JPH07250686A - Ｆｋ５０６結合蛋白遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、配列番号：１又は配列番号：２で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＦＫ５
０６結合蛋白遺伝子、殊に配列番号：２で示される塩基
配列を含む上記ＦＫ５０６結合蛋白遺伝子を提供する。 【効果】本発明遺伝子は、その利用によりＦＫ５０６結
合蛋白蛋白を発現でき、該蛋白は殊に生体における免疫
抑制の作用機序の解明や、自己免疫疾患（例えばリウマ
チ、ＳＬＥ等）に対する治療薬の開発、スクリーニング
等に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＦＫ５０６結合蛋白遺
伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＦＫ５０６は強力な免疫抑制剤であり、
これはしばしばサイクロスポリンＡ（（Borel,J.G. et
al., Agents Actions, 6, 468-471 (1976)）と同様に、
同種移植片拒絶反応（Thomson,A.W., Immunol.Today,1
0, 6-9 (1989)）の予防目的に使用される。その免疫抑
制作用のメカニズムは、早期免疫応答に臨界的な一連の
リンホカイン遺伝子の、Ｔ細胞活性化（Tocci,M. et a
l., J.Immunol.,143, 718-726 (1989) ）の間の、翻訳
抑制に焦点を合わせていると考えられるが、正確なメカ
ニズムは尚不明である。

【０００３】最近、ＡＦ５０６結合蛋白がヒトＴ細胞に
見出され、これがＦＫ５０６の１２ｋＤサイトソリック
リセプター（12 kD cytosolic recepter) であり、ペプ
チジル−プロリル シス−トランス イソメラーゼ活性
（ＰＰＩａｓｅ活性）を有することが証明された（Siek
ier,J. et al., J.Immunol.,143, 1580-1583 (198
9)）。

【０００４】その後、そのアミノ酸配列を基礎として多
くのＦＫ５０６結合蛋白及びそのｃＤＮＡクローンが単
離され、それらの核酸配列が同定された（例えば、ＦＫ
ＢＰ−１２（Standaert,R.F. et al., Nature,346, 671
-674 (1990) ; Maki,N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,
87, 5440-5443 (1990)）、ＦＫＢＰ−１３（Jin,Y. et
al., Proc.Natl.Acad.Sci., 88, 6677-6681 (1991)）、
ＦＫＢＰ−２５（Wiederrecht,G. et al., Biochem.Bio
phys.Res.Comm., 185, 298-303 (1992) ）、ＦＫＢＰ−
５２（Peattie,D.A. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89,
10974-10978 (1992)）等のヒトＦＫＢＰ類及びマウスＦ
ＫＢＰ（Nelson,P.A. et al., Gene, 109, 255-258 (19
91) ）、ウシＦＫＢＰ（Mozier,N.M. et al., Eur.J.Bi
ochem.,194, 19-23 (1990) ）、酵母ＦＫＢＰ（Heitma
n,J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 88, 1948-1952 (1
991)）、ノイロスポーラ クラッサ（Neurospora crass
a)ＦＫＢＰ（Tropschug,M. et al., Nature, 346, 674-
677 (1990)）及びナイセリア メンニジティス（Neisse
ria meningitis) ＦＫＢＰ（Sampson,B.A. et al.,Pro
c.Natl.Acad. Sci.,89, 1164-1168 (1992)）等）。

【０００５】上記ＦＫＢＰ類はいずれも、細胞内蛋白合
成の間の蛋白保持に必須と考えられる（Ficher,G. et a
l., Biomed.Biochim.Acta., 43, 1101-1111 (1984)）Ｐ
ＰＩａｓｅ活性を有している。該ＰＰＩａｓｅ活性がＴ
細胞活性化に必要であることを支持する証拠はないが、
ＦＫ５０６のＦＫＢＰ類への結合はＦＫＢＰ類のＰＰＩ
ａｓｅ活性阻害を引き起こし、Ｔ細胞の不活性化をもた
らすと考えれる（（Tropschug,M. et al., Nature, 34
6, 674-677 (1990)））。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、上記ＦＫ５０６結合蛋白としての新しいＦＫＢＦ類
の遺伝子、より詳しくは前記ヒトＦＫＢＰ−１２と相同
性が高く、その発現蛋白が高いＰＰＩａｓｅ活性を有す
る新規なＦＫＢＰ類の遺伝子を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＦＫ
５０６結合蛋白１２ｋＤ（ＦＫＢＰ−１２）と相同性の
高い蛋白をコードする新規な遺伝子を単離し、その全ｃ
ＤＮＡ配列を決定するに成功し、ここに本発明を完成す
るに至った。

【０００８】即ち本発明は、配列番号：１又は配列番
号：２で表わされるアミノ酸配列をコードするＦＫ５０
６結合蛋白遺伝子に係わる。

【０００９】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【００１０】本発明遺伝子は、上記配列番号：１で表わ
される１０８アミノ酸をコードする３２４核酸配列から
なるオープンリーディンフレームを含むことにより特徴
付けられる遺伝子を包含する。

