JPS6336791A - 酵素によるリン脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素によるリン脂質の製造方法に関し、特に
、塩基構造が変換されたリン脂質を製造する方法に関す
る。

（従来の技術） リン脂質は、単に乳化剤に用い得るのみならずリポソー
ムの基材として薬剤運搬体、人工血液１、人工細胞等へ
の応用が近年注目されており、また、それ自体生理活性
・薬理作用を持つものとして、医学・薬学・工学的分野
の様々な用途が考えられている。このような多様な要求
に対応するために、各々の用途に応じた構造を有するリ
ン脂質を効率的に製造する方法を開発することは、産業
上非常に意義あることである。

酵素によるリン脂質の製造方法として、リン脂質にホス
ホリパーゼＤを任意の受容体の存在下に作用させ、ホス
ファチジル基転移反応を利用して目的とする塩基を持つ
リン脂質を製造する技術は公知である（Ｓ、Ｆ、Ｙａｎ
ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２４２、（３）　４７７〜４８４　（１９６７））　　
：　　ＣＲ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、１０２．２０５〜２１０　（
１９６７）　）。

ホスホリパーゼＤによるホスファチジル基転移反応を利
用してリン脂質の塩基部分を交換しようとする場合、一
般に水相と有機溶媒相との二相系が用いられる。すなわ
ち、主として水溶性である酵素、受容体、ｐＨ緩衝液、
無機塩等を含む水溶液と、主として親油性である原料リ
ン脂質を含む有機溶媒相とを攪拌・混合する反応系であ
る。前出の技４ｉテをはじめ、その後の研究ＣＫ、Ｂｒ
ｕｚｉｋ　ａｎｄＭ、Ｔｓａｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　２３．　　（８）　］、６５６４６６Ｈ１９８
４）など〕においても広く用いられている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、従来用いられていたこのような反応系は、水溶
性成分の溶媒としての多量の水の存在が原因となり、ホ
スホリパーゼＤが本質的に加水分解活性を持っているた
めに、副反応として加水分解が起こり、ホスファチジン
酸く以下ＰＡと略す）を生成するという欠点を有してい
る。

加水分解によるＰＡの生成は、反応後の目的リン脂質の
分離精製を困難にするばかりでなく、加水分解反応によ
っても原料リン脂質が消費されるため、糖や二級アルコ
ール等の反応性の低い受容体に対し７てホスファチジル
基を転移させようとする場合、その反応速度が加水分解
の反応速度に対して極端に低いために事実上目的生成物
を得ることができなかった。

このような問題点は、ホスホリパーゼＤ自体が本来加水
分解酵素である以上、水が存在する限り不可避である。

そこで、本発明者らは、反応系中の水分含量を酵素が失
活しない範囲で極限まで減少させることによりこの問題
を解決すべく、種々検討の結果、従来水溶液として反応
系に、添加していた成分を、担体に吸着あるいは担持せ
しめて添加する新規な反応系を見出し、本発明に至った
ものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、原料リン脂質と、水酸基を有する受容体とを
、担体に吸着させたホスホ１ｊバーゼＤに接触させて反
応を行うことを特徴とする。

本発明において用いられる原料リン脂質としては、ホス
ホリパーゼＤの基質となり得るものであれば、天然から
抽出したもの、または抽出後精製したもの、あるいは合
成したものを問わず使用できる。また、市販のものある
いは公知の方法で調製したものを使用しても差し支えな
い。

例として脱脂大豆レシチン、卵黄レシチン、ホスファチ
ジルコリン（以下ＰＣと略す）、ホスファチジルエタノ
ールアミン（以下ＰＥと略す）、ホスファチジルセリン
（以下ＰＳと略す）、ホスファチジルグリセロール（以
下ＰＧと略す）等またはそれらの混合物等があげられる
。本発明の効果を最大に発揮するためには１、原料リン
脂質として精製したものないしは＆、１）成の９ｉ純な
ものを用いた方が反応生成物の精製の面で都合が良い。

