最初の実用的な試験は、ア
ルカリ溶液中におけるピクリン酸とクレアチニンの結合
によって、赤黄色がかった茶色のクレアチニンピクレー
トの生成を伴う。クレアチニンの検出のためのより最近
の方法は、J.Biol.Chem.,113:515(1936)中でBenedict及
びBehre によって報告されており、その方法はアルカリ
媒体中において３，５−ジニトロ安息香酸とクレアチニ
ンの反応を伴う。これらの反応のいずれもがクレアチニ
ンを脱プロトン化するために、高いpH、すなわち１２〜
１３のオーダーを要求し、それによりその系が適切に働
く。アルカリやアルカリ土類金属の水酸化物のような強
塩基性物質は、典型的にこれらの試薬系において好適な
高いpHを維持するために用いられる。このような高いpH
で操作することは種々の難点があり、特に、ろ過紙又は
多孔性フィルムのような吸収体が試薬系のための支持体
として用いられるときに、アルカリの取り込みにおい
て、その支持体が砕け、支持体マトリックス全体にアル
カリを均一に分布させることの困難性がある。さらに、
試薬を溶液の形態で支持体に塗布し、かつ乾燥残渣を残
すために溶媒を蒸発させるとき、乾燥したアルカリは、
クレアチニン濃度が試験される尿のような液体と接触さ
せるとき容易には溶解しない。
【０００６】本発明は、ペルオキシダーゼ又はプソイド
ペルオキシダーゼの存在下におけるヒドロペルオキシド
が色原指示体を酸化して検出可能な応答を提供する前述
の系中において、銅イオンとクレアチニンが、プソイド
ペルオキシダーゼとして働く化合物を形成し得るという
発見に基づく。
ペルオキシダーゼの存在下におけるヒドロペルオキシド
が色原指示体を酸化して検出可能な応答を提供する前述
の系中において、銅イオンとクレアチニンが、プソイド
ペルオキシダーゼとして働く化合物を形成し得るという
発見に基づく。
【０００７】Polyhedron,Vol.4,No.7,pp.1159-1161,198
5 中で、Mitewaらは、Ｃｕ（II）とクレアチニン間の錯
体形成について記述している。彼らは、Ｃｕ（II）とク
レアチニンとの錯体が、金属：配位子比が１：２で形成
されており、かつ対応するＣｏ（II）、Ｃｄ（II）、Ｚ
ｎ（II）及びＨｇ（II）の錯体とはかなり相違する４個
のキレート環部分からなる錯体が形成されることを開示
している。
5 中で、Mitewaらは、Ｃｕ（II）とクレアチニン間の錯
体形成について記述している。彼らは、Ｃｕ（II）とク
レアチニンとの錯体が、金属：配位子比が１：２で形成
されており、かつ対応するＣｏ（II）、Ｃｄ（II）、Ｚ
ｎ（II）及びＨｇ（II）の錯体とはかなり相違する４個
のキレート環部分からなる錯体が形成されることを開示
している。
【０００８】本発明は、水性媒体中のクレアチニンの検
出方法に関する。この方法は、ヒドロペルオキシド、及
び酸素フリーラジカルの存在下で有色の応答を示す酸化
還元指示薬の存在下に、クレアチニンを含有する疑いの
ある媒体を、銅イオンと接触させる工程を含む。
出方法に関する。この方法は、ヒドロペルオキシド、及
び酸素フリーラジカルの存在下で有色の応答を示す酸化
還元指示薬の存在下に、クレアチニンを含有する疑いの
ある媒体を、銅イオンと接触させる工程を含む。
【０００９】本発明は、いかなる特定の機構又は理論に
も基づいておらず、銅が銅（II）・シトレートの形態で
あり、ＴＭＢがテトラメチルベンジジンである以下の一
連の反応が、クレアチニンの検出のための本システムを
示していると考える。
も基づいておらず、銅が銅（II）・シトレートの形態で
あり、ＴＭＢがテトラメチルベンジジンである以下の一
連の反応が、クレアチニンの検出のための本システムを
示していると考える。
【００１０】
【化１】
【００１１】前式において、反応式１）は待機状態（re
sting state)からのＣｕ・クレアチニン錯体の生成を示
す。反応式２）は、ＴＭＢからＣｕ（II）・クレアチニ
ン錯体へ１個の電子が転移することにより、ＴＭＢ染料
を酸化し、その結果非反応性Ｃｕ（Ｉ）体を生成するこ
とを示す。反応式３）は、再生工程であり、Ｃｕ（Ｉ）
錯体がペルオキシドにより電子を奪われ、Ｃｕ（II）を
再生する工程である。
sting state)からのＣｕ・クレアチニン錯体の生成を示
す。反応式２）は、ＴＭＢからＣｕ（II）・クレアチニ
ン錯体へ１個の電子が転移することにより、ＴＭＢ染料
