JPH07209295A - 抗体及び酵素標識抗原並びにこれらを用いる酵素免疫測定法及び測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アルツハイマー症の治療効果を有する9−ア
ミノ−2、3、5、6、7、8−ヘキサヒドロ−1Ｈ−シクロ
ペンタ（ｂ）キノリン（Ｉ）の酵素免疫測定法及び測定
用キット並びにそれに用いる酵素標識抗原及び抗体を提
供する。 【構成】 （Ａ）式（II） 【化１】 （式中、ｎは０−５の整数を表す。）で表される化合物
と免疫原性担体とを該化合物のカルボキシル基を介して
共有結合せしめて得られる抗原を動物に投与することに
より得られる抗体、（Ｂ）式（II）で表される化合物と
酵素とを該化合物のカルボキシル基を介して共有結合せ
しめて得られる酵素標識抗原、（Ｃ）固相支持体に固定
化された（Ａ）の抗体と（Ｂ）の酵素標識抗原とを用い
る（Ｉ）の酵素免疫測定法、及び（Ｄ） （Ａ）の抗体
及び（Ｂ）の酵素標識抗原をキットの必須の構成試薬と
する（Ｉ）の酵素免疫測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アルツハイマー症の治
療効果を有する後記式（Ｉ）で表される化合物［以下、
化合物（Ｉ）又は単に（Ｉ）ということもある］の酵素
免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ Enzyme immun
oassay 以下、ＥＩＡともいう）及び測定用キット並び
にそれに用いる酵素標識抗原及び抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より薬物等の生物体液中濃度の測定
法としては液体クロマトグラフィー（HPLC）、ガスクロ
マトグラフィーマススペクトロメトリー(GC-MS)を用い
る方法が一般的に行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の方法で化合物（Ｉ）を測定した場合、HPLCでは感度
（10ng/ml)の点で、また、GC-MSでは迅速性の点で必ずし
も満足できるものではない。このため、高感度でかつ迅
速に多くの試料を測定できる方法の開発が望まれてい
た。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、化合物（Ｉ）
を測定する方法として、免疫学的測定法に着目し、この
方法につき鋭意研究を行った結果完成されたものであ
る。一般に、本発明における化合物（Ｉ）のような低分
子化合物はハプテンと呼ばれ抗原性は有するが免疫原性
を持たない。このため、これらのハプテンにつきその抗
体を産生させるために、ハプテン中のアミノ基、カルボ
キシル基等とタンパク質等の免疫原性担体とを共有結合
させたうえで動物に免疫する方法が一般に行われてい
る。しかしながら、化合物（Ｉ）については、そのアミ
ノ基に直接タンパク質を共有結合させようとしても、化
合物（Ｉ）のアミノ基は反応性に乏しくタンパク質との
共有結合体が得られにくい上、得られた共有結合体を用
いて動物に免疫を行っても好ましい抗体が得られない。

【０００５】本発明者等は、化合物（Ｉ）の免疫学的測
定法につき種々研究を行った結果、化合物（Ｉ）の５位
にカルボキシプロピル基等を結合した化合物に、常法に
よりタンパク質を共有結合させることにより得られる複
合体が、ＥＩＡにおける抗体を産生させるための好まし
い免疫原となることを見いだした。本発明は、かかる知
見に基づき更に研究を重ねることにより完成されたもの
である。

【０００６】すなわち、本発明は、（Ａ）下記式（II）

【０００７】

【化３】

【０００８】（式中、ｎは０−５の整数を表す。）で表
される化合物と免疫原性担体とを該化合物のカルボキシ
ル基を介して共有結合せしめて得られる抗原（免疫原）
を動物に非経口的な手段で投与することにより得られる
抗体、及び（Ｂ）上記式（II）で表される化合物と酵素
とを該化合物のカルボキシル基を介して共有結合せしめ
て得られる酵素標識抗原、及び（Ｃ）固相支持体に固定
化された（Ａ）記載の抗体に対し、（Ｂ）記載の酵素標
識抗原と測定試料中の式（Ｉ）