また、原料コストと人手の容易さ、酵素に対する反応性
の面から特にＰＣ，ＰＰ、またはＰＳが工業的に効果が
高く好ましい。

反応は、原料リン脂質を溶解または）じ濁する有機溶媒
の存在下で行うことが好ましく、酵素を失活させること
の少ない溶媒系であればいずれも使用できる。例として
、石油エーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエー
テル、シイツブＩコビルエーテル、クロロホルム、ジク
ロロメタン、四塩化炭素、ジクロロエタン、ｎ−へキサ
ユ／、シクロヘキサン、ｎ−オクタン、イソオクタン、
ｌ１）￥酸エチル、ジオキサン、ベンゼン等の溶媒、ま
たはこれらのン昆合）各課系、またはこれらにアセトン
、アセトニトリルなどの極性溶媒を配合した混合溶媒系
があげられる。ただしアルコール類は目的反応の基質と
なるため、基質として添加する以外に用いることばあま
り好ましくない。

ホスホリパーゼＤとしては、ホスファチジル基転移活性
を有するものであれば、市販のものあるいは公知の方法
で調製したものを問わず使用できる。例として、ベーリ
ンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂ！ｌ）製のキャベツ由来のホスホリ
パーゼＤ、東洋醸造■製の微生物由来のホスホリパーゼ
Ｄ　（ＰＬＤＰ）　、公知の方法〔−例としてケーラと
サストリイ（Ｍ、Ｋａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｐ、Ｓ。

Ｓａｓ　ｔｒｙ）の方法、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″（Ｊ、Ｍ。

Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ＋　　ｅｄ、）、　　ｖｏｌ、Ｉ
４．ｐｐ１９７−２０３゜Ａｃｈａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９６９）　）により抽出
し精製または部分精製した酵素標品、または抽出した粗
酵素があげられる。

受容体としては、コリン、メタノール、エタノール、エ
タノールアミン、セリン、グリセロール、グルコース等
の従来ホスファチジル基転移反応の受容体として知られ
ている化合物のみならず、ニーアミノ−２−プロパノー
ル、１−オルソメチルグルコシド、トレハロースをはじ
めとする従来ホスファチジル基転移反応の受容体とはな
らないとされていた糖類を含む一級または二級アルコー
ル構造を持つ化合物をも用いることができる。

ホスホリパーゼＤを吸着あるいは担持させる担体の材質
としては活性炭、活性白土、ケイ酸、シリカゲル、ケイ
藻土、ゼオライト、アルミナ、多孔質ガラス、陶”Ｊ’
ｊ＝、Ｌｎ器、樹脂などがあげられ、形状としては粒径
０．０２〜０．５ｍｍ程度の粒状あるいはビーズ状が好
ましい。またこれらの担体は、原料リン脂質および受容
体を吸着あるいは担持させることもできる。

ホスホリパーゼＤおよび受容体を担体に吸着あるいは担
持させる方法の例としては、該成分の水溶液を担体と接
触させ、ろ別後過剰の水を凍結乾燥し、あるいはジエチ
ルエーテルまたはクロロホルム等の酵素を失活させない
乾燥有機溶媒を繰り返しまたは連続的に接触させること
により除去する方法、あるいは粉末状にした該成分と担
体とを混合したところへ微量の水を加えて更に混合する
方法などがある。

酵素、受容体その他の成分を吸着または担持させた担体
と、原料リン脂質を溶解または）懸濁した有Ｒ溶媒とを
接触させる方法としては、容器中で担体を溶媒系中に分
散、懸濁し攪拌する方法、または担体をカラムなどに充
填し溶媒系を循環させる方法などがある。

原料リン脂質を担体に吸着あるいは担持させる方法の例
としては、低極性有機溶媒に溶解した原料リン脂質を担
体と接触し吸着させた後、濾過により溶媒を除去する方
法、あるいは原料リン脂質を溶解した有機溶媒を担体に
含浸させた後、溶媒を溜去する方法などがある。

