JPH07170981A - オリゴヌクレオチドの製造法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドの製造法Info
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- JPH07170981A JPH07170981A JP31855493A JP31855493A JPH07170981A JP H07170981 A JPH07170981 A JP H07170981A JP 31855493 A JP31855493 A JP 31855493A JP 31855493 A JP31855493 A JP 31855493A JP H07170981 A JPH07170981 A JP H07170981A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 所望の分子量、塩基配列、および絶体配置を
有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを簡便
かつ計画的に作製する。 【構成】（１）任意の塩基配列を有するホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドを化学合成し、（２）逆相ク
ロマトグラフィー法によって、上記合成オリゴヌクレオ
チドを５′末端保護のまま分離してホスホロチオエート
型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合を分取し、
（３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護のの
ち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離して
各々の立体異性体を分取し、（４）得られた立体異性体
のなかから、所望の絶体配置を有するオリゴヌクレオチ
ドを選択し、それらの５′末端をリン酸化して結合す
る。
有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを簡便
かつ計画的に作製する。 【構成】（１）任意の塩基配列を有するホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドを化学合成し、（２）逆相ク
ロマトグラフィー法によって、上記合成オリゴヌクレオ
チドを５′末端保護のまま分離してホスホロチオエート
型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合を分取し、
（３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護のの
ち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離して
各々の立体異性体を分取し、（４）得られた立体異性体
のなかから、所望の絶体配置を有するオリゴヌクレオチ
ドを選択し、それらの５′末端をリン酸化して結合す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、オリゴヌクレオチド
の製造法に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、ガンや難治性ウイルス疾患の遺伝子治療に用いる
アンチセンス分子として有用なホスホロチオエート型オ
リゴヌクレオチドの新規な製造法に関するものである。
の製造法に関するものである。さらに詳しくは、この発
明は、ガンや難治性ウイルス疾患の遺伝子治療に用いる
アンチセンス分子として有用なホスホロチオエート型オ
リゴヌクレオチドの新規な製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、組換えＤＮＡをはじめとする遺伝
子操作技術の進歩には目覚しいものがあり、生物学一般
のみならず、医学、工学、農学等への応用展開も急速に
拡大しつつある。また、遺伝子そのもについても、その
塩基配列と構造の解析から多数の知見が蓄積されてきて
おり、今日では、多くの原因不明の疾患が遺伝子に関係
することも明らかになってきている。例えばガン遺伝子
発見はガンもまた遺伝子病の１つとして考えるべきであ
ることを示し、また、ある種のウイルスは発ガンに強く
関与していることもわかってきた。こうした背景からガ
ンあるいは難治性ウイルス疾患を対象として、直接遺伝
子に作用する形で治療を行おうとする試み、すなわちア
ンチセンス技術による遺伝子治療が考え出されている。
子操作技術の進歩には目覚しいものがあり、生物学一般
のみならず、医学、工学、農学等への応用展開も急速に
拡大しつつある。また、遺伝子そのもについても、その
塩基配列と構造の解析から多数の知見が蓄積されてきて
おり、今日では、多くの原因不明の疾患が遺伝子に関係
することも明らかになってきている。例えばガン遺伝子
発見はガンもまた遺伝子病の１つとして考えるべきであ
ることを示し、また、ある種のウイルスは発ガンに強く
関与していることもわかってきた。こうした背景からガ
ンあるいは難治性ウイルス疾患を対象として、直接遺伝
子に作用する形で治療を行おうとする試み、すなわちア
ンチセンス技術による遺伝子治療が考え出されている。
【０００３】すなわち、ＤＮＡの複製、転写（ＤＮＡか
らのＲＮＡ生産）、翻訳（ＲＮＡからのタンパク質生
産）などの遺伝子発現は、遺伝子と種々のタンパク質と
の相互作用によって行われる。その際遺伝子の特定領域
を何らかの分子で選択的に被覆あるいは切断することが
できれば、遺伝子の発現は選択的に制御されることにな
