JPH1091A - 好熱性古細菌由来のｆｋｂｐタイプｐｐｉアーゼ、及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
好熱性古細菌由来のｆｋｂｐタイプｐｐｉアーゼ、及びそれをコードする遺伝子Info
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- JPH1091A JPH1091A JP8152546A JP15254696A JPH1091A JP H1091 A JPH1091 A JP H1091A JP 8152546 A JP8152546 A JP 8152546A JP 15254696 A JP15254696 A JP 15254696A JP H1091 A JPH1091 A JP H1091A
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- ppiase
- protein
- amino acid
- acid sequence
- gene
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 耐熱性が高く、変性蛋白質の再生、蛋白
質試薬の安定化、組み換え蛋白質の生産、さらには新規
免疫抑制剤、生理活性物質の開発に有用な酵素であるＰ
ＰＩアーゼ、及びそれをコードする遺伝子。 【効果】 変性蛋白質の再生、蛋白質試薬の安定化、組
み換え蛋白質の生産、新規免疫抑制剤、生理活性物質の
探索などに有用なＰＰＩアーゼ、及びそれをコードする
遺伝子を提供する。
質試薬の安定化、組み換え蛋白質の生産、さらには新規
免疫抑制剤、生理活性物質の開発に有用な酵素であるＰ
ＰＩアーゼ、及びそれをコードする遺伝子。 【効果】 変性蛋白質の再生、蛋白質試薬の安定化、組
み換え蛋白質の生産、新規免疫抑制剤、生理活性物質の
探索などに有用なＰＰＩアーゼ、及びそれをコードする
遺伝子を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性が高く、変
性蛋白質の再生、蛋白質試薬の安定化、組み換え蛋白質
の生産、さらには新規免疫抑制剤、生理活性物質の開発
に有用な酵素であるＰＰＩアーゼ(Peptidyl prolyl cis
-trans isomerase) 、及びそれをコードする遺伝子に関
する。本遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微
生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積
される蛋白質を採集することにより得られる蛋白質は、
種々の用途に利用することができる。
性蛋白質の再生、蛋白質試薬の安定化、組み換え蛋白質
の生産、さらには新規免疫抑制剤、生理活性物質の開発
に有用な酵素であるＰＰＩアーゼ(Peptidyl prolyl cis
-trans isomerase) 、及びそれをコードする遺伝子に関
する。本遺伝子を組み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微
生物や培養細胞を培養液中で培養し、該培養物中に蓄積
される蛋白質を採集することにより得られる蛋白質は、
種々の用途に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質はポリペプタイドであり、その構
造形成、維持に働く因子が近年着目されている。分子シ
ャペロン、ＰＰＩアーゼがそれである。遺伝子組み換え
技術による有用蛋白質生産において、大腸菌等の系にお
いては過剰生産により不活性な封入体として目的蛋白質
が生産されることがある。このような不活化蛋白質を活
性化するには、不活性な封入体を回収後、変性剤により
可溶化し、希釈による再生反応時にこれらの因子を共存
させる方法、及びこれらの因子をコードする遺伝子とと
もに目的遺伝子を発現させる方法が考えられている。一
方、蛋白質試薬にはその液状化、および室温保存化が望
まれているが、これらの因子を共存させることによって
可能になると考えられる。
造形成、維持に働く因子が近年着目されている。分子シ
ャペロン、ＰＰＩアーゼがそれである。遺伝子組み換え
技術による有用蛋白質生産において、大腸菌等の系にお
いては過剰生産により不活性な封入体として目的蛋白質
が生産されることがある。このような不活化蛋白質を活
性化するには、不活性な封入体を回収後、変性剤により
可溶化し、希釈による再生反応時にこれらの因子を共存
させる方法、及びこれらの因子をコードする遺伝子とと
もに目的遺伝子を発現させる方法が考えられている。一
方、蛋白質試薬にはその液状化、および室温保存化が望
まれているが、これらの因子を共存させることによって
可能になると考えられる。
【０００３】一方、ＰＰＩアーゼは免疫抑制剤サイクロ
スポリンＡ及びＦＫ５０６のターゲット分子であるこ
と、また細胞内での蛋白質の折り畳み、細胞内情報伝達
系に関与すること等から、その阻害剤を探索すること
は、新規免疫抑制剤、その他の生理活性物質の開発につ
ながると考えられる。
スポリンＡ及びＦＫ５０６のターゲット分子であるこ
と、また細胞内での蛋白質の折り畳み、細胞内情報伝達
系に関与すること等から、その阻害剤を探索すること
は、新規免疫抑制剤、その他の生理活性物質の開発につ
ながると考えられる。
【０００４】これまで市販されているＰＰＩアーゼは、
例えばシグマ社からCyclophilin（サイクロスポリンＡ
結合性蛋白質）タイプ及びＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合性
蛋白質）タイプのものがそれぞれ、２種類、１種類ずつ
上市されている（シグマ社1996年度カタログP.311及び
P.447)が、いずれも動物由来のものでありその安定性は
低く、４℃あるいは−２０℃という低温で保存する必要
があった。また、いずれも動物の臓器から調製してお
り、供給源の確保にも問題があった。これに関し、〔Jo
