JPH07163393A - 抗一酸化窒素合成酵素モノクローナル抗体、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】一酸化窒素（ＮＯ）合成酵素を高感度に測定し
得る抗ＮＯ合成酵素抗体を提供する。 【構成】マクロファージ、脳由来（神経細胞、グリア細
胞由来など）の一酸化窒素合成酵素の少なくとも一種を
高感度に測定し得る一酸化窒素合成酵素モノクローナル
抗体、該抗体産生ハイブリドーマを作製し、該抗体を用
いた一酸化窒素合成酵素の検出，測定法及び精製法を樹
立した。 【効果】本発明抗体により、簡便かつ高感度に一酸化窒
素合成酵素を測定する事ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一酸化窒素合成酵素に結
合性を有するモノクローナル抗体、その製造法および用
途に関する。さらに、該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】一酸化窒素（ＮＯ）は哺乳動物の生体内
で、生理的な活性、例えば脈管系では血管拡張因子とし
て〔ファーマコロジカル リビュー（Pharmacol. Re
v.）第４３巻，第１０９−１４２頁（１９９１）〕、白
血球系では殺腫瘍細胞殺細菌作用を示す因子として〔Cu
rr. Opin. Immunol. 第３巻，第６５−７０頁（１９９
１）〕、神経系では神経伝達因子として〔ニューロン
（Neuron）第８巻，第３−１１頁（１９９２）〕等、種
々の役割を担っていると考えられている。ＮＯはアルギ
ニンからＮＯ合成酵素により合成される。ＮＯ合成酵素
の遺伝子は、これまで脳〔ネイチャー（Nature）第３５
１巻，第７１４−７１８頁（１９９１）〕、マクロファ
ージ〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー（J. Biol. Chem.）第２６７巻，第６３７０−６３７
４頁（１９９２）〕、血管内皮細胞〔プロシーディング
ス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス
（Proc.Natl. Acad. Sci.）第８９巻，第６３４８−６
３５２頁（１９９２）〕等からクローニングされてい
る。これらの核酸配列から想定されるアミノ酸配列は、
相互に５０〜６０％の相同性を示すものの、何れも異な
った分子種として認識されている。これらのＮＯ合成酵
素のうちマクロファージ型のものはカルシウム／カルモ
ジュリン非依存性で、免疫学的に誘導される誘導型（in
ducible）酵素であり、また脳，血管内皮細胞型のもの
はカルシウム／カルモジュリン依存型で構成的（consti
tutive）な酵素であるといわれている〔セル（Cell）第
７０巻，第７０５−７０７頁（１９９２）〕。ＮＯ合成
酵素に対しては、これまで数種の抗体が得られている
が、その大半がポリクローナル抗体であり、ＮＯ合成酵
素を分別し得るモノクローナル抗体としては、ウシ内皮
細胞由来ＮＯ合成酵素を認識する抗体が知られているの
みである〔J. S. Pollockら，ジャーナル バスキュラル
リサーチ（J. Vasc. Res.），第２９巻，第１８４頁
（１９９２）〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】したがって、種々のＮ
Ｏ合成酵素に対して高感度に結合性を示すモノクローナ
ル抗体を作製することができれば、各ＮＯ合成酵素の細
胞、組織での発現の分布およびその発現量を知ることが
できると同時に、生体内等におけるＮＯ合成酵素しいて
はＮＯの役割をさらに解明することが可能となる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究した結果、誘導型ＮＯ合成酵素の一種
であるマクロファージ由来ＮＯ合成酵素を免疫原とし
て、種々のＮＯ合成酵素に対して高い結合能を有するモ
ノクローナル抗体を作製することに成功した。該モノク
ローナル抗体は、免疫組織化学的あるいは免疫化学測定
法に付すと、種々の細胞由来ＮＯ合成酵素を感度よく検
出または定量できる。また該モノクローナル抗体を用い
ることにより、マクロファージ、脳細胞（神経細胞，グ
リア細胞など）あるいは血管内皮細胞などの細胞由来Ｎ
Ｏ合成酵素を効率よく精製することができる。これらの
知見に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、（１）誘導型一酸化窒素合成
酵素を免疫原とし、一酸化窒素合成酵素に結合性を示
す、ＩｇＧ型モノクローナル抗体、（２）脳由来の一酸
化窒素合成酵素に結合性を示す上記（１）記載のモノク
ローナル抗体、（３）マクロファージ由来の一酸化窒素
合成酵素に結合性を示し、かつ血管内皮細胞由来の一酸
化窒素合成酵素に結合性を示さないモノクローナル抗
体、（４）誘導型一酸化窒素合成酵素で免疫した哺乳動
物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞から
なるクローン化されたハイブリドーマ、（５）マクロフ
ァージ由来の一酸化窒素合成酵素で免疫した哺乳動物の
脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞とを細胞
融合し、クローニングすることを特徴とする上記（４）
記載のハイブリドーマの製造法、（６）上記（４）記載
のハイブリドーマを液体培地中または哺乳動物の腹腔内
で増殖させることを特徴とする上記（１）、（２）また
は（３）記載のモノクローナル抗体の製造法、（７）上
記（１）、（２）または（３）記載のモノクローナル抗
体を用いることを特徴とする一酸化窒素合成酵素の検出
または定量法、（８）酵素免疫測定法である（７）記載
の検出または定量法、（９）上記（１）、（２）または
（３）記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴と
する一酸化窒素合成酵素の精製法である。

【０００５】本発明において哺乳動物の免疫に用いるＮ
Ｏ合成酵素としては、動物由来の誘導型ＮＯ合成酵素で
あればいずれでもよく、分子としては天然型のみならず
部分ペプチドおよびムテイン（mutein）であってもよ
い。動物由来のＮＯ合成酵素の代表例としては、たとえ
ば、ラットマクロファージ由来ＮＯ合成酵素〔Yui, Y.
ら，ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（J. Biol. Chem.）第２６６巻，１２５４４−１２５４
７頁（１９９１）〕などがあげられるが、マクロファー
ジ由来のものが好ましく用いられる。免疫原としては上
述のＮＯ合成酵素をそれぞれの組織から分離してもよ
く、またＮＯ合成酵素をコードする塩基配列を有するＤ
ＮＡを含有する発現ベクターを作製し、適当な宿主細胞
に導入してＮＯ合成酵素を大量に産生させればよい。発
現ベクターは、例えば、(イ)ＮＯ合成酵素をコードする
ＲＮＡを分離し、(ロ)該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、(ハ)該
相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、(ニ)得られた組み
換えプラスミドで宿主を形質転換し、(ホ)得られた形質
転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、例えばＤ
ＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション
法により目的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離
し、(ヘ)該プラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、(ト)該クローン化ＤＮＡをベクターのプロ
モーターの下流に連結する、ことにより、それぞれ製造
することができる。

【０００６】このようにして得られた発現ベクターを、
適当な宿主（例、大腸菌,枯草菌,酵母,動物細胞など）
に組み込み、得られた形質転換体を培地に培養すること
により、 ＮＯ合成酵素を製造することができる。上記
ＮＯ合成酵素蛋白質としては、ＮＯ合成酵素のムテイン
も含まれる。該ＮＯ合成酵素ムテインとしては、本来、
元のペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異した
ものであり、アミノ酸の付加,構成アミノ酸の欠損,他の
アミノ酸への置換が挙げられる。該アミノ酸の付加とし
ては、少なくとも１個のアミノ酸が付加しているものが
挙げられる。該構成アミノ酸の欠損としては、少なくと
も１個のＮＯ合成酵素構成アミノ酸が欠損しているもの
が挙げられる。該他のアミノ酸への置換としては、少な
くとも１個のＮＯ合成酵素構成アミノ酸が別のアミノ酸
で置換されているものが挙げられる。