を酸化し、その結果非反応性Ｃｕ（Ｉ）体を生成するこ
とを示す。反応式３）は、再生工程であり、Ｃｕ（Ｉ）
錯体がペルオキシドにより電子を奪われ、Ｃｕ（II）を
再生する工程である。
【００１２】ＴＭＢが過度にあり、かつＫ1 が定数なの
で、クレアチニンが固定量の場合、溶液の酸性度及びＣ
ｕ（II）とシトレートの比のみが、生成されるＣｕ（I
I）・クレアチニンの量に影響する。このように、
で、クレアチニンが固定量の場合、溶液の酸性度及びＣ
ｕ（II）とシトレートの比のみが、生成されるＣｕ（I
I）・クレアチニンの量に影響する。このように、
【００１３】
【化２】
【００１４】ｋ1 が定数であり、かつ〔ＴＭＢ〕が非常
に大きいので、〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕の量が、
形成される色の度合いを決める。ここで、
に大きいので、〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕の量が、
形成される色の度合いを決める。ここで、
【００１５】
【化３】
【００１６】〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕は、以下の
（Ａ）〜（Ｄ）に依存する。 （Ａ）Ｋ1 ＝平衡定数 （Ｂ）〔Ｈ+ 〕、すなわちpH 〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕は、pHの低下又は〔Ｈ
+ 〕の増加につれて増加する。 （Ｃ）シトレート 〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕が減少するにつれて〔シ
トレート〕は増加するので、Ｃｕ（II）・シトレートを
形成するために十分な〔シトレート〕が存在しなくては
ならない。 （Ｄ）〔Ｈ+ 〕と〔シトレート〕が固定的であるとき、
Ｃｕ（II）の量は〔クレアチニン〕のみに依存する。
（Ａ）〜（Ｄ）に依存する。 （Ａ）Ｋ1 ＝平衡定数 （Ｂ）〔Ｈ+ 〕、すなわちpH 〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕は、pHの低下又は〔Ｈ
+ 〕の増加につれて増加する。 （Ｃ）シトレート 〔Ｃｕ（II）・クレアチニン〕が減少するにつれて〔シ
トレート〕は増加するので、Ｃｕ（II）・シトレートを
形成するために十分な〔シトレート〕が存在しなくては
ならない。 （Ｄ）〔Ｈ+ 〕と〔シトレート〕が固定的であるとき、
Ｃｕ（II）の量は〔クレアチニン〕のみに依存する。
【００１７】銅（II）イオンの供給源は、その陰イオン
がクレアチニンの比色的検出のための反応において不利
には作用しないいかなる可溶性銅塩であってもよい。好
ましい塩類には、硫酸銅、硝酸銅、酸化銅、水酸化銅、
リン酸銅、ヨウ化銅、塩化銅、臭化銅、酢酸銅、シュウ
酸銅を含む。別の可溶性銅（II）塩は、それらがＣｕ
（II）・クレアチニン錯体の形成を許容する限り、使用
され得る。陰イオンがあまりに強く銅に結合する塩類
は、Ｃｕ（II）・クレアチニン錯体が形成されるのを許
容しないであろう。したがって、銅（II）イオンとＥＤ
ＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡ間で形成され
たようなＣｕ（II）錯体は、Ｃｕ（II）・クレアチニン
錯体の形成にとって、十分なＣｕ（II）を放出しないで
あろう。クエン酸塩及び硫酸塩が最も低いブランク反応
性を示すことが観察されたので、それらが好ましい。ク
エン酸銅（II）は、より低いブランク反応性とＣｕ（I
I）・クレアチニン錯体の最大の形成量を示すために特
に好ましい。クレアチニンの非存在下に染料を酸化する
塩類は、ほとんど望ましくない。２、２’−ビピリジン
銅（II）は、クレアチニンの非存在下にかなりのＴＭＢ
の酸化をもたらすので、本発明における使用には適さな
い。クエン酸銅が銅（II）イオン供給源として使用され
る場合に、クエン酸イオン濃度は少なくとも銅のそれよ
りあるべきである。銅イオンの少なくとも２倍であるク
エン酸イオンの過剰分が、クエン酸イオンによるＣｕ
（II）の完全な錯形成反応を保証するために好ましい。
がクレアチニンの比色的検出のための反応において不利
には作用しないいかなる可溶性銅塩であってもよい。好
ましい塩類には、硫酸銅、硝酸銅、酸化銅、水酸化銅、