る。アンチセンス技術はその際用いられる分子（アンチ
センス分子）として核酸およびその誘導体を用いる方法
であり、この方法の基本的原理は原核細胞生物で実際に
機能していることが見いだされている。図１にアンチセ
ンス法の基本的原理を示す。遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）
の特定領域（１本鎖あるいは２本鎖）を、相補的な塩基
配列を持つＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド
（修飾体も含む）で被覆すれば（図１の→１、２、３、
４部分）、その部分の遺伝子発現は選択的に抑制され
る。この際の抑制メカニズムとして （１）物理的に調節分子（リプレサーなど）や合成酵素
類を遺伝子に結合できなくする、（２）対象遺伝子が切
断される、（３）アンチセンス分子と対象遺伝子との二
重鎖形成が内在性加水分解酵素群を活性化しＲＮＡなど
が不活性化される、などが考えられている。こうした機
構を機能させる目的で現在までに数多くのアンチセンス
分子が化学的、生物学的手法で開発されてきている。
らのＲＮＡ生産）、翻訳（ＲＮＡからのタンパク質生
産）などの遺伝子発現は、遺伝子と種々のタンパク質と
の相互作用によって行われる。その際遺伝子の特定領域
を何らかの分子で選択的に被覆あるいは切断することが
できれば、遺伝子の発現は選択的に制御されることにな
る。アンチセンス技術はその際用いられる分子（アンチ
センス分子）として核酸およびその誘導体を用いる方法
であり、この方法の基本的原理は原核細胞生物で実際に
機能していることが見いだされている。図１にアンチセ
ンス法の基本的原理を示す。遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）
の特定領域（１本鎖あるいは２本鎖）を、相補的な塩基
配列を持つＤＮＡ、ＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチド
（修飾体も含む）で被覆すれば（図１の→１、２、３、
４部分）、その部分の遺伝子発現は選択的に抑制され
る。この際の抑制メカニズムとして （１）物理的に調節分子（リプレサーなど）や合成酵素
類を遺伝子に結合できなくする、（２）対象遺伝子が切
断される、（３）アンチセンス分子と対象遺伝子との二
重鎖形成が内在性加水分解酵素群を活性化しＲＮＡなど
が不活性化される、などが考えられている。こうした機
構を機能させる目的で現在までに数多くのアンチセンス
分子が化学的、生物学的手法で開発されてきている。
【０００４】ところが、アンチセンス分子を生体内で作
用させるためにはつぎのような要件を考慮しなければな
らない。すなわち、（１）塩基配列特異性、（２）ハイ
ブリッド安定性、（３）化学的、生化学的安定性、
（４）免疫原性、（５）細胞膜透過性、（６）細胞毒
性、（７）代謝性、（８）調製法等であり、アンチセン
ス分子を化学的に合成する際は、それらに基づいて分子
設計、合成について考慮すべきである。
用させるためにはつぎのような要件を考慮しなければな
らない。すなわち、（１）塩基配列特異性、（２）ハイ
ブリッド安定性、（３）化学的、生化学的安定性、
（４）免疫原性、（５）細胞膜透過性、（６）細胞毒
性、（７）代謝性、（８）調製法等であり、アンチセン
ス分子を化学的に合成する際は、それらに基づいて分子
設計、合成について考慮すべきである。
【０００５】こうした理由から、現在実際に使用されて
いる合成アンチセンス分子は、リン酸結合を修飾したも
のが多い。また、リン酸ジエステル結合を持つ天然型の
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の場合には、この化学合
成はホスホロアミダイト法を採用したＤＮＡ自動合成機
によって容易に行われる。ＯＤＮは対象ＤＮＡあるいは
ＲＮＡと安定な二重鎖を形成しアンチセンス分子として
の機能も高いが、反面リン酸ジエステル結合が細胞培養
液あるいは体液などに含まれるヌクレアーゼ類により容
易に加水分解される（半減期５分間程度）。従ってＯＤ
Ｎをそのまま体内投与することは実際上非常に困難であ
る。このため、体内での寿命を長くするために様々な工
夫がなされているが、分子としての安定性と対象ＤＮＡ
やＲＮＡとの２重鎖の安定性とが両立しない場合が多
い。
いる合成アンチセンス分子は、リン酸結合を修飾したも
のが多い。また、リン酸ジエステル結合を持つ天然型の
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の場合には、この化学合
成はホスホロアミダイト法を採用したＤＮＡ自動合成機
によって容易に行われる。ＯＤＮは対象ＤＮＡあるいは
ＲＮＡと安定な二重鎖を形成しアンチセンス分子として
の機能も高いが、反面リン酸ジエステル結合が細胞培養
液あるいは体液などに含まれるヌクレアーゼ類により容
易に加水分解される（半減期５分間程度）。従ってＯＤ
Ｎをそのまま体内投与することは実際上非常に困難であ
る。このため、体内での寿命を長くするために様々な工
夫がなされているが、分子としての安定性と対象ＤＮＡ
やＲＮＡとの２重鎖の安定性とが両立しない場合が多
い。
【０００６】これに対して、アンチセンス分子が生理的
条件下で電気的に中性であればＤＮＡやＲＮＡとの相互
作用時に静電的斥力が働かないため二重鎖（ハイブリッ
ド）が安定に形成されるであろうとする考えから、トリ
エステル型（ＯＴＲ）、メチルホスホネート型（ＯＭ
Ｐ）、ホスホロチオエート（ＯＰＴ）、ホスホロアミデ
ード（ＯＰＡ）等のアンチセンス分子が開発されてい
る。
条件下で電気的に中性であればＤＮＡやＲＮＡとの相互
作用時に静電的斥力が働かないため二重鎖（ハイブリッ