反応系全体の水分含量は、好ましくは１％以下に抑える
ことにより加水分解反応が従来の反応系に比べて抑制で
きるが、更に０．５％以下に抑えることが好ましい。特
に、水分含量を０．２％以下に制御することにより従来
の反応系では反応し得なかった受容体をも反応させるこ
とができ、本発明の効果が最大に発揮される。

反応温度は用いる酵素の至適温度であればよく、通常３
０〜４０’Ｃの範囲である。ただし、用いる溶媒が低沸
点のものである場合等はこの限りではない。

反応時間は０．５〜３６時間で、好ましくは４〜２４時
間である。

このようにして製造した任意の塩基を持つ目的リン脂質
は溶剤分画、ケイ酸またはシリカゲルクロマトグラフィ
ー、アルミナクロマトグラフィー、ＤＩＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフィー等の公知の手段を適宜用いるこ
とにより、容易に精製することができろ。

（発明の効果） 本発明は、反応系中の水分含量を酵素が失活しない範囲
で極限まで減少させるため、本質的に非水系の反応系を
用いるので、従来の反応系で見られたようなＰＡの大量
の生成はｔｒｎ制され、反応後の目的リン脂質の分離精
製が容易になり収率が向上した。

更に、従来の反応系では得ることのできなかった多くの
種類の目的リン脂質をも製造することが可能となった。

（実施例） 以下、参考例、実施例、および比較例に基づいて本発明
を具体的に説明する。

なお、リン脂質の組成分析、純度検定は薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）で行った。Ｔ　ｔ、　ｃ　＋Ｉｉ（
メルク社製　ｍ５７２１）に脂質試料２０〜１００μｇ
を直径３〜５ｍｍにスポットし、クロロホルム−メタノ
ール−水（１２０ニア０：５）またはクロロホルム−ア
セトン−酢酸−メタノール−水（５０：２０：１５：１
０：５）で展開した。検出にはジットマー試薬、５０％
硫酸、ニンヒドリン試薬またはアンスロン試薬を目的に
応じて使用した。定量的な測定にはジットマー試薬で発
色したものを高速薄層クロマトスキャナー（島原製作所
製Ｃ５−９２０型）で測定した。

また、反応生成物の同定は、特に記さない限り、標卓品
とのＴＬＣ上でのＲｆ値の比較と各種試薬に対する発色
反応で行った。

参考例１ ホウレン草のホスホリパーゼＤを前出の公知の方法の一
例、ケーラとサストリイ（Ｍ、Ｋａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｐ
。

Ｓ、５ａｓｔｒｙ）の方法に従って抽出した。

近在の農家から入手した新鮮なホウレン草（バレート種
）を水洗後細断し、１００ｇに水２０（１ｍｌを加え、
水冷下で５分間ホモジナイズした。５重にしたガーゼで
濾過した濾液を４°Ｃで２，０００Ｘｇ、１５分間遠心
分離し、上清２１０ｍ１を得た。この上清を４℃で水ｌ
Ｉｌに対し３回透析し、４℃でｔｏ、０００×ｇ、１５
分間遠心分離した上清１９５ｍ１をホウレン草粗酵素液
として用いた。なお、この粗酵素液には検出可能量のリ
ン脂質は含まれていないことを確認した。

参考例２ 大豆ＰＣおよびＰＥをパルダン（Ｖｏｎ　Ｈ。

Ｐａｒｄｕｎ）の方法（Ｆｅｔｔｅ　５ｅｔｆｅｎ　Ａ
ｎｓｔｒｉｃｈｍｉｔｔｅ並、　　（２）　５５−６２
　（１９８４））により分離、分画した。

市販脱脂大豆レシチン粉末（ＰＣ２４％、ＰＥ２１％、
ホスファチジルイノシトール１４％、ＰＡ８％）２０ｇ
をイソプロパノ−ルーメタノール−水（５０：４５：５
）　１００ｍｆｆ１に分散し、４０℃で加熱撹拌し溶解
した。攪拌しながら２０℃まで冷却し、２０℃に１時間
保った。不溶物を２０℃に保ったまま遠心分離またはガ
ラスフィルターで減圧濾過した。集めた上清を・減圧下
で乾固し、ＰＣおよびＰ　Ｆ、濃縮物（ＰＣ６８％、Ｐ
Ｅ１７％、ＰＡ７％、ｐｓは含まない）９．７ｇを得た
。