リン酸銅、ヨウ化銅、塩化銅、臭化銅、酢酸銅、シュウ
酸銅を含む。別の可溶性銅（II）塩は、それらがＣｕ
（II）・クレアチニン錯体の形成を許容する限り、使用
され得る。陰イオンがあまりに強く銅に結合する塩類
は、Ｃｕ（II）・クレアチニン錯体が形成されるのを許
容しないであろう。したがって、銅（II）イオンとＥＤ
ＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びＤＴＰＡ間で形成され
たようなＣｕ（II）錯体は、Ｃｕ（II）・クレアチニン
錯体の形成にとって、十分なＣｕ（II）を放出しないで
あろう。クエン酸塩及び硫酸塩が最も低いブランク反応
性を示すことが観察されたので、それらが好ましい。ク
エン酸銅（II）は、より低いブランク反応性とＣｕ（I
I）・クレアチニン錯体の最大の形成量を示すために特
に好ましい。クレアチニンの非存在下に染料を酸化する
塩類は、ほとんど望ましくない。２、２’−ビピリジン
銅（II）は、クレアチニンの非存在下にかなりのＴＭＢ
の酸化をもたらすので、本発明における使用には適さな
い。クエン酸銅が銅（II）イオン供給源として使用され
る場合に、クエン酸イオン濃度は少なくとも銅のそれよ
りあるべきである。銅イオンの少なくとも２倍であるク
エン酸イオンの過剰分が、クエン酸イオンによるＣｕ
（II）の完全な錯形成反応を保証するために好ましい。
【００１８】典型的に、テストされる水性媒体が尿であ
る場合、尿中のクレアチニンの標準範囲が３〜２０mMな
ので銅（II）イオン濃度は５〜３０mMであろう。この範
囲は他の液体においては変わるものであり、例えば血清
においては好適には０．０５〜０．３０mMの範囲の銅
（II）イオン濃度を用いるであろう。銅（Ｉ）イオンは
クレアチニンの非存在下における染料の酸化により、い
くらかのバックグラウンド妨害をもたらす傾向がある。
したがって、Ｃｕ（Ｉ）塩は使用されるべきでない。
る場合、尿中のクレアチニンの標準範囲が３〜２０mMな
ので銅（II）イオン濃度は５〜３０mMであろう。この範
囲は他の液体においては変わるものであり、例えば血清
においては好適には０．０５〜０．３０mMの範囲の銅
（II）イオン濃度を用いるであろう。銅（Ｉ）イオンは
クレアチニンの非存在下における染料の酸化により、い
くらかのバックグラウンド妨害をもたらす傾向がある。
したがって、Ｃｕ（Ｉ）塩は使用されるべきでない。
【００１９】好適な酸化され得る指示薬には、例えばベ
ンジジン；ｏ−トリジン；アルキル基が１〜約６個の炭
素原子を含む３，３’，５，５’−テトラアルキルベン
ジジン；ｏ−ジアニシジン；２，７−ジアミノフルオレ
ン；ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン）−アジ
ン；（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン）−（１
−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２
−オン）−アジン又はこれらの組合せを含む。
ンジジン；ｏ−トリジン；アルキル基が１〜約６個の炭
素原子を含む３，３’，５，５’−テトラアルキルベン
ジジン；ｏ−ジアニシジン；２，７−ジアミノフルオレ
ン；ビス−（Ｎ−エチルキノール−２−オン）−アジ
ン；（Ｎ−メチルベンズチアゾール−２−オン）−（１
−エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２
−オン）−アジン又はこれらの組合せを含む。
【００２０】本発明の使用において好適なヒドロペルオ
キシドは、クメンヒドロペルオキシド；５−ブチルヒド
ロペルオキシド；ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオ
キシド；１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペ
ルオキシド；２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒ
ドロペルオキシド；パラメンタンヒドロペルオキシド；
１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロペルオキシ
ド；ｐ−ｔ−ブチル−イソプロピルベンゼンヒドロペル