【０００７】ＮＯ合成酵素にアミノ酸が付加しているム
テインにおけるアミノ酸の付加としては、ペプチドを発
現する際に用いられる開始コドンに基因するメチオニン
や、シグナルペプチドの付加はこれに含まれないもので
ある。付加されるアミノ酸の数としては、少なくとも１
個であるが、誘導型ＮＯ合成酵素の特徴を失わない限り
何個でもよい。さらに好ましくは、ＮＯ合成酵素間で高
い相同性(ホモロジー)が認められているアミノ酸配列の
一部あるいはすべてが挙げられる。構成アミノ酸が欠損
しているＮＯ合成酵素のムテインにおける欠損している
構成アミノ酸の数としては、少なくとも１個であるが誘
導型ＮＯ合成酵素の有する特徴を失わない限り何個でも
よい。構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているＮ
Ｏ合成酵素のムテインにおける置換される前のＮＯ合成
酵素の構成アミノ酸（被置換アミノ酸）の数としては、
少なくとも１個であるが誘導型ＮＯ合成酵素の特徴を失
わない限り何個でもよい。

【０００８】置換される構成アミノ酸（被置換アミノ
酸）の例としては、システインあるいはシステイン以外
のいずれのアミノ酸も対象となり得るが、システインが
特に好ましく置換される。システイン以外の被置換アミ
ノ酸としては、アスパラギン酸,アルギニン,グリシン,
バリンなどが挙げられる。 被置換アミノ酸がシステインである場合には、置換する
アミノ酸（置換アミノ酸）としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とえば、グリシン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイ
シン,チロシン,フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプト
ファン,セリン,スレオニン,メチオニンなどが挙げられ
る。特に、セリン,スレオニンが好ましい。被置換アミ
ノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換アミ
ノ酸としては、たとえば、アミノ酸の親水性,疎水性あ
るいは電荷の点で、被置換アミノ酸とは異なる性質をも
つものを選ぶ。具体的には被置換アミノ酸がアスパラギ
ン酸の場合には、置換アミノ酸としてアスパラギン,ス
レオニン,バリン,フェニルアラニン,アルギニンなどが
挙げられるが、特にアスパラギン,アルギニンが好まし
い。被置換アミノ酸がアルギニンの場合には置換アミノ
酸としてグルタミン,スレオニン,ロイシン,フェニルア
ラニン,アスパラギン酸が挙げられるが、特にグルタミ
ンが好ましい。被置換アミノ酸がグリシンである場合に
は、置換アミノ酸としては、スレオニン,ロイシン,フェ
ニルアラニン,セリン,グルタミン酸,アルギニンなどが
挙げられ、特にスレオニンが好ましい。被置換アミノ酸
がセリンである場合には、置換アミノ酸としては、メチ
オニン,アラニン,ロイシン,システイン,グルタミン,ア
ルギニン,アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオ
ニンが好ましい。被置換アミノ酸がバリンである場合に
は、置換アミノ酸としては、セリン,ロイシン,プロリ
ン,グリシン,リジン,アスパラギン酸などが挙げられ、
特にセリンが好ましい。被置換アミノ酸としては、アス
パラギン酸,アルギニン,グリシン,セリン,バリンが好ま
しく、置換アミノ酸としては、アスパラギン,グルタミ
ン,アルギニン,スレオニン,メチオニン,セリン,ロイシ
ンが好ましい。

【０００９】上記の置換においては、２以上の置換を同
時に行なってもよい。特に、２または３個の構成アミノ
酸が置換されるのが好ましい。上記のムテインは、上記
した付加,欠損,置換の２つまたは３つが組み合わさった
ものでもよい。該ムテインを製造するためには、特定部
位指向性変異誘発技術(Sitedirected mutagenesis)が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサ
ー(Lather, R. F.)及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq,
J. P.),ジェネティック・エンジニアリング(Genetic E
ngineering)、アカデミックプレス社(１９８３年)第３
１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指
示された変異誘発はエム・スミス（Smith, M.)及びエス
・ギラム（Gillam, S.)、ジェネティック・エンジニア
リング：原理と方法、プレナムプレス社(１９８１年)第
３巻 第１−３２頁に示されている。

【００１０】該ムテインをコードする構造遺伝子を製造
するためには、たとえば、 (a) ＮＯ合成酵素の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖
ＤＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑
種形成させる(この１本鎖で代替すべきシステイン用コ
ドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチ
センス・トリプレットを包含する領域に対して上記プラ
イマーは相補的なものである。但し、当該コドンの他の
アミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス
・トリプレットとの不一致はこの限りでない）、 (b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)を形成させる、
及び (c) この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

【００１１】このようにして得られたプラスミドで適当
な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培地に培養
することにより、ムテインを製造することができる。本
発明における抗原としてのＮＯ合成酵素の構成アミノ酸
が欠損したムテインとしては、ＮＯ合成酵素のアミノ酸
配列のうちのアミノ酸の個数が１００個以上のものから
なるムテインが好ましく、さらに好ましくは１１０個以
上のムテインがあげられる。本発明のモノクローナル抗
体を製造するには、ＮＯ合成酵素、そのムテインまたは
その部分ペプチドを哺乳動物に免疫し、得られた脾臓細
胞と哺乳動物のリンパ球様細胞とを細胞融合させ、次い
でクローン化することにより製造される。該ＮＯ合成酵
素、そのムテインまたはその部分ペプチドを免疫するに
際しては、ＮＯ合成酵素をキャリヤー蛋白との複合体と
してから、これを免疫に用いてもよい。該キャリヤー蛋
白としては、たとえばウシ血清アルブミン,ウシサイロ
グロブリン,ヘモシアニンなどが挙げられる。キャリヤ
ー蛋白複合体を用いる場合に、キャリヤー蛋白とＮＯ合
成酵素とのカップリング比率は、約０.１〜３０倍(キャ
リヤー／ＮＯ合成酵素：重量比)で用いられる。望まし
くは約０.５〜５倍が用いられる。また、ハプテンとキ
ャリヤーとのカップリングには、種々の縮合剤を用いる
ことが出来るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド
等が好都合に用いられる。

【００１２】ＮＯ合成酵素または複合体を用いて免疫す
るに際し、免疫する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモ
ット、ラット、マウス等の実験動物が使われるが、モノ
クローナル抗体を得るためには、ラット、マウスが好ま
しい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、腹腔
内、静脈内、筋肉内、皮内、皮下等のいずれのルートか
らでも可能であるが、主として皮下、腹腔内、静脈内に
(とりわけ皮下)注入するのが好ましい。また、免疫間
隔,免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能である
が、たとえば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫
後、約１〜５日、好ましくは約２〜４日後に摘出した脾
臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は１回に
ペプチド量として、マウス当り約０.１μg以上、好まし
くは約１０μg〜３００μg用いることが望ましい。又、
脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の
上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合を行うこと
が望ましい。

