JPH0720440B2 - ポリアルデヒド活性膜を使用するブロッティング法 - Google Patents

ポリアルデヒド活性膜を使用するブロッティング法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ポリアルデヒド活性微孔質膜を伴う巨大分子
転移、ゲル電気泳動、及びブロッティング法に関する。
アルデヒドは、基質、ビーズ、及び微小球の如き種々の
物質と組み合わせて使用されている高度に反応性の化合
物である。基質に於いて、或る種の膜は、酸化の如き方
法を使用してアルデヒド官能基で化学的に活性化されて
いた。
微孔質の膜は濾過の分野で有益であることが知られてい
る。濾材に関する微孔質の膜の伝統的な使用は、主とし
て、それらの物理的性質、例えば細孔サイズ、厚さ、強
度、等に基いていた。例えば、マイクロフィルトレーシ
ョン（microfiltration）膜による保持は主として機械
的な篩分けにより行われる。膜の化学的性質が作用する
ような用途、例えばガス分離または脱塩に於いてさえ
も、分離種と膜マトリックスとの間の化学結合は一般に
使用されない。
可溶性の種または懸濁種と化学的に反応し得る型の微孔
質の膜は、所謂“アフィニティー膜”である。種々のア
フィニティー膜が市販されている。複雑な混合物中の唯
一の種または二三の種と特異的に相互作用するように設
計されている幾つかの膜は、物理的な分離に頼る伝統的
な膜の改良である。このような高度に特異的な相互作用
の例は、抗原／抗体、ハプテン／抗体、アプロプロテイ
ン（aproprotein）／コファクター及びレクチン／炭水
化物を含む。アフィニティー膜は、抗原と抗体の間の相
互作用が特に関係する免疫診断試験で使用し得る。こう
して、アフィニティー膜は、巨大分子転移、ゲル電気泳
動、及びブロッティングに有益である。
しかしながら、現在市販されているアフィニティー膜は
或る種の欠点を有する。或る膜に関して、活性基が大気
への長期の暴露により分解されるので、貯蔵寿命が制限
される。他の膜に関して、結合能力が制限される。偽陽
性の読み取りへと導き得る非特異的な結合が同様に問題
である。非特異的な共有結合は典型的には膜をブロッキ
ング剤で処理することにより減少される。しかしなが
ら、ブロッキング剤は、その問題を常にうまく解決する
とは限らない。
また、活性膜をつくるこれらの方法には種々の欠点があ
る。例えば、これらの方法の幾つかは、或る種の基質ま
たは膜ポリマーに制限される。例えば、酸化反応は、酢
酸セルロースの如き膜に制限され、その他の市販の膜、
例えばポリスルホン、ナイロンまたはポリプロピレンを
活性化しない。また、その他の化学反応は或る種の微孔
質の膜の細孔構造を損傷することがある。更にその他の
反応では、細孔の目詰まりが問題を生じることがある。
上記の欠点は、現在人手し得るアフィニティー膜の不充
分な特性の幾つか及び当業界に於ける更なる改良に対す
る要望を示す。
発明の要約 広い面に於いて、本発明は、活性微孔質膜に適用される
基質を含むブロッティング組成物に関する。膜ポマリー
は、ポリアルデヒドを含む混合物で物理的に活性化され
る。充分な量のポリアルデヒドが膜ポリマーと組み合わ
されてアミンを含む物質及びその他のアルデヒド反応性
物質との有効な共有結合を与える。
別の広い面に於いて、本発明は、細菌または巨大分子を
含む生物試料を微孔質の膜の如き固定化用マトリックス
に移す方法に関する。また、本発明は、ブロッティング
マトリックスを使用して特定の核酸配列の如き巨大分子
を同定する方法に関する。更に特別な面に於いて、本発
明は、膜ポリマー及びポリアルデヒドを含む活性微孔質
膜の使用を含むゲルブロッティングに関する。更に別の
特別な面に於いて、本発明はドットブロット法に関す
る。更に別の面に於いて、本発明はコロニーハイブリダ
イゼーションに関する。
本発明の膜は、その他の膜よりも或る種の利点を享受す
ると考えられる。一般に、本発明の膜は更に安定であ
り、しかもブロッキング中に短い暴露時間を必要とす
る。或る場合には、本発明の膜は夫々の新しいリハイブ
リダイゼーションプロービングの前にブロッキングを必
要としない。これは、研究者が増大された感度、少ない
液体損失、及び非特異的な吸着を有する膜を用いて研究
を更に有効に行うことを可能にする。また、或る種の本
発明の膜は、水分、酸素、及びブロッティングに典型的
に存在するその他の操作条件に影響され難い。
本発明の種々の膜は、優れた結合能力、特異性及び感度