オキシド；２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）
−６−イソプロピルナフタレン；テトラリンヒドロペル
オキシド又はこれらの組合せを含む。
キシドは、クメンヒドロペルオキシド；５−ブチルヒド
ロペルオキシド；ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオ
キシド；１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペ
ルオキシド；２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒ
ドロペルオキシド；パラメンタンヒドロペルオキシド；
１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロペルオキシ
ド；ｐ−ｔ−ブチル−イソプロピルベンゼンヒドロペル
オキシド；２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）
−６−イソプロピルナフタレン；テトラリンヒドロペル
オキシド又はこれらの組合せを含む。
【００２１】典型的には、可溶性銅塩、ヒドロペルオキ
シド及び酸化され得る指示薬を含む試薬系を水に溶解さ
せるであろう。しかしながら、検定機構を妨害しない限
り、有機溶媒をその系中に取り込んでもよい。ヒドロペ
ルオキシドと酸化され得る指示薬の濃度は、通常１０〜
１５０mMであり、好ましくは６０〜１００mMの範囲であ
ろう。
シド及び酸化され得る指示薬を含む試薬系を水に溶解さ
せるであろう。しかしながら、検定機構を妨害しない限
り、有機溶媒をその系中に取り込んでもよい。ヒドロペ
ルオキシドと酸化され得る指示薬の濃度は、通常１０〜
１５０mMであり、好ましくは６０〜１００mMの範囲であ
ろう。
【００２２】本発明の実施において、検定は、湿式又は
乾式（試験片）形式のいずれでも遂行させ得る。検定を
達成するために、試薬試験片又は試薬のアセトニトリル
溶液及び水溶液の使用を通して、試験サンプルと、たと
えばクエン酸銅（II）のような銅塩、染料及びヒドロペ
ルオキシドを、緩衝させたpH、 好ましくは４．０〜９．
０のpH下で混合させる。吸収体を銅（II）塩や緩衝剤の
水溶液に浸し、吸収体を乾燥させ、その後染料とヒドロ
ペルオキシドの有機溶液にそれを浸し、引き続いて乾燥
させるという従来の方法で、試薬試験片を準備する。
乾式（試験片）形式のいずれでも遂行させ得る。検定を
達成するために、試薬試験片又は試薬のアセトニトリル
溶液及び水溶液の使用を通して、試験サンプルと、たと
えばクエン酸銅（II）のような銅塩、染料及びヒドロペ
ルオキシドを、緩衝させたpH、 好ましくは４．０〜９．
０のpH下で混合させる。吸収体を銅（II）塩や緩衝剤の
水溶液に浸し、吸収体を乾燥させ、その後染料とヒドロ
ペルオキシドの有機溶液にそれを浸し、引き続いて乾燥
させるという従来の方法で、試薬試験片を準備する。
【００２３】本発明を更に、以下の実施例により示す。
【００２４】
【実施例】実施例１ ８．４mMの硫酸銅（II）、１６mMのクエン酸三ナトリウ
ム及びpHを７．０に維持するためのコハク酸緩衝剤２５
０mMを含有する水溶液１．５mLに、０．５mLの尿を添加
することにより、クレアチニンの液体（湿潤相）検定を
行った。その溶液に、アセトニトリル中の１００mMのＤ
ＢＤＨと１００mMのＴＭＢを、攪拌しながら添加した。
ム及びpHを７．０に維持するためのコハク酸緩衝剤２５
０mMを含有する水溶液１．５mLに、０．５mLの尿を添加
することにより、クレアチニンの液体（湿潤相）検定を
行った。その溶液に、アセトニトリル中の１００mMのＤ
ＢＤＨと１００mMのＴＭＢを、攪拌しながら添加した。
【００２５】４２２nmにおける吸光度を、Gilford Resp
onseII分光光度計を用いて６０秒後に測定した。標準溶
液を、クレアチニン濃度と吸光度との検量線を準備する
ために用いた。Ａ＝ＥＣというベールの法則から、尿サ
ンプル中のクレアチニン濃度を決定した。
onseII分光光度計を用いて６０秒後に測定した。標準溶
液を、クレアチニン濃度と吸光度との検量線を準備する
ために用いた。Ａ＝ＥＣというベールの法則から、尿サ
ンプル中のクレアチニン濃度を決定した。
【００２６】実施例２ Whatman BP87ろ過紙を、水性の第１浸液及びアクリロニ