【００１３】上記の細胞融合は例えば摘出したマウスの
脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ欠損(ＨＧＰＲＴ^-)や、 チミジン
キナーゼ欠損(ＴＫ^-)の様なマーカーを持った適切な同
種または異種(好ましくは同種)のミエローマ〔例、Ｐ３
−Ｘ６３−Ａg・８Ｕ１(市森他 ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル・メソッド 第８０巻 第５５頁(１９８
５)〕等の、リンパ球様細胞株との間で融合させる。例
えばケーラーおよびミルスタインらの方法〔ネイチャー
(Nature)第２５６巻，第４９５頁(１９７５)〕に準じて
融合させることにより製造される。たとえばミエローマ
細胞と脾細胞とを約１：５の割合で、たとえばイスコフ
培地とハムＦ−１２培地を１：１に混合した培地(以下
ＩＨ 培地と称する。)に懸濁させ、センダイウイルス,
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の融合剤が用いて融
合することができる。もちろんジメチルスルホキシド
(ＤＭＳＯ)その他の融合促進剤をこれらに替えて加える
ことも可能である。ＰＥＧの平均分子量は、ふつう約１
０００〜９０００,反応時間は約０.５〜３０分,濃度は
約１０％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一
例として、ＰＥＧ ６０００を約３５〜５５％で約４〜
１０分処理することにより、効率よく融合させることが
出来る。融合細胞は、ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン培地〔ＨＡＴ培地：ネイチャー,第２５６巻,
第４９５頁(１９７５)〕等を用いて、選択的に増殖させ
ることが出来る。

【００１４】増殖してきた細胞の培養上清は、目的とす
る抗体の産生の有無についてスクリーニングを行うが、
抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来る。
即ち、まず第１段階として免疫に用いた抗原ペプチドに
対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッセイ(ＲＩ
Ａ)法またはエンザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)法等の
方法で調べることが出来るが、これらの方法についても
種々の変法が可能である。好ましい測定法の一例とし
て、ＥＩＡを用いる一つの方法について述べる。セルロ
ースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を常法に従ってカップリングさせておき、
これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加え、一
定時間、定温(約４〜４０℃を示す。以下においても同
様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った後、
酵素で標識した抗原ペプチド（酵素と抗原ペプチドを常
法に従いカップリングさせた後精製）を加え、一定時
間,定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間,定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光強度等で測定することが出来
る。

【００１５】選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた
抗原ペプチドに対する抗体活性のみられたウエルの細胞
は、限界希釈法等によりクローニングを行うことが望ま
しい。クローン化された細胞の上清について同様にスク
リーニングを行い抗体価の高いウエルの細胞を増やすこ
とにより、免疫に用いた抗原ペプチドと反応性を示すモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンが得られ
る。このようにしてクローン化されたハイブリドーマ
を、液体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体
培地たとえばＲＰＭＩ−１６４０〔Moore,G. E., ら，
ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（ J. Am. Med. Assoc.)１９９,５４９(１９６
７)〕に約０.１〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２
〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養することによ
り、培養液から該モノクローナル抗体を得ることができ
る。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖さ
せ、腹水を採取することにより抗体を取得することが出
来る。このためには、例えばマウスを用いる場合、ミネ
ラルオイル等を前もって接種したＢＡＬＢ／c 等のマウ
スに約１×１０⁴〜１×１０⁷個、好ましくは約５×１０
⁵〜２×１０⁶個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約
７〜２０日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を
採取する。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分
画,ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー等
の分離、精製法により、容易にモノクローナル抗体を純
粋な免疫グロブリンとして単離することが出来る。

【００１６】このようにして、誘導型ＮＯ合成酵素に対
するモノクローナル抗体が得られる。本発明のモノクロ
ーナル抗体にあっては、誘導型ＮＯ合成酵素を免疫原と
し各種のＮＯ合成酵素（好ましくはマクロファージまた
は脳由来）と高感度に結合するものをいうが、さらに製
造時に用いた免疫原のみならず同時にこれとは異なるＮ
Ｏ合成酵素（例えば、脳由来ＮＯ合成酵素などの構成的
なＮＯ合成酵素など）とも結合する抗体であっても本願
発明の抗体に含まれる。本発明のモノクローナル抗体
は、ＮＯ合成酵素と高感度に結合することから、ＮＯ合
成酵素測定用試薬として極めて有用である。さらに生体
臓器、組織中のＮＯ合成酵素の測定を容易にすること
は、ＮＯ合成酵素に関する基礎知見(例えば生体内分布)
を得る上からも極めて有用である。生体臓器,組織中の
ＮＯ合成酵素の検出には通常酵素免疫測定法(ＥＩＡ法)
などによる定量、あるいは蛍光抗体法やＲＩＡ法が用い
られるが、なかでもＥＩＡ法が好ましい。また本発明抗
体を用いこれらの臓器,組織中に存在するＮＯ合成酵素
の大きさを知るにはタンパクのウエスタンブロッティン
グ法が有効である。この方法は臓器,組織由来の粗抽出
液あるいはその部分精製試料をアクリルアミド電気泳動
した後、メンブランフィルターにトランスファーし、Ｈ
ＲＰ標識抗ＮＯ合成酵素抗体で検出する。

【００１７】さらに本発明抗体とＮＯ合成酵素との結合
能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作製してＮＯ
合成酵素の精製に利用することもできる。ＮＯ合成酵素
を検出,定量するために用いられる抗体分子は、そのフ
ラクション｛例、F(ab´)₂，Fab´ もしくはFab｝であ
っても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗体分
子はFab´ であることが好ましい。本発明のモノクロー
ナル抗体は、このようにＮＯ合成酵素の免疫化学的測定
法における試薬として用いることができる。ＮＯ合成酵
素の免疫化学的測定法によって、生体組織や細胞のＮＯ
合成酵素の量を測定することができ、これにより、たと
えば種々の組織や細胞のＮＯ合成酵素を測定することに
より、中枢神経系疾患，脈管系疾患，白血球が関与する
疾患例えば炎症性疾患等の診断に役立つと考えられる。

【００１８】上記免疫学的測定法において、二種の抗体
を用いる測定法を行なうに際しては、一方の抗体として
本発明のモノクローナル抗体を用い、他方の抗体とし
て、本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体を用いることができる。また、測定感度を上げる目
的で３種以上の抗体を適宜組み合わせて用いることもで
きる。ＮＯ合成酵素の測定方法において用いられる担体
上に保持された抗体（固相抗体）における担体として
は、例えば、ゲル粒子(例、アガロースゲル〔例、セフ
ァロース４Ｂ、セファロース６Ｂ(商品名，ファルマシ
ア・ファインケミカル社(スエーデン)製)〕、デキスト
ランゲル〔例、セファデックスＧ−７５、セファデック
スＧ−１００、セファデックスＧ−２００(登録商標，
ファルマシア・ファインケミカル社(スエーデン)
製)〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイオゲルＰ−
３０、バイオゲルＰ−６０、バイオゲルＰ−１００(登
録商標，バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)
製)〕、セルロース粒子〔例、アビセル(登録商標，旭化
成製)、イオン交換セルロース(例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース)〕、物理
的吸着剤〔例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッド、
アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロッ
ド)、シリコン片、スチレン系樹脂(例、ポリスチレン
球、ポリスチレン粒子)、イムノアッセイ用プレート
(例、ヌンク社(デンマーク)製〕、イオン交換樹脂
｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩ
ＲＣ−５０(登録商標，ローム・アンド・ハース社(米
国)製)、ゼオカーブ２２６(商品名，パームチット社(西
ドイツ)製)〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバ
ーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３(登録商標，ダウ
ケミカル社(米国)製〕｝などが挙げられる。