を示す。特別な理論に束縛されないが、本発明の膜の有
効な結合能力は、一部、微孔質の膜の内表面及び外表面
の両方に結合されるアルデヒド官能基によるものと考え
られる。“感度”は少量の結合種または付着種さえをも
検出する膜の能力を表す。“特異性”は複雑な混合物か
ら或る種の種を選択的に結合または濾過する膜の能力を
意味する。本発明の実用上の利点は、アミンの如き典型
的な求核試薬と反応するのに充分反応性であるが、それ
らが周囲の水分または酸素による分解を問題とする程に
は反応性ではない膜を製造することができることであ
る。こうして、本発明の一つの特徴は、高い結合能力及
び改良された感度を有するだけでなく、長い貯蔵寿命及
び取扱の容易なことを有する膜を提供する。
一面に於いて、本発明の膜はポリマー状及び微孔質であ
り、即ち、それはポリマーを含み、しかも内表面及び外
表を有する。本発明の活性微孔質膜が濾過される混合物
と接触される場合、膜の外部は直ちに、直接に混合物に
暴露される。しかしながら、膜の内表面または間隙は直
ちに暴露されない。内表面が混合物に暴露されるのは、
膜が所定時間にわたって混合物と接触された後だけであ
る。これらの内部の間隙または細胞表面は、膜の“内表
面”と総称される。この内表面領域は、本発明の成功に
重要であることがわかった。
一面に於いて、本発明の活性膜は、内表面及び外表面を
実質的に覆う多数のアルデヒド官能基を有する。間隙及
び外表が、膜を活性化するのに有効な量のアルデヒドに
より覆われる。アルデヒド基の数は、アミンを含む物質
及びその他のアルデヒド反応性基と有効に共有結合する
のに充分である。
以下の詳細な説明は本発明を更に詳しく記載し、好まし
い実施態様を開示する。その説明は、実施例及びこの開
示の残りと共に、当業者が本発明を実施し使用すること
を可能にするように当業者に特別にあてられる。
好ましい実施態様の詳細な説明 上記のように、本発明は、膜ポリマー及びポリアルデヒ
ドを含む活性微孔質膜に適用される基質を含むブロッテ
ィング組成物に関する。ポリアルデヒドは、膜を活性化
するのに充分な量、即ちアミンを含む物質及びその他の
アルデヒド反応性物質による有効な共有結合を与えるの
に充分な量で膜ポリマーと物理的に組み合わされる。
この意味の“活性化”または“組み合わせ”は、（ａ）
プレキャスト微孔質膜をポリアルデヒドで被覆または処
理すること、及び（ｂ）膜をキャストする前にポリアル
デヒドを膜ポリマーと物理的に混合することの両方を含
む広義の用語である。前者が“膜の後処理”と称され、
一方、後者が“プレキャスチング”と称される。ポリマ
ーとポリアルデヒドを“物理的に組み合わせること”ま
たは“物理的に混合すること”は、ポリアルデヒドとポ
リマーの間に殆ど化学反応がないことを意味する。
一面に於いて、本発明は、膜の実質的に全ての有効表面
がポリアルデヒドにより被覆されている活性微孔質膜を
含むブロッティング組成物を含む。こうして、活性膜
は、実質的に全ての有効表面、即ち外表面及び内表面の
両方に有効な官能基を与えるのに充分なポリアルデヒド
を含む。実質的に全ての露出表面領域を覆う得られる遊
離アルデヒド基は、本発明の仕上げ膜と、膜と接触する
アミンの如きアルデヒド反応性物質の間に有効な共有結
合を与える。
本発明の膜は“支持された”膜であってもよく、または
支持されていない膜であってもよい。支持された膜は、
基質、好ましくは不織布にキャストされた膜である。支
持された膜は、しばしば、支持されていない膜よりも良
好な機械的性質及び取扱の容易さを有すると考えられ
る。
一般に、本発明の膜を形成するためには、ポリアルデヒ
ドが溶剤に溶解されて混合物を生成する。次いで、その
混合物が膜の後処理またはプレキャスチングにより膜ポ
リマーと物理的に組み合わされる。活性微孔質膜がつく
られた後、溶剤が一般に洗浄により除去されるが、若干
の残留溶剤が残っていてもよい。
或る実施態様では、ポリアルデヒド混合物は膜を適当に
活性化するのに充分なように濃縮される。一方、膜材料
は丈夫であり、しかも多孔質でありポリアルデヒドを含
む混合物により実質的に損傷されないままであるように
充分な耐薬品性のものである。
膜の後処理 好ましい面に於いて、まず微孔質膜は膜ポリマーからキ
ャストされ、次いでキャスト膜をポリアルデヒドを含む
混合物で物理的に被覆または処理することにより活性化
される。この物理的な組み合わせは、細孔構造に潜在的
な損傷を生じるような化学反応を殆ど含まない。