urnal of Fermentation and Bioengineering, Vol.79,
No.2, 87-94, 1995 〕に好熱性真正細菌であるBacillus
stearothermophilus 由来のCyclophilinタイプＰＰＩ
アーゼが報告されているが、６５℃では失活が起こって
しまいそれほど熱安定性は高くない。また、これはサイ
クロスポリンＡに感受性ではないので動物のタイプと異
なっており、免疫抑制剤探索には利用しにくいと考えら
れる。一方、ＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼでは、耐熱性
のものはこれまでに見いだされていなかった。このこと
から、より耐熱性に優れた新しいＰＰＩアーゼの発見が
期待されていた。
例えばシグマ社からCyclophilin（サイクロスポリンＡ
結合性蛋白質）タイプ及びＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合性
蛋白質）タイプのものがそれぞれ、２種類、１種類ずつ
上市されている（シグマ社1996年度カタログP.311及び
P.447)が、いずれも動物由来のものでありその安定性は
低く、４℃あるいは−２０℃という低温で保存する必要
があった。また、いずれも動物の臓器から調製してお
り、供給源の確保にも問題があった。これに関し、〔Jo
urnal of Fermentation and Bioengineering, Vol.79,
No.2, 87-94, 1995 〕に好熱性真正細菌であるBacillus
stearothermophilus 由来のCyclophilinタイプＰＰＩ
アーゼが報告されているが、６５℃では失活が起こって
しまいそれほど熱安定性は高くない。また、これはサイ
クロスポリンＡに感受性ではないので動物のタイプと異
なっており、免疫抑制剤探索には利用しにくいと考えら
れる。一方、ＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼでは、耐熱性
のものはこれまでに見いだされていなかった。このこと
から、より耐熱性に優れた新しいＰＰＩアーゼの発見が
期待されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
の手法を用いて耐熱性ＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼを生
産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供すること
を目的とする。
の手法を用いて耐熱性ＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼを生
産すべく、その生産のもととなる遺伝子を提供すること
を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明のＰＰＩアーゼを
コードする遺伝子の全配列を得るために、精製ＰＰＩア
ーゼを単離し、そのＮ末端アミノ酸配列、及びそのプロ
テアーゼ消化により生成するペプチドのアミノ酸配列を
決定し、それらの配列をもとにプライマーを合成しＰＣ
Ｒ法によりＰＰＩアーゼ遺伝子の断片を取得するととも
に、これをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行い、ＰＰＩアーゼ遺伝子の全塩基配
列を有するクローンを取得してその塩基配列を決定し、
本発明を完成した。
コードする遺伝子の全配列を得るために、精製ＰＰＩア
ーゼを単離し、そのＮ末端アミノ酸配列、及びそのプロ
テアーゼ消化により生成するペプチドのアミノ酸配列を
決定し、それらの配列をもとにプライマーを合成しＰＣ
Ｒ法によりＰＰＩアーゼ遺伝子の断片を取得するととも
に、これをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行い、ＰＰＩアーゼ遺伝子の全塩基配
列を有するクローンを取得してその塩基配列を決定し、
本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明は、配列番号１で表されるＤ
ＮＡ塩基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有するＰＰＩアー
ゼ遺伝子である。また、本発明は、配列番号２で表され
るアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するＰＰＩアーゼ
である。
ＮＡ塩基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有するＰＰＩアー
ゼ遺伝子である。また、本発明は、配列番号２で表され
るアミノ酸配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するＰＰＩアーゼ
である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＰＰＩアーゼ遺伝子は、配列番号１で表されるＤＮＡ塩
基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実
質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有する。ここで、「配列
番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮ
Ａ塩基配列」とは、配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列の幾つかのヌクレオチド残基について、欠失、置換、
付加等の変化が生じた配列であって、ＰＰＩアーゼとし
て作用し得るポリペプタイドをコードする塩基配列をい
う。
ＰＰＩアーゼ遺伝子は、配列番号１で表されるＤＮＡ塩