参考例３ 卵黄レシチ°ンから常法によりＰＣを精製した。

市販卵黄レシチン（ＰＣ６７％、ＰＥ１９％、ＰＡ８％
、リゾＰＣ３％）１０ｇをシリカゲルカラム（径３．８
ｃｍ　Ｘ　６０ｃｍ）を用いて分画した。溶出溶媒とし
てクロロホルム−メタノール（５：１）　１．５７！、
クロロホルム−メタノール（３：１）　３ｐを流し、Ｐ
Ｃを多く含む両分を集め、減圧乾固してＰＣ（ＰＣ９７
％）４．３　ｇを得た。

参考例４ 精製卵黄ＰＣを多孔質ガラスに担持させた。

参考例３で得た精製卵黄Ｐ　Ｃ５００ｍｇを１００ｍｆ
のｎ−ヘキサンに溶かし、直径０．５ｍｍ以下に砕いた
多孔質ガラス５ｇに含浸させた後、ｎ−ヘキサンを減圧
乾固して担持させた。

参考例５ 牛脳からリーズ（Ｍ、Ｌｅｅｓ）の方法（”Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ｓ、Ｐ、Ｃｏｌｏ
ｗｉｃｋ　ａｎｄ　Ｎ、０．Ｋａｐｌａｎ　ｅｄ、）＋
ｖｏ１．３＋　　ｐｐ３２８．Ａｃｈａｄｅｍｉｃ　　
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｈ　　Ｙｏｒｋ（１９５７）　）によ
り粗セファリンを抽出し、ＤＥＡＥ−セルロースカラム
クロマトグラフィーで精製した。

近在の屠殺場で入手した新鮮な牛脳の脳膜および血管を
取り除いたもの３００　ｇを１．２βのアセトン中でホ
モジナイズし、抽出した。濾過残渣をもう一度１．２β
のアセトンで抽出する。濾過残渣を１．２　Ｉ！のエタ
ノールで抽出する。濾過残渣を同様にして１．２１の石
油エーテルで２回抽出し、抽出液を集めて減圧乾固し、
粗セファリン画分３．９ｇを得た。

このものをクロロホルムに溶解し、酢酸型に調製したＤ
ＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマン社製ＤＥ３２、
径２．５ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ）を用いて分画した。クロ
ロホルム−メタノール（１：４）１６でカラムを洗浄後
、酢酸７５０ｍ！で溶出した両分を集めた。＠酸溶出画
分に等容のクロロホルムを加え、２倍容の水で４回洗浄
した。クロロホルム層を減圧乾固し、ＰＳ（ＰＳ９８％
）　０．８　ｇを得た。

参考例６ 市販ケイ藻土を水および溶剤で洗浄し精製した。

１）ｈ５０３セライト（ジョンズ・マンビル・セイルズ
社製、商品名）１００ｇを２１の水に懸濁し洗浄すると
同時にデカンテーションにより微粒子を除去した。同様
にして更に水で２回、メタノールで１回、クロロホルム
で１回洗浄し、最後にアセトン５００　ｍｌに懸濁した
ものを減圧濾過した。風乾後１２０℃で５時間乾燥し、
精製セライト７４ｇを得た。

実施例Ｉ Ｌ−セリン５０ｇ１キヤベツホスホリパーゼＤ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）　　０．５　ｇ　、ｋ７ｊｘ
　化カルシウム・二水塩０．２５ｇを５００ｍＩｌの５
ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５，６に溶かし、特級活性炭（和光
純薬（株製）４０ｇを加え、室温で３０分間撹拌した。