【００１９】担体に抗体を保持させるには、公知の常套
手段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻、第６
９６頁（１９７１年）に記載されているブロムシアン
法、グルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、
より簡便な方法として物理的に担体表面に吸着させても
よい。標識剤を結合させた抗体（標識抗体）における標
識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光
物質などが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。
酵素としては、安定で非活性の大きなものが好ましく、
ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いる
ことができるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオ
キシダーゼとしては、種々の起源のものを用いることが
できるが、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナ
ップル、イチジク、甘藷、ソラマメ、トウモロコシなど
から得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わ
さびから抽出されたホースラディッシュ ペルオキシダ
ーゼ(horseradish peroxidase)(ＨＲＰ)が好ましい。ペ
ルオキシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子と
してのFab´のチオール基を利用するために、あらかじ
めペルオキシダーゼにマレイミド基を導入したものを用
いると好都合である。マレイミド基をペルオキシダーゼ
に導入する方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基
を介してマレイミド基を導入することができる。そのた
めには、Ｎ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシ
レート誘導体を用いることができ、好ましくは、Ｎ−
(γ−マレイミドブチルオキシ)サクシイミド(ＧＭＢＳ
と略称することもある)などが良い。従って、マレイミ
ド基とペルオキシダーゼとの間に一定の基が入っている
こととなってもよい。ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反
応させるには、両者を、pＨ約６ないし８の緩衝液中で
約１０ないし５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反
応させることによって行われる。該緩衝液としては、た
とえば、pＨ７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げら
れる。このようにして得られたマレイミド化ペルオキシ
ダーゼは、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
精製することができる。該ゲルクロマトグラフィーを行
う際に用いられる担体としては、例えば、セファデック
スＧ−２５〔登録商標，ファルマシア・ファインケミカ
ル社(スエーデン)製〕、バイオゲルＰ−２〔登録商標，
バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製〕などが挙げ
られる。

【００２０】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、たとえば、pＨ６.０の
５mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１
Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得ら
れたペルオキシダーゼ標識抗体は、たとえばゲルクロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。該ゲル
クロマトグラフィーを行う際に用いられる担体として
は、例えば、セファデックスＧ−２５〔ファルマシア・
ファインケミカル社(スエーデン)製〕、バイオゲルＰ−
２〔バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製〕などが
挙げられる。さらに、ペルオキシダーゼにチオール基を
導入し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良
い。ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させ
るには、ペルオキシダーゼの場合に準じて行なうことが
でき、また、自体公知のグルタルアルデヒド法,過ヨウ
素酸法,水溶性カルボジイミド法などが用いられる。本
発明の測定系における被検試料としては、組織、細胞、
細胞株や菌体の抽出液またはそれらの培養上清が挙げら
れる。本発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキ
シダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、ペ
ルオキシダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきＮＯ合
成酵素含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った
後、これに、前記で得られたペルオキシダーゼと抗ＮＯ
合成酵素抗体との結合物（酵素標識抗体）を加えて反応
させる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のＮＯ合成酵素の標準溶
液に対してあらかじめ行い、ＮＯ合成酵素と吸光度もし
くは蛍光強度との関係を標準曲線として作成しておく。 ：未知量のＮＯ合成酵素を含む分析対象物(被検試料)
について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線に
あてはめ、分析対象物中のＮＯ合成酵素の量を測定す
る。

【００２１】本発明で得られた抗体を用いてＮＯ合成酵
素を精製することができる。これには、該抗体を用いて
アフィニティーカラムクロマトグラフィーを行なうこと
により行なうことができる。該アフィニティーカラムク
ロマトグラフィーは、たとえば、該抗体を適切な担体に
カップリングさせ、これをカラムに充填し、ＮＯ合成酵
素を含む溶液をカラムに通し吸着させ、次いで溶出させ
ることにより行なうことができる。該担体としては、た
とえば、先に記載された担体と同様のものが挙げられ
る。とりわけゲル粒子や各種合成樹脂が好都合に用いら
れる。たとえばＣＮＢr−活性化セファロース ４Ｂ(フ
ァルマシア・ファインケミカル社製),アフィゲル−１
０,アフィゲル１５(商品名，バイオラッド・ラボラトリ
ーズ社製)などが挙げられる。抗体を担体にカップリン
グさせるには、公知の常套手段を応用し得るが、たとえ
ば“代謝”,第８巻,第６９６頁（１９７１年）に記載さ
れているブロムシアン法,グルタールアルデヒド法が挙
げられる。また、水溶性カルボジイミドを用いる方法、
活性エステル法なども用いることができるが、より簡単
な方法として物理的に担体表面に吸着させてもよい。

【００２２】このようにして得られた抗体結合担体を用
いて精製を行なうには、抗体を結合させた担体を充填し
た抗体カラムに中性付近の緩衝液中に調製したＮＯ合成
酵素溶液を供し、ＮＯ合成酵素を吸着させる。次にカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄したのち、特異的に吸着されたＮ
Ｏ合成酵素を溶出させる。特異的に吸着されたＮＯ合成
酵素を溶出するには、たとえば、低pＨもしくは高pＨの
緩衝液,高濃度の塩を含有する緩衝液を用いて行なわれ
る。該低pＨの緩衝液としては、たとえばpＨ２.３の０.
１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液，pＨ１.８の０.１Ｍ第二
クエン酸ナトリウム−塩酸緩衝液などが挙げられる。該
高pＨの緩衝液としては、たとえばpＨ１１のアンモニア
水,pＨ１１.７の０.２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液などが
挙げられる。該高濃度の塩を含有する緩衝液としては、
たとえば６Ｍグアニジン塩酸溶液,７Ｍ尿素溶液などが
挙げられる。上記の溶出は、バッチ法でもよく、またカ
ラムを用いる方法でもよい。抗原の溶出液はたとえば透
析して精製する。たとえば低pＨの緩衝液で溶出した時
は、たとえば０.１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pＨ１０.
５）などの高ｐＨ緩衝液，高pＨの緩衝液で溶出した時
は、たとえば０.１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（pＨ３.
０）などの低ｐＨ緩衝液で中性化したのち、たとえば
０.１％ＮaＮ₃を含む０.０２Ｍリン酸食塩緩衝液（pＨ
８.０）に対して透析する。また高濃度の塩を含有する
緩衝液で溶出した抗原液は直接上記のリン酸食塩緩衝液
に透析して保存することもできる。また、上記溶出液ま
たは透析液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥標品として
保存することもできる。このようにして本発明の抗体を
用いて精製されるＮＯ合成酵素は、極めて高純度、高単
位のものであり、脳神経系，脈管系，血球系の生理ある
いは疾病の解明などの研究において試薬として用いるの
に有用であると考えられる。