基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実
質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有する。ここで、「配列
番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮ
Ａ塩基配列」とは、配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配
列の幾つかのヌクレオチド残基について、欠失、置換、
付加等の変化が生じた配列であって、ＰＰＩアーゼとし
て作用し得るポリペプタイドをコードする塩基配列をい
う。
【０００９】また、本発明のＰＰＩアーゼは、配列番号
２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表される
アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する。
ここで、「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置
換、付加等の変化が生じた配列であって、ＰＰＩアーゼ
として作用し得るポリペプタイドを表すアミノ酸配列を
いう。
２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号２で表される
アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有する。
ここで、「配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的
に同一なアミノ酸配列」とは、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列の幾つかのアミノ酸残基について、欠失、置
換、付加等の変化が生じた配列であって、ＰＰＩアーゼ
として作用し得るポリペプタイドを表すアミノ酸配列を
いう。
【００１０】本発明のＰＰＩアーゼは、ＦＫＢＰタイプ
に分類されるものであり、動物由来のＰＰＩアーゼと同
様にＦＫ５０６と結合する能力を有する。また、耐熱性
であり、高温でも失活しにくいという性質も持つ。この
ようなＰＰＩアーゼは従来知られておらず、このＰＰＩ
アーゼは新規な酵素である。
に分類されるものであり、動物由来のＰＰＩアーゼと同
様にＦＫ５０６と結合する能力を有する。また、耐熱性
であり、高温でも失活しにくいという性質も持つ。この
ようなＰＰＩアーゼは従来知られておらず、このＰＰＩ
アーゼは新規な酵素である。
【００１１】本発明遺伝子は以下の手順で得ることがで
きる。まず、耐熱性ＰＰＩアーゼを生産できる微生物、
例えば、メタノコッカス・サーモリソロトロフィクス
（Methanococcus thermolithotrophicus）DSM2095 株な
どを培養、集菌後菌体を破砕後、各種クロマトグラフィ
ーによってＰＰＩアーゼを精製する。この精製ＰＰＩア
ーゼをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離し、疎水性の膜であるＰＶＤＦ膜等に電気的に転写す
る。クマシーブリリアントブルーＲ−２５０等の色素で
検出されるバンドを切り出した後、プロテインシークエ
ンサーによりＮ末端からのアミノ酸配列を決定する。ま
た、切り出したバンドをリシルエンドペプチダーゼなど
の適当なプロテアーゼによって消化し、逆相クロマトグ
ラフィーによって回収されたペプチドを同様にアミノ酸
配列を決定する。Ｎ末端アミノ酸配列及び回収されたペ
プチドのアミノ酸配列からＰＣＲに用いるプライマーを
設計し、耐熱性ＰＰＩアーゼを生産できる微生物由来の
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＰＩアーゼ
の部分遺伝子を得ることができる。これを〔32Ｐ〕もし
くはジコキシゲニン等の非放射性プローブで標識し、遺
伝子スクリーニングのプローブとして用いる。
きる。まず、耐熱性ＰＰＩアーゼを生産できる微生物、
例えば、メタノコッカス・サーモリソロトロフィクス
（Methanococcus thermolithotrophicus）DSM2095 株な
どを培養、集菌後菌体を破砕後、各種クロマトグラフィ
ーによってＰＰＩアーゼを精製する。この精製ＰＰＩア
ーゼをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
離し、疎水性の膜であるＰＶＤＦ膜等に電気的に転写す
る。クマシーブリリアントブルーＲ−２５０等の色素で
検出されるバンドを切り出した後、プロテインシークエ
ンサーによりＮ末端からのアミノ酸配列を決定する。ま
た、切り出したバンドをリシルエンドペプチダーゼなど
の適当なプロテアーゼによって消化し、逆相クロマトグ
ラフィーによって回収されたペプチドを同様にアミノ酸
配列を決定する。Ｎ末端アミノ酸配列及び回収されたペ
プチドのアミノ酸配列からＰＣＲに用いるプライマーを
設計し、耐熱性ＰＰＩアーゼを生産できる微生物由来の
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＰＩアーゼ
の部分遺伝子を得ることができる。これを〔32Ｐ〕もし
くはジコキシゲニン等の非放射性プローブで標識し、遺
伝子スクリーニングのプローブとして用いる。
【００１２】一方、耐熱性ＰＰＩアーゼを生産できる微
生物のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、適当な
ベクターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製す
る。ベクターにはλファージ由来の各種ベクターたとえ
ばλgt10やλZapII など、あるいはpUC18 やpBR322等の
プラスミドベクターを用いることができる。目的の遺伝
子を保持するクローンの選択には、前記プローブを用い
てハイブリダイゼーションを行い、これに強く結合する
