JPH0720127A - 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬 - Google Patents
各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ビタミンK依存性蛋白質の各種PIVKA(PIVKA-V
II、-IX、-X、-C、-S、-Z、Protein Induced by Vitami
n K Absence)の簡便な免疫化学的測定法の提供を目的と
する。 【構成】 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を固相化し
た、二抗体サンドイッチ法により、各種PIVKAを測定し
うることを確認した。さらにその方法に基づく各種PIVK
Aの測定試薬に関する。
II、-IX、-X、-C、-S、-Z、Protein Induced by Vitami
n K Absence)の簡便な免疫化学的測定法の提供を目的と
する。 【構成】 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を固相化し
た、二抗体サンドイッチ法により、各種PIVKAを測定し
うることを確認した。さらにその方法に基づく各種PIVK
Aの測定試薬に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体試料中の各種PIVK
Aの免疫化学的測定方法および測定試薬に関し、詳しく
は医学の分野で利用される測定方法および測定試薬に関
する。
Aの免疫化学的測定方法および測定試薬に関し、詳しく
は医学の分野で利用される測定方法および測定試薬に関
する。
【０００２】
【従来の技術】生体のビタミンＫ依存性血漿蛋白質とし
てプロトロンビン、第VII因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因
子、プロテインC、プロテインSおよびプロテインZがあ
る。これら蛋白質の生合成機構は、ビタミンKおよびカ
ルボキシラーゼの存在下で前駆蛋白質の約10個のグルタ
ミン酸残基のγ位がカルボキシル化され、活性体正常蛋
白質に変換され生理作用を発現する。このグルタミン酸
残基はＮ末端領域に存在しており、この領域をＧｌａ領
域という。生体内が、生理的、臨床的にビタミンKの不
足する状態、あるいはビタミンK拮抗剤の投与によって
ビタミンK作用が抑制された状態になると、グルタミン
酸残基のカルボキシル化の不完全なものが生成する。
てプロトロンビン、第VII因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因
子、プロテインC、プロテインSおよびプロテインZがあ
る。これら蛋白質の生合成機構は、ビタミンKおよびカ
ルボキシラーゼの存在下で前駆蛋白質の約10個のグルタ
ミン酸残基のγ位がカルボキシル化され、活性体正常蛋
白質に変換され生理作用を発現する。このグルタミン酸
残基はＮ末端領域に存在しており、この領域をＧｌａ領
域という。生体内が、生理的、臨床的にビタミンKの不
足する状態、あるいはビタミンK拮抗剤の投与によって
ビタミンK作用が抑制された状態になると、グルタミン
酸残基のカルボキシル化の不完全なものが生成する。
【０００３】PIVKAとは、このようなカルボキシル化が
不完全なビタミンK依存性血漿蛋白質の総称であってPro
tein Induced by Vitamin K Absence or Antagonistの
略称である。アミノ末端領域に存在する約10個のグルタ
ミン酸残基のうち、カルボキシル化されない残基数は一
定しておらず、一種の蛋白質で数種類のPIVKAが混在し
た状態で存在している。また、PIVKAとは正常のビタミ
ンK依存性血漿蛋白質のγ−カルボキシグルタミン酸残
基の脱カルボキシ体であるということもできる。上記ビ
タミンK依存性蛋白質のPIVKAは、それぞれ順番にPIVKA-
II、PIVKA-VII、PIVKA-IX、PIVKA-X、PIVKA-C、PIVKA-S
およびPIVKA-Zという。上記PIVKA-IIは、プロトロンビ
ンのPIVKAである。
不完全なビタミンK依存性血漿蛋白質の総称であってPro
tein Induced by Vitamin K Absence or Antagonistの
略称である。アミノ末端領域に存在する約10個のグルタ
ミン酸残基のうち、カルボキシル化されない残基数は一
定しておらず、一種の蛋白質で数種類のPIVKAが混在し
た状態で存在している。また、PIVKAとは正常のビタミ
ンK依存性血漿蛋白質のγ−カルボキシグルタミン酸残
基の脱カルボキシ体であるということもできる。上記ビ
タミンK依存性蛋白質のPIVKAは、それぞれ順番にPIVKA-
II、PIVKA-VII、PIVKA-IX、PIVKA-X、PIVKA-C、PIVKA-S
およびPIVKA-Zという。上記PIVKA-IIは、プロトロンビ
ンのPIVKAである。
【０００４】各種PIVKA測定の臨床的な有用性について
は、ビタミンKの不足状態あるいは抑制状態において当
該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果PIVKA
が血液中に出現するので、ビタミンKの不足状態あるい
は抑制状態のマーカーとしてその測定は臨床上重要であ
る。また最近では、肝細胞癌に伴って血液中に各種のPI
VKAが出現することが見いだされ、従来肝細胞癌の良い
マーカーとされているα−フェトプロテインが陰性の肝
細胞癌患者においてもPIVKA-IIが高頻度に出現すること
により、α−フェトプロテインと同等の臨床的な有用性
が認められている。各種PIVKAとビタミンKおよび肝細胞
癌との関連について参考のために下記文献1)から4)を列
挙する。
は、ビタミンKの不足状態あるいは抑制状態において当
該γ−カルボキシル化が不完全となり、その結果PIVKA
が血液中に出現するので、ビタミンKの不足状態あるい
は抑制状態のマーカーとしてその測定は臨床上重要であ
る。また最近では、肝細胞癌に伴って血液中に各種のPI
VKAが出現することが見いだされ、従来肝細胞癌の良い
マーカーとされているα−フェトプロテインが陰性の肝
細胞癌患者においてもPIVKA-IIが高頻度に出現すること
により、α−フェトプロテインと同等の臨床的な有用性
が認められている。各種PIVKAとビタミンKおよび肝細胞
癌との関連について参考のために下記文献1)から4)を列
挙する。