濾別後、８時間凍結乾燥し、酵素、受容体その他を吸着
させた活性炭５３．７　ｇを得た。

参考例２で得た大豆ｐｃおよびＰＥ濃縮物８ｇを５００
ｍ１のジエチルエーテルに溶かし、酵素、受容体その他
を吸着させた活性炭５３．５ｇを加え分散させた。密閉
容器中で３７℃に保温し、１７時間５００ｒｐｍで撹拌
して反応させた。

反応溶媒を濾過により回収し、活性炭は２００ｍｆｆ１
のクロロホルムで３回洗った。反応溶媒と洗液を合わせ
て減圧乾固し、リン脂質混合物（ＰＣ８％、ＰＥ８％、
ＰＡ９％、Ｐ３７２％）６．９ｇを得た。

このものをクロロホルムに？容かしてＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム（ワットマン社製ＤＥ３２　、径３．８×２
７　ｃｍ）で分画した。カラムをクロロホルム−メタノ
ール（１：４Ｎ、！Ｍで洗浄後、酢酸１．２１！で溶出
した画分から参考例５に示したと同様にしてＰＳ（ＰＳ
９９％）３．４ｇを回収した。

実施例２ 塩酸でｐｉ（５，０に調整したＩＭエタノールアミ′ン
水溶液２５ｍ１と参考例１で調製したホウレン草粗酵素
液２５ｍ１の混合液に参考例６で得た精製セライト２．
５ｇを加え、室温で３０分間攪拌した。・濾別後少量の
ジイソプロピルエーテルにｙＬ！、′ＩｉＪシ、カラム
（径Ｉ　Ｘ３．５　ｃｍ）に充填した。乾燥したジイソ
プロピルエーテル２．５１を流して過剰の水を吸収、除
去した後、市販卵黄レシチン（ＰＣ６７％、ＰＥ１９％
、ＰＡ８％、リゾＰＣ３％）３ｇを溶かしたジイソプロ
ピルエーテル２０ｍ１を定量ポンプを用いて流速０．３
〜０．５　ｄ／分、３０℃で６時間循環させ、反応させ
た。

反応溶媒を回収し、カラムを１０ｍ１のクロロホルムで
３回洗った。反応溶媒と洗液を合わせて減圧乾固し、リ
ン脂質混合物（ＰＣ１％、ＰＥ８５％、ＰＡＩＯ％、リ
ゾＰＣ２％）２．７ｇを得た。

このものをクロロホルムに溶かしてシリカゲルカラム（
径２．５　Ｘ　４０ｃｍ）で分画した。クロロホルム−
メタノール−水（６５：２５：２）　２１で？容出し、
ＰＥを含む画分を集めて減圧乾固し、ＰＥ（ＰＥ９７％
）１．６ｇを得た。

実施例３ 塩酸でｐＨ５，５に調整した３３３ｍＭ１−アミノ−２
−プロパノール水溶液２艷にキャベツホスホリパーゼＤ
（ベーリンガー・マンハイム社製）５０ｍｇ、塩化カル
シウム・二水塩０．５ｍｇを溶解し、参考例６で得た精
製セライト２００ｍｇを加え、１５分間よく振り混ぜた
。１２．０００　Ｘ　ｇで１５分間遠心分雛した沈殿を
６時間凍結乾燥し、酵素、受容体その他を吸着させたセ
ライト２７８ｍｇを得た。

１０ｍ１のｎ−ヘキサン−アセトン（９５：５）に参考
例４で得た精製卵黄ＰＣを担持させた多孔質ガラス６０
０ｍｇ、および酵素、受容体その他を吸着させたセライ
）　２７６ｍｇを懸濁、分散した。３７°Ｃで２４時間
５００ｒｐｍで攪拌し、反応させた。

反応溶媒を濾過により回収し、担体は５　ｍｌのクロロ
ホルムで３回洗った。反応溶媒と洗液を合わせて減圧乾
固し、リン脂質混合物４２ｍｇを得た。

このものにはＰＡ４％が含まれるが、ＰＣは検出されず
、残りの９４％を占めるものはシソＩ・マー試薬にもニ
ンヒドリン試薬にも陽性で、ＴＬＣ上のＲｆ値が標準Ｐ
Ｅときわめて近いことから、１−アミノ−２−プロパノ
ールにホスファチジル基が思入された目的リン脂質であ
ると判定した。