【０００９】

【化４】

【００１０】で表される化合物［9−アミノ−2、3、5、
6、7、8−ヘキサヒドロ−1Ｈ−シクロペンタ（ｂ）キノ
リン］とを競合的に反応させることを特徴とする式
（Ｉ）で表される化合物の酵素免疫測定法、及び（Ｄ）
少なくとも、（Ａ）記載の抗体及び（Ｂ）記載の酵素標
識抗原をキットの必須の構成試薬とすることを特徴とす
る式（Ｉ）で表される化合物の酵素免疫測定用キット、
に関するものである。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。式（II）
で表される化合物（以下、化合物（II）又は単に（II）
という）は、新規物質であり、以下の反応式［化５］で
示すとおり式（III）のシクロヘキサノン誘導体と式（I
V）の２−アミノ−１−シクロペンテン−１−カルボニ
トリルをポリリン酸エチルの存在下で反応させ、得られ
た式（Ｖ）の化合物を加水分解することにより製造でき
る。（特開昭６３−２９７３６７） 尚、式（III）のシクロヘキサノン誘導体が新規物質で
ある場合は、該物質は、式（III-1）の１−ピロリジノ
−１−シクロヘキセンと式（III-2）の化合物とを有機
溶媒中で反応させて式（III-3）の化合物を製造し、更
に、このものに水を加えて反応させることにより製造で
きる。反応式中、ｎは０〜５の整数を表し、Ｒはアルキ
ル基を表す。本発明では、化合物（II）のうち、ｎが１
〜４の整数である化合物が好ましい。

【００１２】

【化５】

【００１３】免疫原性担体としては、タンパク質、ポリ
ペプチド、糖タンパクなどがあげられる。具体的には、
タンパク質としては、牛血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミン、卵白アルブミン、牛ガンマグロブリンなどが、
ポリペプチドとしては、ポリリジンなどが、糖タンパク
としては、リポポリサッカライド、キーホールリンペッ
トヘモシアニンなどがそれぞれあげられる。中でもタン
パク質が好ましい。

【００１４】本発明では、化合物（II）と免疫原性担体
を共有結合させた複合体が、抗体を産生するための免疫
原として用いられる。かかる免疫原を製造する方法とし
ては、従来より使用されている方法、例えば、無水ジメ
チルホルムアミド（DMF）等の溶媒中で、トリ−ｎ−ブ
チルアミン等のアミン類とイソブチルクロロホルメート
等のアルキルクロロホルメートを用いて化合物（II）と
免疫原性担体とを共有結合せしめる方法（混合酸無水物
法）が使用される。

【００１５】かくして得られる免疫化学的測定用抗体作
製のための抗原は、宿主動物に免疫し、抗体産生に用い
る。宿主動物としては、たとえば家兎、ラット、モルモ
ット、マウス、ヤギなどがあげられる。かかる動物への
免疫は抗原を静脈内投与、皮内投与もしくは皮下投与な
どの非経口的な手段で投与することにより行われる。投
与には、通常アジュバント（フロイントコンプリートア
ジュバント Freund's complete adjuvant またはフロ
イントインコンプリートアジュバント Freund's incomp
lete adjuvant）と抗原とでエマルジョンを作製したも
のを用い、少量を投与後、一定期間毎（通常１週間から
１カ月の一定期間毎）に同一抗原を投与する方法が行わ
れる。投与中は、一定期間毎に血清中の抗体価を測定し
最も高い値が得られた時点で全採血する。

【００１６】血液は血清に分離しそのまま抗血清（抗
体）として用いることができるが、化合物（Ｉ）の測定
感度を高めるために硫安分画、ゲルろ過、DEAE陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、プロテインＡアフィニ
ティクロマトグラフィーなどによりIgGに精製したもの
を抗体として用いることが好ましい。この抗体が粉末
（凍結乾燥品）の場合にはそれを水に溶解して適当な濃
度の抗体水溶液として用い、水溶液の場合には適当な濃
度に希釈して用いる。このときの抗体濃度は、通常、0.
01〜10μg/ml、好ましくは0.05〜1.0μg/mlの蛋白質濃
度で使用される。かくして得られた抗体は、化合物
（Ｉ）をその代謝物あるいは構造的に類似の他の化合物
と区別して認識することができるので、化合物（Ｉ）の
ＥＩＡあるいはラジオイムノアッセイ用の抗体として有
用なものである。

【００１７】かかる抗体をＥＩＡに用いる場合は、後述
のごとく酵素標識抗原と共に用いることになる。酵素標
識抗原は、化合物（II）と酵素、例えばペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−D−ガラクトシダーゼなどとを共有結合させる
ことにより得られる。このうち、本発明では、ペルオキ
シダーゼ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を
共有結合させたものが好ましい。共有結合させる方法と
しては、前述の免疫原性担体と化合物（II）とを共有結
合させる方法が同様に用いられる。本発明の酵素標識抗
原は、粉末（凍結乾燥品）の場合にはそれを水に溶解し
て適当な濃度の水溶液として用い、水溶液の場合には、
通常それを水で適当な濃度に希釈して用いる。

【００１８】本発明の化合物（Ｉ）のＥＩＡ又はＥＩＡ
用キットには、化合物（Ｉ）に対して特異的な免疫反応
性を有する抗体及び化合物（II）の酵素標識抗原を必須
とするものであるが、かかるＥＩＡ又はＥＩＡ用キット
にはこれらの試薬のほかに、固相支持体、洗浄液、ブロ
ッキング液、化合物（Ｉ）の検量線を作成するための化
合物（Ｉ）溶液、酵素の基質、過酸化水素なども必要と
する。