クローンを選択すればよい。また、他の生物由来のＦＫ
ＢＰタイプＰＰＩアーゼ遺伝子間のホモロジーの高い領
域のアミノ酸配列から適宜プライマーを合成してＰＣＲ
法によりＤＮＡ断片を取得し、それをプローブにしても
良い。塩基配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバ
ート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手
順により翻訳開始コドンから終止コドンを含むＰＰＩア
ーゼをコードするＤＮＡの全長を単離することができ
る。なお、このＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡを含む
大腸菌pUFKC1は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM P-15622として寄託されている（寄託日平成８年５
月１５日）。単離したＤＮＡは適当な発現ベクターに挿
入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることによ
り、当該蛋白質を大量調製することが可能である。
生物のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、適当な
ベクターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製す
る。ベクターにはλファージ由来の各種ベクターたとえ
ばλgt10やλZapII など、あるいはpUC18 やpBR322等の
プラスミドベクターを用いることができる。目的の遺伝
子を保持するクローンの選択には、前記プローブを用い
てハイブリダイゼーションを行い、これに強く結合する
クローンを選択すればよい。また、他の生物由来のＦＫ
ＢＰタイプＰＰＩアーゼ遺伝子間のホモロジーの高い領
域のアミノ酸配列から適宜プライマーを合成してＰＣＲ
法によりＤＮＡ断片を取得し、それをプローブにしても
良い。塩基配列の決定はサンガー法やマキサム−ギルバ
ート法等の一般的な方法によって決定できる。以上の手
順により翻訳開始コドンから終止コドンを含むＰＰＩア
ーゼをコードするＤＮＡの全長を単離することができ
る。なお、このＰＰＩアーゼをコードするＤＮＡを含む
大腸菌pUFKC1は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
FERM P-15622として寄託されている（寄託日平成８年５
月１５日）。単離したＤＮＡは適当な発現ベクターに挿
入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることによ
り、当該蛋白質を大量調製することが可能である。
【００１３】
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明の範囲はこれに限定されるものではない。
発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００１５】〔実施例１〕 DSM2095株からのＰＰＩアー
ゼの単離・精製 好熱性古細菌メタノコッカス・サーモリソロトロフィク
スDSM2095 株（以下、単に「DSM2095 株」という）を海
水ベース培地（酵母エキス２ｇ、バクトトリプトン２
ｇ、酢酸ナトリウム１ｇ、ＰＩＰＥＳ１．７g 、ＤＡＢ
ビタミン溶液〔Appl. Environ. Microbial., 55, 2832-
2836, 1989〕１０ml/L海水pH6.8)内にて嫌気条件及び
水素／炭酸ガス（４：１）の混合ガスの通気下で６５℃
で一昼夜培養し菌体を回収した。これを２５mMリン酸緩
衝液（pH７．０）に懸濁することにより細胞は浸透圧シ
ョックにより破砕される。上清を遠心分離によって回収
し、これをButyl scpharose カラム（ファルマシア社）
による疎水クロマトグラフィーに供し、ＰＰＩアーゼ活
性画分を回収した。ＰＰＩアーゼ活性は〔Nature, Vol.
337, No.6206, 473-475, 1989 〕に記載されているキモ
トリプシンカップリング法により測定することができ
る。回収される活性画分を限外濾過膜（分画分子量１０
０００）により濃縮を行い、これをSuperose12HRカラム
（ファルマシア社）によるゲル濾過により分離した。こ
れによって回収される画分を、次にMonoQカラム（ファ
ルマシア社）による陰イオン交換クロマトグラフィーに
供した。回収される活性画分を、最後にTSKgel Ethr-5P
W カラム（トーソー社）による疎水クロマトグラフィー
によって分離を行った。回収された画分について、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果を図
１に示す。右側が回収画分であり、左側が分子量マーカ
ーである。図１に示すように、ゲル上で明確に検出でき
るのは分子量約１６kDのＰＰＩアーゼのバンドだけであ
る。従って、この精製段階でほぼ完全に不純物を除去で
きたと考えられる。
ゼの単離・精製 好熱性古細菌メタノコッカス・サーモリソロトロフィク
スDSM2095 株（以下、単に「DSM2095 株」という）を海
水ベース培地（酵母エキス２ｇ、バクトトリプトン２
ｇ、酢酸ナトリウム１ｇ、ＰＩＰＥＳ１．７g 、ＤＡＢ
ビタミン溶液〔Appl. Environ. Microbial., 55, 2832-
2836, 1989〕１０ml/L海水pH6.8)内にて嫌気条件及び
水素／炭酸ガス（４：１）の混合ガスの通気下で６５℃
で一昼夜培養し菌体を回収した。これを２５mMリン酸緩
衝液（pH７．０）に懸濁することにより細胞は浸透圧シ
ョックにより破砕される。上清を遠心分離によって回収
し、これをButyl scpharose カラム（ファルマシア社）
による疎水クロマトグラフィーに供し、ＰＰＩアーゼ活
性画分を回収した。ＰＰＩアーゼ活性は〔Nature, Vol.
