JPH0716426B2

JPH0716426B2 - 酵素によるリン脂質の製造方法

Info

Publication number: JPH0716426B2
Application number: JP18002586A
Authority: JP
Inventors: 研一藤田; 幸子村上; 孝一岩並; 悟徳山; 理仲地
Original assignee: 日本油脂株式会社
Priority date: 1986-08-01
Filing date: 1986-08-01
Publication date: 1995-03-01
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: JPS6336792A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、酵素によるリン脂質の製造方法に関し、特
に、塩基構造が変換されたリン脂質を製造する方法に関
する。

（従来の技術）リン脂質は、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソー
ムの基材として薬剤運搬体、人工血液、人工細胞等への
応用が近年注目されており、また、それ自体生理活性・
薬理作用を持つものとして、医学・薬学・工学的分野の
様々な用途が考えられている。このような多様な要求に
対応するために、各々の用途に応じた構造を有するリン
脂質を効率的に製造する方法を開発することは、産業上
非常に意義のあることである。

酵素によるリン脂質の製造方法として、リン脂質にホス
ホリパーゼＤを任意の受容体に存在下に作用させ、ホス
ファチジル基転移反応を利用して目的とする塩基を持つ
リン脂質を製造する技術は公知である〔S.F.Yang,et a
l.,J.Biol.Chem.,242,（３） 477〜484（1967）〕：
〔R.M.C.Dawson,Biochem.J.,102,205〜210（1967）〕。

ホスホリパーゼＤによるホスファチジル基転移反応を利
用してリン脂質の塩基部分を交換しようとする場合、一
般に水相と有機溶媒相との二相系が用いられる。すなわ
ち、主として水溶性である酵素、受容体、pH緩衝液、無
機塩等を含む水溶液と、主として親油性である原料リン
脂質を含む有機溶媒相とを撹拌・混合する反応系であ
る。前出の技術をはじめ、その後の研究〔K.Bruzik and
M.Tsai,Biochemistry23，（８）1656−1661（1984）な
ど〕においても広く用いられている。

（発明が解決しようとする問題点）しかし、従来用いられていたこのような反応系は、水溶
性成分の溶媒としての多量の水の存在が原因となり、ホ
スホリパーゼＤが本質的に加水分解活性を持っているた
めに、副反応として加水分解が起こり、ホスファチジン
酸（以下PAと略す）を生成するという欠点を有してい
る。

加水分解によるPAの生成は、反応後の目的リン脂質の分
離精製を困難にするばかりでなく、加水分解反応によっ
ても原料リン脂質が消費されるため、糖や二級アルコー
ル等の反応性の低い受容体に対してホスファチジル基を
転移させようとする場合、その反応速度が加水分解の反
応速度に対して極端に低いために事実上目的生成物を得
ることができなかった。

このような問題点は、ホスホリパーゼＤ自体が本来加水
分解酵素である以上、水が存在する限り不可避である。

そこで、本発明者らは、反応系中の水分含量を酵素が失
活しない範囲で極限まで減少させることによりこの問題
を解決すべく、種々検討の結果、従来二相系の水相とし
て反応系に添加していた成分を、逆ミセル（w/o型マイ
クロエマルション）中に封入して添加する新規な反応系
を考案し、本発明に至ったものである。

本明細書において、逆ミセルとは、低極性溶媒中で両親
媒性分子が親油性基を外側に、親水性基を内側に向けて
極微量の水相を中心として会合した状態をいう。

（問題点を解決するための手段）本発明は原料リン脂質を溶解した有機溶媒中に、水酸基
を持つ受容体およびホスホリパーゼＤを含む水相を逆ミ
セル中に封入した形態で添加して反応を行うことを特徴
とする。

本発明において用いられる原料リン脂質としては、ホス
ホリパーゼＤの基質となり得るものであれば、天然から
抽出したもの、または抽出後精製したもの、あるいは合
成したものを問わず使用できる。また、市販のものある
いは公知の方法で調製したものを使用しても差し支えな
い。