【０００５】 1)Motohara K. Kuroki Y. Kan H. Endo F. Mtsuda I. Detection of vitamin K deficiency by use of an enz
yme-linked immunosorbent assay for circulating abn
ormal prothrombin. Pediatric Research.1985;19:354-
7 2)Okuda H. Obata H. Nakanishi T. Furukawa R. Hashi
moto E. Production of abnormal prothrombin (des-γ-carboxy
prothrombin) by hepatocellular carcinoma.Journal
Hepatology. 1987;4:357-63 3)Yoshikawa Y. Sakata Y. Toda G. Oka H. The acquired vitamin K-dependent γ-carboxylation
deficiency in hepato cellular carcionama involves
not only prothrombin, but also proteinC. Hepatolo
gy. 1988;8:524-530 4)古川みどり、中西敏己、奥田博明、小幡裕、鈴木宏
治、西岡淳二 肝細胞癌における各種PIVKAの産生に関する検討 肝臓．1990;31:110。
yme-linked immunosorbent assay for circulating abn
ormal prothrombin. Pediatric Research.1985;19:354-
7 2)Okuda H. Obata H. Nakanishi T. Furukawa R. Hashi
moto E. Production of abnormal prothrombin (des-γ-carboxy
prothrombin) by hepatocellular carcinoma.Journal
Hepatology. 1987;4:357-63 3)Yoshikawa Y. Sakata Y. Toda G. Oka H. The acquired vitamin K-dependent γ-carboxylation
deficiency in hepato cellular carcionama involves
not only prothrombin, but also proteinC. Hepatolo
gy. 1988;8:524-530 4)古川みどり、中西敏己、奥田博明、小幡裕、鈴木宏
治、西岡淳二 肝細胞癌における各種PIVKAの産生に関する検討 肝臓．1990;31:110。
【０００６】これまで各種PIVKAの測定方法がいくつか
報告されている。PIVKA-IIの測定方法としては、ポリク
ローナルな抗PIVKA-II抗体を使用した競合ラジオイムノ
アッセイ法(Blanchard R. et al. Acquired vitamin K-
dependent carboxylation deficiency in liver diseas
e. The New England Journal of Medicine. 1981;305:2
42-8)、あるいは正常プロトロンビンを吸収後、残存す
るPIVKA-IIのトロンビン活性を測定する方法(Soulier
J. et al. A new method to assay des-γ-carboxyprot
hrombin. Gastroenterology. 1986;91:1258-62)などが
報告されている。またPIVKA-II以外のPIVKA-IX、PIVKA-
C、PIVKA-SおよびPIVKA-Zの測定に関しては、塩化バリ
ウムを生物学的試料に添加しこれらPIVKAの正常蛋白質
を沈殿させた後、上清を検体として使用しポリクローナ
ルな抗第IX因子抗体、抗プロテインＣ抗体、抗プロテイ
ンＳ抗体および抗プロテインＺ抗体を使用したサンドイ
ッチEIA法により測定する方法が報告されいてる（古川
みどり 他．肝細胞癌における各種PIVKAの産生に関す
る検討．肝臓．1990;31:110)。また、PIVKA-Cの測定に
関しては、吉川ら(Yoshikawa Y. et al. The acquired
vitamin K-dependent γ-carboxylation deficiency in
hepatocellular carcinoma involves not onlyprothro
mbin, but also protein C. Hepatology. 1988;8:524-5
30)が、正常プロテインCにのみ反応しPIVKA-Cとは反応
しないモノクローナル抗体を使用して総プロテインC量
に対する正常プロテインC量の比を算出し、その比が小
さければ小さい程PIVKA-Cの量が多いことを利用してPIV
KA-Cの定量を行っている。
報告されている。PIVKA-IIの測定方法としては、ポリク
ローナルな抗PIVKA-II抗体を使用した競合ラジオイムノ
アッセイ法(Blanchard R. et al. Acquired vitamin K-
dependent carboxylation deficiency in liver diseas
e. The New England Journal of Medicine. 1981;305:2
42-8)、あるいは正常プロトロンビンを吸収後、残存す
るPIVKA-IIのトロンビン活性を測定する方法(Soulier
J. et al. A new method to assay des-γ-carboxyprot
hrombin. Gastroenterology. 1986;91:1258-62)などが
報告されている。またPIVKA-II以外のPIVKA-IX、PIVKA-
C、PIVKA-SおよびPIVKA-Zの測定に関しては、塩化バリ
ウムを生物学的試料に添加しこれらPIVKAの正常蛋白質
を沈殿させた後、上清を検体として使用しポリクローナ
ルな抗第IX因子抗体、抗プロテインＣ抗体、抗プロテイ
ンＳ抗体および抗プロテインＺ抗体を使用したサンドイ
ッチEIA法により測定する方法が報告されいてる（古川
みどり 他．肝細胞癌における各種PIVKAの産生に関す
る検討．肝臓．1990;31:110)。また、PIVKA-Cの測定に
関しては、吉川ら(Yoshikawa Y. et al. The acquired