トリルの第２浸液に、それぞれ６０／６０／６０℃の３
乾燥域を用いながら連続的に含浸させることにより、乾
燥試薬紙を調製した。第１浸液には、硫酸銅の形態で銅
イオンを含ませた。また、待機状態において、銅と結合
させるため、尿蛋白との結合を妨害するため及びホスフ
ェート、オキサレート並びに尿中に存在する遊離アミン
又はアンモニウムとのキレート化を防ぐために、クエン
酸を含ませ、さらに低い銅結合能を有する緩衝剤として
コハク酸を含ませた。第２浸液には、酸化還元指示薬で
ある３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）、ヒドロペルオキシドとしてジイソプロピルベンゼ
ンジヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ）を含ませた。
トリルの第２浸液に、それぞれ６０／６０／６０℃の３
乾燥域を用いながら連続的に含浸させることにより、乾
燥試薬紙を調製した。第１浸液には、硫酸銅の形態で銅
イオンを含ませた。また、待機状態において、銅と結合
させるため、尿蛋白との結合を妨害するため及びホスフ
ェート、オキサレート並びに尿中に存在する遊離アミン
又はアンモニウムとのキレート化を防ぐために、クエン
酸を含ませ、さらに低い銅結合能を有する緩衝剤として
コハク酸を含ませた。第２浸液には、酸化還元指示薬で
ある３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭ
Ｂ）、ヒドロペルオキシドとしてジイソプロピルベンゼ
ンジヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ）を含ませた。
【００２７】
【表１】
【００２８】分析 試験片を、上記の組成物から調製した紙から製造した。
６６０nmにおける反射率を、Clinitek-10 （登録商標）
分光光度計で測定した。クレアチニンを種々のレベルで
含有する尿中に試験片を含浸させてから４５秒後に得ら
れた６００nmにおける反射率を、クレアチニンに対する
試薬反応性を調べるために用いた。クレアチニン値がRo
eche COBAS-FARA 装置において、標準方法、すなわちヤ
ッフェ反応を用いて測定済の、個々に集められた２２の
尿を用いて、試薬反応性を測定した。試験される尿を、
比重とpHの広い範囲にわたり分配した。
６６０nmにおける反射率を、Clinitek-10 （登録商標）
分光光度計で測定した。クレアチニンを種々のレベルで
含有する尿中に試験片を含浸させてから４５秒後に得ら
れた６００nmにおける反射率を、クレアチニンに対する
試薬反応性を調べるために用いた。クレアチニン値がRo
eche COBAS-FARA 装置において、標準方法、すなわちヤ
ッフェ反応を用いて測定済の、個々に集められた２２の
尿を用いて、試薬反応性を測定した。試験される尿を、
比重とpHの広い範囲にわたり分配した。
【００２９】図１は、クレアチニン濃度の関数としての
反射率のグラフである。試薬結果をＫ／Ｓ値で示したと
きには非直線の試薬応答となり、反射率値で示したとき
には直線の試薬応答となった。ヤッフェ反応を用いて測
定したクレアチニン値と本発明の酸化性クレアチニン試
薬をもって得られた反射率値との間には、良好な相関性
が確認された。２００mg/dL のクレアチニンを含有する
尿での試薬結果では、５０mLのアスコルビン酸の添加に
よっては影響を受けず、アスコルベートによる負の影響
を示さなかった。さらに、４５mg/dL のクレアチニンを
含有する尿サンプルでの試薬結果では、０．４０５mg/d
L のヘモグロビンの添加によっては影響を受けず、この
レベルのペルオキシド活性ヘモグロビンでは、正の妨害
を示さなかった。試薬反応性は、pHの減少とともに増加
した。pHが７．０の試薬は、５０〜２５０mg/dL クレア
チニンを含有するサンプル間で、もっとも大きい反射率
を示した。クレアチニン反応性を、塩化第二鉄でも調べ
たが、高いレベルの妨害が、鉄を不適切なものにした。
銅は、クレアチニン以外の尿の成分、例えばホスフェー
トからほとんど妨害を受けないので、それを選択した。
アンモニウムや緩衝剤として用いるコハク酸の影響を抑
制するために、さらにクエン酸を含有させた。他の緩衝
剤、例えばアセテート、マロン酸、硼酸、酒石酸及びリ
ンゴ酸をも使用され得る。
反射率のグラフである。試薬結果をＫ／Ｓ値で示したと