例として脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチ
ジルコリン（以下PCと略す）、ホスファチジルエタノー
ルアミン（以下PEと略す）、ホファチジルセリン（以下
PSと略す）、ホスファチジルグリセロール（以下PGと略
す）等またはそれらの混合物等があげられる。本発明の
効果を最大に発揮するためには、原料リン脂質として精
製したものないしは組成の単純なものを用いた方が反応
生成物の精製の面で都合が良い。また、原料コストと入
手の容易さ、酵素に対する反応性の面から特にPC、PEま
たはPSが工業的に効果が高く好ましい。

逆ミセルは界面活性剤により形成することが好ましい。

原料リン脂質の大部分が、炭素鎖長12以上のアシル基二
本を有するPC、PE、PGまたはPSまたはこれらの混合物で
ある場合、原料リン脂質自身が逆ミセルを形成するため
の界面活性剤としての作用をする。しかし、原料リン脂
質が炭素鎖長10以下のアシル基二本を有するPC、PE、P
S、PGまたはリゾPC、リゾPE、リゾPS、リゾPGの場合の
ように、原料リン脂質自体では逆ミセルを形成し難い場
合には、下記の条件を満たす界面活性剤を別に添加する
ことが好ましい。

（ａ）反応溶媒中に臨界ミセル濃度以上の濃度で溶解し
得る。

（ｂ）逆ミセルを形成し得る。

（ｃ）酵素活性に決定的な損失を与えない。

（ｄ）アルコール残基を持たないことが望ましい。

例として、ラウリル硫酸ナトリウム、ジ（２−エチルヘ
キシル）スルホコハク酸ナトリウム、ジｎ−オクチルス
ルホコハク酸ナトリウム、ポリオキシエチレンノニルフ
ェニルエーテル等があげられる。これら界面活性剤の添
加量は、原料リン脂質１モルに対して0.5〜５モルで、
好ましくは１〜３モルである。

反応溶媒としては、下記の条件を満たすものであれば使
用できる。

（ａ）原料リン脂質を臨界ミセル濃度以上の濃度で溶解
し得る。

（ｂ）水をほとんど混和あるいは溶解しない。

（ｃ）酵素活性に決定的な損失を与えない。

すなわち、分子内に二重結合またはエーテル結合を有し
ていても構わない、アルキル基等の官能基を有していて
も構わない、炭素数５〜10の直鎖状または分岐鎖状また
は環状の炭化水素化合物もしくは炭素数１〜２のハロゲ
ン化炭化水素化合物あるいはそれらの混合物であり、例
としてｎ−ヘキサン、イソオクタン、ジエチルエーエ
ル、ジイソプロピルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼ
ン、キシレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエ
タンおよびこれらのうち二種以上の混合系があげられ
る。アルコール構造を持つ化合物は、ホスファチジル基
転移反応の受容体となるため、基質として用いる以外に
添加することはあまり好ましくない。

ホスホリパーゼＤとしては、ホスファチジル基転移活性
を有するものであれば、市販のものあるいは公知の方法
で調製したものを問わず使用できる。例として、ベーリ
ンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）製
のキャベツ由来のホスホリパーゼＤ、東洋醸造（株）製
の微生物由来のホスホリパーゼＤ（PLDP）、公知の方法
〔一例としてケーツとサストリイ〔M.Kates and P.S.Sa
stry）の方法、“Methods in Enzymology"（J.M.Lowens
tein,ed.）,vol.14,pp197−203,Achademic Press,New Y
ork（1969）〕により抽出し精製または部分精製した酵
素標品、または抽出した粗酵素があげられる。

受容体としては、コリン、メタノール、エタノール、エ
タノールアミン、セリン、グリセロール、グルコース等
の従来ホスファチジル基転移反応の受容体として知られ
ている化合物のみならず、１−アミノ−２−プロパノー
ル、１−オルソメチルグルコシド、トレハロースをはじ
めとする従来ホスファチジル基転移反応の受容体とはな
らないとされていた糖類を含む一級または二級アルコー
ル構造を持つ化合物をも用いることができる。