【００１９】固相支持体は、抗体又は抗原を固定化する
ための支持体として必要なものである。そのような固相
支持体の形状としては、例えば、イムノアッセイ用のプ
レート、チューブ、ビーズ、膜などをあげることがで
き、その材質としては、例えば、ポリエチレン、ポリス
チレン、ポリプロピレン、ニトロセルロース、ガラスな
どをあげることができる。固相支持体に抗体を固定化す
る場合は、抗体はアルカリ性の溶液に溶解し、固相支持
体に接触させ（物理的に）吸着させる。このときの抗体
の濃度は、通常、0.1〜20μg/ml、好ましくは1〜10μg/
mlの蛋白量で使用される。また、アルカリ性の溶液とし
ては、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液など
が用いられる。

【００２０】洗浄液は、固相支持体に一定量の抗（Ｉ）
抗体等の抗体を固定化した後にその固相支持体に固定化
されなかったものを洗浄して除去したり、固相支持体に
固定化した抗体に対して測定試料中の化合物（Ｉ）と酵
素標識抗原とを競合的に反応させた後に未反応物を洗浄
して除去するために必要である。また、洗浄液は測定試
料の希釈液ならびにアッセイの際の緩衝液としても用い
る。このような目的に用いる洗浄液としては、例えば、
水、反応時のpHに調整した緩衝液（リン酸緩衝液、リン
酸緩衝生理食塩液（PBS）、トリス−塩酸緩衝液などの
緩衝液）、前記の緩衝液にツイーン20などの界面活性剤
を0.01〜2.0容量％含むものなどをあげることができ
る。中でも、前記の界面活性剤を0.02〜0.50容量％含む
反応時のpHに調整した緩衝液を用いるのが好ましい。

【００２１】ブロッキング液は、酵素標識抗原が抗
（Ｉ）抗体を固定化していない固相支持体表面に非特異
的に結合するのを防ぐため必要である。このような目的
に用いるブロッキング液は、BSA(牛血清アルブミン）、
OVA(卵白アルブミン）、KLH(笠貝ヘモシアニン）、γー
グロブリン、ゼラチン、カゼインなどのタンパク質を前
記の洗浄液に溶解することによって調製することができ
るが、これらのタンパク質の濃度は、0.5〜5.0重量％と
することが好ましい。また、必要に応じてブロッキング
液にはアジ化ナトリウムなどのようなタンパク質の防腐
剤を必要量添加することもできる。

【００２２】測定試料としては、ヒトの尿、血清、血漿
などのヒト体液の他ラット、マウス、イヌなどの動物の
体液を用いることができる。化合物（Ｉ）の測定では、
これらの測定試料を化合物（Ｉ）が測定できる範囲内に
前記の洗浄液で希釈したものを用いて測定する。

【００２３】酵素の基質としては、酵素標識抗原中の酵
素の比色の基質、例えば、抗原に標識した酵素が西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（HRP）である場合は、オルト−
フェニレンジアミン(OPD)または2，2’−アミノビス（3
−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸）(ABTS)等
が使用される。また、HRPの蛍光の基質であるｐ−ヒド
ロキシフェニルプロピオン酸(HPPA)或いは発光の基質で
あるルミノールを用いることもできる。これらのHRPを
用いた酵素反応には過酸化水素が要求される。

【００２４】以上のようにして固相支持体、洗浄液、ブ
ロッキング液、化合物（Ｉ）の検量線作成のための化合
物（Ｉ）溶液、基質、過酸化水素を準備し、抗（Ｉ）抗
体、及び酵素標識抗原を用いて以下のような各段階を経
ることにより測定試料中の化合物（Ｉ）を測定すること
ができる。

【００２５】(1)固相支持体に一定量の抗（Ｉ）抗体等
を固定化する段階 固相支持体に抗（Ｉ）抗体又は抗（Ｉ）抗体に対する抗
体（ロバ或いはヤギ抗家兎IgG等の第二抗体）を一定時
間接触させる。また、接触時の温度は、抗体溶液が凍結
又は沸騰しない限り特に限定されないが、好ましくは４
〜37℃が良い。 (2)固相支持体に固定化されていない抗（Ｉ）抗体等を
除去する段階 固相支持体に抗（Ｉ）抗体等を固定化後、抗体溶液を除
去し、固相支持体に固定化されずに残留している抗
（Ｉ）抗体等を洗浄液で数回洗浄することによって除去
する。