きには非直線の試薬応答となり、反射率値で示したとき
には直線の試薬応答となった。ヤッフェ反応を用いて測
定したクレアチニン値と本発明の酸化性クレアチニン試
薬をもって得られた反射率値との間には、良好な相関性
が確認された。２００mg/dL のクレアチニンを含有する
尿での試薬結果では、５０mLのアスコルビン酸の添加に
よっては影響を受けず、アスコルベートによる負の影響
を示さなかった。さらに、４５mg/dL のクレアチニンを
含有する尿サンプルでの試薬結果では、０．４０５mg/d
L のヘモグロビンの添加によっては影響を受けず、この
レベルのペルオキシド活性ヘモグロビンでは、正の妨害
を示さなかった。試薬反応性は、pHの減少とともに増加
した。pHが７．０の試薬は、５０〜２５０mg/dL クレア
チニンを含有するサンプル間で、もっとも大きい反射率
を示した。クレアチニン反応性を、塩化第二鉄でも調べ
たが、高いレベルの妨害が、鉄を不適切なものにした。
銅は、クレアチニン以外の尿の成分、例えばホスフェー
トからほとんど妨害を受けないので、それを選択した。
アンモニウムや緩衝剤として用いるコハク酸の影響を抑
制するために、さらにクエン酸を含有させた。他の緩衝
剤、例えばアセテート、マロン酸、硼酸、酒石酸及びリ
ンゴ酸をも使用され得る。
【００３０】本発明の方法は、銅イオンの使用に限定さ
れる。鉄はいくらかのクレアチニン結合能を示すが、非
特異的である。待機状態においては、鉄はクレアチニン
以外の尿成分に対して不安定である。
れる。鉄はいくらかのクレアチニン結合能を示すが、非
特異的である。待機状態においては、鉄はクレアチニン
以外の尿成分に対して不安定である。
【図１】クレアチニン濃度と反射率の関係を示した図で
ある。
ある。
Claims (11)
- 【請求項１】 水性媒体中のクレアチニンの検出方法に
おいて、ヒドロペルオキシド、及び酸素フリーラジカル
とプソイドペルオキシダーゼの存在下に色応答を示す酸
化され得る染料の存在下に、クレアチニンを含有する疑
いのある水性媒体を銅（II）イオンと接触させることを
特徴とするクレアチニンの検出方法。 - 【請求項２】 銅（II）イオンが、可溶性銅（II）塩か
ら供給され、その塩の陰イオンが、硫酸イオン、硝酸イ
オン、酸化物イオン、水酸化物イオン、リン酸イオン、
ヨウ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、酢酸イ
オン又はシュウ酸イオンからなる群から選択される請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 銅（II）イオンがクエン酸銅（II）から
供給される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 水性媒体中のクエン酸イオン濃度が、銅
（II）イオン濃度の少なくとも２倍である請求項３記載
の方法。 - 【請求項５】 水性媒体が尿であり、かつ銅（II）イオ
ンの濃度が、少なくとも５〜３０mMである請求項１記載
の方法。 - 【請求項６】 酸化され得る染料が、ベンジジン；ｏ−
トリジン；アルキル基が１〜６個の炭素原子を含む３，
３’，５，５’−テトラアルキルベンジジン；ｏ−ジア
ニシジン；２，７−ジアミノフルオレン；ビス−（Ｎ−
エチルキノール−２−オン）−アジン；（Ｎ−メチルベ
ンズチアゾール−２−オン）−（１−エチル−３−フェ
ニル−５−メチルトリアゾール−２−オン）−アジン又
はこれらの組合せである請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 ヒドロペルオキシドが、クメンヒドロペ
ルオキシド；５−ブチルヒドロペルオキシド；ジイソプ
ロピルベンゼンヒドロペルオキシド；１−ヒドロキシシ
クロヘキサン−１−ヒドロペルオキシド；２，５−ジメ
チルヘキサン−２，５−ジヒドロペルオキシド；パラメ
ンタンヒドロペルオキシド；１，４−ジイソプロピルベ
ンゼンヒドロペルオキシド；ｐ−ｔ−ブチル−イソプロ
ピルベンゼンヒドロペルオキシド；２−（α−ヒドロペ
ルオキシイソプロピル）−６−イソプロピルナフタレ
ン；テトラリンヒドロペルオキシド又はこれらの組合せ
である請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 水性媒体中の酸化され得る染料とヒドロ
ペルオキシドの濃度が、１０〜１５０mMである請求項１