【００２３】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示す
ものとする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly :グリシン Ａla :アラニン Ｖal :バリン Ｌeu :ロイシン Ｉle :イソロイシン Ｓer :セリン Ｔhr :スレオニン Ｃys :システイン Ｍet :メチオニン Ｇlu :グルタミン酸 Ａsp :アスパラギン酸 Ｌys :リジン Ａrg :アルギニン Ｈis :ヒスチジン Ｐhe :フェニールアラニン Ｔyr :チロシン Ｔrp :トリプトファン Ｐro :プロリン Ａsn :アスパラギン Ｇln :グルタミン Ｃlz :２−クロロベンジルオキシカルボニル ＢrZ :２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂzl :ベンジル Ｂoc :t−ブトキシカルボニル

【００２４】

【実施例】以下に実施例をもって、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらによってなんら限定され
るものではない。なお、後述の実施例で得られた本発明
の抗体産生ハイブリドーマは、次に示すように寄託され
ている。 （ＩＦＯ） （ＮＩＢＨ） 動物細胞 ＩＦＯ Ｎo. ＦＥＲＭ Ｎo. ────────────────────────────────── マウスハイブリドーマＮ２ ５０３９８ ＢＰ−４２５８ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ５ ５０３９９ ＢＰ−４２５９ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ２１ ５０４００ ＢＰ−４２６０ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ１１ ５０４４０ (1994. 3. 7) ────────────────────────────────── ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＮＩＢＨ：通商産業省工業技術院生命工業技術研究所 表中（ ）内は受託日を示す。 実施例１ ＮＯ合成酵素の調製 雄性Kb１ Wistarラット（体重２００〜２３０ｇ）の腹
腔に、１匹当り生理食塩水１０mlに溶解した４０mgのＢ
ＣＧを接種した。接種して２週後、５０mlのリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）をラット腹腔に接種し、腹腔滲出
細胞を採取した。遠心（３００×ｇ，１０分間）後上清
を除去し、２５mlの低張ＮaＣｌ（０．２％）溶液を加
え、混入した赤血球を溶血させたのち、１．６％のＮa
Ｃｌを２５ml加え等張液に戻した。再度遠心（３００×
ｇ，１０分間）後、細胞を１０％ウシ胎仔血清、１０ng
／mlリポポリサッカライドを含有するＤＭＥＭ（Dulbec
co's modified Eagle's medium）に浮遊させ、１０cmカ
ルチャーディシュに播種し、３７℃，５％炭酸ガス（Ｃ
Ｏ₂）下で２４時間培養を行った。培養後、非接着性の
細胞をＰＢＳで３回洗浄することにより除去し、接着性
の細胞をラバーポリスマンで剥離収集した。このように
して得られたマクロファージを１mＭ ＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）を含有する５０mＭトリス−塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．４）に、１×１０⁸個／mlの濃度になる
よう浮遊させ、０．１mg／mlフェニールメチルスルフォ
ニルフルオリド，０．０１mg／mlトリプシンインヒビタ
ー，０．０１mg／mlロイペプチン，０．０１mg／mlアン
チパイン，０．０１mg／mlペプスタチン等を添加した。
マクロファージ浮遊液を超音波破砕（Ultrasonic disru
ptor, output ６，３秒，トミー精工）し、１００,００
０×ｇ，６０分遠心して上清を得た。精製は以下のよう
に行った。７．５mlの上清を１mＭ ＤＴＴを含有する
５０mＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で平衡
化した２′，５′−ＡＤＰ−アガロースカラムに供し
た。カラムを１mＭ ＤＴＴと７５０mＭ ＮaＣｌを含有
する５０mＭ トリス−塩酸１０mlと１mＭ ＤＴＴを含有
する５０mＭトリス−塩酸１０mlで順次洗浄し、１mＭ
ＤＴＴと１mＭ ＮＡＤＰＨを含有する５０mＭ トリス−
塩酸２mlで溶出を行った。溶出したＮＯ合成酵素サンプ
ルをセントリコン１０（Amicon, Danvers, ＭＡ）を用
いて５０μlまで濃縮し、１mＭＤＴＴを含有する５０m
Ｍ トリス−塩酸で平衡化したゲル濾過カラム Superose
１２ＨＲ１０／３０(３００×１０mm，ファルマシア
ＬＫＢ BiotechnologyUppsala，スウェーデン）に供
し、ＮＯ合成酵素フラクションを得た。

【００２５】実施例２ 抗ＮＯ合成酵素モノクローナル
抗体の取得 （1） 免疫 ＢＡＬＢ／c マウス(♀８週令)に対し、実施例１で得ら
れたＮＯ合成酵素１０μｇとフロインド完全アジュバン
ト（Difco Laboratories, 米国）の混合物を皮下に接種
した。 ２ケ月後にＮＯ合成酵素１０−１５μｇとフロイ
ンド不完全アジュバント（Difco）の混合物を同マウス
皮下に接種し、同様の免疫を約１ケ月間隔で、さらに４
回行い、最終免疫１ケ月後５０mＭ トリス−塩酸（ｐＨ
７．４）に溶かした１５μｇのＮＯ合成酵素を同マウス
の静脈内に接種した。

【００２６】（2） 細胞融合 上記（1）で得られた免疫マウスより、抗原最終投与の
３日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を取得し、
ＭＥＭ培地に懸濁した。マウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａg・８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）は５％ウシ胎仔血清を
含有するＧＩＴ培地（日本製薬）で５％炭酸ガス，９５
％空気の条件で継代培養した。細胞融合はケーラーとミ
ルスタインが確立した分法〔ネイチャー（Nature）第２
５６巻，第４９５頁(１９７５)〕に準じて行った。Ｐ３
Ｕ１細胞６．９×１０⁷個と上述の方法で得られた免疫
されたリンパ球３．２×１０⁸個を混合し、遠心後、細
胞にあらかじめ３７℃に加温した０．５mlのＭＥＭ培地
に溶解した４５％ＰＥＧ６０００を、ゆっくり滴下し
た。７分後３７℃に加温したＭＥＭ培地を１分間に０．
５mlずつ加え１５mlとした後、室温で６００回転１５分
間遠心し上清を除去した。 この細胞沈澱物を５％ウシ胎
仔血清を含有するＧＩＴ培地２１０mlに懸濁し、９６穴
マイクロプレート（ヌンク社，Naperville,ＩＬ)に１０
０μｌずつ２０６４ウエルに播種した。 １日後、ＨＡＴ
（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ，アミノプテリン４×１
０^-7Ｍ，チミジン１.６×１０^-5Ｍ）を含んだＧＩＴ培
地(５％牛胎仔血清含有）（以下ＨＡＴ培地と称する）
を各ウエルに１５０μｌずつ添加し、 さらに３日おき
に、培地の１／２量を新しいＨＡＴ培地と交換した。こ
のようにして生育した細胞は雑種細胞である。