vitamin K-dependent γ-carboxylation deficiency in
hepatocellular carcinoma involves not onlyprothro
mbin, but also protein C. Hepatology. 1988;8:524-5
30)が、正常プロテインCにのみ反応しPIVKA-Cとは反応
しないモノクローナル抗体を使用して総プロテインC量
に対する正常プロテインC量の比を算出し、その比が小
さければ小さい程PIVKA-Cの量が多いことを利用してPIV
KA-Cの定量を行っている。
【０００７】しかしながら、以上の報告例で明らかなよ
うに、いずれも生物学的試料の前処理を必要としたり、
測定に使用する抗体材料の調製が繁雑であったり、測定
系が複雑であったりして多数の臨床検体を扱う臨床検査
の場においては実用的ではない。
うに、いずれも生物学的試料の前処理を必要としたり、
測定に使用する抗体材料の調製が繁雑であったり、測定
系が複雑であったりして多数の臨床検体を扱う臨床検査
の場においては実用的ではない。
【０００８】一方これらの方法に対して、抗PIVKA-IIモ
ノクローナル抗体を使用した特異的なPIVKA-II測定方法
（特開昭60-60557号）は非常に簡便であり、しかも正確
に多数の検体が測定できるという特徴を持っており、現
在その方法を使用した測定試薬が唯一のPIVKA-II測定診
断薬として広く利用されている。特開昭60-60557号の抗
PIVKA-IIモノクローナル抗体ＭＵ−３は、ビタミンK拮
抗剤投与者の血漿中からPIVKA-IIを精製し、それを免疫
用抗原としてマウスに免疫してPIVKA-IIに対するモノク
ローナル抗体を作製している。これと同一の方法で、ビ
タミンK拮抗剤投与者の血漿中からPIVKA-II以外の各種P
IVKAを精製し、それを免疫用抗原としてマウスに免疫し
て各種PIVKAに対するモノクローナル抗体を作製するこ
とは理論的には可能である。
ノクローナル抗体を使用した特異的なPIVKA-II測定方法
（特開昭60-60557号）は非常に簡便であり、しかも正確
に多数の検体が測定できるという特徴を持っており、現
在その方法を使用した測定試薬が唯一のPIVKA-II測定診
断薬として広く利用されている。特開昭60-60557号の抗
PIVKA-IIモノクローナル抗体ＭＵ−３は、ビタミンK拮
抗剤投与者の血漿中からPIVKA-IIを精製し、それを免疫
用抗原としてマウスに免疫してPIVKA-IIに対するモノク
ローナル抗体を作製している。これと同一の方法で、ビ
タミンK拮抗剤投与者の血漿中からPIVKA-II以外の各種P
IVKAを精製し、それを免疫用抗原としてマウスに免疫し
て各種PIVKAに対するモノクローナル抗体を作製するこ
とは理論的には可能である。
【０００９】しかしながら、実際上PIVKA-II以外の各種
PIVKAは、ビタミンK拮抗剤投与者の血漿中に非常に微量
しか含まれていないので、これを用いてモノクローナル
抗体を作製するには大量の血漿を必要とし、それらの精
製が非常に困難である。
PIVKAは、ビタミンK拮抗剤投与者の血漿中に非常に微量
しか含まれていないので、これを用いてモノクローナル
抗体を作製するには大量の血漿を必要とし、それらの精
製が非常に困難である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】以上の如く、各種PIVK
Aの実用的な精度のよい測定法はPIVKA-IIしか確立され
ておらず、研究および臨床の場において他のPIVKAに関
しても有効な測定法の確立が強く望まれている。本願発
明はPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-S、および-Zの簡便で正
確な免疫化学的測定法を確立し、肝細胞機能、病理の診
断試薬への応用を目的とする。
Aの実用的な精度のよい測定法はPIVKA-IIしか確立され
ておらず、研究および臨床の場において他のPIVKAに関
しても有効な測定法の確立が強く望まれている。本願発
明はPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-S、および-Zの簡便で正
確な免疫化学的測定法を確立し、肝細胞機能、病理の診
断試薬への応用を目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは特開昭60-6
0557号公報で開示された抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
ＭＵ−３のエピトープ部位を研究した。すなわち、PIVK
A-IIのGla領域アミノ酸配列をもとに種々の長さのペプ
チドフラグメントを合成し、これら合成ペプチドに対す
る該モノクローナル抗体の結合能を検討した結果、プロ
トロンビンのアミノ酸配列13〜23位のデカルボキシルペ
プチドをエピトープ部位とする抗体であることを見いだ
した。ビタミンK依存性血漿蛋白質のGla領域のアミノ酸
配列を比較すると、表１に示す如く相同性を有してお
り、特に13〜21位アミノ酸配列はかなり高い相同性を有
することが判明した。このことから他のPIVKAもこの抗P
IVKA-IIモノクローナル抗体と反応性を有する可能性が
あり、該モノクローナル抗体を用いることにより各種PI
VKAと個々に、または全PIVKA量を測定することができる
のではないかと考え鋭意研究の結果、該モノクローナル
抗体はPIVKA-VII、-IX、-X、-Cなどに対しても予想外に
強い結合能を有することを初めて見いだし本発明を完成
するに到った。
0557号公報で開示された抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
ＭＵ−３のエピトープ部位を研究した。すなわち、PIVK
A-IIのGla領域アミノ酸配列をもとに種々の長さのペプ
チドフラグメントを合成し、これら合成ペプチドに対す
る該モノクローナル抗体の結合能を検討した結果、プロ
トロンビンのアミノ酸配列13〜23位のデカルボキシルペ
プチドをエピトープ部位とする抗体であることを見いだ
した。ビタミンK依存性血漿蛋白質のGla領域のアミノ酸
配列を比較すると、表１に示す如く相同性を有してお
り、特に13〜21位アミノ酸配列はかなり高い相同性を有
することが判明した。このことから他のPIVKAもこの抗P
IVKA-IIモノクローナル抗体と反応性を有する可能性が
あり、該モノクローナル抗体を用いることにより各種PI
VKAと個々に、または全PIVKA量を測定することができる