【００１１】また、本発明遺伝子は、上記配列番号：２
で表わされる８０アミノ酸をコードする２４０核酸配列
からなるオープンリーディンフレームを含むことにより
特徴付けられる遺伝子を包含する。

【００１２】之等本発明遺伝子によってコードされる新
規なＦＫ５０６結合蛋白質は、高いＰＰＩａｓｅ活性を
有する特徴がある。

【００１３】また本発明遺伝子においては、例えば配列
番号：３に示されるように、一本鎖ＤＮＡ配列で表され
るが、本発明はかかる一本鎖ＤＮＡ配列に相補的なＤＮ
Ａ配列や之等の両者を含むコンポーネントも包含する。
尚、上記配列番号：３に示す本発明遺伝子を表すＤＮＡ
配列は、配列番号：１に示すアミノ酸配列に従う各アミ
ノ酸残基をコードするコドンの一つの組合わせ例であ
り、本発明遺伝子においてはこれに限らず、上記アミノ
酸配列を変えることなく各アミノ酸残基に対して任意の
コドンを組合わせ選択したＤＮＡ塩基配列を有すること
も勿論可能である。該コドンの選択は、遺伝子組換えに
利用する宿主のコドン使用頻度を考慮した常法に従うこ
とができ（Ncl.Acids Res., 9, 43-74(1981)）、之等は
常法に従って化学合成等により製造できる。

【００１４】更に本発明遺伝子には、上記で示されるア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を欠失、
付加等により改変してなり、本発明ＦＫ５０６結合蛋白
と同様のＰＰＩａｓｅ活性を有する同効物をコードする
ＤＮＡ配列もまた包含される。之等ポリペプチドの製
造、改変（変異）等は天然に生じることもあり、また翻
訳後の修飾により製造することができる。更に遺伝子工
学的手法により天然の遺伝子（本発明遺伝子）を、例え
ばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス等の方法に
より改変したり、ホスファイトトリエステル法等の化学
合成手段により変異させたＤＮＡを合成したり、両者を
組合せて所望の遺伝子を合成することができる。

【００１５】本発明遺伝子は、これを利用して、即ち例
えばこれを微生物のベクターに組込み、形質転換された
微生物を培養することによって、本発明ＦＫ５０６結合
蛋白を容易に大量に発現でき、該蛋白を単離、提供でき
る。これはＰＰＩａｓｅ活性を有することから、Ｔ細胞
活性化を始めとする各種薬理用途に有効であり、また、
各種の疾患の発生機序等や病態の解明等にも役立つもの
である。より具体的には、本発明遺伝子の利用により得
られる組換えＦＫ５０６結合蛋白は、免疫抑制剤の結合
蛋白質である面より、例えば生体における免疫抑制の作
用機序の解明や、自己免疫疾患（例えばリウマチ、ＳＬ
Ｅ等）に対する治療薬の開発、スクリーニングや、新し
い結合蛋白の内因性リガンドの探索と治療薬の開発等に
有効利用できるものである。

【００１６】以下、本発明遺伝子につき詳述すれば、本
発明遺伝子の単離は、一般的遺伝子工学的手法により、
例えばヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー（ＦＫ５０６
結合蛋白をコードする遺伝子を含む適当な起源細胞より
全ＲＮＡを分離し、これよりｍＲＮＡを単離、精製し、
より常法に従い合成されるｃＤＮＡ）から適当なプロー
ブを用いてクローンを選択し、該クローンを精製し、そ
の塩基配列を決定することにより実施できる。かくし
て、本発明遺伝子を得ることができる。

【００１７】上記方法において、起源細胞としては、Ｆ
Ｋ５０６結合蛋白の存在が知られている各種動物の細
胞、組織や之等に由来する培養細胞の可溶性画分等のい
ずれでもよく、これは培養上清から各種のクロマトグラ
フィー操作に従って単離精製することができる。

【００１８】上記ＦＫ５０６結合蛋白発現起源細胞は、
適当な細胞培養培地を利用して、常法の細胞培養法に従
い培養できる。ここで用いられる培地としては、例えば
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＣＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０
６６培地、ダルベッコ改変イーグルの最小必須培地（Ea
gle's MEM ）、フィッシャーの培地、Ｆ−１０培地等を
例示できる。之等培地には必要に応じて牛胎児血清（Ｆ
ＣＳ）等の血清やアルブミン等の血清成分を適宜添加す
ることもできる。培養は、通常の方法、例えば炭酸ガス
培養法等により実施でき、一般には約３０〜４０℃程
度、好ましくは約３７℃前後で、約５〜１７日間、好ま
しくは約８〜１１日間程度を要して行なわれる。