記載の方法。 - 【請求項９】 水性媒体中の酸化され得る染料とヒドロ
ペルオキシドの濃度が、６０〜１００mMである請求項８
記載の方法。 - 【請求項１０】 銅（II）イオン、ヒドロペルオキシド
及び酸化され得る染料を、それを塗布した吸収試験片に
よって、水性媒体に適用する請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 水性媒体中のクレアチニンを検出する
ための検出具において、銅（II）イオンの供給源、ヒド
ロペルオキシド、及び酸素フリーラジカルとプソイドペ
ルオキシダーゼの存在下で検出可能な応答を示す酸化さ
れ得る染料を吸収させた吸収試験片を含む検出具。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/140,878 US5374561A (en) | 1993-10-25 | 1993-10-25 | Oxidative creatinine assay |
| US08/140878 | 1993-10-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07155197A true JPH07155197A (ja) | 1995-06-20 |
| JP3537507B2 JP3537507B2 (ja) | 2004-06-14 |
Family
ID=22493202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25807794A Expired - Lifetime JP3537507B2 (ja) | 1993-10-25 | 1994-10-24 | クレアチニンの検出方法及び検出具 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5374561A (ja) |
| JP (1) | JP3537507B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5702955A (en) * | 1995-05-22 | 1997-12-30 | Bayer Corporation | Ascorbate resistant detection of hydrogen peroxide |
| DE19521290C2 (de) * | 1995-06-10 | 1997-06-12 | Juergen Lehmann | Teststreifen für Urinanalyten und Auswertefarbtafel |
| US5610073A (en) * | 1995-09-26 | 1997-03-11 | Bayer Corporation | Use of CO2 absorbant for stabilization of dried alkaline reagent in creatinine assay |
| US5733787A (en) * | 1996-06-17 | 1998-03-31 | Bayer Corporation | Method for the detection of creatinine |
| CA2249778A1 (en) * | 1997-12-15 | 1999-06-15 | Bayer Corporation | Competitive apo-peroxidase assay |
| US6074881A (en) * | 1998-08-03 | 2000-06-13 | Bayer Corporation | Method for the prevention of hemoglobin interference in reagent systems for measuring peroxidase activity |
| US6001656A (en) * | 1998-09-28 | 1999-12-14 | Bayer Corporation | Method for the detection of creatinine |
| AU2397200A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-31 | Sedum Laboratories | Tetramethylbenzidine formulation with increased performance for horseradish peroxidase enzyme assays |