337, No.6206, 473-475, 1989 〕に記載されているキモ
トリプシンカップリング法により測定することができ
る。回収される活性画分を限外濾過膜（分画分子量１０
０００）により濃縮を行い、これをSuperose12HRカラム
（ファルマシア社）によるゲル濾過により分離した。こ
れによって回収される画分を、次にMonoQカラム（ファ
ルマシア社）による陰イオン交換クロマトグラフィーに
供した。回収される活性画分を、最後にTSKgel Ethr-5P
W カラム（トーソー社）による疎水クロマトグラフィー
によって分離を行った。回収された画分について、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。結果を図
１に示す。右側が回収画分であり、左側が分子量マーカ
ーである。図１に示すように、ゲル上で明確に検出でき
るのは分子量約１６kDのＰＰＩアーゼのバンドだけであ
る。従って、この精製段階でほぼ完全に不純物を除去で
きたと考えられる。
【００１６】以上のように精製されたＰＰＩアーゼのＦ
Ｋ５０６に対する結合性を、そのＰＰＩアーゼ活性の阻
害から調べた。結果を図２に示す。図２に示すように、
ＰＰＩアーゼは動物由来のＦＫＢＰと同様にＦＫ５０６
結合性であった。また、ＩＣ50値は２５０nMであった。
Ｋ５０６に対する結合性を、そのＰＰＩアーゼ活性の阻
害から調べた。結果を図２に示す。図２に示すように、
ＰＰＩアーゼは動物由来のＦＫＢＰと同様にＦＫ５０６
結合性であった。また、ＩＣ50値は２５０nMであった。
【００１７】また、ＰＰＩアーゼの耐熱性をその酵素活
性を指標として調べた。結果を図３に示す。図中の○が
１００℃で加熱した場合、図中の●が９０℃で加熱した
場合である。図３に示すように、活性の半減期は３０分
(１００℃）、９０分（９０℃）であり、極めて熱安定
性の高い蛋白質であることがわかった。
性を指標として調べた。結果を図３に示す。図中の○が
１００℃で加熱した場合、図中の●が９０℃で加熱した
場合である。図３に示すように、活性の半減期は３０分
(１００℃）、９０分（９０℃）であり、極めて熱安定
性の高い蛋白質であることがわかった。
【００１８】〔実施例２〕ＰＰＩアーゼの部分アミノ酸
配列の分析 実施例１で精製したＰＰＩアーゼを２０％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動によってさらに分離した。そ
の後、ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社）に
電気的にブロッティングし（日本エードー）、クマシー
ブリリアントブルーＲ−２５０によって染色し１６kDa
の蛋白質を検出した。切り出した１６kDa のバンドはプ
ロテインシークエンサーPSQ-2 （島津製作所）によりそ
のＮ末端アミノ酸配列を決定した。また、切り出したバ
ンドを８％アセトニトリルを含む２５mMトリス−塩酸
（pH８．０）溶液中でリシルエンドペプチダーゼ（和光
純薬社）によって３７℃で一昼夜消化し、超音波処理に
よって回収されるペプチドをマイクロボンダスフェアー
C18 カラム（ウォーターズ社）による逆相クロマトグラ
フィーによって分離し、得られた３つのペプチドを上記
プロティンシーケンサーによる分析に供した。決定した
配列は下記の通りである。
配列の分析 実施例１で精製したＰＰＩアーゼを２０％ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動によってさらに分離した。そ
の後、ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社）に
電気的にブロッティングし（日本エードー）、クマシー
ブリリアントブルーＲ−２５０によって染色し１６kDa
の蛋白質を検出した。切り出した１６kDa のバンドはプ
ロテインシークエンサーPSQ-2 （島津製作所）によりそ
のＮ末端アミノ酸配列を決定した。また、切り出したバ
ンドを８％アセトニトリルを含む２５mMトリス−塩酸
（pH８．０）溶液中でリシルエンドペプチダーゼ（和光
純薬社）によって３７℃で一昼夜消化し、超音波処理に
よって回収されるペプチドをマイクロボンダスフェアー
C18 カラム（ウォーターズ社）による逆相クロマトグラ
フィーによって分離し、得られた３つのペプチドを上記
プロティンシーケンサーによる分析に供した。決定した
配列は下記の通りである。
【００１９】〔Ｎ末端アミノ酸配列〕 Val-Asp-Lys-Gly-Lys-Ile-Lys-Val-Asp-Tyr-Ile-Gly-Ly
s-Leu-Glu-Ser-Gly-Asp-Val-Phe-Asp-Thr-Ser-Ile-Glu-
Glu 〔リシルエンドペプチターゼ消化により精製したペプチ
ドのアミノ酸配列〕 Lys-Ile-Pro-Arg-Asp-Ala-Phe-Lys Lys-Ala-Tyr-Gly-Asn-Arg-Asn-Glu-Met-Leu-Ile-Gln-Ly
s Lys-Asp-Leu-Val-Phe-Thr-Ile-Lys なお、下線部はＰＣＲプライマーの設計部位を示す。
s-Leu-Glu-Ser-Gly-Asp-Val-Phe-Asp-Thr-Ser-Ile-Glu-
Glu 〔リシルエンドペプチターゼ消化により精製したペプチ
ドのアミノ酸配列〕 Lys-Ile-Pro-Arg-Asp-Ala-Phe-Lys Lys-Ala-Tyr-Gly-Asn-Arg-Asn-Glu-Met-Leu-Ile-Gln-Ly
s Lys-Asp-Leu-Val-Phe-Thr-Ile-Lys なお、下線部はＰＣＲプライマーの設計部位を示す。
【００２０】〔実施例３〕 DSM2095株のゲノムＤＮＡの
調製 実施例１と同様にDSM2095 株を５Ｌの海水ベース培地で
培養を行った。湿潤菌体１．０g を１０mlのＴＮＥ緩衝
液（１００mM ＮａＣｌ，２０mM ＥＤＴＡを含む２０