【００２６】(3)酵素標識抗原が抗（Ｉ）抗体等を固定
化していない固相支持体表面に非特異的に結合するのを
防止する段階 抗（Ｉ）抗体等を結合した固相支持体に一定容量のブロ
ッキング液を一定時間接触させる。接触時の温度は、抗
体溶液が凍結又は沸騰しない限り特に限定されないが、
好ましくは４〜37℃が良い。 (4)固相支持体に固定化した抗（Ｉ）抗体等に対して測
定試料中の化合物（Ｉ）と酵素標識抗原とを競合的に反
応させる段階 固相支持体に抗（Ｉ）抗体が固定化されている場合に
は、測定試料ならびに酵素標識抗原を同時に或いはそれ
ぞれ順次接触させ一定時間競合反応させる。固相支持体
に抗家兎IgGが固定化されている場合には、測定試料、
抗（Ｉ）抗体ならびに酵素標識抗原を同時に或いはそれ
ぞれ順次接触させ一定時間競合反応させる。反応時の温
度は、反応混液が凍結又は沸騰しない限り特に限定され
ないが、好ましくは４〜37℃が良い。

【００２７】(5)抗（Ｉ）抗体等を介して固相支持体と
結合していない酵素標識抗原を除去する段階 前記の反応混液を除去し、抗（Ｉ）抗体等を介して固相
支持体に結合せずに残留している測定試料と酵素標識抗
原などを洗浄液で数回洗浄することによって除去する。 (6)抗（Ｉ）抗体等を介して固相支持体に結合した酵素
標識抗原と酵素の基質ならびに過酸化水素とを反応させ
る段階 酵素の基質ならびに過酸化水素の一定容量を前記の抗
（Ｉ）抗体等を介して固相支持体に結合した酵素標識抗
原と一定時間反応させる。好ましくはその後硫酸などの
酸、水酸化ナトリウムなどのアルカリまたはアジ化ナト
リウムなどの酵素阻害剤を用いて酵素反応を停止したほ
うがよい。反応温度は、そのときに用いる酵素の至適温
度範囲内であれば特に問題ないが、好ましくは15〜37℃
が良い。

【００２８】(7)前記の酵素反応後の反応液の吸光度、
蛍光強度或いは発光強度を測定する段階 前記の酵素反応後の反応液の呈色の最大吸光度を示す波
長で、又は最大励起波長でその反応液の吸光度、蛍光強
度或いは発光強度を測定する。尚、本測定方法では、予
め、上記各段階の操作を用い、かつ、測定試料のかわり
に既知量の化合物（Ｉ）を用いた測定結果から検量線を
作成しておき、測定試料の測定結果と照合することによ
り、測定試料中の化合物（Ｉ）の濃度を知ることができ
る。上記(4)に示すように抗（Ｉ）抗体に対し酵素標識
抗原と測定試料中の化合物（Ｉ）とで競合的反応が起こ
ることによってその試料中の化合物（Ｉ）の量を迅速か
つ高感度に測定することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明の参考例及び実施例を示し、本
発明を具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発
明を例示するためのものであって、本発明の範囲を限定
するものではない。

【参考例１】 4ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ーヘキサヒドロー1
Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ーイル］ブチリッ
クアシッド［化合物（VI）］の合成 i) エチルー2ーシクロヘキセノンブチレートの合成 エタノール70mlに、1ーピロリジノー1ーシクロヘキセノ
ン25.0g、4ーブロモブチリックアシッドエチルエステル3
3.6gを加え、24時間還流反応し、更に水60mlを加え5時
間還流反応した。反応終了後水60mlを加え、エーテルで
2回抽出した。エーテル層は飽和食塩水で洗浄後、無水
硫酸ナトリウムで乾燥し減圧下で留去した。残留物は減
圧蒸留により精製した。 収率：5.1g(15％) 沸点：136ー141℃/3mmHg

【００３０】ii) 4ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ー
ヘキサヒドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ー
イル］ブチリックアシッドエチルエステルの合成 ポリリン酸エチル57gを無水クロロホルム50mlに溶解
し、これにi)で得たエチルー2ーシクロヘキセノンブチ
レート5.07g(23.9mM)および2ーアミノー1ーシクロペン
テンー1ーカルボニトリル2.58g(23.9mM)を加え、55℃で
10時間反応させた。冷後、氷を加えた28％アンモニア水
中に滴下してアルカリ性とし、クロロホルムにて2回抽
出した。クロロホルム層は水洗後、無水硫酸ナトリウム
で乾燥し、減圧下で留去した。残留物は、酢酸エチルで
結晶化して3.28gの粗結晶を得た。また、母液からは、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより1.50gの粗
結晶を得た。これらを合わせ、酢酸エチル−エーテル混
液より4.20g(58.0%)の白色粉末状結晶を得た。 融
点：112ー114℃