のではないかと考え鋭意研究の結果、該モノクローナル
抗体はPIVKA-VII、-IX、-X、-Cなどに対しても予想外に
強い結合能を有することを初めて見いだし本発明を完成
するに到った。
【００１２】
【表１】
【００１３】本発明は抗PIVKA-IIモノクロ−ナル抗体を
用いることによりすべての各種PIVKAを測定しうる免疫
化学的測定方法および測定試薬に関するものである。す
なわち本発明は、 （１）生体試料中のPIVKAを免疫化学的測定法で測定す
る方法であって、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用
することを特徴とするPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-Sまた
は-Zの各種PIVKAの測定方法 （２）抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を固相化抗体とし
て使用する二抗体サンドイッチ法を用いる、上記（１）
記載の各種PIVKAの測定方法 （３）各種PIVKAがPIVKA-Xである、上記（１）記載の各
種PIVKAの測定方法 （４）抗PIVKA-IIモノクローナル抗体がＭＵ−３であ
る、上記（１）記載の各種PIVKAの測定方法 （５）およびこれらの方法を用いる各種PIVKAの測定試
薬である。
用いることによりすべての各種PIVKAを測定しうる免疫
化学的測定方法および測定試薬に関するものである。す
なわち本発明は、 （１）生体試料中のPIVKAを免疫化学的測定法で測定す
る方法であって、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を使用
することを特徴とするPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-Sまた
は-Zの各種PIVKAの測定方法 （２）抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を固相化抗体とし
て使用する二抗体サンドイッチ法を用いる、上記（１）
記載の各種PIVKAの測定方法 （３）各種PIVKAがPIVKA-Xである、上記（１）記載の各
種PIVKAの測定方法 （４）抗PIVKA-IIモノクローナル抗体がＭＵ−３であ
る、上記（１）記載の各種PIVKAの測定方法 （５）およびこれらの方法を用いる各種PIVKAの測定試
薬である。
【００１４】以下に本発明を詳細に説明する。使用する
抗PIVKA-IIモノクロナ−ル抗体は、特開昭60-60557号記
載のＭＵ−３が好ましいが、その作製方法は下記のよう
に行うことにより作製することができる。モノクローナ
ル抗体の作製のための免疫用抗原であるPIVKA-IIの精製
は、ビタミンK拮抗剤投与者の血漿を硫安塩析、DEAE-Se
phacel、Heparin-Sepharose、Blue-Sepharose、Ultroge
n AcA44のゲル濾過およびプロトロンビンアフィニティ
ーカラム法にて精製して調製すればよく、他のPIVKAも
常法に準じればよい。抗PIVKAモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマ細胞の作製は、精製PIVKAをマウスに免
疫しその脾臓細胞を採取し、Koehler G.等の方法(Koehl
er G. MilsteinC. Deviation of specific antibody-pr
oducting culture and tumor lines bycell fusion. Eu
r. J. Immunol. 1976;6:511-9)によりミエローマ細胞株
P3U1と細胞融合、クローニングを行い、正常蛋白質とは
反応せずに免疫用抗原であるPIVKAと反応し、さらに各
種PIVKAとも反応する抗PIVKA抗体産生ハイブリドーマ細
胞株（以下この細胞株の産生する抗体を抗PIVKAモノク
ローナル抗体と称する）を分離する。抗PIVKA抗体産生
ハイブリドーマ細胞株をマウスに投与し、腹水を得た
後、腹水よりProtein AにてIgGを精製することができ
る。
抗PIVKA-IIモノクロナ−ル抗体は、特開昭60-60557号記
載のＭＵ−３が好ましいが、その作製方法は下記のよう
に行うことにより作製することができる。モノクローナ
ル抗体の作製のための免疫用抗原であるPIVKA-IIの精製
は、ビタミンK拮抗剤投与者の血漿を硫安塩析、DEAE-Se
phacel、Heparin-Sepharose、Blue-Sepharose、Ultroge
n AcA44のゲル濾過およびプロトロンビンアフィニティ
ーカラム法にて精製して調製すればよく、他のPIVKAも
常法に準じればよい。抗PIVKAモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマ細胞の作製は、精製PIVKAをマウスに免
疫しその脾臓細胞を採取し、Koehler G.等の方法(Koehl
er G. MilsteinC. Deviation of specific antibody-pr
oducting culture and tumor lines bycell fusion. Eu
r. J. Immunol. 1976;6:511-9)によりミエローマ細胞株
P3U1と細胞融合、クローニングを行い、正常蛋白質とは
反応せずに免疫用抗原であるPIVKAと反応し、さらに各
種PIVKAとも反応する抗PIVKA抗体産生ハイブリドーマ細
胞株（以下この細胞株の産生する抗体を抗PIVKAモノク
ローナル抗体と称する）を分離する。抗PIVKA抗体産生
ハイブリドーマ細胞株をマウスに投与し、腹水を得た
後、腹水よりProtein AにてIgGを精製することができ
る。
【００１５】本発明の各種PIVKAの測定方法は競合法、
二抗体サンドイッチ法、凝集法などの免疫化学的手法に
より行うことができるが、好ましくは二抗体サンドイッ
チ法が挙げられる。この方法を用いる場合は、いわゆる
第一抗体として固相化抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を
使用し、第二抗体として測定目的の各PIVKAの正常蛋白
質に対するする抗体を標識して使用すればよい。すなわ
ちPIVKA-VIIの測定の場合にはPIVKA-VIIと第VII因子の
共通抗原に対する抗体である抗第VII因子抗体を、PIVKA
-IXの測定の場合にはPIVKA-IXと第IX因子の共通抗原に