mMトリス塩酸緩衝液、pH８．０）に懸濁した。１０％Ｓ
ＤＳ溶液と１％トリトンＸ−１００溶液を各々１mlずつ
添加し、４℃で一晩放置した。ついで温度を５０℃にし
てプロティナーゼＫ溶液（２０mg/ml)を５０μl 添加し
４時間振盪した。フェノール処理、クロロホルム処理
後、ＲＮase Ａ溶液（０．５mg/ml）を５０μl 添加
し、３７℃で１時間放置した。再び１０％ＳＤＳ溶液を
１ml、プロティナーゼＫ溶液（２０mg/ml)を５０μl 添
加し５０℃で７０分放置した。フェノール処理、クロロ
ホルム処理後（溶液量１０ml) 、１mlの３Ｍの酢酸ナト
リウム溶液（pH５．２）、２５mlのエタノールを添加
し、−２０℃で２時間放置した。その後高速遠心機で遠
心しＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノール溶液３mlで沈
澱を洗浄、遠心エバポレーターで乾固させて、ＴＥ緩衝
液０．５mlに溶解した。この操作により約２mgのゲノム
ＤＮＡが得られた。
調製 実施例１と同様にDSM2095 株を５Ｌの海水ベース培地で
培養を行った。湿潤菌体１．０g を１０mlのＴＮＥ緩衝
液（１００mM ＮａＣｌ，２０mM ＥＤＴＡを含む２０
mMトリス塩酸緩衝液、pH８．０）に懸濁した。１０％Ｓ
ＤＳ溶液と１％トリトンＸ−１００溶液を各々１mlずつ
添加し、４℃で一晩放置した。ついで温度を５０℃にし
てプロティナーゼＫ溶液（２０mg/ml)を５０μl 添加し
４時間振盪した。フェノール処理、クロロホルム処理
後、ＲＮase Ａ溶液（０．５mg/ml）を５０μl 添加
し、３７℃で１時間放置した。再び１０％ＳＤＳ溶液を
１ml、プロティナーゼＫ溶液（２０mg/ml)を５０μl 添
加し５０℃で７０分放置した。フェノール処理、クロロ
ホルム処理後（溶液量１０ml) 、１mlの３Ｍの酢酸ナト
リウム溶液（pH５．２）、２５mlのエタノールを添加
し、−２０℃で２時間放置した。その後高速遠心機で遠
心しＤＮＡを沈澱させ、７０％エタノール溶液３mlで沈
澱を洗浄、遠心エバポレーターで乾固させて、ＴＥ緩衝
液０．５mlに溶解した。この操作により約２mgのゲノム
ＤＮＡが得られた。
【００２１】〔実施例４〕ＰＣＲによるＰＰＩアーゼ遺
伝子断片の増幅およびその塩基配列の決定 実施例１で得られたＰＰＩアーゼのＮ末端アミノ酸配列
およびリシルエンドペプチダーゼ消化生成ペプチドのア
ミノ酸配列に相当する以下のＤＮＡプライマーを合成し
た。 PN-F1 ： AA(AG)AT(ATC)AA(AG)GT(ATCG)GA(TC)TA(TC)AT PF-R1 ： TT(TC)TG(ATG)AT(ATCG)A(AG)CAT(TC)TC(AG)TT PF-R2 ： TT(AG)AA(ATCG)GC(AG)TC(TC)CT(ATCG)GG(ATG)
AT
伝子断片の増幅およびその塩基配列の決定 実施例１で得られたＰＰＩアーゼのＮ末端アミノ酸配列
およびリシルエンドペプチダーゼ消化生成ペプチドのア
ミノ酸配列に相当する以下のＤＮＡプライマーを合成し
た。 PN-F1 ： AA(AG)AT(ATC)AA(AG)GT(ATCG)GA(TC)TA(TC)AT PF-R1 ： TT(TC)TG(ATG)AT(ATCG)A(AG)CAT(TC)TC(AG)TT PF-R2 ： TT(AG)AA(ATCG)GC(AG)TC(TC)CT(ATCG)GG(ATG)
AT
【００２２】PN-F1はＮ末端アミノ酸配列に基づいて設
計したプライマー、PF-R1及びPF-R2はリシルエンドペプ
チダーゼ消化生成ペプチドのアミノ酸配列に基づいて設
計したプライマーである。実施例２のように調製したDS
M 2095株のＤＮＡを鋳型としてPCR Amplification kit
( 宝酒造) を用いたＰＣＲ反応の結果、PN-F1 とPF-R1
のプライマーの組み合わせでは２４０bp、PN-F1 とPF-R
2 の組み合わせでは２７０bpの断片が増幅された。それ
ぞれ２．５％アガロースゲル（ニューシーブＧＴＧ、宝
酒造）で電気泳動を行い、ＤＮＡ断片を切り出して透析
チューブに挿入し、電気泳動により溶出し、フェノール
処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。沈澱を
７０％エタノールで洗浄後、減圧乾固し、ＴＥ緩衝液に
溶解した。
計したプライマー、PF-R1及びPF-R2はリシルエンドペプ
チダーゼ消化生成ペプチドのアミノ酸配列に基づいて設
計したプライマーである。実施例２のように調製したDS
M 2095株のＤＮＡを鋳型としてPCR Amplification kit
( 宝酒造) を用いたＰＣＲ反応の結果、PN-F1 とPF-R1
のプライマーの組み合わせでは２４０bp、PN-F1 とPF-R
2 の組み合わせでは２７０bpの断片が増幅された。それ
ぞれ２．５％アガロースゲル（ニューシーブＧＴＧ、宝
酒造）で電気泳動を行い、ＤＮＡ断片を切り出して透析
チューブに挿入し、電気泳動により溶出し、フェノール
処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。沈澱を
７０％エタノールで洗浄後、減圧乾固し、ＴＥ緩衝液に
溶解した。
【００２３】以上のように調製したＤＮＡ断片をpT7-Bl
ueベクター(Novagen社）に Takaraligation kit Ver.1
（宝酒造）を用いて連結し、コンピテントセルE.coli J
M109（宝酒造）を用いて形質転換した。陽性クローンを
選択し、挿入断片のあることを確認後、２５mlのＬＢ培
地（５０μg/mlのアンピシリンを含む）に植菌し、一晩
３７℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、
主にラボマニュアル遺伝子工学増補版 pp51-52（村松正
実編、丸善、1990年）記載の方法に従ってプラスミドＤ
ＮＡを調製した。この操作により約２０μg のＤＮＡを