一般にポリアルデヒドが本発明に使用されると考えられ
る。選ばれるポリアルデヒドは溶剤に充分に可溶性であ
ることが好ましく、真の溶液を与えて、例えば、膜表面
の有効ではない被覆を生じるような望ましくない分散液
を避ける。本発明の実施に特に有益とわかったポリアル
デヒドは、ポリアクロレイン及びアクロレインコポリマ
ーを含む。
ポリアルデヒドが溶解する溶剤の濃度が、重要であるこ
とがわかった。溶剤が充分に濃縮されていない場合、そ
れはポリアルデヒドを含む真の溶液を生成しない。溶剤
が過度に濃縮される場合、それは或る種の膜の膜口（po
rt）構造を損傷することがある。それ故、溶剤濃度は、
膜の損傷を避けるために下げられるべきである。これ
は、溶剤濃度を、例えば、水またはアルコール（これら
は溶剤濃度を下げ、しかもポリアルデヒドを溶解する）
で希釈することにより行うことができる。
ポリアクロレインが使用される場合、ピリジンまたはジ
メチルホルムアミド（DMF）の如き強溶剤がポリアクロ
レインを溶解するのに使用される。後処理法の一つの実
施態様は、DMFまたはピリジンに溶解された純粋なポリ
アクロレインで処理された微孔質膜を含む。高濃度で
は、DMFまたはピリジンはポリスルホンの細孔構造を損
傷する。それ故、ポリスルホンに関して、ポリアクロレ
インを含む混合物中の有効なDMF溶液は約60％のDMF及び
約40％の水を有する。実施例７はDMF溶剤濃度の一つの
操作範囲を示す。その他の膜ポリマー、例えばナイロン
またはポリプロピレンからつくられた膜ポリマーは一般
に細孔損傷に対して敏感ではなく、溶剤濃度に関係しな
いでポリアクロレインでうまく被覆し得る。
ポリスルホン膜と良好に作用することがわかった一つの
ポリアルデヒドは、アクロレインのコポリマー、例えば
ヒドロキシエチルメタクリレートアクロレインコポリマ
ーである。このコポリマーは、純粋なポリアクロレイン
よりもDMF及びピリジンの如き溶剤に更に可溶性であ
る。こうして、それ程濃縮されていない溶剤が膜の細孔
構造への潜在的な損傷を避けるために使用し得る。
また、ポリアルデヒドと溶剤の釣り合いのとれた量が重
要である。膜を充分に活性化するのに充分なポリアルデ
ヒドが存在すべきである。更に、ポリアルデヒドを溶解
するのに充分な溶剤が使用されることが必要である。溶
液の容積当たり約0.2重量％〜約10重量％のポリアルデ
ヒドが適切であると考えられる。
プレキャスチング処理 別の実施態様は、キャスチングの前に膜ポリマーの活性
化を与える。これをプレキャスチング処理と称すること
ができる。この実施態様では、ポリアルデヒドと膜ポリ
マーはキャスチングの前に物理的に混合される。膜ポリ
マーを活性化するのに充分なポリアルデヒドが存在すべ
きである。ポリアクロレインの場合、約1:5〜約1:1のポ
リアクロレイン対膜ポリマーの重量比が適切である。
本発明は微孔質膜の特別な種に厳密に限定されない。し
かしながら、適切な膜ポリマーの選択が最大の有効性を
得るのに重要である。一般に言えば、膜ポリマーの種
は、ポリアルデヒドを含む溶剤系に耐え得ることが必要
である。好適な膜ポリマーの例は、ポリスルホン及びア
クリルニトリル−塩化ビニルコポリマーを含む。また、
ナイロン、酢酸セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポ
リプロピレン、及びガラス繊維の如きその他の膜が、有
効に作用すると予想できる。
ポリアルデヒドを含む混合物と接触して膨潤または溶解
する膜材料は望ましくない。しかしながら、これはポリ
アルデヒドに対して使用される溶剤の濃度に或る程度依
存する。例えば、ポリスルホン膜に関して濃厚なDMFは
膜に損傷を生じる。従って、ポリスルホン微孔質膜の場
合、アクロレインとヒドロキシエチルメタクリレートの
コポリマーの如き一層可溶性のポリアルデヒドを使用す
ることが好ましい。ポリスルホン膜が殆ど損傷されない
ことが、このコポリマー溶剤系で見られた。
重合 重合条件がまた重要である。例えば、或る種の条件下で
は、重合はアクロレインのアルデヒド基を伴い、それ
故、得られるポリマーは、たとえばあったとしても非常
にわずかのアルデヒド官能基を有する。
ポリアルデヒドコポリマーがアクロレインモノマーとヒ
ドロキシエチルメタクリレートとの間で生成される場
合、過酸化物の如き適当な通常の開始剤を使用する遊離
基共重合が好ましい。対照的に、その反応が塩基触媒系
の開始剤、例えば水酸化ナトリウムの影響下で行われる