【００１９】上記培養細胞乃至組織からの全ＲＮＡの分
離は、一般的な抽出法に従い実施でき、この抽出操作
は、上記培養により培養上清中にＦＫ５０６結合蛋白が
最も多く生産蓄積される時期に行なわれるのがよい。ま
た、上記起源組織乃至培養細胞からの全ＲＮＡの抽出
は、例えば組織を用いる場合は、氷冷下にＥＤＴＡ、Ｄ
ＴＴ（ジチオスレイトール）等を加えたリン酸カリウム
緩衝液等の適当な緩衝液中で、組織を破砕後、グアニジ
ン・イソシアネート混合液や適当な界面活性剤、例えば
ＳＤＳ、ＮＰ−４０、トリトンＸ１００、デオキシコー
ル酸等を用いて、或はホモジナイザーや凍結融解等の物
理的方法によって、部分的に又は完全に破壊、可溶化さ
せた後、染色体ＤＮＡをポリトロン（POLYTRON, Kinema
tica Switzerland）等のミキサーもしくは注射筒を用い
てある程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分
別することにより行ない得る。この操作には、特にフェ
ノール・クロロホルム抽出もしくは１０００００×ｇ程
度の超遠心を用いる塩化セシウム重層法（Chirgwin,J.
M., et al., Biochemistry,18, 5294(1979)）等を一般
的に採用できる。また、上記各方法においては、ＲＮａ
ｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、ＲＮａｓｅイン
ヒビター、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチル
ピロカーボネート、バナジウム複合体、ベントナイト、
マカロイド等を添加しておくのがよい。

【００２０】上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからの
ｍＲＮＡの分離、精製は、抽出物を例えばオリゴｄＴ−
セルロース（Collaborative Research Inc. ）、ポリＵ
−セファロース（Pharmacia 社）、セファロース２Ｂ
（ファルマシア社製）等の吸着カラムを用いる方法によ
り又はバッチ法により実施できる。

【００２１】上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常
不安定であり、安定な相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の型に代
えられ、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由
来のレプリコンに接続される。インビトロでの上記ｍＲ
ＮＡのｃＤＮＡへの変換、即ちｃＤＮＡの合成は、一般
に次のようにして行なうことができる。

【００２２】即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとし
（このプライマーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベク
タープライマーに付加されたオリゴｄＴのいずれであっ
てもよい）、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で、逆
転写酵素を用いてｍＲＮＡからこれに相補的な一本鎖ｃ
ＤＮＡを合成する。次のステップは上記において遊離の
オリゴｄＴを用いたか、ベクタープライマーに付加され
たオリゴｄＴを用いたかにより、それぞれ以下の如く異
なる。

【００２３】前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカ
リ処理等により分解して除去し、その後一本鎖ＤＮＡを
鋳型として、逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用い
て、二本鎖ＤＮＡを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮ
Ａの両端をエキソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれ
に適当なリンカーＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数付加し、これを適当なベクターに組込む。
これは使用するベクターに応じてそれぞれ公知の方法、
例えばグブラーとホフマンの方法等に従い行なうことが
できる。また上記ｃＤＮＡの合成には、市販のｃＤＮＡ
合成キットを用いることもでき、これによればより操作
が容易となる利点がある。ここで用いられるベクターと
しては、特に制限はないが、λｇｔ系のファージベクタ
ーやＥＫ系プラスミドベクター等を単独でもしくは組合
せて、宿主に応じて適当に選択するのがよい。上記λｇ
ｔ系のファージベクターの具体例としては、λｇｔ１
０、λｇｔ１１等を例示できる。之等λｇｔ系ファージ
ベクターを用いる方法は、ヤングらの方法に準じること
ができる（Young,R.A., et al., in DNA Cloning, 1,49
(1985) ）。

【００２４】また後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを残
存させたまま、上記と同様のアニーリング可能な組合せ
の塩基を複数付加した開環状プラスミドと、リンカーＤ
ＮＡ（しばしば動物細胞で自立複製できる領域とｍＲＮ
Ａの転写プロモーター領域を含むＤＮＡ断片が用いられ
る）とを、アニーリングさせて閉環状とした後、ｄＮＴ
Ｐ存在下でＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラーゼＩとを共
存させて、ｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換して完全なプラス
ミドＤＮＡを作成する。