ド）が安定に形成されるであろうとする考えから、トリ
エステル型（ＯＴＲ）、メチルホスホネート型（ＯＭ
Ｐ）、ホスホロチオエート（ＯＰＴ）、ホスホロアミデ
ード（ＯＰＡ）等のアンチセンス分子が開発されてい
る。
【０００７】なかでも次式にそのヌクレオチド構造を示
したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドは、上記（１）〜
（８）の要件を最もよく満たすアンチセンス分子であ
り、現在、その作成と応用が広く検討されている。
したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドは、上記（１）〜
（８）の要件を最もよく満たすアンチセンス分子であ
り、現在、その作成と応用が広く検討されている。
【０００８】
【化１】
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このＯ
ＰＴ型オリゴヌクレオチドはリン原子に対して立体異性
であり、各リン酸結合にそれぞれＳ型とＲ型の絶体配置
が存在するため（図２）、同一塩基配列のオリゴヌクレ
オチドであっても、ｎ量体では２n-1 個の異性体が出現
することになる。
ＰＴ型オリゴヌクレオチドはリン原子に対して立体異性
であり、各リン酸結合にそれぞれＳ型とＲ型の絶体配置
が存在するため（図２）、同一塩基配列のオリゴヌクレ
オチドであっても、ｎ量体では２n-1 個の異性体が出現
することになる。
【００１０】たとえば４量体のオリゴヌクレオチドの場
合には、個々のインターヌクレオチド結合に関して、８
種類（ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＳＳ、ＲＳＲ、ＳＲＲ、ＳＲ
Ｓ、ＳＳＲ、ＳＳＳ）の異性体が生成する。このため
に、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドからなるアンチセンス
分子は様々な立体異性体の混合物となり、対象遺伝子と
の結合力が弱くなるという欠点をもつ。
合には、個々のインターヌクレオチド結合に関して、８
種類（ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＳＳ、ＲＳＲ、ＳＲＲ、ＳＲ
Ｓ、ＳＳＲ、ＳＳＳ）の異性体が生成する。このため
に、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドからなるアンチセンス
分子は様々な立体異性体の混合物となり、対象遺伝子と
の結合力が弱くなるという欠点をもつ。
【００１１】そこで、従来は、核酸と絶体配置について
莫大な組み合わせからなる立体異性体の混合物のなかか
ら、目的の機能を持った特定分子を選択しなければなら
ず、その調製作業には多大な時間と労力を必要とする。
このため、現在は、特定分子を選択せずに混合物のまま
のＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを使用しているが、この
混合物は機能のない分子も多く含むため、目的とする効
果を得るためには過剰量のオリゴヌクレオチドを使用し
なければならない。しかしながら、ＯＰＴ型オリゴヌク
レオチドは数μｍｏｌの濃度を超えて細胞内に導入する
と毒性を示す。このため、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチド
をアンチセンス療法に用いるためには、目的の機能を持
った特定分子のみを選択的に使用することが不可欠であ
る。
莫大な組み合わせからなる立体異性体の混合物のなかか
ら、目的の機能を持った特定分子を選択しなければなら
ず、その調製作業には多大な時間と労力を必要とする。
このため、現在は、特定分子を選択せずに混合物のまま
のＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを使用しているが、この
混合物は機能のない分子も多く含むため、目的とする効
果を得るためには過剰量のオリゴヌクレオチドを使用し
なければならない。しかしながら、ＯＰＴ型オリゴヌク
レオチドは数μｍｏｌの濃度を超えて細胞内に導入する
と毒性を示す。このため、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチド
をアンチセンス療法に用いるためには、目的の機能を持
った特定分子のみを選択的に使用することが不可欠であ
る。
【００１２】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、所望の塩基配列と絶体配置を有する
ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを、簡便かつ効率よく作製
するための方法を提供することを目的としている。
されたものであり、所望の塩基配列と絶体配置を有する
ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを、簡便かつ効率よく作製
するための方法を提供することを目的としている。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、所望の塩基配列と絶体配置とを
有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの製造
法であって、（１）任意の塩基配列を有するホスホロチ
オエート型オリゴヌクレオチドを化学合成し、（２）逆
相クロマトグラフィー法によって、上記合成オリゴヌク
レオチドを５′末端保護のまま分離してホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合を分取