場合、たとえあったとしてもわずかの遊離アルデヒドが
生成される。同様に、イオン化放射線が使用される場
合、微小球が生成され、これは多孔質膜の全ての間隙に
侵入し得ないことがある。
一般に、好ましい重合条件は、細孔構造に損傷を与え
ず、またその構造の目詰まりを生じないで、微孔質膜を
有効に覆う高度に可溶性の高度に官能性のポリマー混合
物を与える重合条件である。本発明のポリアルデヒド
は、DMFまたはピリジンの如き溶剤を有する溶液に充分
に可溶性であり、微孔質膜の構造の実質的に全ての細孔
または間隙に侵入する。
本発明の一つの実施態様に於いて、アルデヒド官能基
は、膜ポリマーを有効量のポリアルデヒドを含む混合物
と混合することにより結合される。一般に言えば、ポリ
アルデヒドを含む混合物の種類及び量は膜の結合有効性
を変化させる。これらが、以下に説明される。
良好な溶解性を有するが、ポリスルホン膜の細孔構造を
損傷しない好ましい実施態様は、アクロレインコポリマ
ーである。しかしながら、アクロレインとコモノマーの
混入は、反応性アルデヒド基の濃度を若干下げることが
ある。それ故、コモノマーの選択が重要である。溶解性
と高反応性の良好なバランスがアクロレインとヒドロキ
シエチルメタクリレートのコポリマーで見られる。
膜の製造法 本発明の別の広い面は、活性微孔質膜の製造法であり、
この方法は基本的には活性化工程及びキャスチング工程
を含む。更に特別に、活性化工程は、ポリアルデヒドを
膜ポリマーと混合、処理または組み合わせることにより
膜ポリマーを活性化することを言う。キャスチング工程
は、膜ポリマーを含む微孔質膜をそれ自体をキャストす
ることを含む。
微孔質膜をキャストする実際の方法は通常のものであ
る。好ましい実施態様では、まずキャスチング工程が行
われる。ここでは、微孔質膜マトリックスが膜ポリマー
系（これは、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル−塩
化ビニル、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン及びポリプ
ロピレンの如きポリマーを含んでもよい）からキャスト
される。また、マトリックスはガラス繊維を含んでもよ
い。微孔質膜の細サイズは、直径が0.1〜約10ミクロン
であることが好ましい。これらは殆どの適用に関して充
分に多孔質であることがわかった。
膜のキャスチング後に、活性化工程または処理工程が行
われる。ここでは、ポリアルデヒドがキャスト微孔質膜
と物理的に組み合わされる。ポリアルデヒドを含む混合
物の希薄な溶液が、膜ポリマー系に有害ではない溶剤中
でつくられることが好ましい。有害な溶剤は、一般に、
膜の溶解性を、それが細孔構造を崩壊させることにより
膜を損傷する点まで、増大する溶剤である。上記のよう
に、好ましい溶剤は、せいぜい約60％のDMFを有する水
性DMF溶液である。また、ピリジンが溶剤として使用し
得る。
実施態様のうちの一つは、アクロレインをヒドロキシエ
チルメタクリレートと共重合してコポリマーを得、次い
で溶剤と混合して適当な濃度及び溶解性を有する混合物
を得ることを含む。膜は、全ての内表面及び外表面の適
当な湿潤を確実にする方法でこの混合物中に浸漬され
る。一旦乾燥されると、膜が使用に供される。
この方法の別の実施態様では、まず活性化工程が行われ
る。この実施態様では、キャスチングの前にポリアルデ
ヒドが微孔質ポリマーと物理的に混合される。ポリアル
デヒドを含む混合物は、膜ポリマーと適当な割合で物理
的に混合される。この混合物を使用して、膜マトリック
スが常法でキャストされる。膜が液相または固相から固
相またはゲル相への転移を受け、続いて乾燥された場
合、膜の細孔表面は反応に利用できるアルデヒド官能基
を有する。
下記の反応工程は、アクロレインが重合される方法を説
明する。示されるように、アクロレインは、重合条件に
応じて、アルデヒド基または炭素−炭素二重結合により
重合し得る。
それ故、得られるポリマーは、ペンダントビニル基
（Ｉ）またはアルデヒド基（II）を有するポリマーであ
る。ポリマーIIは溶剤系の存在下でキャストされる膜に
適し、またキャスチングの前に膜を活性化するように膜
を形成する混合物中にブレンドするのに適する。上記の
ように、多種の膜が処理し得るようにアルデヒドポリマ
ーの溶解性を改良することが好ましい。
活性微孔質膜は種々の用途に使用し得る。それは結合マ
トリックスとして特に有効である。種々のアミンを含む