【００２７】（3） 抗体産生細胞の検索 実施例（1）記載の方法で精製されたＮＯ合成酵素を
０．５μg／mlになるようＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈
し、その１００μｌを９６穴イムノプレート（ヌンク
社）の各ウエルに入れ４℃一夜放置し、固相にＮＯ合成
酵素を結合させた。ＰＢＳで洗浄した後、余剰の結合部
位を塞ぐため、ブロックエース（雪印乳業）を２０％含
有するＰＢＳを２５０μｌずつウエルに注入して、使用
時まで冷所に保存した。 以上のようにして得られたＮＯ
合成酵素を結合した９６穴イムノプレートに、雑種細胞
上清を１００μｌずつ加え室温で２時間インキュベート
した。培養上清を除去、洗浄後、２次抗体としてＨＲＰ
標識ヤギ抗マウスＩgＧ抗体（カペル社，米国）を加え
室温で２時間インキュベートした。２次抗体を除去し、
よくウエルを洗浄した後、ＨＲＰ用基質溶液（０．０２
％ Ｈ₂Ｏ₂と０．１５％ o−フェニレンジアミンを含む
ｐＨ５．５のクエン酸ナトリウム緩衝液）を１００μｌ
加え、 ２５℃で１０分反応させ、２Ｎ硫酸１００μｌを
加えることにより酵素反応を停止させた後、マイクロプ
レート用自動比色計（ＭＴＰ−３２，コロナ社）を用
い、４９２nmにおける吸光度を測定した。その結果１４
ウエルにＮＯ合成酵素に結合性を示す抗体の存在を認め
た。

【００２８】（4） 雑種細胞のクローニング 抗体の存在を認めたウエルの細胞を、１ウエルあたり
０．５個となるように、予め５×１０⁴個／ウエルのマ
ウス胸腺細胞を栄養細胞として播いておいた９６穴マイ
クロプレートに播き、クローニングを行った。その結
果、それぞれのウエルから代表的なクローン細胞各１個
を得、合計１４のクローン細胞Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ
４，Ｎ５，Ｎ７，Ｎ８，Ｎ９，Ｎ１１，Ｎ１２，Ｎ１
４，Ｎ１６，Ｎ１８及びＮ２１を得た。

【００２９】（5） 抗体の製造 上記（4）においてクローニングによって得られた１４
種のハイブリドーマクローンをそれぞれあらかじめ０.
５ｍｌのミネラルオイルを腹腔内に投与しておいたＢＡ
ＬＢ／c マウスの腹腔内に１匹あたり１×１０⁶個接種
することにより腹水化を行なった。ハイブリドーマを腹
腔に投与して１０日後、腹水を採取した。得られたそれ
ぞれの腹水約１０ｍｌから、ステーリンら〔ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー,第２５６巻,第９７
５０−９７５４頁(１９８１)〕の方法に準じてモノクロ
ーナル抗体を精製した。まず腹水からフィブリン様物質
を除去するため１０,０００回転１５分間遠心した後、
ＰＢＳ（８.１mＭ−リン酸二ナトリウム，１.５mＭ リ
ン酸カリウム，２７mＭ ＫＣｌ,１３７mＭ ＮaＣｌ,pＨ
７.２)で２８０nmの紫外部吸収(Ａ₂₈₀)が１２〜１４の
値を示す濃度に希釈した。希釈後サンプルに飽和硫酸ア
ンモニウム溶液を４７％の濃度になるように加え、４℃
で撹拌しながら６０分間塩析を行い、その後遠心(１０,
０００回転,１５分間)を行なって沈澱物を得た。 沈澱物
を５０mＭ ＮaＣｌ含有２０mＭトリス緩衝溶液(pＨ７.
９)に溶融し、同溶液２リットルに対して透析を行った。
２時間後、２リットルの新しい同じ透析液に換え、 さ
らに１５時間透析を行った。透析後、沈澱を除去するた
め１０,０００回転１５分間遠心を行い、上清をＡ₂₈₀の
値が２０〜３０の濃度になるように調製した。このサン
プルを充分量の５０mＭ−ＮaＣｌ含有トリス緩衝溶液で
平衡化した２０ｍｌのＤＥＡＥセルロースカラム(ワッ
トマンＤＥ₅₂)にかけ、５０mＭ ＮaＣｌ含有トリス緩
衝溶液でよく洗った後、 ５０mＭ−５００mＭ ＮaＣｌを
含む同緩衝液の濃度勾配塩溶液を用いて１.５ｍｌ／分
の流出速度で分画を行って素通り画分を濃縮し、それぞ
れの精製モノクローナル抗体Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ４，
Ｎ５，Ｎ７，Ｎ８，Ｎ９，Ｎ１１，Ｎ１２，Ｎ１４，Ｎ
１６，Ｎ１８およびＮ２１を得た。抗体の純度の確認に
はラエムリらの方法〔ネイチャー,第２２７巻,６８０−
６８５頁(１９７０)〕に準じてＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を用いた。すなわち、硫安塩析し、Ｄ
ＥＡＥセルロースカラムで素通りした画分を、２−メル
カプトエタノールで還元し、アクリルアミド濃度１０％
のゲルを用いて１８０ボルトで２.５時間泳動を行っ
た。その結果、いずれのモノクローナル抗体も分子量
５２ＫＤa前後にＨ鎖,２８ＫＤa前後にＬ鎖の２つのバ
ンドが認められた。

【００３０】（6） 抗体のサブクラスの測定 抗体のサブクラスは次の方法で測定した。即ち実施例１
で得られたＮＯ合成酵素をコートした９６穴イムノプレ
ートにクローン化されたそれぞれのハイブリドーマ培養
上清を１００μｌ入れ室温で２時間インキュベートし
た。培養上清を除去,洗浄後ウサギ抗マウスγ₁，γ_2a，
γ_2b，γ₃，Ｋ鎖，λ鎖に対する抗体(カペル社)をそれ
ぞれ１００μｌ入れ室温で２時間インキュベートした。
それぞれの抗体を除去,洗浄後ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ
ＩgＧ抗体(カペル社)を加え室温で２時間インキュベー
トした。標識抗体を除去し、よく洗浄した後、上記(3)
記載の方法で酵素反応を行ない吸光度を測定した。その
結果、Ｎ８，Ｎ９，Ｎ１１，Ｎ１２，Ｎ１４，Ｎ１６，
Ｎ１８及びＮ２１抗体はγ₁，κ，Ｎ１及びＮ７抗体は
γ_2a，κ，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ４及びＮ５はγ_2b，κのサブ
クラスに属する抗体であることが判明した。