し、（３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護
ののち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離
して各々の立体異性体を分取し、（４）得られた立体異
性体のなかから、所望の絶体配置を有するホスホロチオ
エート型オリゴヌクレオチドを選択し、それらの５′末
端をリン酸化して結合する、ことを特徴とするオリゴヌ
クレオチドの製造法を提供する。
を解決するものとして、所望の塩基配列と絶体配置とを
有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドの製造
法であって、（１）任意の塩基配列を有するホスホロチ
オエート型オリゴヌクレオチドを化学合成し、（２）逆
相クロマトグラフィー法によって、上記合成オリゴヌク
レオチドを５′末端保護のまま分離してホスホロチオエ
ート型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合を分取
し、（３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護
ののち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離
して各々の立体異性体を分取し、（４）得られた立体異
性体のなかから、所望の絶体配置を有するホスホロチオ
エート型オリゴヌクレオチドを選択し、それらの５′末
端をリン酸化して結合する、ことを特徴とするオリゴヌ
クレオチドの製造法を提供する。
【００１４】またこの発明の製造法は、上記（１）にお
いて化学合成したホスホロチオエート型オリゴヌクレオ
チドが３−８量体であること、（２）および（３）の逆
相クロマトグラフィー法に用いる溶離液が酢酸アンモニ
ウム水溶液を主成分とすること、（４）におけるホスホ
ロチオエート型ヌクレオチドの結合を酵素的方法または
化学的方法により行なうこと、およびそのようにして結
合されたオリゴヌクレオチドが１０−３０量体であるこ
と、をそれぞれ好ましい態様としてもいる。
いて化学合成したホスホロチオエート型オリゴヌクレオ
チドが３−８量体であること、（２）および（３）の逆
相クロマトグラフィー法に用いる溶離液が酢酸アンモニ
ウム水溶液を主成分とすること、（４）におけるホスホ
ロチオエート型ヌクレオチドの結合を酵素的方法または
化学的方法により行なうこと、およびそのようにして結
合されたオリゴヌクレオチドが１０−３０量体であるこ
と、をそれぞれ好ましい態様としてもいる。
【００１５】
【作用】以下、この発明の製造法について詳しく説明す
る。 Ｉ．ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの合成 例えば、公知のホスホロアミダイト法固相自動合成と、
テトラエチルチウラムジスルフィド〔Ｅｔ2 ＮＣ（Ｓ）
ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2 〕などのイオウ原子導入試薬を組
み合わせて、任意の塩基配列を有するＯＰＴ型オリゴヌ
クレオチドを合成する（図３）。ヌクレオチドの数は、
３〜８個（３〜８量体）、好ましくは４〜６個（４〜６
量体）とする。その結果、例えば５量体オリゴヌクレオ
チドの場合には、１６種類（２5-1 ）の立体異性体の集
合としてＯＰＴ型オリゴヌクレオチドが合成される。同
様に、４量体の場合には８種類（２4-1 ）、６量体の場
合には３２種類（２6-1 ）の異性体集合となる。
る。 Ｉ．ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの合成 例えば、公知のホスホロアミダイト法固相自動合成と、
テトラエチルチウラムジスルフィド〔Ｅｔ2 ＮＣ（Ｓ）
ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2 〕などのイオウ原子導入試薬を組
み合わせて、任意の塩基配列を有するＯＰＴ型オリゴヌ
クレオチドを合成する（図３）。ヌクレオチドの数は、
３〜８個（３〜８量体）、好ましくは４〜６個（４〜６
量体）とする。その結果、例えば５量体オリゴヌクレオ
チドの場合には、１６種類（２5-1 ）の立体異性体の集
合としてＯＰＴ型オリゴヌクレオチドが合成される。同
様に、４量体の場合には８種類（２4-1 ）、６量体の場
合には３２種類（２6-1 ）の異性体集合となる。
【００１６】なお、塩基配列については特段の制限はな
く、アンチセンス分子としての用途に応じて適宜とする
ことができるが、例えば標的遺伝子の特定配列（発現調
節領域や構造遺伝子領域等）に対するハイブリッド安定
性等を考慮する。 II．異性体の分取（第１段階） まず、合成したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを逆相クロ
マトグラフィー法によって分離する。この時、各オリゴ
ヌクレオチドはその５′末端保護基を結合した状態でカ
ラムを通過させる。こうすることによって、例えば５量
体オリゴヌクレオチドの場合には、各異性体が４本の吸
光度（２５４ｎｍ）ピークとして分離される。同様に、
４量体の場合には、２本、６量体の場合には８本のピー
クとして分離される。なお、このような異性体分離は、
酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を主成分とする溶離
液（ｐＨ７．０程度）をカラムに通液して行なうことが
できる。
く、アンチセンス分子としての用途に応じて適宜とする
ことができるが、例えば標的遺伝子の特定配列（発現調