酵素、受容体等を逆ミセル中に封入するには、原料リン
脂質を臨界ミセル濃度以上に溶かした有機溶媒中に、酵
素、受容体等の溶液を滴下し、ただちに振盪撹拌または
超音波処理するなどの公知の方法を用いることができ
る。

逆ミセルを形成させると同時に、ホスファチジル基転移
反応時のPAの副生を抑えるためには、反応系中の水分含
量を原料リン脂質または界面活性剤１モルに対して６〜
15モルにする必要があり、好ましくは、８〜12モルで最
も良好な結果を得ることができる。

反応温度は用いる酵素の至適温度であればよく、通常30
〜40℃の範囲である。好ましくは、逆ミセルを形成させ
てから酵素反応終了に至るまで一定に保つことにより逆
ミセルの安定性が向上する。ただし、用いる溶媒が低沸
点のものである場合等はこの限りではない。

反応時間は0.5〜36時間で、好ましくは４〜24時間であ
る。

このようにして製造した任意の塩基を持つ目的リン脂質
は溶剤分画、ケイ酸またはシリカゲルクロマトグラフィ
ー、アルミナクロマトグラフィー、DEAE−セルロースク
ロマトグラフィー等の公知の手段を適宜用いることによ
り、容易に精製することができる。

また、PAの生成が抑制されているため、未反応基質の回
収も容易に行うことができる。

（発明の効果）本発明の反応系を用いることにより、従来の反応系で見
られたようなPAの生成は抑制され、反応後の目的リン脂
質の分離精製が容易になった。

また、従来の反応系では殆どあるいは全く得ることので
きなかった目的リン脂質をも製造することが可能となっ
た。

（実施例）以下、参考例、実施例、および比較例に基づいて本発明
を具体的に説明する。

なお、リン脂質の組成分析、純度検定は薄層クロマトグ
ラフィー（TLC）で行った。TLC板（メルク社製No.572
1）に脂質試料20〜100μｇを直径３〜5mmにスポット
し、クロロホルム−メタノール−水（120:70:5）または
クロロホルム−アセトン−酢酸−メタノール−水（50:2
0:15:10:5）で展開した。検出にはジットマー試薬、50
％硫酸、ニンヒドリン試薬またはアンスロン試薬を目的
に応じて使用した。定量的な測定にはジットマー試薬で
発色したものを高速薄層クロマトスキャナー（島津製作
所製CS−920型）で測定した。

参考例１大豆PCおよびPEをパルダン（Von H.Pardun）の方法〔Fe
tte Seifen Anstrichmitte86，（２）55−62（1984）〕
により分離、分画した。

市販脱脂大豆レシチン粉末（PC24％、PE21％、ホスファ
チジルイノシトール14％、PA8％）20gをイソプロパノー
ル−メタノール−水（50:45:5）100mlに分散し、40℃で
加熱撹拌し溶解した。撹拌しながら20℃まで冷却し、20
℃に１時間保った。不溶物を20℃に保ったまま遠心分離
またはガラスフィルターで減圧濾過した。集めた上清を
減圧下で乾固し、PCおよびPE濃縮物（PC68％、PE17％、
PA7％、PSは含まない）9.7gを得た。

参考例２牛脳からリーズ（M.Lees）の方法〔“Methods in Enzym
ology"（S.P.Colowick and N.O.Kaplan ed.）,vol.3,pp
328,Achademic Press,New York（1957）〕により粗セフ
ァリンを抽出し、DEAE−セルロースカラムクロマトグラ
フィーで精製した。

近在の屠殺場で入手した新鮮な牛脳の脳膜および血管を
取り除いたもの300gを1.2のアセトン中でホモジナイ
ズし、抽出した。濾過残渣をもう一度1.2のアセトン
で抽出する。濾過残渣を1.2のエタノールで抽出す
る。濾過残渣を同様にして1.2の石油エーテルで２回
抽出し、抽出液を集めて減圧乾固し、粗セファリン画分
3.9gを得た。

このものをクロロホルムに溶解し、酢酸型に調製したDE
AE−セルロースカラム（ワットマン社製DE32、径2.5cm
×20cm）を用いて分画した。クロロホルム−メタノール
（1:4）１でカラムを洗浄後、酢酸750mlで溶出した画
分を集めた。酢酸溶出画分に等容のクロロホルムを加
え、２倍容の水で４回洗浄した。クロロホルム層を減圧
乾固し、PS（PS98％）0.8gを得た。