【００３１】実施例３ 抗体の特徴 (1) ウェスタンブロット法 実施例１で得られたＮＯ合成酵素をPhast−システム
（ファルマシア社）を用いて１０〜１５％グラジエント
ゲル上で電気泳動を行なった。泳動後、メンブランフィ
ルターにトランスファーし、実施例２で得られた各抗Ｎ
Ｏ合成酵素のモノクローナル抗体で反応を行ない、アル
カリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、
抗ＮＯ合成酵素抗体の結合性を検討した。その結果、１
４種のいずれの抗体も１５０kＤaのＮＯ合成酵素に結合
性を示すことが分かった。 （2）組織化学染色 ５週令のWister ラットの腹腔に生理食塩水に溶解した
ＢＣＧ２０mgを接種し、２週間後に諸臓器を摘出した。
速やかに凍結を行ない、cryostat で５μmの厚さに薄切
した。冷アセトンで固定後、内因性ペルオキシダーゼを
ブロックし、Ｎ４，Ｎ５，Ｎ１６及びＮ２１のそれぞれ
のモノクローナル抗体を１時間反応させた。ＰＢＳでよ
く洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を１時間
反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄を行い、３−３′ジ
アミノベンジジンを基質として組織化学染色を行なっ
た。その結果、４種の抗体は全て、肺・脾マクロファー
ジ，肝クッパー細胞をはじめ諸臓器組織のマクロファー
ジと反応した。またＮ５抗体は神経細胞，Ｎ２１抗体は
astrocyteとも反応性を示した。 免疫電顕的検討は以下のように行った。上述のラットの
腹腔または肺胞マクロファージをリポポリサッカライド
（ＬＰＳ）１ng／ml存在下で２４時間培養した。このよ
うにして活性化させたマクロファージを過ヨウ素酸−リ
ジン−パラホルムアルデヒドで固定後、同様の染色を行
い、オスミウム酸で後固定した。固定後、Epon 樹脂〔E
pok ８１２，Dodecenyl succinic anhydride, Methyl n
adic anhydride（以上 応研商事），ＤＭＰ−３０（ポ
リサイエンス社）の混合物〕に包埋し、超薄切片を作成
してＨ３００電子顕微鏡（ヒタチ製）で観察した。その
結果、マクロファージの核膜，粗面小胞体，ゴルジ装置
などの合成系に抗体陽性反応が認められた。 （3）蛍光抗体染色 カバーグラス上にチオグリコレートで誘導したマウス腹
腔マクロファージを接着させ、ＬＰＳおよびインターフ
ェロン（ＩＦＮ）−γで刺激し、４％パラホルムアルデ
ヒドで固定後、５μg／mlになるよう調製したそれぞれ
のモノクローナル抗体で４℃，一晩反応させた。反応後
ＰＢＳで洗浄し、蛍光抗体標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体
で室温、２時間染色した。ＰＢＳでよく洗浄後、蛍光顕
微鏡観察を行った。その結果、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ
５，Ｎ８，Ｎ９，Ｎ１１，Ｎ１２，Ｎ１４，Ｎ１６，Ｎ
１８，Ｎ２１の１２種のモノクローナル抗体がマクロフ
ァージに反応性を示した。

【００３２】実施例４ 酵素活性に及ぼす抗体の効果 実施例１記載のマクロファージ浮遊液を超音波破砕して
遠心（１００,０００×Ｇ，６０分）した上清（cytoso
l）２００μlに１mg／mlに調製した実施例２記載の各モ
ノクローナル抗体１００μl加え、室温で６０分間ゆる
やかに撹拌しながら反応させた。対照として同様に調製
した抗エンドセリンモノクローナル抗体〔Suzuki, N.
ら，ジャーナル オブ イムノロジカル メソッズ（J.
Immunol.Methods）第１１８巻，第２４５−２５０頁
（１９８９）〕および５０mＭトリス緩衝溶液（ｐＨ
７．４）を用いた。反応混合物を等量に２分割し、一方
を３．３mgのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ（フ
ァルマシア）を浮遊させた３０μlの５０mＭトリス緩衝
浮遊液、他方を３０μlの５０mＭトリス緩衝溶液と混合
し、室温で３０分間ゆるやかに撹拌しながら反応させ
た。反応後、混合物を１,０００×Ｇで２分間遠心し上
清を採取した。上清中のＮＯ合成酵素の酵素活性をＮＯ
の分解産物である亜硝酸塩，硝酸塩を測定することによ
り定量した〔Yui, Y.ら，ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー(J. Biol. Chem.)第２６６巻，第
１２５４４−１２５４７頁（１９９１）〕。また、上記
Cytosol分画２００μlを精製したＮＯ合成酵素（１０μ
g／ml）２００μl（９００nmol/分/mg蛋白）に変えて同
様の操作を行った。得られた結果を〔図１〕および〔図
２〕に示す。図中、Ｂはトリス緩衝液を、Ｃは抗エンド
セリン抗体を示し、各数字は抗体の名称中の番号(Ｎ番
号)を示している。Cytosol分画を酵素原として用いた場
合、いずれの抗ＮＯ合成酵素モノクローナル抗体も酵素
活性の阻害活性を示さず、むしろ５０mＭトリス緩衝液
単独に比し高い酵素活性が認められた（図１斜線カラ
ム）。Ｎ４，Ｎ５，Ｎ７，Ｎ２１抗体では酵素活性はト
リス緩衝液単独の場合の約２倍を示した。対照として用
いた抗エンドセリン抗体も若干酵素活性の上昇を示した
が、酵素活性はプロテインＡセファロースの共存により
除去されなかった。それに比し、抗ＮＯ合成酵素モノク
ローナル抗体を用いた場合は、いずれもプロテインＡセ
ファロースの共存により酵素活性の除去が認められた
（図１黒色カラム）。精製したＮＯ合成酵素を用いた場
合、酵素活性はトリス緩衝液単独では殆んど失活した
（図２，Ｂ）。これに対し、抗ＮＯ合成酵素抗体と反応
させた場合、酵素活性は５〜１７％残存し（図１下斜線
カラム）、酵素活性はプロテインＡセファロースで除去
された（図２黒色カラム）。抗エンドセリン抗体でも若
干酵素活性は残存したが、プロテインＡセファロースで
は除去されなかった（図２，Ｃ）。以上の結果は、抗Ｎ
Ｏ合成酵素モノクローナル抗体がＮＯ合成酵素と結合す
ることにより、その酵素活性を安定化させたためである
と推定される。またCytosol分画より不安定（Yui, Y.
ら，前掲）である精製ＮＯ合成酵素を用いた場合では、
抗体の添加により酵素活性安定化がより明確に認められ
た結果もこの推定を強く裏付けている。

【００３３】実施例５ (1) 抗体の酵素標識 精製Ｎ１１抗体（６．５mg／ml）１．５mlを０．１Ｍ
ＮaＣl を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に対
して４℃で６時間透析し、ペプシン（シグマ社製、米
国）（０．２５mg）を加え、３７℃で２０時間消化し
た。１Ｍトリス緩衝液でｐＨを７にして反応を止め、Ul
trogel AcA ４４（ＩＢＦ社製、フランス）のカラムで
０．１５Ｍ ＮaＣl を含む０．０２Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）を溶出液として分離し、Ｆ(ab′)₂ を得
た。これを０．９mlに濃縮後、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）に対して４℃で２０時間透析し、０．２
Ｍメルカプトエチルアミン、５mＭ ＥＤＴＡ、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）０．１mlを加えて、３７
℃、９０分間還元した。反応液を Sephadex Ｇ−２５fi
ne（ファルマシア・ファインケミカル社製、スエーデ
ン）（φ１×６０cm）で５mＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として分離し、Ｆa
b′画分を得た。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）（ベーリンガーマンハイム社製、西ドイツ）
１０mgを０．９mlの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶かし、Ｎ−（γ−マレイミドブチルオキシ）サ
クシンイミド（ＧＭＢＳ）２．１mgをＮ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）１００μl に溶かして加え、室
温で４５分間撹拌後、Sephadex Ｇ−２５fine（φ１．
２×６０cm）で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を
溶出液として分離し、マレイミド基の導入されたＨＲＰ
を得た（マレイミド化ＨＲＰ）。Ｆab′とマレイミド化
ＨＲＰをモル比で１：１になるように混ぜ、４℃で２０
時間反応した。反応後、Ultrogel AcA ４４のカラムで
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を溶出液として分
離し、酵素標識抗体（Ｎ１１Ｆab′−ＨＲＰ）を得た。