節領域や構造遺伝子領域等）に対するハイブリッド安定
性等を考慮する。 II．異性体の分取（第１段階） まず、合成したＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを逆相クロ
マトグラフィー法によって分離する。この時、各オリゴ
ヌクレオチドはその５′末端保護基を結合した状態でカ
ラムを通過させる。こうすることによって、例えば５量
体オリゴヌクレオチドの場合には、各異性体が４本の吸
光度（２５４ｎｍ）ピークとして分離される。同様に、
４量体の場合には、２本、６量体の場合には８本のピー
クとして分離される。なお、このような異性体分離は、
酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を主成分とする溶離
液（ｐＨ７．０程度）をカラムに通液して行なうことが
できる。
【００１７】次に、分離した各異性体を分取する。これ
は公知の方法に従って行なうことができ、たとえば各ピ
ークに対応するカラム画分を切り出し、オリゴヌクレオ
チド分子を溶出、精製等すればよい。 III．異性体の分取（第２段階） 分取した各異性体を、上記IIと同様の逆相クロマトグラ
フィー法によってさらに分離する。ただし、この時に
は、各異性体オリゴヌクレオチドの５′末端保護基をは
ずした状態でカラムに流す。こうすることによって、上
記IIで分取された各異性体の集合が各々４本のピークと
して分離される。すなわち、４量体からは合計８本のピ
ーク（第１段階：２ピーク×第２段階：４ピーク）、５
量体からは１６ピーク（４×４）、６量体からは３２ピ
ーク（８×４）が得られ、それらを上記IIと同様に分取
することによって、各分子量に応じた数量の立体異性体
（すなわち、４量体→８個；５量体→１６個：６量体→
３２個）が得られる。 IV．各異性体の結合 上記 IIIで分取した各異性体についてその立体構造を分
析し、目的に応じて幾つかを選択し、各々の５′末端を
リン酸化して結合する。こうすることによって、所望の
塩基配列と、リン酸結合部位における所望の絶体配置と
を有するＯＴＰ型ヌクレオチドが得られる。
は公知の方法に従って行なうことができ、たとえば各ピ
ークに対応するカラム画分を切り出し、オリゴヌクレオ
チド分子を溶出、精製等すればよい。 III．異性体の分取（第２段階） 分取した各異性体を、上記IIと同様の逆相クロマトグラ
フィー法によってさらに分離する。ただし、この時に
は、各異性体オリゴヌクレオチドの５′末端保護基をは
ずした状態でカラムに流す。こうすることによって、上
記IIで分取された各異性体の集合が各々４本のピークと
して分離される。すなわち、４量体からは合計８本のピ
ーク（第１段階：２ピーク×第２段階：４ピーク）、５
量体からは１６ピーク（４×４）、６量体からは３２ピ
ーク（８×４）が得られ、それらを上記IIと同様に分取
することによって、各分子量に応じた数量の立体異性体
（すなわち、４量体→８個；５量体→１６個：６量体→
３２個）が得られる。 IV．各異性体の結合 上記 IIIで分取した各異性体についてその立体構造を分
析し、目的に応じて幾つかを選択し、各々の５′末端を
リン酸化して結合する。こうすることによって、所望の
塩基配列と、リン酸結合部位における所望の絶体配置と
を有するＯＴＰ型ヌクレオチドが得られる。
【００１８】なお、このヌクレオチドは１０−３０量
体、好ましくは１５−２０量体程度となるように異性体
を結合して作成する。また、各異性体の結合は、例えば
Ｔ４ライゲースを用いた酵素的方法あるいは縮合剤を用
いた化学的方法を用いて行なうことができる。以下、実
施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明す
るが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
体、好ましくは１５−２０量体程度となるように異性体
を結合して作成する。また、各異性体の結合は、例えば
Ｔ４ライゲースを用いた酵素的方法あるいは縮合剤を用
いた化学的方法を用いて行なうことができる。以下、実
施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明す
るが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】図３に示したように、ホスホロアミダイト法
固相自動合成とＥｔ2 ＮＣ（Ｓ）ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2
によるイオウ原子の導入を組み合わせて、配列番号１記
載の塩基配列を有する５量体ＯＰＴ型オリゴヌクレオチ
ドを合成した。この合成オリゴヌクレオチドを、５′末
端の保護基（ＤＭＴｒ基）を結合した状態で市販の逆相
クロマトグラフィーカラム（４０℃）に注入し、０．１
Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）か
らなる溶離液（Ａ）と、等量の０．１Ｍ酢酸トリエチル
アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）およびアセトニトリ
ルからなる溶離液（Ｂ）を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで混
合比を変化させながら、順次カラムに通液し、２５４ｎ
ｍの吸光度を指標として異性体を分離した。その結果、
図４に示したように４本のピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が
得られた。
固相自動合成とＥｔ2 ＮＣ（Ｓ）ＳＳＣ（Ｓ）ＮＥｔ2