参考例３市販のジオクチルスルホコハク酸ナトリウムを精製し
た。

ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム（日本油脂株式会
社製、商品名ラピゾールＢ−90）の50％メタノール溶液
100mlを４℃で３時間静置後、４℃で2,000×ｇ、15分間
遠心分離し沈殿を除去した。

上清に特級活性炭（和光純薬（株）製）5gを加え、18時
間穏やかに撹拌した。活性炭を濾別し、メタノールを溜
去した。

乾固物を五酸化リンの入った減圧デシケーター中で一昼
夜以上乾燥したものを精製ジオクチルスルホコハク酸ナ
トリウムとして用いた。

参考例４前出のケーツとサストリイ（M.Kates and P.S.Sastry）
の方法に従ってキャベツ可溶画分からホスホリパーゼＤ
を部分精製した。

近在の農家から入手した新鮮なキャベツの内側の葉を水
洗後細断し、100gに水200mlを加え、氷冷下で５分間ホ
モジナイズした。５重にしたガーゼで濾過した濾液を４
℃で12,000×ｇ、30分間遠心分離し、上清190mlを得
た。この上清を55℃、５分間熱処理後、直ちに氷冷し
た。４℃で12,000×ｇ、30分間遠心分離し、上清175ml
を得た。

−15℃に冷却したアセトン350mlを撹拌しながら少しず
つ加え、10分間静置後４℃で12,000×ｇ、30分間遠心分
離して沈殿を集めた。

沈殿を15mlの50mM酢酸緩衝液pH5.6に溶かし、４℃で同
じ緩衝液500mlに対し３回透析した。

不溶物を４℃で10,000×ｇ、15分間遠心分離したものを
キャベツ部分精製ホスホリパーゼＤとして用いた。

なお、この酵素液には検出可能量のリン脂質は含まれて
いないことを確認した。

実施例１Ｌ−セリン1.5M、キャベツホスホリパーゼＤ（ベーリン
ガー・マンハイム社製）7mg/ml、塩化カルシウム・二水
塩10mMを0.5mlの5mM酢酸緩衝液pH5.6に溶かし、水相と
した。参考例１で得た大豆PCおよびPEの濃縮物1.5gを乾
燥したジイソプロピルエーテル40mlに溶かし、有機相と
した。

有機相を35℃に保ち、NS100−2U型超音波洗浄機（出力1
00W、日本精機製作所製）で超音波処理しながら水相0.3
5mlを滴下し、更に１分間超音波処理し、ほぼ透明な逆
ミセル液を得た。

このものを35℃、12時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PC4
8％、PE14％、PA11％で、標準PSとRfが一致し、ジット
マー試薬およびニンヒドリン試薬に陽性を示すことから
PSと同定した生成物24％を含んでいた。

反応混液をそのまま酢酸型に調製したDEAE−セルロース
カラム（ワットマン社製 DE32、径2.5×20cm）を用いて
分画した。

カラムをクロロホルム−メタノール（1:4）500mlで溶出
し、減圧乾固して未反応基質（PC73％、PE27％）を回収
した。

更にカラムを酢酸400mlで溶出した。酢酸溶出画分を集
め、等容のクロロホルムを加え、２倍容の水で４回洗浄
した。クロロホルム層を減圧乾固し、PS（PS98％）294m
gを回収した。

実施例２市販水素添加卵黄レシチン（PS99％）40mgを溶かしたイ
ソオクタン1mlを有機相として、38℃で実施例１と同様
にして、塩酸でpH5.7に調整した１−アミノ−２−プロ
パノール1.5M、キャベツホスホリパーゼＤ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）7mg/ml、塩化カルシウム・二水塩
10mMからなる水相11μを滴下し、逆ミセルを形成させ
た。