調製した。１サンプルあたり１μg のＤＮＡを鋳型とし
て、Dye Terrninatorcyclesequencing kit（パーキンエ
ルマー社）を用いてシークエンス反応を行い、ＤＮＡシ
ークエンサー（373A，アプライドバイオシステムズ社）
により塩基配列を決定した。その結果、ＰＣＲによって
増幅された上記２つの遺伝子断片はＰＰＩアーゼのプラ
イマー設計部位に相当するアミノ酸配列と一致するこ
と、他の生物のＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼと相同性を
示すことから、確かにＰＰＩアーゼ遺伝子の一部である
ことが明らかになった。
ueベクター(Novagen社）に Takaraligation kit Ver.1
（宝酒造）を用いて連結し、コンピテントセルE.coli J
M109（宝酒造）を用いて形質転換した。陽性クローンを
選択し、挿入断片のあることを確認後、２５mlのＬＢ培
地（５０μg/mlのアンピシリンを含む）に植菌し、一晩
３７℃で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、
主にラボマニュアル遺伝子工学増補版 pp51-52（村松正
実編、丸善、1990年）記載の方法に従ってプラスミドＤ
ＮＡを調製した。この操作により約２０μg のＤＮＡを
調製した。１サンプルあたり１μg のＤＮＡを鋳型とし
て、Dye Terrninatorcyclesequencing kit（パーキンエ
ルマー社）を用いてシークエンス反応を行い、ＤＮＡシ
ークエンサー（373A，アプライドバイオシステムズ社）
により塩基配列を決定した。その結果、ＰＣＲによって
増幅された上記２つの遺伝子断片はＰＰＩアーゼのプラ
イマー設計部位に相当するアミノ酸配列と一致するこ
と、他の生物のＦＫＢＰタイプＰＰＩアーゼと相同性を
示すことから、確かにＰＰＩアーゼ遺伝子の一部である
ことが明らかになった。
【００２４】〔実施例５〕DAM2095 株ゲノムＤＮＡライ
ブラリーの作製 実施例２に従って作製したゲノムＤＮＡ３０μg に２５
ユニットの制限酵素BamHI を添加して２４時間３７℃で
反応し、切断を行った。切断反応後の溶液をフェノール
処理、エタノール沈澱をして、ＤＮＡを得た。一方、Ba
mHI および脱リン酸化処理したpUC18 をファルマシア社
より購入し、その位置にゲノムＤＮＡ切断断片をTakara
ligation kit Ver.1 により連結し、Ecoli JM109 を用
いて形質転換し DSM2095株ゲノムＤＮＡライブラリーと
した。
ブラリーの作製 実施例２に従って作製したゲノムＤＮＡ３０μg に２５
ユニットの制限酵素BamHI を添加して２４時間３７℃で
反応し、切断を行った。切断反応後の溶液をフェノール
処理、エタノール沈澱をして、ＤＮＡを得た。一方、Ba
mHI および脱リン酸化処理したpUC18 をファルマシア社
より購入し、その位置にゲノムＤＮＡ切断断片をTakara
ligation kit Ver.1 により連結し、Ecoli JM109 を用
いて形質転換し DSM2095株ゲノムＤＮＡライブラリーと
した。
【００２５】〔実施例６〕ＰＰＩアーゼ遺伝子を含む組
み換えクローンの選択 実施例３によって作製した２７０bpのＤＮＡ断片（PN-F
1 とPF-R2 をプライマーとした断片）１μg を、DIG DN
Alabelling and detection kit（ベーリンガーマンハイ
ム社）を用いてランダムプライマーによりラベルし、プ
ローブとした。一方、実施例４に従って作製した形質転
換株をＬＢプレート（アンピシリン、 X- gal を含む）
にまいて一晩培養後、ナイロンメンブレン ハイボンド
Ｎ（アマシャム社）上に固定し、コロニーハイブリダイ
ゼーションは６３℃、ウォッシングは６０℃で行った。
約３７００個のクローンより、プローブと結合する３個
のコロニーを得た。これらのコロニーのプラスミド挿入
されているＤＮＡ断片を調べた結果、３クローンともＰ
ＰＩアーゼ遺伝子全長を含んでいることが予想された。
そしてDye Terminatorcycle sequencing kitを用いてシ
ークエンス反応を行い、373AＤＮＡシークエンサーによ
り塩基配列を決定した。得られた遺伝子は図４に示した
通り、ＰＰＩアーゼ遺伝子全長を含んでいた。なお、翻
訳開始コドン、バリンの位置は実施例１によって決定し
たアミノ酸配列及び遺伝子配列から推定したものであ
る。
み換えクローンの選択 実施例３によって作製した２７０bpのＤＮＡ断片（PN-F
1 とPF-R2 をプライマーとした断片）１μg を、DIG DN
Alabelling and detection kit（ベーリンガーマンハイ
ム社）を用いてランダムプライマーによりラベルし、プ
ローブとした。一方、実施例４に従って作製した形質転
換株をＬＢプレート（アンピシリン、 X- gal を含む）
にまいて一晩培養後、ナイロンメンブレン ハイボンド
Ｎ（アマシャム社）上に固定し、コロニーハイブリダイ
ゼーションは６３℃、ウォッシングは６０℃で行った。
約３７００個のクローンより、プローブと結合する３個
のコロニーを得た。これらのコロニーのプラスミド挿入
されているＤＮＡ断片を調べた結果、３クローンともＰ
ＰＩアーゼ遺伝子全長を含んでいることが予想された。
そしてDye Terminatorcycle sequencing kitを用いてシ
ークエンス反応を行い、373AＤＮＡシークエンサーによ
り塩基配列を決定した。得られた遺伝子は図４に示した
通り、ＰＰＩアーゼ遺伝子全長を含んでいた。なお、翻
訳開始コドン、バリンの位置は実施例１によって決定し
たアミノ酸配列及び遺伝子配列から推定したものであ
る。
【００２６】
【発明の効果】本発明は、動物由来のものと同様に、免
疫抑制剤ＦＫ５０６に結合性である耐熱性のＦＫＢＰタ
イプＰＰＩアーゼ遺伝子を提供する。本発明の遺伝子か
ら作られる蛋白質は、変性蛋白質の再生、蛋白質試薬の