【００３１】iii) 4ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8
ーヘキサヒドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5
ーイル］ブチリックアシッド［化合物（VI）］の合成 ii)で得た4ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ーヘキサ
ヒドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ーイル］
ブチリックアシッドエチルエステル化合物0.337g(1.10m
M)に0.1N水酸化ナトリウム13mlを加え、90℃にて2時間
加熱反応させた。冷後、0.1N 塩酸15mlで酸性とし、少
量の飽和食塩水を加え、クロロホルムで洗浄した。水層
より析出した結晶をろ取し、少量の水で洗浄した。粗結
晶を水より再結晶し、0.21g(68.6%)の白色粉末状結晶を
得た。

【００３２】融点：242.0ー243.5℃(分解) ＩＲ：νKBrmaxｃｍ^-1 3400、3350(NH₂) 3000〜2500(OH) 1710(C=O)¹ HーＮＭＲ：CDCl₃、TMS、PPM 1.51〜1.75(6H、m) 2.05〜2.12(2H、m) 2.18〜2.29(3H、m) 2.41〜2.49(3H、m) 2.68〜2.72(2H、t) 2.85(1H、br) 2.95〜2.99(2H、t) 7.43(2H、br)¹³ CーＮＭＲ：CDCl₃、TMS、PPM 174.2(C=O) 154.3、153.0(ピリジン環) 149.0(ピリジン環) 118.8、113.6(ピリジン環) 35.1、33.5、33.2、30.7、 27.6、23.8、22.2、22.0、21.8、16.6
(CH₂) ＭＳ：m/Z 246(M⁺)

【００３３】

【参考例２】2ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ーヘキ
サヒドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ーイ
ル］アセテックアシッド［化合物（VII）］の合成 i) 2ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ーヘキサヒドロ
ー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ーイル］アセテ
ックアシッドエチルエステルの合成 ポリリン酸エチル40gを無水クロロホルム100mlに溶解
し、これにエチルー2ーシクロヘキセノンアセテート 5.
63g(30.6mM)および2ーアミノー1ーシクロペンテンー1ー
カルボニトリル 3.25g(30.1mM)を加え、40℃で20時間反
応させた。冷後、氷を加えた28％アンモニア水中に滴下
してアルカリ性とし、クロロホルムにて2回抽出した。
クロロホルム層は水洗後、無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、減圧下で留去した。残留物は、酢酸エチルで結晶化
して10.55gの粗結晶を得た。酢酸エチルで再結晶し、6.
312g(収率 76.5%)の白色粉末状結晶を得た。 融点：11
7ー120℃

【００３４】ii) 2ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ー
ヘキサヒドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ー
イル］アセテックアシッド[化合物(VII）］の合成 i)で得た2ー［9ーアミノー2、3、5、6、7、8ーヘキサヒ
ドロー1Ｈーシクロペンタ（ｂ）キノリンー5ーイル］ア
セテックアシッドエチルエステル500mg(1.82mM)に1N 水
酸化ナトリウム2.3mlを加え、90℃にて４時間加熱反応
させた。冷後、1N 塩酸2.3mlで中和し、析出した結晶を
ろ取し、水及び酢酸エチルで洗浄し、407mg（収率91.1
%)の白色粉末状結晶を得た。

【００３５】ＩＲ：νKBrmaxｃｍ^-1 3375、3200(NH) 2650(NH⁺) 1670、1625(C=N、C=C) 1565、
1390(COO^-)¹ HーＮＭＲ：DMSOーd₆、PPM 1.34〜1.46(1H、m) 1.55〜1.69(1H、m、) 1.85〜1.98(2H、m) 2.02〜2.12(2H、dt、) 2.22〜2.35(2H、m) 2.40〜2.50(1H、m) 2.58〜2.66(1H、m) 2.69(2H、t、J=7.1Hz) 2.83(2H、t、J=7.3Hz) 2.96〜3.09(1H、m)¹³ CーＮＭＲ：DMSOーd₆、PPM 35.8(CH) 43.4(CH₂) 112.9、117.7、151.2、153.5、156.4(ピリジン環) 174.3(COOH) 20.8、22.1、23.0、27.4、30.3、32.0(CH₂)