このものを38℃、８時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PC6
2％、PA5％で、標準PEとRfが近接しジットマー試薬およ
びニンヒドリン試薬に陽性を示すことから１−アミノ−
２−プロパノールにホスファチジル基が導入された目的
リン脂質と判定した生成物24％を含んでいた。

実施例３参考例２で得た牛脳PS（PS98％）40mgを溶かしたシクロ
ヘキサン1mlを有機相として、38℃で実施例１と同様に
して、グリセリン1.5M、キャベツホスホリパーゼＤ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）7mg/ml、塩化カルシウム
・二水塩10mM、5mM酢酸緩衝液pH5.6からなる水相９μ
を滴下し、逆ミセルを形成させた。

このものを38℃、12時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PS7
0％、PA3％で、標準PGとRfが一致し、ジットマー試薬に
陽性を示すことからPGと同定した生成物25％を含んでい
た。

実施例４市販ジパルミトイルPC100mgを溶かしたベンゼン2.5mlを
有機相として、35℃で実施例１と同様にして１−オルソ
メチルグルコシド1.5M、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造
（株）製PLDP）1mg/ml、5mM酢酸緩衝液pH5.6からなる水
相20μを滴下し、逆ミセルを形成させた。

このものを35℃、12時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PC7
4％、PA4％で、未同定リン脂質19％を含んでいた。

反応混液を直接、No.5745分取用TLCプレート（メルク社
製）を用い、クロロホルム−メタノール−水（120:70:
5）を展開溶媒として分画、分取し、未同定リン脂質16m
gを得た。

このリン脂質をJMS−DX303型質量分析装置（日本電子
（株）製）を用い、下記条件にて分析したところ、陽イ
オン側の親ピークがm/e847、陰イオン側の親ピークがm/
e823であった。

測定条件イオン化法:FAB法衝撃ガス:Xe 一時イオン加速電圧:6kV フィラメント電流:20mA 検出器：オンバーション・ダイノード押し出し電圧:15kV マトリクス：トリエタノールアミン（陽イオンの場合塩
化ナトリウム添加）データ処理:JMA−DA5000 これらの値は１−オルソメチルグルコシドにホスファチ
ジル基が導入されたと仮定した分子量（824）の各々ナ
トリウム塩（分子量824＋23）および陰イオン（分子量8
24−１）と一致したことから、目的リン脂質であると同
定した。

実施例５市販ジパルミトイルPC100mgを溶かしたクロロホルム−
イソオクタン（35:65）2.5mlを有機相として、35℃で実
施例１と同様にして、トレハロース1.5M、ホスホリパー
ゼＤ（東洋醸造（株）製PLDP）1mg/ml、5mM酢酸緩衝液p
H5.6からなる水相17μを滴下し、逆ミセルを形成させ
た。

このものを35℃、12時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PC7
6％、PA5％で、ジットマー試薬およびアンスロン試薬に
同時に陽性を示すことから、トレハロースにホスファチ
ジル基が導入された目的リン脂質であると判定したリン
脂質17％を含んでいた。

反応混液を実施例４と同様にして分画分取して得たリン
脂質16mgを実施例４と同様にして質量分析を行ったとこ
ろ、陽イオン側親ピークm/e995、陰イオン側親ピークm/
e971で、計算分子量（972）の各々ナトリウム塩（分子
量972＋23）、陰イオン（分子量972−１）と一致したこ
とから、目的リン脂質であると同定した。

実施例６市販ジオクチルPC100mg、参考例３で得た精製ジオクチ
ルスルホコハク酸ナトリムウム90mgを溶かしたｎ−ヘキ
サン3mlを有機相として、37℃で実施例１と同様にし
て、塩酸でpH6.0に調整した1.5Mエタノールアミンに1mg
/mlのホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）製PLDP）を溶
かしたもの36μを水相として滴下し、逆ミセルを形成
させた。

このものを37℃、10時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液の一部を取り、直接TLCで分析したところ、PC7
1％、PA7％で、標準PEに近いRf値を持ち、ジットマー試
薬およびニンヒドリン試薬に同時に陽性を示すことか
ら、目的リン脂質であると判定したリン脂質22％を含ん
でいた。