対する抗体である抗第IX因子抗体を、PIVKA-Xの測定の
場合にはPIVKA-Xと第X因子の共通抗原に対する抗体であ
る抗第X因子抗体を、PIVKA-Cの測定の場合にはPIVKA-C
とプロテインCの共通抗原に対する抗体である抗プロテ
インC抗体を、PIVKA-S測定の場合にはPIVKA-Sとプロテ
インSの共通抗原に対する抗体である抗プロテインS抗体
を、PIVKA-Z測定の場合にはPIVKA-ZとプロテインZの共
通抗原に対する抗体である抗プロテインZ抗体を使用す
ることにより生体試料中の各種PIVKAを測定することが
できる。さらに第二抗体として、上記各種PIVKA用第二
抗体混合物を用いれば、生体試料中の全PIVKA量の測定
も可能である。用いる第二抗体はポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体いずれを使用してもよく、さらにこ
のPIVKA測定系に用いる抗体は抗体断片F(ab')2またはFa
bを使用することもできる。第二抗体を標識する標識物
質としては蛍光物質、放射性物質、化学発光物質、生物
発光物質、電気化学発光物質、色素、酵素など定量可能
な物質であればいずれの物質でも使用することができ
る。第一抗体を固相化した場合の固相化担体としてはマ
イクロタイタープレート、プラスチックビーズ、磁気ビ
ーズ、赤血球、ゼラチン粒子など常用される担体はいず
れも使用しうる。
二抗体サンドイッチ法、凝集法などの免疫化学的手法に
より行うことができるが、好ましくは二抗体サンドイッ
チ法が挙げられる。この方法を用いる場合は、いわゆる
第一抗体として固相化抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を
使用し、第二抗体として測定目的の各PIVKAの正常蛋白
質に対するする抗体を標識して使用すればよい。すなわ
ちPIVKA-VIIの測定の場合にはPIVKA-VIIと第VII因子の
共通抗原に対する抗体である抗第VII因子抗体を、PIVKA
-IXの測定の場合にはPIVKA-IXと第IX因子の共通抗原に
対する抗体である抗第IX因子抗体を、PIVKA-Xの測定の
場合にはPIVKA-Xと第X因子の共通抗原に対する抗体であ
る抗第X因子抗体を、PIVKA-Cの測定の場合にはPIVKA-C
とプロテインCの共通抗原に対する抗体である抗プロテ
インC抗体を、PIVKA-S測定の場合にはPIVKA-Sとプロテ
インSの共通抗原に対する抗体である抗プロテインS抗体
を、PIVKA-Z測定の場合にはPIVKA-ZとプロテインZの共
通抗原に対する抗体である抗プロテインZ抗体を使用す
ることにより生体試料中の各種PIVKAを測定することが
できる。さらに第二抗体として、上記各種PIVKA用第二
抗体混合物を用いれば、生体試料中の全PIVKA量の測定
も可能である。用いる第二抗体はポリクローナル抗体、
モノクローナル抗体いずれを使用してもよく、さらにこ
のPIVKA測定系に用いる抗体は抗体断片F(ab')2またはFa
bを使用することもできる。第二抗体を標識する標識物
質としては蛍光物質、放射性物質、化学発光物質、生物
発光物質、電気化学発光物質、色素、酵素など定量可能
な物質であればいずれの物質でも使用することができ
る。第一抗体を固相化した場合の固相化担体としてはマ
イクロタイタープレート、プラスチックビーズ、磁気ビ
ーズ、赤血球、ゼラチン粒子など常用される担体はいず
れも使用しうる。
【００１６】次に本発明における一例として二抗体サン
ドイッチ法を利用する測定法は例えば次のように実施さ
れる。なお、ここでは酵素免疫測定法の場合を示すが、
ラジオイムノアッセイ法あるいはその他の方法において
も本発明が使用できることは言うまでもない。本発明測
定試薬の具体的態様を示せば次の如くになる。すなわ
ち、本発明測定試薬は、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
を必須の構成成分とし、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
（単独または固相化したもの）、標準抗原、酵素及び基
質よりなる群より任意に選択したものを組み合わせたも
ののセットである。ここにおいて、セット中に固相が含
まれる場合に当該固相が抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
によってコートされた状態で提供されること、あるいは
セット中に抗ヒトプロトロンビン抗体、抗第VII因子抗
体、抗第IX因子抗体、抗第X因子抗体、抗プロテインC抗
体、抗プロティンS抗体、抗プロテインZ抗体などの一部
と酵素とが含まれる場合に、両者がコンジュゲートした
状態で提供されることは自由であり、これらも同様に本
発明測定試薬の態様に含まれる。また測定の実施の便益
のために適当なる抗原希釈液、反応希釈液、基質溶解
液、反応停止液等がセット中に添付されることも自由で
あり、これらは本発明を限定するものではない。
ドイッチ法を利用する測定法は例えば次のように実施さ
れる。なお、ここでは酵素免疫測定法の場合を示すが、
ラジオイムノアッセイ法あるいはその他の方法において
も本発明が使用できることは言うまでもない。本発明測
定試薬の具体的態様を示せば次の如くになる。すなわ
ち、本発明測定試薬は、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
を必須の構成成分とし、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
（単独または固相化したもの）、標準抗原、酵素及び基
質よりなる群より任意に選択したものを組み合わせたも
ののセットである。ここにおいて、セット中に固相が含
まれる場合に当該固相が抗PIVKA-IIモノクローナル抗体
によってコートされた状態で提供されること、あるいは
セット中に抗ヒトプロトロンビン抗体、抗第VII因子抗
体、抗第IX因子抗体、抗第X因子抗体、抗プロテインC抗
体、抗プロティンS抗体、抗プロテインZ抗体などの一部
と酵素とが含まれる場合に、両者がコンジュゲートした
状態で提供されることは自由であり、これらも同様に本
発明測定試薬の態様に含まれる。また測定の実施の便益
のために適当なる抗原希釈液、反応希釈液、基質溶解
液、反応停止液等がセット中に添付されることも自由で
あり、これらは本発明を限定するものではない。
【００１７】測定は、まず抗PIVKA-IIモノクローナル抗
体コート固相体に標準抗原または被検生体試料を加えて
反応させる。固相体を洗浄後、PIVKA-II測定の場合には