| US6210971B1 (en) * | 1999-01-25 | 2001-04-03 | Bayer Corporation | Assay for the detection of creatinine |
| JP4214271B2 (ja) * | 2002-10-15 | 2009-01-28 | アークレイ株式会社 | クレアチニン測定用試験片 |
| US6872573B2 (en) * | 2003-01-02 | 2005-03-29 | Bayer Corporation | Fluorescent creatinine assay |
| US20060281188A1 (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Ratiometric test strip and method |
| WO2009078950A2 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Cornell University | Method of determing excretion of sodium and other analytes |
| CN102661949A (zh) * | 2012-04-23 | 2012-09-12 | 南京工业大学 | 一种尿液肌酐检测试纸及其制备方法 |
| US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
| EP2930247A1 (en) | 2014-04-07 | 2015-10-14 | Fundació Clinic per a la Recerca Biomèdica (FCRB) | Biomarker of prognosis and acute-on chronic liver failure in cirrhosis |
| WO2019139980A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Idexx Laboratories, Inc. | Methods for measuring analyte and/or protein in biological samples |
| JP2021520484A (ja) | 2018-04-03 | 2021-08-19 | サノフイＳａｎｏｆｉ | ラテラルフロー免疫アッセイストリップ装置 |
| CA3234510A1 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | Idexx Laboratories, Inc. | Homogenous enzyme immunoassay |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3710510A (en) * | 1971-05-10 | 1973-01-16 | Cabot Corp | Plant growth media and methods |
| US4004368A (en) * | 1975-02-24 | 1977-01-25 | Cabot Corporation | Agricultural soil compositions |
| US5173431A (en) * | 1991-10-12 | 1992-12-22 | Miles Inc. | Copper oxidation protein assay |
-
1993
- 1993-10-25 US US08/140,878 patent/US5374561A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-10-24 JP JP25807794A patent/JP3537507B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3537507B2 (ja) | 2004-06-14 |
| US5374561A (en) | 1994-12-20 |
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