安定化、組み換え蛋白質の生産、さらには新規免疫抑制
剤、生理活性物質の探索に極めて有用である。
疫抑制剤ＦＫ５０６に結合性である耐熱性のＦＫＢＰタ
イプＰＰＩアーゼ遺伝子を提供する。本発明の遺伝子か
ら作られる蛋白質は、変性蛋白質の再生、蛋白質試薬の
安定化、組み換え蛋白質の生産、さらには新規免疫抑制
剤、生理活性物質の探索に極めて有用である。
【００２７】
配列番号１ 配列の長さ：５２７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名 ：Methanococcus thermolithotrophicus 配列
【００２８】配列番号２ 配列の長さ：１５４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：不明状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名 ：Methanococcus thermolithotrophicus 配列 Val Ile Phe Leu Val Asp Lys Gly Val Lys Ile Lys Val Asp Tyr Ile Gly Lys Leu Glu Ser Gly Asp Val Phe Asp Thr Ser Ile Glu Glu Val Ala Lys Glu Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Asp Arg Glu Tyr Glu Pro Leu Glu Phe Val Val Gly Glu Gly Gln Leu Ile Gln Gly Phe Glu Glu Ala Val Leu Asp Met Glu Val Gly Asp Glu Lys Thr Val Lys Ile Pro Ala Glu Lys Ala Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Met Leu Ile Gln Lys Ile Pro Arg Asp Ala Phe Lys Glu Ala Asp Phe Glu Pro Glu Glu Gly Met Val Ile Leu Ala Glu Gly Ile Pro Ala Thr Ile Thr Glu Val Thr Asp Asn Glu Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu Ala Gly Lys Asp Leu Val Phe Thr Ile Lys Ile Ile Glu Val Val Glu
【図１】精製ＰＰＩアーゼのＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を表す写真である。
ゲル電気泳動を表す写真である。
【図２】ＰＰＩアーゼ活性とＦＫ５０６濃度との関係を
表す図である。
表す図である。
【図３】ＰＰＩアーゼ活性と加熱時間との関係を表す図
である。
である。
【図４】ＰＰＩアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列と、それ
をコードするアミノ酸配列を表す図である。
をコードするアミノ酸配列を表す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成８年６月１７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
Claims (2)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列、
又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同
一なＤＮＡ塩基配列を有するＰＰＩアーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号２で表されるアミノ酸配列、又
は配列番号２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一な
アミノ酸配列を有するＰＰＩアーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8152546A JPH1091A (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 好熱性古細菌由来のｆｋｂｐタイプｐｐｉアーゼ、及びそれをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8152546A JPH1091A (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 好熱性古細菌由来のｆｋｂｐタイプｐｐｉアーゼ、及びそれをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1091A true JPH1091A (ja) | 1998-01-06 |
Family
ID=15542831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8152546A Pending JPH1091A (ja) | 1996-06-13 | 1996-06-13 | 好熱性古細菌由来のｆｋｂｐタイプｐｐｉアーゼ、及びそれをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1091A (ja) |
-
1996
- 1996-06-13 JP JP8152546A patent/JPH1091A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050802 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051129 |