【００２５】上記の如くして得られるＤＮＡは、これを
ベクターの宿主、例えばエシェリヒア コリ(Esherichi
a coli) 、バチルス ズブチリス(Bacillus subtilis)
、サッカロミセス セレビシアエ (Saccharomyces cer
evisiae) 等の適当な宿主内に導入して、これを形質転
換できる。このＤＮＡの宿主への導入及び形質転換法と
しては、一般に用いられる方法、例えば主として対数増
殖期にある細胞を集め、ＣａＣｌ₂ 処理して自然にＤＮ
Ａを取り込みやすい状態にしてプラスミドを取り込ませ
る方法等を採用できる。上記方法においては、通常知ら
れているように形質転換の効率を一層向上させるために
ＭｇＣｌ₂ やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。
また微生物細胞をスフェロプラスト又はプロトプラスト
化してから形質転換させる方法も採用できる。之等の方
法の詳細は、グブラーとホフマンの方法（Gubler,U. an
d Hoffman,B.J., Gene, 25, 263(1983) ）に記載されて
いる。また一般にファージベクターとしてよく用いられ
ているλファージをベクターとする場合は、インビトロ
パッケージング（in vitro packaging）にて、λファー
ジによるｃＤＮＡライブラリーを作製することができ
る。尚、該ｃＤＮＡライブラリーとしては、市販のｃＤ
ＮＡライブラリー、例えばクローンテック（Clontech）
社より市販の各種ｃＤＮＡライブラリーを用いることも
できる。

【００２６】かくして得られるｃＤＮＡライブラリーか
らの、本発明目的遺伝子のスクリーニングは、通常の方
法により実施できる。該スクリーニング方法としては、
例えばｃＤＮＡの産生する蛋白質に対してＦＫ５０６結
合蛋白特異抗体を使用して、ウエスタンブロッティング
により対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的
のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたサザ
ンブロッティング法、ノーザンブロッティング法等や之
等の組合せを例示できる。ここで用いられるプローブと
しては、目的のＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はそれによりコ
ードされるアミノ酸配列に関する情報をもとにして化学
合成されたＤＮＡ配列等を用いるのが一般的であり、天
然から調製されたＤＮＡやＲＮＡもかかるプローブとし
て利用できる。

【００２７】上記プローブの調製は、より詳しくは、以
下の如くして実施される。即ち、ＦＫ５０６結合蛋白を
含む組織もしくは培養細胞より得られるＲＮＡからオリ
ゴｄＴ−セルロースカラムにてポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを選
別し、上記方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを合成し、反応を
停止させた後、ＦＫ５０６結合蛋白の一部のアミノ酸配
列情報に対応すると考えられるプライマーを自動オリゴ
ヌクレオチド合成機で合成し、これを用いてＰＣＲ法
（Saiki,R.K., et al., Science, 230, 1350-1354(198
5) ）により一本鎖ｃＤＮＡを増幅させる。

【００２８】次に増幅させたｃＤＮＡ断片を１．０％ア
ガロースゲル電気泳動により単離精製する。上記で得ら
れるＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、常法に従うことが
できる。例えば得られたＤＮＡ断片を適当な制限酵素に
てＤＮＡ消化した後、ジデオキシ法（Sanger F., Nickl
en S. and Coulson A.R., DNA sequencing with chain-
terminating inhibitors, Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.
A.,74,5463-5467(1977)）やマキサム−ギルバート法（M
axam,A.M. and Gilbert,W., Method in Enzymology,65,
499(1980) ）等により行なうことができる。更に、上
記塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用
いても容易に行ない得る。

【００２９】かくして、決定された本発明遺伝子の一具
体例の全ＤＮＡ塩基配列は配列番号：３に示す通りであ
る。

【００３０】本発明においては、上記で配列決定された
ＤＮＡ断片の一部をプローブとし、これを例えばランダ
ムプライムＤＮＡラベル化法（Feinberg,A.P., et al.,
Anal.Biochem., 137, 266-267(1984)）を用いたランダ
ムプライムＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製、アマ
ーシャム社製等）を用いて標識し、かくして得られる標
識プローブを目的とする本発明遺伝子のスクリーニング
に利用することもできる。

【００３１】目的ＤＮＡのスクリーニングは、上記標識
プローブ等を用いて、ベントンとデービスにより開発さ
れたプラークハイブリダイゼーション法（Benton,W. an
d Davis,R., Science, 196, 383-394(1977) ）等に従っ
て実施できる。

【００３２】上記で得られる本発明遺伝子は、常法に従
って各種プラスミドにクローニングできる。例えば適当
な制限酵素にて切断後、精製した本発明遺伝子断片を、
同制限酵素にて切断して精製したプラスミド等のクロー
ニングベクターの切断部位に挿入すればよく、これによ
り組換え体プラスミドを収得できる。該組換え体を適当
な宿主、例えば大腸菌に形質導入し、該形質転換体よ
り、通常公知の方法、例えばMolecular Cloning (A Lab
oratory Manual), T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambro
ok, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) p104-106
に記載の方法等に従うことにより、該遺伝子がコードさ
れるクローンの制限酵素地図を作成できる。上記クロー
ンの塩基配列決定は、これを適当な制限酵素にて消化
後、前記ジデオキシ法やマキサム−ギルバート法等に従
い実施できる。更に上記塩基配列の決定は、市販のシー
クエンスキット等を用いても容易に行ない得る。