巨大分子が、それに共有結合する。それ故、膜は、タン
パク質、核酸及びその他の求核試薬を選択的に結合する
のに使用し得る。その後、結合種は、触媒及び分析の如
き種々の用途に使用し得る。
ブロッティング組成物 別の広い面に於いて、本発明はポリアルデヒドで活性化
された微孔質膜を伴うブロッティング組成物及びブロッ
ティング法を含む。“ブロッティング”は、特別な遺伝
子構造を分析するための公知の技術である。DNAブロッ
ティングは“サザントランスファー”（これは1975年に
E.M.サザンにより開発された）として知られる操作の工
程である。また、ブロッティングは、RNAブロッティン
グ（ノーザントランスファー）及びタンパク質／免疫ブ
ロッティング（ウェスタントランスファー）も含む。
本発明のブロッティング組成物は、活性膜（これは微孔
質であることが好ましい）に適用される基質、好ましく
はゲルを含む。基質は、タンパク質または核酸、例えば
DNAまたはRNAの如き種々の巨大分子を含んでもよい。膜
は、活性膜ポリマー、即ち、膜と接触し得るアミンを含
む物質及びその他のアルデヒド反応性物質と有効な共有
結合を与えるのに充分な量のポリアルデヒドを含む混合
物を有する膜ポリマーを含む。この記載を満たす膜は、
先に説明されている。
更に特別な面に於いて、本発明は、スポット浸潤により
膜の外表面に接触される（好ましくは、直接適用され
る）核酸の試料を含む組成物に関する。この組成物の使
用は、結合種に対するハイブリダイゼーションにより膜
に結合された核酸の特定の配列を検出する手段を与え
る。
種々の方法、例えばスポット湿潤またはドット−ブロッ
ティングが、基質を膜に適用するのに利用できる。“ド
ット−ブロット”法は、特定の核酸配列を検出するのに
有益である。その方法は、膜に結合された核酸を、プロ
ーブが結合された核酸ストランド（これは核酸の特定の
配列にのみ相補性である）とハイブリッドを形成するこ
とを含む。このプローブが結合された核酸ストランド
は、一般に、特定の配列を含む膜に結合された核酸分子
のみに有効に結合し、またはハイブリッドを形成する。
核酸とハイブリッドを形成した後、そのプローブが通常
の酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）により検出し得
る。実施例11は、ポリアルデヒドで活性化されたポリス
ルホン膜を使用するDNAドット−ブロット操作を伴う本
発明の一面を示す。
巨大分子及び細菌の転移及び同定 本発明の別の面は、細菌または巨大分子、例えばDNA、R
NA、及びタンパク質の生物試料を固定化マトリックス、
詳しくは、膜ポリマー及び活性化量のポリアルデヒドを
含む微孔質膜に移すことにある。ポリアルデヒドは、巨
大分子または細菌を結合または固定化するのに充分な量
で存在することが好ましい。
それ故、本発明の特別な実施態様は、生物試料中の核酸
の特定の配列が検出し得るドット−ブロット法に関す
る。その方法は、当該核酸を含む生物試料をスポット湿
潤により微孔質膜に適用することを含む。通常、生物試
料からの細菌細胞が溶解されて巨大分子、DNA、または
タンパク質を放出する。生物試料が適用された後、核酸
は、プローブが結合された核酸ストランド（これは検出
することが求められている核酸の特定の配列に対し相補
性である）とハイブリッドを形成させられる。ハイブリ
ダイゼーション後に、そのプローブが通常の放射性プロ
ーブまたは酵素結合免疫吸着検定法即ちELISAとして知
られている操作により検出される。ハイブリダイゼーシ
ョン工程の前に、膜の非特異的反応性部位が、例えば、
膜をリン酸緩衝液中の２％（W/V）の無脂肪ドライミル
ク/2％（W/V）のグリシンの溶液と反応させることによ
りブロックまたは“キャップ”されることが好ましい。
本発明の別の特別な実施態様は、多分散された生物試料
または巨大分子、例えば核酸をゲル電気泳動によりそれ
らのサイズ及び電荷に応じて分画に分離し、試料または
巨大分子を微孔質膜に移し、特定の核酸配列を同定する
ことを含む特定の核酸配列の同定法に関する。これを行
うための一般的な操作が、サザントランスファー（DNA
分子に関して）、ノーザントランスファー（RNA分子に
関して）、及びウェスタントランスファー（タンパク質
に関して）として当業界で公知である。更に特別な面に
於いて、本発明は、特定のDNA、例えば、音波処理され
たサケDNAを、適当な電流をゲル中に流して、クエン酸
塩緩衝液を使用して、アガロースゲルディスクからポリ