PIVKA-IIとプロトロンビンの共通抗原に対する抗体であ
る抗プロトロンビン抗体に酵素を標識した複合体を第二
抗体として添加し、PIVKA-VIIの測定の場合にはPIVKA-V
IIと第VII因子の共通抗原に対する抗体である抗第VII因
子抗体の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-IXの測定の場
合にはPIVKA-IXと第IX因子の共通抗原に対する抗体であ
る抗第IX因子抗体の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-X
の測定の場合にはPIVKA-Xと第X因子の共通抗原に対する
抗体である抗第X因子抗体の酵素標識複合体を添加し、P
IVKA-Cの測定の場合にはPIVKA-CとプロテインCの共通抗
原に対する抗体である抗プロテインC抗体の酵素標識複
合体を添加し、PIVKA-S測定の場合にはPIVKA-Sとプロテ
インSの共通抗原に対する抗体である抗プロテインS抗体
の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-Z測定の場合にはPIV
KA-ZとプロテインZの共通抗原に対する抗体である抗プ
ロテインZ抗体の酵素標識複合体を加えて再び反応させ
る。次に、固相体を洗浄し、最後に基質を加えて反応
後、基質の分解量を分光光度計を用いて測定する。後記
実施例によって示されるごとく、本発明測定試薬によっ
てはじめて簡便且つ正確な各種PIVKAの測定が可能とな
る。
体コート固相体に標準抗原または被検生体試料を加えて
反応させる。固相体を洗浄後、PIVKA-II測定の場合には
PIVKA-IIとプロトロンビンの共通抗原に対する抗体であ
る抗プロトロンビン抗体に酵素を標識した複合体を第二
抗体として添加し、PIVKA-VIIの測定の場合にはPIVKA-V
IIと第VII因子の共通抗原に対する抗体である抗第VII因
子抗体の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-IXの測定の場
合にはPIVKA-IXと第IX因子の共通抗原に対する抗体であ
る抗第IX因子抗体の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-X
の測定の場合にはPIVKA-Xと第X因子の共通抗原に対する
抗体である抗第X因子抗体の酵素標識複合体を添加し、P
IVKA-Cの測定の場合にはPIVKA-CとプロテインCの共通抗
原に対する抗体である抗プロテインC抗体の酵素標識複
合体を添加し、PIVKA-S測定の場合にはPIVKA-Sとプロテ
インSの共通抗原に対する抗体である抗プロテインS抗体
の酵素標識複合体を添加し、PIVKA-Z測定の場合にはPIV
KA-ZとプロテインZの共通抗原に対する抗体である抗プ
ロテインZ抗体の酵素標識複合体を加えて再び反応させ
る。次に、固相体を洗浄し、最後に基質を加えて反応
後、基質の分解量を分光光度計を用いて測定する。後記
実施例によって示されるごとく、本発明測定試薬によっ
てはじめて簡便且つ正確な各種PIVKAの測定が可能とな
る。
【００１８】
【発明の効果】本発明の各種PIVKAの測定方法および測
定試薬にあっては、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を用
いることにより、各種PIVKAを簡便且つ正確に測定する
ことを可能にした。
定試薬にあっては、抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を用
いることにより、各種PIVKAを簡便且つ正確に測定する
ことを可能にした。
【００１９】
【実施例】以下に記載する実施例により本発明を更に具
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。 実施例１ PIVKA-IIの精製 ビタミンK拮抗剤投与者の血漿に4M飽和硫安を等量加え2
時間攪拌後遠心分離した。沈殿物を0.1Mリン酸緩衝液で
溶解し透析した。DEAE-Sephacelにて0M〜0.6MNaCl分画
を行い、PIVKA-II画分を集め透析後Heparin-Sepharose
およびBlue-Sepharoseに通した。Ultrogel AcA44にてゲ
ル濾過および抗プロトロンビンアフィニティーカラムで
PIVKA-IIを精製した。
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。 実施例１ PIVKA-IIの精製 ビタミンK拮抗剤投与者の血漿に4M飽和硫安を等量加え2
時間攪拌後遠心分離した。沈殿物を0.1Mリン酸緩衝液で
溶解し透析した。DEAE-Sephacelにて0M〜0.6MNaCl分画
を行い、PIVKA-II画分を集め透析後Heparin-Sepharose
およびBlue-Sepharoseに通した。Ultrogel AcA44にてゲ
ル濾過および抗プロトロンビンアフィニティーカラムで
PIVKA-IIを精製した。
【００２０】実施例２ 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞
株の確立 精製PIVKA-IIをマウスに12.5μg/匹で5回免疫をし、そ
の脾臓細胞を採取してKoehler G.等の方法(Koehler G.M
ilstein C. Deviation of specific antibody-producti
ng culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J.
Immunol. 1976;6:511-9)によりミエローマ細胞株P3U1
と細胞融合し、限界希釈法により3回クローニングを行
い、プロトロンビンと反応せず免疫用抗原であるPIVKA-
IIと反応し、さらに各種PIVKAと反応するモノクローナ
ル抗体を産生する細胞株を抗PIVKAモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ細胞株ＭＵ−３として確立した。
株の確立 精製PIVKA-IIをマウスに12.5μg/匹で5回免疫をし、そ
の脾臓細胞を採取してKoehler G.等の方法(Koehler G.M
ilstein C. Deviation of specific antibody-producti
ng culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J.