【００３３】かくして、決定された本発明ＦＫ５０６結
合蛋白遺伝子によりコードされる対応アミノ酸配列は、
配列番号：１及び配列番号：２に示す通りである。

【００３４】上記本発明遺伝子（ＤＮＡ）を利用して、
公知の各種遺伝子組換え技術〔例えばScience, 224,143
1,(1984) ; Biochem.Biophys.Res.Comm., 130, 692 (19
85): Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 80, 5990 (1983)
等参照〕に従って、本発明の組換え体ＦＫ５０６結合蛋
白を得ることができる。

【００３５】該ＦＫ５０６結合蛋白の製造は、より詳細
には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤ
ＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、
該形質転換株を培養することにより行なわれる。ここで
宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用
いることができる。脊椎動物細胞の発現ベクターとして
は、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロ
モーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部
位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これ
は更に必要により複製起点を有していてもよい。また真
核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でも
サッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母等の
真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフ
アターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８
２〔A.Miyanohara et al, Proc.Natl. Acad. Sci., U.
S.A., 80, 1-5 (1983)〕等を利用できる。原核生物の宿
主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく用いられる。
之等を宿主とする場合、本発明では例えば該宿主菌中で
複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン（例え
ばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを利用するのが好
ましい。上記宿主としての大腸菌としては、エシエリヒ
ア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２株等がよく用いら
れ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２がよく用いら
れるが、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベクタ
ーをも利用できる。プロモーターとしては、例えばトリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター、lpp プロモータ
ー、lac プロモーター、Ｐ_L プロモーター等を使用でき
る。

【００３６】かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿
主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法として
は、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質
転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺
伝子によりコードされる目的のＦＫ５０６結合蛋白が生
産、蓄積される。該培養に用いられる培地としては、採
用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選
択利用できる。例えば宿主細胞として大腸菌等を利用し
た形質転換体の培養には、ＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培
地、Ｍ６３培地等を使用でき、之等培地には更に必要に
応じて通常公知の各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビタ
ミン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加できる。
上記形質転換体の培養は、宿主細胞の生育に適した条件
下で実施でき、大腸菌の場合は例えばｐＨ約５〜８、好
ましくは７又はその付近、温度約２０〜４３℃、好まし
くは３７℃又はその付近を採用できる。上記により、形
質転換体の細胞内乃至は細胞外に目的とする組換えＦＫ
５０６結合蛋白蛋白が生産、蓄積乃至分泌される。

【００３７】該目的蛋白は、その物理的性質、化学的性
質等を利用した各種の分離操作（「生化学データーブッ
ＩＩ」、1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日
株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, vol.25, N
o.25, 8274-8277(1986); Eur.J. Biochem., 163, 313-3
21 (1987) 等参照）により分離、精製できる。該方法と
しては、具体的には例えば通常の再構成処理、蛋白沈澱
剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック
法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー
（ゲル瀘過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体
クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例示で
きる。上記により容易に高収率で所望の組換え蛋白を工
業的規模で製造できる。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、ＦＫ５０６結合蛋白遺
伝子が提供され、該遺伝子を用いれば、ＦＫ５０６結合
蛋白を容易に大量に製造でき、該蛋白は、ＰＰＩａｓｅ
活性を有することから、各種疾患治療薬の開発等に利用
可能である。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００４０】

【実施例１】 （１）クローニング及びシークエンシング ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社、
ＣＡ；Ｕｎｉ−ＺａｐＩＩベクター）より、ヒトＦＫ５
０６結合蛋白１２ｋｄａと相同性の高い１．０ｋｂクロ
ーンを常法に従い選択し、これをＯＴＫ４と名付けた。

【００４１】上記ＯＴＫ４をプローブとして、同ｃＤＮ
Ａライブラリー（約百万プラーク）をスクリーニング
し、更に、ＯＴＫ４（６−１）及びＯＴＫ４（４−１）
と名付けた２つのｃＤＮＡクローンを得た。之等３つの
ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列を、³²Ｓ−ｄＴＴＰを用
いたデオキシ−ターミネーション法により決定した。

【００４２】その結果、ＯＴＫ４とＯＴＫ４（６−１）
は、同一の核酸配列を有することが判った。

【００４３】ＯＴＫ４（６−１）の完全核酸配列は、配
列番号：３に示される通りである。

【００４４】このクローンは、配列番号：１で表わされ
る１０８アミノ酸をコードする３２４核酸配列のオープ
ンリーディングフレームを有しており、その７２塩基配
列の５′非コード領域はＧＣ−リッチ配列を含み、４７
０塩基配列の３′−非コード領域にはポリアデニル化シ
グナルＡＡＴＡＡＡに次いでポリＡテイルが認められ
た。

