JPH07236690A - 線溶活性物質の固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 表面にアミノ基（又はカルボキシル基）を有
する材料を、カルボキシル基（又はアミノ基）を有する
水溶性高分子化合物及び縮合剤を含有する水系媒体で処
理し、次いで線溶活性物質及び縮合剤を含有する水系媒
体で処理する。 【効果】 線溶活性物質の固定化のための全反応を水系
媒体中で行うことができるので、材料の変形、寸法変化
を起こすことなく効率よく線溶活性物質を固定化するこ
とができる。また、有機溶媒を使用するよりも安価であ
り、固定化処理後の有機溶媒の廃液処理の問題もなくな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、材料の変形、寸法変化
を起こすことなく、材料の表面に効率よく線溶活性物質
を固定化することができる線溶活性物質の固定化方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療材料の分野において、高分子
化合物が使われるようになったが、高分子化合物からな
る材料を人工血管、カテーテル、人工腎臓、人工心臓、
人工弁、人工肺等として直接血液と接する部位に使用し
た場合、血栓形成を引き起こすという問題があった。血
栓形成は多くの血液凝固酵素の関与する一連の複雑な反
応により、最終的にはフィブリノーゲンが不溶性のフィ
ブリンに変化することを意味している。従来の抗血栓性
材料の開発はこの血液凝固系に注目し、血液凝固系酵素
の阻害剤として働くヘパリンを材料表面に適用し、フィ
ブリノーゲンのフィブリンへの変化を阻害することにあ
った。しかし、この方法ではヘパリンが溶出するととも
に効果が失われていくという欠点があった。

【０００３】そこで、いったん生成したフィブリンを溶
解するウロキナーゼ等の酵素、すなわち、線溶活性物質
を材料表面に固定化する方法が見出された。例えば、特
開昭５１−８１８７６号公報にはポリアミドの表面に縮
合剤を用いて線溶活性物質を結合させる方法が開示され
ている。この方法は、ポリアミドの末端のアミノ基又は
カルボキシル基と線溶活性物質のカルボキシル基又はア
ミノ基を結合させる方法であり、アルカリ処理によりポ
リアミドの主鎖を切断して末端基をある程度増加させる
ことによって、固定化量を増やすことが可能であるが、
長期にわたり抗血栓性を維持させるためにはその固定化
量では十分でなかった。そのため、特開昭５２−９０６
８８号公報には、線溶活性物質の固定化量を増やすため
に、材料をポリアミン、次いでポリカルボン酸無水物で
処理した後、線溶活性物質の溶液と接触させる方法が開
示されている。この方法によると、線溶活性物質と結合
可能な酸無水物基の数を大幅に増やすことができて、線
溶活性物質の固定化量の大幅な増加がみられた。このポ
リカルボン酸無水物基を応用した固定化技術は、ポリエ
ステル（特開昭５２−０１０３７８号公報）、ポリウレ
タン（特開昭５３−１０６７７８号公報）、ポリビニル
アルコール（特開昭５３−１２９４８０号公報）等の材
料表面に線溶活性を付与する方法としてすでに開示され
ている。