実施例４ 参考例１で得たホウレン草粗酵素液を凍結乾燥した粉末
１００ｍｇと活性炭３００ｍｇとをよく混ぜ、グリセロ
ール（水分３％）　６０ｍｇを加えてよく練り混ぜた。

このものを参考例５で得た牛脳ＰＳ５０ｍｇを溶かした
１５ｍ１のクロロホルム中に分散し、３５℃で５時間５
００ｒｐｍで撹拌し、反応させた。

反応溶媒を濾過により回収し、活性炭は５　ｍｌのクロ
ロホルムで３回洗った。反応溶媒と洗液を合わせて減圧
乾固し、リン脂質混合物（ＰＳ２８％、ＰＡ３　　％、
　　ＰＣ６７％）　　４４ｍｇを得ノこ。

実施例５ １−オルソメチルグルコシド６００ｍｇ、ホスホリパー
ゼＤ（東洋醸造（横裂ＰＬＤＰ）１２／、１ｇを５　ｍ
ｌの５ｍＭ酢酸緩衝液ｐ　Ｈ５，６に溶かし、活性炭１
ｇに実施例３と同様にして吸着させ、凍結乾燥した。

ジパルミトイルＰＣ４５ｍｇを？容かしたクロロホルム
−イソオクタン（１：１）　１５ｍｆに酵素、受容体等
を吸着させた活性炭９５０ｍｇを分散し、３８°Ｃで１
２時間５００ｒｐｍ　Ｔ：攪拌して反応させた。

実施例４と同様にしてリン脂質混合物４８ｍｇを得た。

このものをｌ１ｈ５７４５分取用ＴＬＣプレート（メル
ク社製）を用い、クロロホルム−メタノール−水（１２
０ニア０：５）を展開溶媒として分画、分取し、未同定
リン脂質２９ｍｇを得た。

このリン脂質をＪＭＳ−ＤＸ３０３型質量分析装置（日
本電子ｅｓ製）を用い、下記条件にて分析したところ、
陽イオン側の親ピークがｍ／ｅ　８４７、陰イオン側の
親ピークがｍ／ｅ　８２３であった。

測定条件 イオン化法　　　　ＣＦＡＢ法 衝撃ガス　　　　　：Ｘｅ 一部イオン加速電圧：５ｋＶ フィラメント電流　：２０ｍＡ 検出器　　　　　　：コンバージョン・ダイノード 押し出し電圧　　　：１５に、Ｖ マトリクス　　　　　ニトリエタノールアミン（陽イオ
ンの場合塩化 ナトリウム添加） データ処理　　　　：ＪＭ八−ＤＡ５０００これらの値
は１−オルソメチルグルコシドにホスファチジル基が導
入されたと仮定した分子量（８２４）の各々ナトリウム
塩（分子量８２４　＋　２３）および陰イオン（分子ｆ
ｆｉ　８２４−１）と−敗したことから、目的リン脂質
であると同定した。

実施例６ Ｉ・レバロース１ｇとホスホリパーゼＤ（東洋醸造（掬
製ＰＬＤＰ）１０ｔ！ｇを５　ｍｌの水に溶かし、乾燥
した市販のビーズ状スチレン−ジビニルベンゼン樹脂を
加えて４°Ｃで５時間攪拌し、含浸させた。

濾別後１８時間凍結乾燥したものをジパルミトイルＰＣ
４５ｍｇを溶かした乾燥したジクロロメタン２Ｑｍｌ中
に分散させ、３７°Ｃで２４時間、４Ｏｒｐｍで回転鏝
のし、反応させた。

反応溶媒を濾過により回収し、樹脂を２Ｑｍｌのジクロ
ロメタンで３回洗った。反応溶媒と洗液とを合わせて減
圧乾固し、リン脂質混合物４３ｍｇを得た。

このものはＰＣ３８％、ＰＡ５％を含んでいたが、５４
９４を占めるリン脂質はジットマー試薬とアンスロン試
薬に陽性であることから、トレハロースにホスファチジ
ル基が導入された目的リン脂質であると判定した。