【００４５】一方、他のクローンＯＴＫ４（４−１）
は、配列番号：２で表わされる８０アミノ酸をコードし
ており、これはＯＴＫ４（６−１）のスプライシング形
態と考えられた。該ＯＴＫ４（４−１）は、ＯＴＫ４
（６−１）のコード領域の１９９塩基部位（６６位Ａｌ
ａの後）に、１４アミノ酸配列と終始コドンとをコード
する４５塩基配列が挿入されたものであり、その結果、
上記８０アミノ酸配列をコードしている。

【００４６】ＦＫＢＰ−１２（Van Duyne,G.D. et a
l., Science,252, 839-842 (1991) ）の構造解析を基礎
として、ＯＴＫ４（４−１）は、５つのベーター−シー
ト（beta-sheets ）を有するＯＴＫ４（６−１）に比し
て、Ｃ−末端領域において、２つのベーター−シート及
びそれらの間の一つのループ（loop）を欠失していた。

【００４７】上記両クローンの模式図を図１に示す。該
図中、矢印は後述するＰＣＲプライマーＦＫ−１、ＦＫ
−２及びＦＫ−３）を示し、ＥＸは上記４５塩基配列の
挿入領域を示す。

【００４８】（２）他のＦＫＢＰ類との相同性 ＯＫＴ４（６−１）は、ヒトＦＫＢＰ−１２と最も高い
相同性を示した。即ち、ヒトＦＫＢＰ−１２と核酸配列
で７６％、アミノ酸配列で８８％の相同性を示した。

【００４９】また、これはヒトＦＫＢＰ−５２（Peatti
e,D.A. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,89, 10974-10978
(1992)）、ＦＫＢＰ−１３（Jin,Y. et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci., 88, 6677-6681 (1991)）及びＦＫＢＰ−
２５（Wiederrecht,G. et al.,Biochem.Biophys.Res.Co
mm., 185, 298-303 (1992) ）とはそれぞれ、４９．５
％（９７アミノ酸）、４４．６％（９２アミノ酸）及び
３８．０％（１０８アミノ酸）の相同性を示した。

【００５０】（３）組換え蛋白の製造 ＯＴＫ４（６−１）ｃＤＮＡの全コード領域を、Ｂａｍ
ＨＩサイトを有する下記表１に示すＦＫ−１及びＦＫ−
２をプライマーとしてＰＣＲ法により増殖させた。

【００５１】

【表１】

【００５２】ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩで消化し、ＰＧ
ＥＸ２Ｔ発現ベクター（ファルマシア社）のＢａｍＨＩ
サイトにクローン化した。

【００５３】本発明の組換えＦＫ５０６結合蛋白質（Ｏ
ＴＫ４蛋白）を、文献記載の方法（Ayer,D.E. et al.,
Cell, 72, 211-222 (1993)）に準じて、大腸菌（E. col
i DH5 ）を用いて、ＧＳＴ融合蛋白として発現させ、製
造、精製した。

【００５４】即ち、上記で得たＰＧＥＸ２Ｔ発現ベクタ
ーにより形質転換した大腸菌のコロニーを２０ｍｌＬＢ
／アンピシリン培地に接種し、１２〜１５時間、３７℃
でインキュベートした。

【００５５】培養物を新鮮なＬＢ／アンピシリン培地２
００ｍｌで１：１０に希釈した。

【００５６】１時間インキュベーション後、１ｍＭ Ｉ
ＰＴＧを加え、更に３〜５時間インキュベートした。

【００５７】細胞を３０００ｒｐｍでペレット化し、冷
却した破砕緩衝液５ｍｌに再懸濁させ、超音波破砕し、
次いで氷上で１時間インキュベートした。

【００５８】細胞溶解物を３０００ｒｐｍで遠心分離
し、上清をグルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシ
ア社）に加え、４℃で１時間インキュベートした。

【００５９】混合物を３００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、上清を除去した。グルタチオンセファロース４Ｂを
ＰＢＳで３度及びＰＢＳ−Ｔ（１％トリトンＸ含有ＰＢ
Ｓ）で１度洗浄した。

【００６０】ＧＳＴタグを除く全長のＯＴＫ４蛋白を得
るために、ＧＳＴ融合蛋白をトロンビンで切断し、グル
タチオンセファロース４Ｂを洗浄液（５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄
後、トロンビン切断緩衝液（２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 含
有洗浄液）９００ｍｌ及びトロンビン（シグマ社）１０
０ｍｌをグルタチオンセファロース４Ｂ中加え、混合物
を２５℃で１時間インキュベートし、次いで３００ｒｐ
ｍで遠心分離した。

【００６１】かくして得られたＯＴＫ４蛋白（上清）を
−８０℃で貯蔵した。

【００６２】（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クマーシーブル
ー染色及び蛋白量の測定 ＯＴＫ４蛋白を、１５％ポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動を行ない、次いで蛋白をクマーシーブリリアント
ブルー染色（Wilson,C.M. et al., Methods Enzymol.,
91, 236-247 (1983)）して分析した。