【０００４】しかしながら、このポリカルボン酸無水物
を用いて処理するには、ポリカルボン酸無水物を有機溶
媒に溶解しなくてはならない。これは、ポリカルボン酸
無水物は水中に溶解させると酸無水物基が加水分解して
ジカルボン酸となり、線溶活性物質溶液との処理におい
て反応不可能となるからである。ここで用いられる有機
溶媒としてはアセトン、メチルエチルケトン等のケトン
類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素等であり、
基材となる高分子物質が例えばポリメタクリル酸メチル
等のようにこれらの有機溶媒に可溶な場合、上記の処理
は行うことが不可能であるし、ポリアミド、ポリウレタ
ンのように不溶なものであっても有機溶媒によって膨潤
し、材料本体の変形、寸法変化を引き起こす問題を有し
ていた。また、従来、固定化反応を水系で行うことによ
る利点、例えば、有機溶媒の安全衛生上の問題、廃液処
理コスト等についてを開示しているものは皆無であっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、水系媒体中
で線溶活性物質を固定化することができて、上記のよう
な問題点を解決することができる線溶活性物質の固定化
方法を提供することを目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意検討の結果、材料としてア
ミノ基（又はカルボキシル基）を有する材料を、カルボ
キシル基（又はアミノ基）を有する水溶性高分子化合物
と縮合剤を含有する水系媒体中で処理し、さらに、線溶
活性物質及び縮合剤を含有する水系媒体で処理すると、
材料の表面に効率よく線溶活性物質を固定化することが
できることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本
発明は、表面にアミノ基を有する材料を、カルボキシル
基を有する水溶性高分子化合物及び縮合剤を含有する水
系媒体で処理し、次いで、線溶活性物質及び縮合剤を含
有する水系媒体で処理することを特徴とする線溶活性物
質の固定化方法であり、また、表面にカルボキシル基を
有する材料を、アミノ基を有する水溶性高分子化合物及
び縮合剤を含有する水系媒体で処理し、次いで、線溶活
性物質及び縮合剤を含有する水系媒体で処理することを
特徴とする線溶活性物質の固定化方法を要旨とするもの
である。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、アミノ基（又はカルボキシル基）を表面に有す
る材料としては、表面にアミノ基（又はカルボキシル
基）をわずかでも有する水不溶性の有機高分子化合物で
あればいかなるものでもよい。ここでアミノ基とは、窒
素原子に直接結合する水素原子を１個以上有する第一ア
ミン又は第二アミンを示す。アミノ基（又はカルボキシ
ル基）を表面に有する材料は、例えば高分子末端にカル
ボキシル基又はアミノ基を有するナイロン等のポリアミ
ド、高分子末端にカルボキシル基を有するポリエチレン
テレフタレート等のポリエステル、高分子側鎖にカルボ
キシル基又はアミノ基を有するものとしてアクリル酸、
アリルアミン等を一成分として含む共重合体が挙げら
れ、また、高分子材料表面を加水分解することにより、
末端又は側鎖にカルボキシル基又はアミノ基を生成する
ことが可能なポリウレタン、ポリメタクリル酸メチル等
が挙げられる。更に高分子中にカルボキシル基又はアミ
ノ基を含まなくてもグロー放電処理やコロナ放電処理の
ように有機溶媒を用いない手段により上記官能基を表面
に導入できるものであってもかまわない。

【０００８】上記に示した高分子化合物は単体である必
要はなく、上記高分子化合物と他の高分子と混合したも
の、又は他の高分子や金属等の表面を上記した高分子化
合物でコーティングしたものであってもよい。アミノ基
又はカルボキシル基を有する水溶性高分子化合物として
は、アミノ基又はカルボキシル基を１分子中に少なくと
も３個以上含む水溶性の高分子化合物であればよいが、
１分子中に１０個以上有することが望ましい。このよう
な高分子化合物として、ポリアクリル酸、ポリメタクリ
ル酸、ポリエチレンイミン等の他に、アクリル酸、メタ
クリル酸、マレイン酸、４−アミノスチレン、アリルア
ミン、４−ビニル安息香酸等のアミノ基又はカルボキシ
ル基を有するモノマーとアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ート等の親水性モノマーとの共重合体等、さらにアミノ
酸の１種であるグルタミン酸、アスパラギン酸、リシン
等の重合体が挙げられる。またこれらの水溶性高分子化
合物は、水に対する溶解性を増大させるために一部のア
ミノ基又はカルボキシル基が例えば塩酸塩、ナトリウム
塩等の塩化合物であってもよい。