【００３６】

【実施例１】 免疫原ならびに抗体価測定用抗原の調製 i) 免疫原性担体である牛血清アルブミン(BSA、シグマ社
製)(100mg)の約50倍モル量の化合物（VI）(21 mg)を乾
燥ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、トリーnーブチ
ルアミンを2倍モル量(60μl)を加え、-5℃以下に冷却
後、イソブチルクロロホルメートの等モル量(30μl)を
加え、-5℃以下で5分間反応した。これを氷冷した上記B
SA溶液に一度に加えた。さらに、1Ｎ 水酸化ナトリウム
により溶液のpHを9.0付近に調節しながら氷冷下6時間か
くはんした。さらに、冷暗所(4℃)に12時間放置し、流
水で12時間透析後、内液を1Ｎ塩酸でpHを4.5に調整して
白濁沈殿物を得た。これに水を加えて懸濁させた後、少
量の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて溶解させ、
流水で6時間透析した後、凍結乾燥し化合物（VI）とBSA
の共有結合体である免疫原［化合物(VI）-BSA複合体］
を得た。収量は、111.9mgであり化合物（VI）のBSA1モ
ルあたりの結合比は約6モルであった。

【００３７】ii) 参考例２で得た化合物（VII）100 mg
を乾燥DMFに溶解しi)と同様の方法にて免疫原［化合物
（VII）-BSA複合体］を調製した。化合物（VII）の場合
の収量は、62.6mgでありBSA1モルあたりの結合比は約18
モルであった。

【００３８】iii) 免疫原性担体としてBSAのかわりに卵
白アルブミン(OVA、シグマ社製)を用いる以外はi)と同様
に処理し抗体価測定用抗原［化合物(VI）-OVA複合体］
を調製した。化合物（VI）21mgよりの収量は62.9mgであ
りOVA1モルあたりの化合物（VI）の結合比は約2モルで
あった。

【００３９】

【実施例２】 抗体[抗（Ｉ）抗体]の作製 i) 家兎への免疫 化合物（VI）-BSA複合体2mg又は化合物（VII）-BSA複合
体2mgをそれぞれフロイントコンプリートアジュバント
(FCA、 DIFCOラボラトリーズ社製)0.5mlおよび日本薬局
方生理食塩液（扶桑薬品工業）0.5mlに十分に懸濁させ
たものを家兎（雄性ニュージーランドホワイト種）の背
部皮内20箇所以上に投与して免疫した。両複合体とも家
兎５羽に、初回免疫後は毎月1回部分採血により抗体価
を測定しながら追加免疫を行った。

【００４０】ii) 抗体価の測定 各部分採血時に採取した抗血清の抗体価は、化合物（V
I）-OVA複合体をELISA法（Enzyme-linked immunosorben
t assay)における吸着抗原として用いて測定した。96穴
平底ELISA用プレート(Nonーstaticーcharge Microplate 9
6F-RN、バイオテック社製)の各ウエルに化合物（VI）-OV
A複合体を入れ4℃で終夜放置して固相化し、洗浄液（0.
05%ツイーン20-リン酸緩衝液）で洗浄後0.5%BSAー0.05%
ツイーン20ーリン酸緩衝液により4℃で終夜放置しブロッ
キングを行った。同洗浄液で洗浄後、2倍段階希釈した
抗血清を各ウエルに加え室温で2時間放置した。同洗浄
液で洗浄後、HRP標識抗家兎IgGヤギIgG（YEラボラトリ
ーズ社製）を加え、室温で1時間静置した。さらに同洗
浄液で洗浄後、オルト-フェニレンジアミン-0.01％過酸
化水素により室温で15分間発色させ、0.1%亜硫酸ナトリ
ウム-1Ｎ硫酸により酵素反応を停止させた。ただちに各
ウエルの492nmにおける吸光度を測定し、各抗血清の吸
光度が対照の正常無処置家兎血清の吸光度の2倍以上を
示す最高希釈倍数を当該抗血清の抗体価とした。

【００４１】iii) 抗血清の評価 実施例２ーi)に従って免疫を行い、化合物（VI）-BSA複
合体の場合は8回、化合物（VII）-BSA複合体の場合は11
回免疫後に全採血を行った。ＥＩＡに使用する抗血清を
選ぶため、実施例２ーii)に従い家兎の個体別にIgGに精
製された抗血清を用いて、化合物（Ｉ）ならびに化合物
（Ｉ）の代謝物標品である化合物（VIII）、（IX）、
（Ｘ）（特開平3-275672）を測定し、それぞれの50％競
合阻害する濃度で抗血清の評価を行った。これらの代謝
物標品を構造式（VIII）〜（Ｘ）に示し、評価結果を表
１に示した。

【００４２】

【化６】

【００４３】

【表１】

【００４４】化合物（Ｉ）の50％競合阻害濃度は、化合
物（VI）-BSA複合体で免疫して得られた抗体(Lot.B-1〜
B-5)を用いると0.1〜0.3ng/mlであるのに対して、化合
物（VII）-BSA複合体で免疫して得られた抗体(Lot.A-1、
2、3、5)では0.3〜0.7ng/mlであった。また、代謝物標品
との交差反応率は一水酸化体である化合物（VIII）及び
（IX）では0.2〜4.0％及び0.3〜5.7％とさまざまであ
り、二水酸化体のひとつである化合物（Ｘ）では0.2％
以下であった。これら9個体の抗体より、化合物（Ｉ）
に対する50％競合阻害濃度と、代謝物標品との交差反応
率からLot.Bー1、Bー3及びBー4を選び、これらを混合してＥ
ＩＡに用いることとした。混合した抗体は、化合物
（Ｉ）の正確な定量に対する交差反応性の影響は最小の
ものであると信じられる。すなわち本抗体は化合物
（Ｉ）を密接に関係する代謝物質から区別する、化合物
（Ｉ）についての正確な定量を提供する試薬である。