アルデヒドで活性化された微孔質膜に移し、ELISAまた
は通常の放射性プローブ検出操作を使用して膜に結合さ
れたDNAを検出することを含むDNA配列の同定法を含む。
別の特別な面に於いて、本発明は、毛管作用により核酸
を微孔質膜に移し、その後、その配列を検出することを
含む特定の核酸配列及びタンパク質の同定方法に関す
る。その配列の検出は、例えば、ELISAにより行うこと
ができる。更に特別な実施態様は、音波処理されたサケ
DNAを、クエン酸ナトリウム緩衝液を使用し、吸着紙を
使用して毛管作用によりアガロースゲルディスクからポ
リアルデヒドで活性化された微孔質ポリスルホン膜に移
すことを含む。
電気泳動 本発明の別の面はゲル電気泳動に関する。一般に言え
ば、ゲル電気泳動は、タンパク質の如き巨大分子を分離
し、定量し、特性決定するのに有益である。また、それ
は多分散された核酸試料をそれらのサイズ及び電荷に応
じて分画に分離するのに有益である。
特定の核酸配列を同定する前に、核酸の多分散された試
料は、通常のゲル電気泳動により、それらのサイズ及び
電荷に応じて分画に分離し得る。この分離後に、夫々の
分画が、通常、毛管作用または電位のいずれかにより、
ゲルから固体担体に移される。この転移操作が、RNAに
関して“ノーザントランスファー”として、またDNAに
関して“サザントランスファー”として普通に知られて
いる。この転移後に、微孔質膜に結合され、しかも特定
の配列または特別な免疫特性を有する核酸またはタンパ
ク質の検出が、上記の通常のハイブリダイゼーション
法、例えばゲルブロッティング法、スポット−湿潤法ま
たはドット−ブロット法によ行い得る。
それ故、一面に於いて、本発明は、タンパク質または核
酸の如き巨大分子を、膜ポリマー及びポリアルデヒドを
含む活性微孔質膜、例えばこの詳細な説明の他の部分に
記載されたポリアルデヒドを含む膜に移すことを含むゲ
ル電気泳動法に関する。電気の作用及び毛管作用による
ゲルから本発明のポリアルデヒドで活性化された膜への
核酸またはタンパク質の転移及び特定の核酸配列の同定
が、実施例12及び実施例13に例示されている。
本発明が、以下の実施例の考慮により更に明らかにな
る。これらの実施例は本発明の使用を単に例示すること
を目的とする。
実施例 実施例１ アクロレインの重合 新しく蒸留したアクロレイン（50ml、0.749モル）、過
酸化ベンゾイル（2g、8.26ミリモル）及びジメチルホル
ムアミド（DMF）250mlを含む混合物を室温で３時間窒素
でパージした。次いで、その混合物を攪拌しながら70〜
80℃に２時間加熱した。得られる溶液を室温で15時間攪
拌した。黄色がかった均一な溶液を得た。この溶液を水
で希釈してポリアクロレインを白色の沈澱として得た。
ポリアクロレインをピリジンに再度溶解し、実施例２で
使用するために室温で貯蔵した。
実施例２ ポリスルホン微孔質膜をポリアクロレイン混合物で被覆
することによる膜の活性化 実施例１のポリアクロレイン／ピリジン溶液を70℃に加
熱し、１容積の沸騰水で希釈した。このポリアクロレイ
ンを含む混合物を70℃でポリスルホン微孔質膜に適用
し、空気中で室温で乾燥した。上記の処理により、膜の
透明化（clearing,多孔質構造の分解）の徴候は観察さ
れなかった。これは、混合物溶剤が強すぎなかったこと
を示した。
実施例３ ポリアクロレイン混合物によるプレキャスチングによる
膜の活性化 実施例１のポリアクロレイン/DMF溶液をポリスルホンと
混合して微孔質膜をプレキャストした。ポリアクロレイ
ン溶液30g、追加のDMF10ml、ポリエチレングリコール10
g、ポリビニルピロリドン1.5g、及びポリスルホン8.5g
をブレンドすることによりキャスチング混合物を調製し
た。その混合物を室温でガラスプレートの上にキャスト
し、保湿室中で貯蔵して細孔を形成させた。この方法に
より製造した微孔室膜は、6.8秒/100ml/9.62cm2/572mmH
gの水流量及び1.3kg/cm2（18psi）の水バブルポイント
を示した。これは、膜が微孔質であり、しかも適当な細
孔構造を有することを示した。
実施例４ アクロレインとヒドロキシエチルメタクリレートの共重
合 ヒドロキシエチルメタクリレートアクロレインコポリマ
ーをDMFに溶解し、水で希釈した。このような混合物を
以下の方法でつくった。新しく蒸留したアクロレイン
（50ml、0.749モル）、ヒドロキシエチルメタクリレー
ト（15ml、0.12モル）、過酸化ベンゾイル（3.25g、13.