【０００９】本発明における線溶活性物質とは、フィブ
リンの溶解に関与する酵素であり、血栓中に含まれる不
溶性のフィブリンを溶解する作用を有する。例えば、プ
ラスミン、プリノラーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキ
ナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター等が挙
げられる。

【００１０】縮合剤は、材料表面のアミノ基（又はカル
ボキシル基）と水溶性高分子化合物のカルボキシル基
（又はアミノ基）とを、水溶性高分子化合物のカルボキ
シル基（又はアミノ基）と線溶活性物質のアミノ基（又
はカルボキシル基）とを脱水反応により結合させる機能
を有するものであり、例えば、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１
−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ−４−エチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホネー
ト、Ｎ−シクロヘキシル−５−フェニルイソオキサゾリ
ウム−３’−スルホネート、Ｎ，Ｎ' −ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド等が挙げられる。水不溶性の縮合剤の
場合は水系媒体中に分散して用いることも可能である
が、縮合剤は水溶性であるものが好ましい。

【００１１】本発明においては、表面にアミノ基（又は
カルボキシル基）を有する材料を、カルボキシル基（又
はアミノ基）を有する水溶性高分子化合物及び縮合剤を
含有する水系媒体で処理し、次いで、線溶活性物質及び
縮合剤を含有する水系媒体で処理することによって固定
化するものである。

【００１２】次に、固定化方法を詳細に説明する。ま
ず、カルボキシル基（又はアミノ基）を有する水溶性高
分子化合物を純水又はｐＨ緩衝溶液に溶解し、その中に
縮合剤の水溶液を添加して水溶性高分子化合物のカルボ
キシル基（又はアミノ基）を活性化させた後、この溶液
で材料の処理を行い、材料表面のアミノ基（又はカルボ
キシル基）と水溶性高分子化合物のカルボキシル基（又
はアミノ基）とを脱水反応により結合させる。この溶液
の水溶性高分子化合物の濃度は１０重量％以下が好まし
く、さらには０．０１〜５重量％がより好ましい。ま
た、縮合剤の水溶液の濃度は１０重量％以下が好まし
い。また、この反応は、任意の温度で行うことが可能で
あるが、５０℃以下で行われるのが好ましく、０〜２０
℃がより好ましい。水溶性高分子化合物水溶液を材料表
面に接触させた後は、必要に応じて純水、又は、希酸に
よる洗浄、乾燥を行うが、直接次の工程に進んでもかま
わない。

【００１３】このようにして材料の表面を水溶性高分子
化合物及び縮合剤を含有する水系媒体で処理した後、線
溶活性物質及び縮合剤を含有する生理食塩水溶液等の水
系媒体で処理して、水溶性高分子化合物によって導入さ
れたカルボキシル基（又はアミノ基）と線溶活性物質の
アミノ基（又はカルボキシル基）とを結合させる。

【００１４】線溶活性物質及び縮合剤を含有する水系媒
体は、必要に応じてｐＨ又は塩濃度等を調節して用いら
れる。

【００１５】この水系媒体で処理するための条件は、温
度を３７℃以下に保つのが好ましく、０〜１０℃に保つ
とより好ましい。また、必要に応じて、撹拌、振とう等
の手段を用いて表面を更新するのが好ましい。

【００１６】本発明により表面に線溶活性が固定化され
た材料は、従来の方法によって得られるものよりもカル
ボキシル基又はアミノ基が多く高活性を示し、その効果
も長時間維持される。そして、血液がこれらの材料の表
面に接触した際、優れた抗血栓性を示すので、人工血
管、カテーテル、人工心臓、人工肺、人工腎臓等として
の医療材料として有効である。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。