実施例７市販１−ステアロイルリゾPC200mg、ラウリル硫酸ナト
リウム（和光純薬（株）製、生化学用）100mgを溶かし
たジクロロメタン−イソオクタン（3:7）5mlを有機相と
し、35℃で実施例１と同様にして、参考例４で得たキャ
ベツ部分精製酵素液に1.5Mのグリセリン、塩化カルシウ
ム・二水塩10mMを溶かしたもの65μを水相として滴下
し、逆ミセルを形成させた。

このものを35℃、15時間、15rpmで往復振盪し、反応さ
せた。

反応混液を直接、酢酸型に調製したDEAE−セルロースカ
ラム（ワットマン社製DE52、径1.8×5cm）を用いて分画
した。クロロホルム−メタノール（1:4）100mlでカラム
を洗浄後、50mM酢酸アンモニウムを含むクロロホルム−
メタノール（1:4）100mlで溶出した画分を集めた。酢酸
溶出画分に、等容のクロロホルムを加え、２倍容の水で
４回洗浄した。

クロロホルム層を減圧乾固して得られたリン脂質26.7mg
を実施例４と同様にして質量分析を行ったところ、陽イ
オン側親ピークm/e534、陰イオン側親ピークm/e511で、
計算分子量（512）の各々ナトリウム塩（分子量512＋2
3）、陰イオン（分子量512−１）と一致したことから、
目的とする１−ステアロイルリゾPGであると同定した。

比較例１従来の反応系で、実施例１とできるだけ近い条件で反応
を行った。

Ｌ−セリン200mM、塩化カルシウム40mM、ホスホリパー
ゼＤ（ベーリンガー・マンハイム社製）2.5mgを含むpH
5.6の50mM酢酸緩衝液2.5mlと、参考例１で得た大豆PCお
よびPE濃縮物40mgを溶かしたジイソプロピルエーテル5m
lを37℃、500rpmで撹拌した。

同一のもの５検体を平行して各１、２、４、12時間反応
させた。反応後、5mlのジエチルエーテルで３回脂質を
抽出し、リン脂質組成を分析した。結果を下表に示す。

比較例２従来の反応系で、実施例４とできるだけ近い条件で反応
を行った。

１−オルソメチルグルコシド1.5M、ホスホリパーゼＤ
（東洋醸造（株）製PLDP）20μｇを溶かしたpH5.6の50m
M酢酸緩衝液2.5mlと、ジパルミトイルPC100mgを溶かし
たベンゼン2.5mlを35℃、500rpmで撹拌し、反応させ
た。

比較例１と同様にして経時的に分析したが、実施例４で
認められた目的リン脂質に相当するスポットがTLC上に
認められず、16時間反応した時点で基質が完全に分解さ
れたため、分析を打ち切った。

比較例３従来の反応系で、実施例５とできるだけ近い条件で反応
を行った。

トレハロース1.5M、ホスホリパーゼＤ（東洋醸造（株）
製PLDP）20μｇを溶かしたpH5.6の50mM酢酸緩衝液2.5ml
と、ジパルミトイルPC100mgを溶かしたクロロホルム−
イソオクタン（35:65）2.5mlを35℃、500rpmで撹拌し、
反応させた。

比較例１と同様にして経時的に分析したが、実施例５で
認められた目的リン脂質に相当するスポットがTLC上に
認められず、16時間反応した時点で基質が完全に分解さ
れたため、分析を打ち切った。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】塩基構造が変換されたリン脂質を製造する
にあたり、原料リン脂質を溶解した有機溶媒中に、水酸
基を持つ受容体およびホスホリパーゼＤを含む水相を逆
ミセル中に封入した形態で添加して反応を行うことを特
徴とする酵素によるリン脂質の製造方法。
【請求項２】逆ミセルを界面活性剤により形成し、該界
面活性剤として原料リン脂質自体を利用する特許請求の
範囲第１項記載の製造方法。
【請求項３】受容体がセリン、エタノールアミン、１−
アミノ−２−プロパノール、１−オルソメチル−グルコ
シド、グリセロール、トレハロースのいずれかである特
許請求の範囲第１項記載の製造方法。