【００４５】iv)抗血清の精製 化合物（VI）ーBSA複合体で免疫して得られた抗血清のう
ち、家兎No.1、3、4の抗血清264mlについて硫安分画なら
びにDEAE陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる
精製を行った。抗血清264mlに50mMリン酸緩衝生理食塩
液（PBS）（pH7.0）264mlを加える。固型硫安203.3gを
攪拌しながら徐々に加え（50％飽和）20分間ゆっくり攪
拌した後、8000rpm、20分間遠心分離した。得られた沈殿
を、PBSに溶解し全量を50mlとする。攪拌しながら飽和
硫安33mlを加え（40％飽和）、20分間攪拌後遠心分離し
た。再び沈殿をPBSに溶解し全量を50mlにした後、飽和
硫安12.5mlを加え（20％飽和）、20分間攪拌する。遠心
分離により沈殿を除き上清をとり、飽和硫安20.5mlを加
えた（40％飽和）。沈殿を25mM PBS(pH8.0)に溶解し、
同じ緩衝液に透析した。透析後の試料は8000rpm、10分
間遠心分離後、その上清を25mM PBS(pH 8.0)で平衡化し
たＤＥ-52(ワットマン社製)を充填したカラムにチャー
ジし、25mM PBSで溶出する。素通り画分を分取し、280n
mの吸光度を測定した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(SDSーPAGE)により純度の高いIgGが分画された画
分を集めた。収量：IgG画分2811mg。

【００４６】

【実施例３】 酵素標識抗原の調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を標識酵素として、
混合酸無水物法により化合物（VI）又は化合物（VII）
との共有結合体(複合体)を作製した。すなわち、化合物
（VI）2.8mg(0.01mM)或いは化合物（VII）6.7mg(0.024m
M)を無水ジメチルホルムアミド(DMF)500μlに溶解し、
トリ−n−ブチルアミン20μl(0.001mM)、イソブチルクロ
ロホルメート10μl(0.0005mM)を加え、氷冷下5分間かく
はんした。そこにHRP(TOYOBO株式会社)20mg(0.0005mM)
を加え、pH9.0に調整しながら氷冷下6時間反応させた。
反応後、50mM PBSに約17時間透析し、トヨパールHW55F
(TOSOH株式会社)を用いたゲルクロマトグラフィーによ
り分画、精製を行った。415、260および280nmにおいて
吸収の認められた画分について免疫活性を調べ、最も活
性の高い画分を酵素標識抗原［化合物(VI）-HRP標識抗
原1.3ml及び化合物（VII）-HRP標識抗原1.3ml]とした。

【００４７】

【実施例４】 測定法 i)酵素標識抗原を用いるＥＩＡの操作手順 第二抗体（ヤギ抗家兎IgG、H+L鎖、Kirkegaard&Perry ラ
ボラトリーズ社製）を0.015M炭酸ナトリウム-0.035M炭
酸水素ナトリウム緩衝液(pH 9.7)に10μg/mlになるよう
に溶解し、これを96穴マイクロタイタープレート(Mxiso
rb F96、ヌンク社製)の各ウエルに250μlずつ分注し、４
℃で一晩以上放置した。第二抗体を捨て、４倍に希釈し
たブロックエース（ブロッキング液、雪印乳業株式会
社）を各ウエルに300μl入れ、４℃で一晩放置しブロッ
キングを行った。ブロッキング液を捨て洗浄液(0.05%ツ
イーン20-10mM PBS)で４回洗浄後、化合物（Ｉ）標準溶
液又は測定試料100μl、抗（Ｉ）抗体(IgG、0.25μg/ml)
50μl、化合物（VI）HRP標識抗原50μlおよび緩衝液（洗
浄液と同一組成のもの）50μlを加え、４℃で一晩反応
させた。洗浄後、基質として0.128％ 2,2'−アミノビス
（3−エチルベンゾチアゾリン−6-スルホン酸）（ABT
S、ベーリンガーマンハイム山之内社製）100μl、0.01%
過酸化水素50μlおよび緩衝液（洗浄液と同一組成のも
の）100μlを加え、室温で２時間反応させた。次いで、
0.1％アジ化ナトリウム50μlを加え反応を停止させ、41
5nmでその吸光度を測定した。