【００１８】実施例１ １ｃｍ角のナイロン６フィルムを２．５Ｎ塩酸に浸し、
３０℃で３０分間処理した。一方、ポリアクリル酸（和
光純薬社製）の水溶液を濃度０．２重量％、ｐＨ４．０
に調製し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ；同仁化学社
製）を濃度０．０５重量％になるように加え、この溶液
に上記フィルムを２４時間浸漬（５℃以下）した後、希
酸、および純水で洗浄し、乾燥して、ポリアクリル酸処
理フィルムを得、以下の処理を氷浴中で行った。１／１
０Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）と生理食塩水との
等容量混合液にＷＳＣを０．２６ｍｇ／ｍｌになるよう
に加え、この液にポリアクリル酸処理フィルムを浸し、
１０分間撹拌した。次いで、ウロキナーゼ（ミドリ十字
社製）を最終濃度１５００国際単位／ｍｌになるように
添加し、５℃以下で４８時間放置した。このように処理
したフィルムを純水で洗浄、乾燥させ、ウロキナーゼ固
定化ナイロンフィルムを得た。このフィルムのウロキナ
ーゼ活性を合成基質法（Morita et al, J. Biochem., 8
2, 1495 (1977)）により測定したところ、９．７国際単
位／ｃｍ² であった。

【００１９】比較例１ 比較のために上記実施例１においてポリアクリル酸処理
を行わず、他は実施例１と同様の条件でナイロン６フィ
ルムを処理し、ナイロン６フィルムの表面のアミノ基又
はカルボキシル基に直接ウロキナーゼを固定化したもの
を得た。このフィルムのウロキナーゼ活性は、０．３国
際単位／ｃｍ² であった。

【００２０】実施例２ 外径１．６ｍｍ、内径１．０ｍｍ、長さ３０ｃｍのポリ
ウレタン製チューブを８０℃の純水で６時間処理し、純
水で洗浄、乾燥した。次いで、ポリアクリル酸（和光純
薬社製）の水溶液を濃度０．２重量％、ｐＨ４．０に調
製し、ＷＳＣを濃度０．０５重量％になるように加え、
この溶液に上記チューブを２４時間浸漬し（５℃以
下）、希酸、および純水で洗浄し、乾燥してポリアクリ
ル酸処理チューブを得、以下の処理を氷浴中で行った。
１／１０Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）と生理食塩
水との等容量混合液にＷＳＣを０．１５ｍｇ／ｍｌにな
るように加え、この液に前記のように処理を行ったチュ
ーブを浸し、１０分間放置し、次いで、ウロキナーゼ
（ミドリ十字社製）を最終濃度１５００国際単位／ｍｌ
になるように添加し、５℃以下で２４時間放置した後、
純水で洗浄、乾燥し、ウロキナーゼ固定化チューブを得
た。このチューブのウロキナーゼ活性を実施例１と同様
の方法で測定したところ、３．２国際単位／ｃｍ² であ
った。

【００２１】実施例３ 外径２．０ｍｍ、内径１．５ｍｍ、長さ５０ｃｍのポリ
ウレタン製チューブを８０℃の純水で６時間処理し、純
水で洗浄、乾燥した。次いで、ポリアクリル酸（和光純
薬社製）の水溶液を濃度０．２重量％、ｐＨ４．０に調
製し、ＷＳＣを濃度０．０５重量％になるように加え、
この溶液に上記チューブを３０時間浸漬した（５℃以
下）後、希酸、および純水で洗浄し、乾燥して、ポリア
クリル酸処理チューブを得、以下の処理を氷浴中で行っ
た。１／１０Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）と生理
食塩水との等容量混合液にＷＳＣを０．３ｍｇ／ｍｌに
なるように加え、この液に前記処理を行ったチューブを
浸し、１０分間放置した。次いで、組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター（Genentech 社製）を最終濃度０．１
ｍｇ／ｍｌになるように添加し、５℃以下で２４時間放
置後、チューブを純水で洗浄、乾燥させ組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター固定化チューブを得た。このチュ
ーブに固定化された組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーのフィブリン溶解活性を金井等の方法（「臨床検査法
提要」改訂第２７版，金原出版，ＶＩ−１００）を参照
して測定した。すなわち、長さ２ｍｍの試料片をフィブ
リン平板上にのせ、３７℃で２４時間インキュベートし
た後のフィブリン膜の溶解円の径を測定した。試料片を
中心に直径１４．５ｍｍのフィブリンが溶解した。