Immunol. 1976;6:511-9)によりミエローマ細胞株P3U1
と細胞融合し、限界希釈法により3回クローニングを行
い、プロトロンビンと反応せず免疫用抗原であるPIVKA-
IIと反応し、さらに各種PIVKAと反応するモノクローナ
ル抗体を産生する細胞株を抗PIVKAモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ細胞株ＭＵ−３として確立した。
【００２１】実施例３ 測定法 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体をエンザイムイムノアッ
セイ用マイクロプレートへ固相化する方法は特開昭60-6
05575号記載の常法により行った。このようにして得ら
れた抗体PIVKA-IIモノクローナル抗体コート固相に、1
ウエル当り被検検体100μlを注入し、4℃で一夜間反応
させた。次に固相を0.05Mトリス−塩酸緩衝液pH7.5(0.0
5%Tween20)で3回洗浄後、PIVKA-II測定の場合には抗プ
ロトロンビン抗体に酸素を標識した酵素標識抗体を100
μl加え、PIVKA-VII測定の場合には抗第VII因子抗体の
酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-IX測定の場合には
抗第IX因子抗体の酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-
Xの測定の場合には抗第X因子抗体の酵素標識抗体を100
μl添加し、PIVKA-Cの測定の場合には抗プロテインC抗
体の酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-S測定の場合
には抗プロテインS抗体の酵素標識抗体を100μl添加
し、PIVKA-Z測定の場合には抗プロテインZ抗体の酵素標
識抗体を100μl加え、室温で1時間反応させた。次に固
相を0.05Mトリス−塩酸緩衝液pH7.5(0.05%Tween20)で3
回洗浄後、ABTS溶液100μlを加えて60分間室温で静置
し、2mMアジ化ナトリウム100μlを加えて反応を停止し
て分光光度計により波長405nmの吸光度を測定した。こ
の方法により測定したPIVKA-II及びPIVKA-Xの標準曲線
を図１に示す。
セイ用マイクロプレートへ固相化する方法は特開昭60-6
05575号記載の常法により行った。このようにして得ら
れた抗体PIVKA-IIモノクローナル抗体コート固相に、1
ウエル当り被検検体100μlを注入し、4℃で一夜間反応
させた。次に固相を0.05Mトリス−塩酸緩衝液pH7.5(0.0
5%Tween20)で3回洗浄後、PIVKA-II測定の場合には抗プ
ロトロンビン抗体に酸素を標識した酵素標識抗体を100
μl加え、PIVKA-VII測定の場合には抗第VII因子抗体の
酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-IX測定の場合には
抗第IX因子抗体の酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-
Xの測定の場合には抗第X因子抗体の酵素標識抗体を100
μl添加し、PIVKA-Cの測定の場合には抗プロテインC抗
体の酵素標識抗体を100μl添加し、PIVKA-S測定の場合
には抗プロテインS抗体の酵素標識抗体を100μl添加
し、PIVKA-Z測定の場合には抗プロテインZ抗体の酵素標
識抗体を100μl加え、室温で1時間反応させた。次に固
相を0.05Mトリス−塩酸緩衝液pH7.5(0.05%Tween20)で3
回洗浄後、ABTS溶液100μlを加えて60分間室温で静置
し、2mMアジ化ナトリウム100μlを加えて反応を停止し
て分光光度計により波長405nmの吸光度を測定した。こ
の方法により測定したPIVKA-II及びPIVKA-Xの標準曲線
を図１に示す。
【００２２】実施例４ 肝疾患患者および健常人検体中のPIVKA-IIおよびPIVKA-
Xの測定 肝疾患患者108人および健常人10人より得られた血漿あ
るいは血清を使用して、本発明の測定試薬によりPIVKA-
IIおよびPIVKA-Xを測定した。その結果を図-2に示す。
図２からも明らかなように本発明による測定試薬は、従
来の測定試薬で測定できなかったPIVKA-Xを測定するこ
とができ、陽性率は10.2％上昇した。
Xの測定 肝疾患患者108人および健常人10人より得られた血漿あ
るいは血清を使用して、本発明の測定試薬によりPIVKA-
IIおよびPIVKA-Xを測定した。その結果を図-2に示す。
図２からも明らかなように本発明による測定試薬は、従
来の測定試薬で測定できなかったPIVKA-Xを測定するこ
とができ、陽性率は10.2％上昇した。
【００２３】このように、第一抗体として抗PIVKA-IIモ
ノクローナル抗体を使用し、第二抗体である標識抗体を
変えるだけで各種PIVKAの測定が可能となり、従来では
測定できなかった早期の肝細胞癌で出現する各種PIVKA
を簡便かつ正確に測定しえることは肝細胞癌の診断上き
わめて有用である。
ノクローナル抗体を使用し、第二抗体である標識抗体を
変えるだけで各種PIVKAの測定が可能となり、従来では
測定できなかった早期の肝細胞癌で出現する各種PIVKA
を簡便かつ正確に測定しえることは肝細胞癌の診断上き
わめて有用である。
【図１】 本発明の方法によるPIVKA-IIおよびPIVKA-X
の標準曲線
の標準曲線
【図２】 肝疾患患者検体中のPIVKA-IIおよびPIVKA-X
の測定値
の測定値
Claims (7)
- 【請求項１】 生体試料中の各種PIVKAを免疫化学的測
定法で測定する方法であって、抗PIVKA-IIモノクローナ
ル抗体を使用することを特徴とするPIVKA-VII、-IX、-
X、-C、-Sまたは-Zの各種PIVKAの測定方法。 - 【請求項２】 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体を固相化
抗体として使用する二抗体サンドイッチ法を用いる請求
項１記載のPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-Sまたは-Zの各種
PIVKAの測定方法。 - 【請求項３】 各種PIVKAがPIVKA-Xである請求項１記載
の各種PIVKAの測定方法。 - 【請求項４】 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体がＭＵ−
３である請求項１、２または３記載のPIVKA-VII、-IX、
-X、-C、-Sまたは-Zの各種PIVKAの測定方法。 - 【請求項５】 生体試料中のPIVKAを免疫化学的測定法
で測定する試薬であって、抗PIVKA-IIモノクローナル抗
体を必須の構成成分とするPIVKA-VII、-IX、-X、-C、-S
または-Zの各種PIVKAの測定試薬。 - 【請求項６】 各種PIVKAがPIVKA-Xである請求項５記載
の各種PIVKAの測定試薬。 - 【請求項７】 抗PIVKA-IIモノクローナル抗体がＭＵ−
３である請求項５または６記載の各種PIVKAの測定試
薬。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6016348A JPH0720127A (ja) | 1993-05-07 | 1994-02-10 | 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬 |
| US08/229,280 US5516640A (en) | 1993-05-07 | 1994-04-18 | Method of determination of pivka |
| CA002121927A CA2121927A1 (en) | 1993-05-07 | 1994-04-22 | Method of determination of pivka of every kind and reagent therefor |
| KR1019940009432A KR0148619B1 (ko) | 1993-05-07 | 1994-04-30 | Pivka-x의 측정방법 및 측정시약 |
| EP94303274A EP0645630A3 (en) | 1993-05-07 | 1994-05-06 | Method for determining the presence of a pivka and reagent therefor. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-130015 | 1993-05-07 | ||
| JP13001593 | 1993-05-07 | ||