【００４８】ii)本発明のＥＩＡを用いた検量線の作成 前記実施例に基づいてヒト血清中の化合物（Ｉ）の濃度
測定のための検量線を作成した。この検量線より本発明
のＥＩＡの測定可能範囲は10pg/ml〜10ng/mlである。検
量線を図１に示す。

【００４９】

【実施例５】 化合物（Ｉ）測定用キットの調製 下記に示した方法によって、それぞれ試薬を調製し、化
合物（Ｉ）測定用キットを作成した。 i)酵素標識抗原 実施例３で得た酵素標識抗原[化合物（VI）-HRP標識抗
原］を0.2％BSA-10mM PBSで2倍希釈したものを5mlのポ
リスチレンチューブに10μlずつ分注して酵素標識抗原
を調製した。本品は使用時に希釈して用いる。 ii)抗（Ｉ）抗体 実施例２-iv)で得た抗（Ｉ）抗体(IgG画分)100mg/mlを5
mlのポリスチレンチューブに10μlずつ分注して抗
（Ｉ）抗体を調製した。本品は使用時に希釈して用い
る。 iii)第二抗体固相化担体 前記、測定法の操作手順に記載したと同様の方法で家兎
IgGに対するヤギ第二抗体をポリスチレン性マイクロタ
イタープレートに吸着せしめ第二抗体固相化担体を調製
した。本品は使用時に実施例４-i)に示したブロッキン
グ操作を施した後用いる。 iv)化合物（Ｉ）標準溶液 蒸留水に化合物（Ｉ）を1mg/mlの濃度となるように溶解
したものを5mlのポリスチレンチューブに10μlずつ分注
して化合物（Ｉ）標準溶液を調製した。本品は使用時に
希釈して用いる。

【００５０】

【発明の効果】本発明にかかる化合物（II）と免疫原生
担体との共有結合体（複合体）は、化合物（Ｉ）に対し
て高い親和性及び高い力価を有する抗体を効率よく生産
する。また、化合物（II）の酵素標識抗原は、抗体に対
し生物体液中の化合物（Ｉ）と競合的に反応する。この
ため、本発明によれば、試料中の化合物（Ｉ）の濃度を
極めて高感度にかつ再現性よく測定可能であり、かつ
又、その操作法も簡便であり、迅速に多数の試料を処理
することができる。更に、本発明では、酵素標識抗原、
抗体等からなる試薬を分注保存しておくことが可能であ
り、化合物（Ｉ）の測定用キットとしても有用である。

【００５１】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト血清に化合物（Ｉ）を添加したときの検量
線を示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記式（II） 【化１】 （式中、ｎは０−５の整数を表す。）で表される化合物
   と免疫原性担体とを該化合物のカルボキシル基を介して
   共有結合せしめて得られる抗原を動物に非経口的な手段
   で投与することにより得られる抗体。
2. 【請求項２】上記式（II）で表される化合物が、式中の
   ｎが１−４の整数を表す化合物である請求項１記載の抗
   体。
3. 【請求項３】免疫原性担体がタンパク質、ポリペプチド
   及び糖タンパクからなる群から選ばれた１つである請求
   項１記載の抗体。
4. 【請求項４】免疫原性担体がタンパク質である請求項１
   記載の抗体。
5. 【請求項５】請求項１の式（II）で表される化合物と酵
   素とを該化合物のカルボキシル基を介して共有結合せし
   めて得られる酵素標識抗原。
6. 【請求項６】酵素がペルオキシダーゼ、アルカリホスフ
   ァターゼ、グルコースオキシダーゼ及びβ−D−ガラク
   トシダーゼからなる群から選ばれた１つである請求項５
   記載の酵素標識抗原。
7. 【請求項７】酵素がペルオキシダーゼである請求項５記
   載の酵素標識抗原。
8. 【請求項８】固相支持体に固定化された請求項１、請求
   項２、請求項３又は請求項４記載の抗体に対し、請求項
   ５、請求項６、又は請求項７記載の酵素標識抗原と測定
   試料中の式（Ｉ） 【化２】 で表される9−アミノ−2、3、5、6、7、8−ヘキサヒド
   ロ−1Ｈ−シクロペンタ（ｂ）キノリンとを競合的に反
   応させることを特徴とする式（Ｉ）で表される化合物の
   酵素免疫測定法。
9. 【請求項９】少なくとも、請求項１、請求項２、請求項
   ３又は請求項４記載の抗体及び請求項５、請求項６又は
   請求項７記載の酵素標識抗原をキットの必須の構成試薬
   とすることを特徴とする式（Ｉ）で表される化合物の酵
   素免疫測定用キット。