4ミリモル）及びDMF200mlからなる混合物を窒素で１時
間パージし、次いで１時間還流させた。得られる混合物
を室温で15時間攪拌した。黄色のコポリマー溶液を得
た。このコポリマー溶液を、擬固させないで1.5容積の
水で希釈した。
実施例５ 微孔質膜をコポリマー混合物で被覆することによるポリ
スルホン膜の活性化 実施例４のコポリマー溶液を70℃に加熱し、70℃の1.5
容積の水で希釈した。このコポリマー溶液を支持された
微孔質ポリスルホン膜に室温で適用し、空気中で室温で
乾燥した。この処理により、膜の明らかな徴候は観察さ
れなかった。更に、支持されたポリスルホン膜は、上記
の処理の後に、13.5秒/100ml/9.62cm2/572mmHgの水流量
を示した。これは、ヒドロキシエチルメタクリレートア
クロレインコポリマー混合物が微孔質膜の細孔構造を殆
ど損傷しなかったことを示した。
実施例６ アクロレインとヒドロキシエチルメタクリレートの共重
合 種々の膜による本発明の有用性を実証するために、第二
のコポリマー混合物をつくり、ポリスルホン微孔質膜及
びアクリロニトリル／塩化ビニルコポリマー微孔質膜に
適用した。
まず、新しく蒸留したアクロレイン（265ml、3.97モ
ル）、ヒドロキシエチルメタクリレート（62ml、0.49モ
ル）、過酸化ベンゾイル（17g、70ミリモル）及びDMF10
60mlの混合物を窒素ガスで６時間パージした。次いで、
この混合物を95％に22時間加熱した。コポリマーの最終
濃度は17.5％（W/V）であった。得られる褐色のコポリ
マー溶液を、膜の後処理のために室温で貯蔵した。
実施例７ 被覆によるポリスルホン微孔質膜及びポリアクリロニト
リル−塩化ビニル微孔質膜の活性化 実施例６のコポリマー溶液を1:1:1のDMF/水／イソプロ
パノールの混合物で希釈して0.5％、１％、２％、３
％、４％及び５％（W/V）溶液を含む種々のコポリマー
溶液を生成した。これらのコポリマー溶液をポリスルホ
ン微孔質膜及びポリアクリロニトリル−塩化ビニル膜に
適用した。
これらの膜を脱イオン水で急冷し、脱イオン水で数回洗
浄し、70℃で乾燥した。これらの膜のうちの二つ、即ち
４％の溶液で処理した膜の流量を測定した。膜の水流量
が減少されたことがわかった。例えば、処理されたポリ
スルホン膜の流量は107秒/100ml/9.62cm2/572mmHgから1
3.1秒/100ml/9.62cm2/572mmHgまで減少された。この流
量の減少は、膜の内表面が被覆されたことを示した。処
理された膜の流量が表１に見られる。これらの膜の結合
能力が実施例８に示される。
実施例８ 以下のデータにより示されるように、本発明の幾つかの
実施態様は優れた結合能力を示した。
実施例９ グリオキシルアガロースポリアルデヒドを含む本発明の
別の実施態様をつくって本発明の有用性を更に示した。
グリオキシルアガロースポリアルデヒド（FMCコーポレ
ーションにより製造されたヌフィックス（NuFix、商
標））0.5gを沸騰水200ml中に混合して溶液を調製し
た。その溶液を使用して実施例５と同様にしてポリスル
ホン膜を処理した。膜の流れ特性は変わらないままであ
ることが観察され、これは、細孔構造が実質的に損傷さ
れないままであることを示した。
実施例10 以下のデータから示されるように、本発明の膜は、その
他の市販の膜よりも優れている特異性及び結合能力を示
した。市販のアフィニティー膜Ａは、商品名バイオダイ
ン（Biodyne）としてパール・コーポレーション（Pall
Corporation）により販売されるナイロン系の膜であっ
た。市販のアフィニティー膜Ｂは、商品名イモビロン
（Immobilon）としてミリポア・コーポレーション（Mil
lipore Corp.）により販売される二フッ化ポリビニリデ
ン系の膜であった。
これらの結合能力は、P.K.Smithらにより開発されたBCA
法（Analytical Biochemistry,150,76頁（1985））に従
って測定した。
実施例11 この実施例はDNAドット−ブロット操作用のポリアルデ
ヒドで活性化されたポリスルホン膜に関するものである
ので、この実施例は本発明の有用性を示す。典型的に
は、音波処理されたDNAをキャリヤーDNAとして使用す
る。しかしながら、ここでは、それは本発明を例示する
のに使用されている。夫々、０、５、50及び500ngのDNA
を有する音波処理されたサケDNA（一本鎖、580個の塩
基）の四種の１μｌの溶液を四つのポリアルデヒドで活
性化されたポリスルホン膜に適用した。膜を食塩加リン
酸緩衝液中の２％（W/V）の無脂肪ドライミルク/2％（W
/V）のグリシンと反応させることにより、膜の過剰の結
合部位をキャップした。次いで、これらの膜を、T.Mani
atis,Molecular Cloning-A Laboratory Manual、特に38
7〜389頁、Cold Spring Harbor Laboratory（1982）
（この文献は参考として本明細書に含まれる）に概説さ
れた操作に従ってスルホプローブが結合された相補的DN
A標準物質でハイブリッド形成されたプレハイブリダイ
ゼーション溶液に暴露した。スルホプローブの検出を、
Technical Bulletin No.:Probe-2（６−87）,Sigma Che