| JP6016348A JPH0720127A (ja) | 1993-05-07 | 1994-02-10 | 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0720127A true JPH0720127A (ja) | 1995-01-24 |
Family
ID=26352679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6016348A Pending JPH0720127A (ja) | 1993-05-07 | 1994-02-10 | 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5516640A (ja) |
| EP (1) | EP0645630A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0720127A (ja) |
| KR (1) | KR0148619B1 (ja) |
| CA (1) | CA2121927A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012161226A1 (ja) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | 積水メディカル株式会社 | Pivka-ii測定試薬における非特異反応の抑制方法 |
| JP2014035278A (ja) * | 2012-08-09 | 2014-02-24 | Fujirebio Inc | Ｐｉｖｋａ−ｉｉ測定方法、測定試薬及び測定キット |
| WO2021107105A1 (ja) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | 積水メディカル株式会社 | 免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6693075B1 (en) * | 1997-10-23 | 2004-02-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US6747003B1 (en) * | 1997-10-23 | 2004-06-08 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7247708B2 (en) * | 1997-10-23 | 2007-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| WO2001013123A2 (de) * | 1999-08-14 | 2001-02-22 | november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin | Verfahren zur indirekten bestimmung des blutgerinnungsstatus |
| EP1154273B1 (en) * | 1999-12-14 | 2006-02-15 | Sanko Junyaku Co., Ltd. | Method for immunologically assaying pivka-ii |
| DE60138364D1 (de) * | 2000-02-11 | 2009-05-28 | Bayer Healthcare Llc | Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate |
| SE0000675D0 (sv) | 2000-03-02 | 2000-03-02 | Protease Ab | Monoclonal antibodies |
| US7812132B2 (en) | 2000-04-28 | 2010-10-12 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US7220837B1 (en) | 2000-04-28 | 2007-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Modified vitamin K-dependent polypeptides |
| US20030211094A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-11-13 | Nelsestuen Gary L. | High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides |
| SI1499719T1 (sl) * | 2002-04-30 | 2011-03-31 | Bayer Healthcare Llc | Polipeptidne variante faktorja VII ali VIIa |
| AU2003266931B2 (en) * | 2002-09-30 | 2010-01-21 | Bayer Healthcare Llc | FVII or FVIIa variants having increased clotting activity |
| US20040176704A1 (en) * | 2003-03-04 | 2004-09-09 | Stevens Timothy A | Collection device adapted to accept cartridge for point of care system |
| DK1608745T3 (da) * | 2003-03-20 | 2009-06-15 | Bayer Healthcare Llc | FVII eller FVIIa-Varianter |
| KR100731693B1 (ko) * | 2003-04-23 | 2007-06-25 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 질환 예후 모델의 작성 방법, 이 모델을 이용한 질환 예후예측 방법, 이 모델에 의한 예후 예측 장치, 및 그의프로그램ㆍ기억 매체 |
| NZ573412A (en) * | 2003-06-19 | 2010-09-30 | Maxygen Holdings Ltd | Factor VII or VIIa Gla domain variants |
| FI119203B (fi) * | 2005-03-21 | 2008-08-29 | Juha Horsti | Menetelmä protrombiiniajan määrittämiseksi |
| US8283162B2 (en) * | 2009-03-10 | 2012-10-09 | Abbott Laboratories | Antibodies relating to PIVKAII and uses thereof |
| US9120862B2 (en) * | 2010-07-26 | 2015-09-01 | Abbott Laboratories | Antibodies relating to PIVKA-II and uses thereof |
| US10641768B2 (en) * | 2011-07-08 | 2020-05-05 | Abbott Japan Co. Ltd. | Methods and kits for decreasing interferences from leukocytes in specific binding assays |
| CN103837686A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-06-04 | 上海北加生化试剂有限公司 | 一种检测人免疫球蛋白g4的试剂盒及其制备方法 |
| JP6713478B2 (ja) * | 2015-10-07 | 2020-06-24 | 富士レビオ株式会社 | Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法、及びｐｉｖｋａ−ｉｉ免疫測定試薬又はキットの製造方法 |
| CN105510585A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-04-20 | 苏州市博力生物科技有限公司 | 人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4353982A (en) * | 1980-04-10 | 1982-10-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
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