【００６３】結果を図２に示す。図２中、レーン１は上
記ＩＰＴＧ非誘導の時の全細胞蛋白を、レーン２は同Ｉ
ＰＴＧ誘導時の全細胞蛋白を、レーン３は同精製処理後
のＧＳＴ−ＯＴＫ４融合蛋白を、またレーン４は同切断
処理後のＯＴＫ４蛋白をそれぞれ示す。

【００６４】また、上記で精製されたＯＴＫ４蛋白の蛋
白量を、ローリー法（Lowry,O.H. et al., Nature, 33
7, 476-478 (1989)）により測定した。その結果、該蛋
白量は５００ｍｇ／ｍｌであった。

【００６５】（５）ＰＰＩａｓｅ活性測定 精製された蛋白の酵素活性を文献記載の方法（Fisher,
G. et al., Nature, 337, 476-487 (1989) ）を、以下
のように変形して測定した。即ち、ペプチド（Ｎ−スク
シニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロ
アニリド）中、のプロリン−アラニン ペプチド結合の
異性化（シスからトランスへ）を測定した。

【００６６】上記ペプチドのトランス体は、キモトリプ
シンにより、ｐ−ニトロアニリドの遊離を伴って、容易
に分解され、これは４０５ｎｍでの吸光度測定により定
量できる。

【００６７】反応液１．０ｍｌは最終濃度０．１ｍＭ上
記ペプチド基質（２．１ｍＭストック溶液から３０μｌ
（取り出して使用）、１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．８）及び１．０μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌのＯ
ＴＫ４蛋白を含み、２５℃にて反応を行なった。

【００６８】１分後、２ｍｇ／ｍｌキモトリプシン（シ
グマ社）を含む１００ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）
３０μｌを加え、混合し、１０秒後から分光光度計にて
４０５ｎｍの吸収を１０秒間隔にて測定した。

【００６９】結果を図３〔縦軸＝吸光度（４０５ｎ
ｍ）、横軸＝時間（１０秒）〕に示す。図３中、白丸の
曲線はＯＴＫ４蛋白１．０μｇ／ｍｌを使用した時の結
果であり、黒丸の曲線は同１０μｇ／ｍｌの結果であ
り、黒三角はＯＴＫ４蛋白を含まないコントロールの結
果である。

【００７０】該図より、コントロールに比べて著しい吸
光度の増加がＯＴＫ４蛋白添加群において認められ、Ｏ
ＴＫ４蛋白の使用量に応じた活性が認められた。

【００７１】（６）各種臓器のノーザンブロット解析 いろいろな組織でのＯＴＫ４遺伝子の発現量を調べるた
めに、クロンテック社のｍＲＮＡ（human miltiple-tis
sue Northern blot system）を用いて試験した。

【００７２】即ち、５０％フォルムアミド、１０×デン
ハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、２％ＳＤＳ及び１００μｇ
変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液で５０℃、４時間のハイ
ブリダイゼーションと１８時間のハイブリダイゼーショ
ンを行なった。プローブとしては、³²Ｐで標識したＯＴ
Ｋ４ｃＤＮＡを用いた。洗浄は２×ＳＳＣ、０．０５％
ＳＤＳで室温、１０分間、３回行なった。そして、更
に０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで５０℃、１５分
間、２回行なった。そして、−８０℃、６０時間、露光
した。

【００７３】結果を図４に示す。

【００７４】図において、各レーンはレーン１から順
次、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、
脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢白
血球の各組織を示し、左端にｍＲＮＡのサイズマーカー
（ｋｂ）を示した。

【００７５】該図より、ＯＴＫ４遺伝子ｍＲＮＡの発現
が、種々の組織で認められることが判る。

【００７６】（７）各種臓器のＲＴ（reverse transcri
ptase ）−ＰＣＲ解析 ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim GmbH)社
のランダムｐ（ｄＮ）₆ を用いて、各臓器のＲＮＡ１０
μｇを逆転写し、ＦＫ−１プライマーとＦＫ−２プライ
マー（表１参照）を用いてＰＣＲ反応を行なった。反応
条件は９４℃−０．５分、５４℃−１分及び７２℃−１
分を１サイクルとして４０サイクル実施した。

【００７７】次いで、常法に従って２％アガロースゲル
電気泳動を行ない、ナイロン膜にトランスファーし、³²
Ｐで末端標識したＦＫ−３（表１参照）と５０℃ハイブ
リダイゼーションさせた。室温、６×ＳＳＣ、１０分
と、更に５０℃、１０分洗浄し、オートラジオグラフィ
ーにて検出した。アクチンをコントロールとした。

【００７８】結果を図５に示す。図５中の各臓器は次の
ものである。

【００７９】cerebrum…大脳 cerebellum…小脳 liver …肝臓 kidney…腎臓 skeltal muscle…骨格筋 stomach …胃 ileum …回腸 colon …結腸