更に、実施例５と同様にして一部をＴＬＣで分取し、質
量分析を行ったところ、陽イオン側視ピークｍ／ｅ　９
９５、陰イオン側視ピークｍ／ｅ　９７１で、計算分子
！！　（９７２）の各々ナトリウム塩（分子量９７２＋
２３）　、陰イオン（分子量９７２−１）と一致したこ
とから、目的リン脂質であると同定した。

比較例１ 従来の反応系で、実施例１とできるだけ近い条件で反応
を行った。

Ｌ−セゾン２００　ｍ　Ｍ　、塩化カルシウム４０ｍＭ
、ホスホリパーゼＤ（ベーリンガー・マンハイム社製）
２．５ｍｇを含むｐＨ５，６の５０ｍＭ酢酸緩衝液５　
ｒｒｌ。

と、参考例２で得た大豆ｐｃおよびＰＥの濃縮物４０ｍ
ｇを溶かしたジエチルエーテル５　ｍｌを３７°ＣＣ１
５００ｒｐで撹拌した。

同一のもの５検体を平行して各１．２．４．８．１６時
間反応させた。反応後、５ｍｌのジエチルエーチルで３
回脂質を抽出し、リン脂質Ｎ■成を分析した。結果を第
１表に示す。

第１表 組成（％） 比較例２ 従来の反応系で、実施例２とできるだけ近い条件で反応
を行った。

塩酸でｐＨ５，０に調整した１Ｍエタノールアミン水溶
液０．３５ｍｆと参考例１で得たホウレン草粗酵素液０
．３７５ｍＡ！、水４．２１５ｍ１、市販卵黄レシチン
４５ｍｇを溶かしたジイソプロピルエーテル５−を３０
℃、５００ｒｐｍで攪拌した。

同一のもの４検体を平行して各１．２．４．６時間反応
させ、比較例１と同様にして分析した。

結果を第２表に示す。

第２表 組成（％） 比較例３ 従来の反応系で、実施例５とできるだけ近い条件で反応
を行った。

１−オルソ−メチルグルコシド６００ｍｇ　、ホスホ、
リパーゼＤ（東洋醸造（４菊！！！！ＰＬＤＰ）１２μ
ｇを溶かしたｐＨ５，６の５０ｍＭ酢酸ａＭ　ｆＪｉ液
５　ｍＲとジパルミトイルＰＣ４５ｍｇを溶かしたクロ
ロホルム−イソオクタン（１：１）　　５ｍｌを３８℃
、５００ｒｐｍで攪拌し、反応させた。

比較例１および２と同様にして経時的に分析したが、実
施例５で認められた目的リン脂質に相当するスボ７）が
ＴＬＣ上に認められず、８時間反応した時点で基質が完
全に分解されたため、分析を打ち切った。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）塩基構造が変換されたリン脂質を製造するにあた
   り、原料リン脂質と水酸基を有する受容体とを、担体に
   吸着させたホスホリパーゼＤに接触させて反応を行うこ
   とを特徴とする酵素によるリン脂質の製造方法。
2. （２）反応を有機溶媒の存在下で行う特許請求の範囲第
   １項記載の製造方法。
3. （３）原料リン脂質を吸着させた担体と、受容体および
   ホスホリパーゼＤを吸着させた担体とを混合し反応させ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。
4. （４）担体が活性炭、活性白土、ケイ酸、シリカゲル、
   ケイ藻土、ゼオライト、アルミナ、多孔質ガラス、陶器
   、磁器、または樹脂である特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。
5. （５）受容体が、セリン、エタノールアミン、１−アミ
   ノ−２−プロパノール、１−オルソメチル−グルコシド
   、トレハロースのいずれかである特許請求の範囲第１、
   ２、３または４項記載の製造方法。
6. （６）反応系中の水分含量が１％以下の状態で反応を行
   う特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の製
   造方法。