【００２２】実施例４ １ｃｍ角のナイロン６フィルムを２．５Ｎ塩酸に浸し、
３０℃で３０分処理した。次いで、ポリエチレンイミン
（ナカライテスク社製）の水溶液を濃度１重量％、ｐＨ
８．０に調製し、ＷＳＣを濃度０．４４重量％になるよ
うに加え、この溶液に上記フィルムを２４時間浸漬（５
℃以下）した後、純水で洗浄し、乾燥してポリエチレン
イミン処理フィルムを得、以下の処理を氷浴中で行っ
た。１／１０Ｍ−リン酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）と生理
食塩水との等容量混合液にウロキナーゼ（ミドリ十字社
製）を濃度１５００国最単位／ｍｌになるように加え、
この液に前記ポリエチレンイミン処理を行ったフィルム
を浸し、ＷＳＣを０．２６ｍｇ／ｍｌになるように加え
て７２時間放置した後、純水で洗浄、乾燥させ、ウロキ
ナーゼ固定化ナイロンフィルムを得た。このフィルムに
固定化されたウロキナーゼのフィブリン溶解活性を実施
例３と同様の方法で測定したところ、５ｍｍ角の試料片
を中心に直径１０．６ｍｍのフィブリンが溶解した。

【００２３】実施例５ 外径１．６ｍｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５０ｍｍのポリ
ウレタン製チューブを８０℃の純水で６時間処理し、純
水で洗浄、乾燥した。これとは別に、無水マレイン酸−
メチルビニルエーテル共重合体（五協産業社製，Gantre
z AN-119）１gを１００ｍｌの水に分散させ、４０℃で
一昼夜撹拌し溶解させた。この溶液に水酸化ナトリウム
溶液を加えｐＨ４．０に調製し、ＷＳＣを濃度０．０５
重量％になるように加え、上記チューブを２４時間浸漬
した（５℃以下）た後、希酸、および純水で洗浄し、乾
燥後、以下の処理を氷浴中で行った。１／１０Ｍ−リン
酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）と生理食塩水との等容量混合
液にＷＳＣを０．１５ｍｇ／ｍｌになるように加え、こ
の液に前記処理を行ったチューブを浸し、１０分間放置
し、次いで、組織プラスミノーゲンアクチベーター（Ge
nentech 社製）を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるよう
に添加し、５℃以下で２４時間放置した後、純水で洗
浄、乾燥し、組織プラスミノーゲンアクチベーター固定
化チューブを得た。このチューブに固定化された組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターのフィブリン溶解活性を
実施例３と同様の方法で測定したところ、長さ２ｍｍの
試料片を中心に直径１３．３ｍｍのフィブリンが溶解し
た。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、線溶活性物質の固定化
のための全反応を水系媒体中で行うことができるので、
材料の変形、寸法変化を起こすことなく効率よく線溶活
性物質を固定化することができる。また、有機溶媒を使
用するよりも安価であり、固定化処理後の有機溶媒の廃
液処理の問題もなくなる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面にアミノ基を有する材料を、カルボ
   キシル基を有する水溶性高分子化合物及び縮合剤を含有
   する水系媒体で処理し、次いで、線溶活性物質及び縮合
   剤を含有する水系媒体で処理することを特徴とする線溶
   活性物質の固定化方法。
2. 【請求項２】 表面にカルボキシル基を有する材料を、
   アミノ基を有する水溶性高分子化合物及び縮合剤を含有
   する水系媒体で処理し、次いで、線溶活性物質及び縮合
   剤を含有する水系媒体で処理することを特徴とする線溶
   活性物質の固定化方法。