によるイオウ原子の導入を組み合わせて、配列番号１記
載の塩基配列を有する５量体ＯＰＴ型オリゴヌクレオチ
ドを合成した。この合成オリゴヌクレオチドを、５′末
端の保護基（ＤＭＴｒ基）を結合した状態で市販の逆相
クロマトグラフィーカラム（４０℃）に注入し、０．１
Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）か
らなる溶離液（Ａ）と、等量の０．１Ｍ酢酸トリエチル
アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）およびアセトニトリ
ルからなる溶離液（Ｂ）を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで混
合比を変化させながら、順次カラムに通液し、２５４ｎ
ｍの吸光度を指標として異性体を分離した。その結果、
図４に示したように４本のピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が
得られた。
【００２０】次いで、この４本のピークを分取し、それ
ぞれの５末端保護基を外したのち、上記と同様の逆相ク
ロマトグラフィー法により再度異性体を分離した。その
結果、図５に示したようにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各画分から
各々４本のピークが検出され、さらにこれら１６本のピ
ークについて分析した結果、各ピークが図５に示したＲ
／Ｓ異性体にそれぞれ対応することを確認した。
ぞれの５末端保護基を外したのち、上記と同様の逆相ク
ロマトグラフィー法により再度異性体を分離した。その
結果、図５に示したようにＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各画分から
各々４本のピークが検出され、さらにこれら１６本のピ
ークについて分析した結果、各ピークが図５に示したＲ
／Ｓ異性体にそれぞれ対応することを確認した。
【００２１】さらに、これら１６本のピークからそれぞ
れ異性体を分取し、５′末端をリン酸化したのち４個毎
に任意の組み合わせでＴ４ライゲース結合して４種類の
ＯＴＰ型オリゴヌクレオチドを作製した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列を反復する２
０量体（２０塩基）で、それぞれリン酸結合部位におけ
る絶体配置（Ｒ／Ｓ）が任意に設計されている。
れ異性体を分取し、５′末端をリン酸化したのち４個毎
に任意の組み合わせでＴ４ライゲース結合して４種類の
ＯＴＰ型オリゴヌクレオチドを作製した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列を反復する２
０量体（２０塩基）で、それぞれリン酸結合部位におけ
る絶体配置（Ｒ／Ｓ）が任意に設計されている。
【００２２】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、所望の分子量と、所望の塩基配列、および所望の
絶体配置を有するＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを簡便か
つ計画的に作製することが可能となる。これによってＯ
ＰＴ型オリゴヌクレオチドのアンチセンス分子としての
有用性が一層拡大し、ガンや難治性ウイルス疾患に対す
る新たな治療法、治療薬の開発が促進される。
って、所望の分子量と、所望の塩基配列、および所望の
絶体配置を有するＯＰＴ型オリゴヌクレオチドを簡便か
つ計画的に作製することが可能となる。これによってＯ
ＰＴ型オリゴヌクレオチドのアンチセンス分子としての
有用性が一層拡大し、ガンや難治性ウイルス疾患に対す
る新たな治療法、治療薬の開発が促進される。
【００２３】
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＣＡＴＣＧ
【図１】アンチセンス法の基本原理を例示した模式図で
ある。
ある。
【図２】各々、ＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの異性体を
例示した構造図である。
例示した構造図である。
【図３】自動合成によるＯＰＴ型オリゴヌクレオチドの
合成例を例示した模式図である。
合成例を例示した模式図である。
【図４】この発明方法における第１段階の異性体分離結
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。
【図５】この発明方法における第２段階の異性体分離結
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。
果を例示した吸光度（２５４ｎｍ）グラフである。
Claims (5)
- 【請求項１】 所望の塩基配列と絶体配置とを有するホ
スホロチオエート型オリゴヌクレオチドの製造法であっ
て、 （１）任意の塩基配列を有するホスホロチオエート型オ
リゴヌクレオチドを化学合成し、 （２）逆相クロマトグラフィー法によって、上記合成オ
リゴヌクレオチドを５′末端保護のまま分離してホスホ
ロチオエート型オリゴヌクレオチドの各立体異性体集合
を分取し、 （３）これらの立体異性体集合を、５′末端脱保護のの
ち、逆相クロマトグラフィー法によってさらに分離して
各々の立体異性体を分取し、 （４）得られた立体異性体のなかから、所望の絶体配置
を有するホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを選
択し、それらの５′末端をリン酸化して結合する、こと
を特徴とするオリゴヌクレオチドの製造法。 - 【請求項２】 請求項１の（１）において化学合成した
ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドが、３〜８量
体であるオリゴヌクレオチドの製造法。 - 【請求項３】 請求項１の（２）および（３）の逆相ク
ロマトグラフィー法に用いる溶離液が、酢酸アンモニウ
ムおよび／または酢酸トリエチルアンモニウム水溶液を
主成分とするオリゴヌクレオチドの製造法。 - 【請求項４】 請求項１の（４）におけるホスホロチオ
エート型オリゴヌクレオチドの結合を、酵素的方法また
は化学的方法により行うオリゴヌクレオチドの製造法。 - 【請求項５】 請求項１の（４）において結合されたホ
スホロチオエート型オリゴヌクレオチドが、１０−３０
量体であるオリゴヌクレオチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31855493A JPH07170981A (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | オリゴヌクレオチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31855493A JPH07170981A (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | オリゴヌクレオチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07170981A true JPH07170981A (ja) | 1995-07-11 |
Family
ID=18100433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31855493A Pending JPH07170981A (ja) | 1993-12-17 | 1993-12-17 | オリゴヌクレオチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07170981A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6265168B1 (en) | 1998-10-06 | 2001-07-24 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| US6642374B2 (en) | 1997-04-25 | 2003-11-04 | Transgenomic, Inc. | Process for separation of polynucleotide fragments |
| JPWO2021210409A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | ||
| JPWO2021210408A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | ||
| JPWO2023282120A1 (ja) * | 2021-07-06 | 2023-01-12 |
-
1993
- 1993-12-17 JP JP31855493A patent/JPH07170981A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6642374B2 (en) | 1997-04-25 | 2003-11-04 | Transgenomic, Inc. | Process for separation of polynucleotide fragments |
| US6419824B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-07-16 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| US6265168B1 (en) | 1998-10-06 | 2001-07-24 | Transgenomic, Inc. | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides |
| JPWO2021210409A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | ||
| WO2021210409A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | 核酸オリゴマーを含む組成物 |
| JPWO2021210408A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | ||
| WO2021210408A1 (ja) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | 住友化学株式会社 | 核酸オリゴマーの製造方法 |
| CN115362163A (zh) * | 2020-04-14 | 2022-11-18 | 住友化学株式会社 | 核酸寡聚物的制造方法 |
| US12540156B2 (en) | 2020-04-14 | 2026-02-03 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Method for producing nucleic acid oligomer |
| JPWO2023282120A1 (ja) * | 2021-07-06 | 2023-01-12 |
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