【００３４】(2) 抗体結合固相の作製 精製Ｎ５抗体を１０μg／mlになるよう０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８）で希釈し、その１００μl を９６
ウエルイムノプレートの各ウエルに入れ４℃一夜放置
し、固相に抗体を結合させた。０．１５Ｍ ＮaＣl を
含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄
した後、２５％ブロックエース（雪印乳業）、０．１５
Ｍ ＮaＣl を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）２５０μl ずつウエルに注入して、使用時まで
冷所に保存した。 (3) サンドイッチＥＩＡ法 種々の濃度に調製したＮＯ合成酵素１００μl を、抗体
を結合させたウエルに入れ４℃で一夜インキュベートし
た。ＮＯ合成酵素溶液を除去後、１００倍に希釈した酵
素標識抗体（Ｎ１１Ｆab′−ＨＲＰ）をウエル当たり１
００μl 加え、室温で２時間インキュベートした。標識
抗体を除去後、ＨＲＰ基質溶液を加え、実施例２記載と
同様の方法で以下酵素反応を行い４９２nmにおける吸光
度を測定した。その結果、本測定系でのＮＯ合成酵素の
検出限界は２．５〜５ng／ウエルであった〔図３〕。

【００３５】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ＮＯ合
成酵素に高感度に結合し、またその結合能も高いので、
種々の細胞由来のＮＯ合成酵素の検出または測定用試薬
などとして、有利に用いることができる。従って、ＮＯ
合成酵素の細胞，組織内での発現の分布および発現を知
ることができ、またＮＯ合成酵素自身やＮＯの役割をさ
らに解明することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で得られた、抗ＮＯ合成酵素抗体によ
るCytosol分画中のＮＯ合成酵素の活性の安定化を示
す。

【図２】実施例４で得られた、抗ＮＯ合成酵素抗体によ
る精製ＮＯ合成酵素の活性の安定化を示す。

【図３】実施例５で得られた、抗ＮＯ合成酵素抗体を用
いるサンドイッチＥＩＡによるＮＯ合成酵素の検量線を
示す。

【符号の説明】

Ｂはトリス緩衝液を示す。 Ｃは抗エンドセリン抗体を示す。

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【手続補正書】

【提出日】平成６年３月２５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２４】

【実施例】以下に実施例をもって、本発明をさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらによってなんら限定され
るものではない。なお、後述の実施例で得られた本発明
の抗体産生ハイブリドーマは、次に示すように寄託され
ている。 （ＩＦＯ） （ＮＩＢＨ） 動物細胞 ＩＦＯ Ｎo. ＦＥＲＭ Ｎo. ────────────────────────────────── マウスハイブリドーマＮ２ ５０３９８ ＢＰ−４２５８ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ５ ５０３９９ ＢＰ−４２５９ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ２１ ５０４００ ＢＰ−４２６０ （1993. 4. 2） (1993. 4.14) マウスハイブリドーマＮ１１ ５０４４０ Ｐ−１ ４２３４ (1994. 3. 7) (1994. 3.16) ────────────────────────────────── ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪） ＮＩＢＨ：通商産業省工業技術院生命工業技術研究所 表中（ ）内は受託日を示す。 実施例１ ＮＯ合成酵素の調製 雄性Kb１ Wistarラット（体重２００〜２３０ｇ）の腹
腔に、１匹当り生理食塩水１０mlに溶解した４０mgのＢ
ＣＧを接種した。接種して２週後、５０mlのリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）をラット腹腔に接種し、腹腔滲出
細胞を採取した。遠心（３００×ｇ，１０分間）後上清
を除去し、２５mlの低張ＮaＣｌ（０．２％）溶液を加
え、混入した赤血球を溶血させたのち、１．６％のＮa
Ｃｌを２５ml加え等張液に戻した。再度遠心（３００×
ｇ，１０分間）後、細胞を１０％ウシ胎仔血清、１０ng
／mlリポポリサッカライドを含有するＤＭＥＭ（Dulbec
co's modified Eagle's medium）に浮遊させ、１０cmカ
ルチャーディシュに播種し、３７℃，５％炭酸ガス（Ｃ
Ｏ₂）下で２４時間培養を行った。培養後、非接着性の
細胞をＰＢＳで３回洗浄することにより除去し、接着性
の細胞をラバーポリスマンで剥離収集した。このように
して得られたマクロファージを１mＭ ＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）を含有する５０mＭトリス−塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．４）に、１×１０⁸個／mlの濃度になる
よう浮遊させ、０．１mg／mlフェニールメチルスルフォ
ニルフルオリド，０．０１mg／mlトリプシンインヒビタ
ー，０．０１mg／mlロイペプチン，０．０１mg／mlアン
チパイン，０．０１mg／mlペプスタチン等を添加した。
マクロファージ浮遊液を超音波破砕（Ultrasonic disru
ptor, output ６，３秒，トミー精工）し、１００,００
０×ｇ，６０分遠心して上清を得た。精製は以下のよう
に行った。７．５mlの上清を１mＭ ＤＴＴを含有する
５０mＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で平衡
化した２′，５′−ＡＤＰ−アガロースカラムに供し
た。カラムを１mＭ ＤＴＴと７５０mＭ ＮaＣｌを含有
する５０mＭ トリス−塩酸１０mlと１mＭ ＤＴＴを含有
する５０mＭトリス−塩酸１０mlで順次洗浄し、１mＭ
ＤＴＴと１mＭ ＮＡＤＰＨを含有する５０mＭ トリス−
塩酸２mlで溶出を行った。溶出したＮＯ合成酵素サンプ
ルをセントリコン１０（Amicon, Danvers, ＭＡ）を用
いて５０μlまで濃縮し、１mＭＤＴＴを含有する５０m
Ｍ トリス−塩酸で平衡化したゲル濾過カラム Superose
１２ＨＲ１０／３０(３００×１０mm，ファルマシア
ＬＫＢ BiotechnologyUppsala，スウェーデン）に供
し、ＮＯ合成酵素フラクションを得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】誘導型一酸化窒素合成酵素を免疫原とし、
   一酸化窒素合成酵素に結合性を示す、ＩｇＧ型モノクロ
   ーナル抗体。
2. 【請求項２】脳由来の一酸化窒素合成酵素に結合性を示
   す請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】マクロファージ由来の一酸化窒素合成酵素
   に結合性を示し、かつ血管内皮細胞由来の一酸化窒素合
   成酵素に結合性を示さないモノクローナル抗体。
4. 【請求項４】誘導型一酸化窒素合成酵素で免疫した哺乳
   動物の脾臓細胞と、同種または異種のリンパ球様細胞か
   らなるクローン化されたハイブリドーマ。
5. 【請求項５】マクロファージ由来の一酸化窒素合成酵素
   で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と、同種または異種のリ
   ンパ球様細胞とを細胞融合し、クローニングすることを
   特徴とする請求項４記載のハイブリドーマの製造法。
6. 【請求項６】請求項４記載のハイブリドーマを液体培地
   中または哺乳動物の腹腔内で増殖させることを特徴とす
   る請求項１、２または３記載のモノクローナル抗体の製
   造法。
7. 【請求項７】請求項１、２または３記載のモノクローナ
   ル抗体を用いることを特徴とする一酸化窒素合成酵素の
   検出または定量法。
8. 【請求項８】酵素免疫測定法である請求項７記載の検出
   または定量法。
9. 【請求項９】請求項１、２または３記載のモノクローナ
   ル抗体を用いることを特徴とする一酸化窒素合成酵素の
   精製法。