【００８０】該図より、ＯＴＫ４（４−１）に対してＯ
ＴＫ４（６−１）の発現が優勢であるが、いずれもよく
発現されていることが判る。

【配列表】

【００８１】配列番号：１ 配列の長さ：１０８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Gly Val Glu Ile Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Lys Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Gln 20 25 30 Asn Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Arg Ile Gly Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Phe Glu Glu Gly Ala 50 55 60 Ala Gln Met Ser Leu Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Cys Thr Pro Asp 65 70 75 80 Val Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Val Ile Pro Pro Asn Ala 85 90 95 Thr Leu Ile Phe Asp Val Glu Leu Leu Asn Leu Glu 100 105

【００８２】配列番号：２ 配列の長さ：８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Gly Val Glu Ile Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe 1 5 10 15 Pro Lys Lys Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Gln 20 25 30 Asn Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys 35 40 45 Phe Arg Ile Gly Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Phe Glu Glu Gly Ala 50 55 60 Ala Gln Leu Gly Pro Leu Ser Pro Leu Pro Ile Cys Pro His Pro Cys 65 70 75 80

【００８３】配列番号：３ 配列の長さ：８７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： 直接の起源 ライブラリー名：ヒト胎児脳cDNAライブラリー クローン名：ＯＴＫ４（６−１） 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７０．．３９３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列： CGCTGGGCCG GAGCCGAGCC GGGGTCGGGC AGCAGCAGGA CCCCCAGAGG CGGGGCCTGT 60 GGGACCGCT ATG GGC GTG GAG ATC GAG ACC ATC TCC CCC GGA GAC GGA 108 Met Gly Val Glu Ile Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly 1 5 10 AGG ACA TTC CCC AAG AAG GGC CAA ACG TGT GTG GTG CAC TAC ACA GGA 156 Arg Thr Phe Pro Lys Lys Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly 15 20 25 ATG CTC CAA AAT GGG AAG AAG TTT GAT TCA TCC AGA GAC AGA AAC AAA 204 Met Leu Gln Asn Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys 30 35 40 45 CCT TTC AAG TTC AGA ATT GGC AAA CAG GAA GTC ATC AAA GGT TTT GAA 252 Pro Phe Lys Phe Arg Ile Gly Lys Gln Glu Val Ile Lys Gly Phe Glu 50 55 60 GAG GGT GCA GCC CAG ATG AGC TTG GGG CAG AGG GCG AAG CTG ACC TGC 300 Glu Gly Ala Ala Gln Met Ser Leu Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Cys 65 70 75 ACC CCT GAT GTG GCA TAT GGA GCC ACG GGC CAC CCC GGT GTC ATC CCT 348 Thr Pro Asp Val Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Val Ile Pro 80 85 90 CCC AAT GCC ACC CTC ATC TTT GAC GTG GAG CTG CTC AAC TTA GAG 393 Pro Asn Ala Thr Leu Ile Phe Asp Val Glu Leu Leu Asn Leu Glu 95 100 105 TGAAGGCAGG AAGGAACTCA AGGTGGTGGC TGGAGATGGC TGCTGCTCAC CCTCCTAGCC 453 TGCTCTGCCA CTGGGACGGC TCCTTGCTTT TGGGGCTCTT GATCAGTGTG CTAACCTCAC 513 TGCCTCATGG CATCATCCAT TCTCTCTGCC CAAGTTGCTC TGTATGTGTT CGTCAGTGTT 573 CATGCGATTC TTGCTTGAGG AAACTTCGTG CAGATTAAGC ATTCAAGGTT GTGCATTTTG 633 TGTGATGCAG TAGTAGCCTT TCCTGATAAC AGAACACAGA TCTCTTGTTC GCACAATCTA 693 CACTAGCCAT TACCTTCACA TTAAACCACA CACAAGGTGC TCAGACATGA AATGTACATG 753 GCGTACCGTA CACAGAGGGA CTTGAGCCAG TTACCTTTGC TGTCACTTTC TCTCTTATAA 813 ATTCTGTTAG CTGCTCACTT AAACAATGTC CTCTTTGAGA AAATGTAAAA TAAAGGCTCT 873 GAGCTT 879

【図面の簡単な説明】

【図１】ＯＫＴ４（６−１）（上段）及びＯＴＫ４（４
−１）（下段）の塩基配列の模式図である。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＯＫＴ４蛋白の分析結
果を示す図である。

【図３】ＯＫＴ４蛋白のＰＰＩａｓｅ活性を示す図であ
る。

【図４】ＯＴＫ４遺伝子を用いた各組織のノーザンブロ
ット解析の結果を示す図である。

【図５】各種臓器のＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＯＴＫ４
（４−１）及びＯＴＫ４（６−１）の発現を調べた結果
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１又は配列番号：２で表わされ
   るアミノ酸配列をコードするＦＫ５０６結合蛋白遺伝
   子。