mical Co.（1987）に記載された操作により行った。得
られる着色生成物、即ちドットを570nmでデンシトメー
ターで定量した。０、５、50及び500ngのDNA適用量を有
する膜に関して、ドットの強さ（OD570）としてのDNAの
検出は、夫々0.018、0.089、0.164、及び0.288であるこ
とがわかった。
実施例12 この実施例はポリアルデヒドで活性化されたポリスルホ
ン膜へのDNAの電気転移（electro-transfer）に関する
ものであるので、この実施例は本発明の有用性を示す。
音波処理されたサケDNA（一本鎖、580個の塩基）を、20
0MAの電流でクエン酸ナトリウム緩衝液を使用して２時
間にわたって１％のアガロースゲルディスクから膜に移
した。ゲルディスクは13mmの直径及び0.13mmの厚さを有
する。ゲルディスク当たりクエン酸ナトリウム緩衝液中
１％のアガロース及び200ngのDNAを使用した。三層の24
mmの膜ディスクを転移中に使用して核酸を停止する膜の
能力を観察した。
電気転移後に、これらの膜を２％（W/V）のグリシン／
食塩加リン酸緩衝液で処理して過剰の結合部位を失活し
た。膜に結合されたDNAの検出は、実施例11に記載した
操作を使用して行った。
ポリアルデヒドで活性化されたポリスルホン膜の第一層
に関して、白色のバックグラウンド上のパープル−ブル
ー色の13mmの円が観察された。第二層及び第三層は着色
を示さず、これは、核酸の第一の層に浸透しなかったこ
とを示唆する。
実施例13 この実施例はポリアルデヒドで活性化されたポリスルホ
ン膜へのDNAの毛管転移（capillary-transfer）に関す
るものであるので、この実施例は本発明の有用性を示
す。音波処理されたサケDNA（一本鎖、580個の塩基）
を、クエン酸ナトリウム緩衝液を使用し、吸着紙を使用
して、毛管作用により、15時間にわたって１％のアガロ
ースゲルディスクからポリアルデヒドで活性化されたポ
リスルホン膜に移した。夫々のアガロースゲルディスク
は13mmの直接及び0.13mmの厚さであった。ゲルディスク
当たりクエン酸ナトリウム緩衝液中１％のアガロース及
び200μｇのDNAを使用した。核酸を停止する膜の能力を
観察するために三層の24mmの膜ディスクを転移中に使用
した。転移後、膜を実施例11のようにして処理して膜に
結合されたDNAを検出した。
ポリアルデヒドで活性化されたポリスルホン膜の第一層
に関して、白色のバックグラウンド上のパープル−ブル
ー色の13mmの円が観察された。第二層及び第三層は着色
を示さず、これは、核酸が第１の層に浸透しなかったこ
とを示唆する。
詳しく説明されなかったその他の実施態様及び方法、改
良及び変更は、本発明の範囲内に当然含まれる。例え
ば、巨大分子を移す操作は、生物試料を、ポリスルホン
以外の適合性の膜ポリマー、例えば、ナイロンまたはポ
リプロピレンと混合されたポリアルデヒドを含む微孔質
膜と接触させることを伴い得る。また、その操作は、減
圧を膜に適用して試料の濾過を改良することのような追
加の工程を含んでもよく、その結果、減圧が適用されな
かった場合よりも短時間で巨大分子が膜に結合される。
同様に、その操作は、膜に結合する核酸の特異性を改善
するための種々のプレハイブリダイゼーション工程を含
んでもよい。しかしながら、本発明は上記の実施態様及
び実施例に限定されないことが理解される。本発明は、
以下に見られる請求の範囲により特定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス メナヘム イスラエル 76120 レホヴォト ピーオ ーボックス 2057 (56)参考文献 特開 平１−158054（ＪＰ，Ａ)

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】巨大分子および細菌から選択されるアルデ
    ヒド反応性物質である生物試料を固定化用マトリックス
    に移し、試料を検出または同定する方法において、膜を
    有効に活性化するのに十分な量の溶質中においてプレキ
    ャスチングまたは膜の後処理により溶質としてのポリア
    ルデヒドと物理的に結合された細孔構造を有するポリア
    ルデヒドで活性化された微孔質ポリマー膜の微小細孔に
    基質として試料を適用すること、およびそのように固定
    化した試料を検出または同定することを含む方法であっ
    て、上記の適用工程が： ａ）ゲルと混合した生物試料を膜にゲルブロッティング
    すること、 ｂ）生物試料を膜にスポット−湿潤すること、 ｃ）生物試料を膜に電気転移すること、 ｄ）生物試料を膜に毛管転移すること、 から選択される転移であるような上記の方法。
  2. 【請求項２】生物試料が細菌を含む請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】生物試料がDNA、RNAおよびタンパク質から
    成る群より選択される巨大分子を含む請求の範囲第１項
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】検出工程をELISAにより行う請求の範囲第
    １項に記載の方法。
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