JPH07258111A - 免疫抑制剤による副作用の軽減剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫抑制剤による副作用の緩和に有用な副作
用軽減剤を提供することを目的とする。 【構成】 本発明の副作用軽減剤は、ＨＧＦ（Hepatocy
te Growth Factor, 肝細胞増殖因子）を有効成分として
含有することからなる。本発明の副作用軽減剤の有効成
分であるＨＧＦは、免疫抑制剤による多臓器的又は全身
的な副作用の軽減を図ることができる。従って、本発明
によれば、副作用に起因する免疫抑制剤の用法・用量の
制約が少なくなり、免疫抑制剤が用いられる各種疾患の
治癒率及び臓器移植の成功率を向上させることができる
と共に患者の負担を著しく軽減することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫抑制剤による副作
用の軽減剤に関する。より詳細には、ＨＧＦ（Hepatocy
te Growth Factor）を有効成分とし、免疫抑制剤による
副作用を緩和し得る副作用の軽減剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、自己免疫疾患や悪性腫瘍の治
療、臓器移植における移植片拒絶反応の抑制などに免疫
抑制剤が使用されている。免疫抑制剤は、過剰に起こっ
ている免疫応答を抑制する薬剤であり、その免疫抑制の
特異性により、非特異的免疫抑制剤と特異的免疫抑制剤
に大別される。非特異的免疫抑制剤としては、例えば、
副腎皮質ホルモン（例えば、コルチゾン、デキサメタゾ
ン等）、代謝拮抗剤（例えば、６−メルカプトプリン、
アザチオプリン、５−フルオロウラシル、メトトレキサ
ート等）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミ
ド、ブスルファン等）、アルカロイド（例えば、ビンブ
ラスチン、ビンクリスチン等）、抗生物質（例えば、シ
クロスポリンＡ及びＧ、ＦＫ５０６、マイトマイシン
Ｃ、ダウノルビシン等）などが挙げられる。また、特異
的免疫抑制剤としては、例えば、抗リンパ球グロブリ
ン、リンパ球表面に発現されている各種抗原に対するモ
ノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗
体等）などが挙げられる。上記の免疫抑制剤において、
シクロスポリン及びＦＫ５０６は強い免疫抑制作用を有
し、腎臓、肝臓、心臓、膵臓などの臓器移植における移
植片拒絶反応の抑制にすばらしい成績を収めており、注
目されている薬剤である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、多くの
免疫抑制剤が使用されているが、何れの薬剤も副作用を
有しており、例えば、骨髄抑制、白血球減少、血小板減
少、重症感染症、肝障害、腎障害、神経障害、肺障害、
胃腸障害、食欲不振、悪心、嘔吐、下痢、貧血、口内
炎、脱毛、起毛、皮膚色素沈着、血圧低下、不整脈、発
熱、痙攣、不妊症、無精子症、倦怠感など、多臓器的又
は全身的な副作用が報告されている。このように、現在
用いられている免疫抑制剤は副作用が強く、その投与量
に制約があるとともに使用に際しては細心の注意を払う
必要があるという問題がある。より具体的には、骨髄抑
制の強い免疫抑制剤は、白血球減少症を起し、重症感染
症を発症し易く、その投与量を制限せざるを得ない。そ
のため、臓器移植においては急性拒絶反応が発症し易
く、機能不全に陥ることが多かった。臓器移植後の急性
拒絶反応の発症率を著しく低減できることから、臓器移
植の際に汎用されるシクロスポリンは、骨髄抑制の出現
頻度が少ないため、白血球減少症に伴う重篤な感染症の
発症を防止でき、臓器移植後の管理が容易になるという
利点を有し、この効果からも臓器移植の成績を著しく向
上させることが可能になった。

【０００４】しかし、シクロスポリンにおいても副作用
は認められ、例えば、腎毒性、肝毒性、神経障害、高血
圧、大腿骨頭壊死、白内障、糖尿病、急性膵炎、サイト
メガロウイルス感染症などが報告されており、その投与
量が制約される。特に、腎移植において、腎毒性に基づ
く腎障害は、移植腎の予後に重大な影響を及ぼすのみな
らず、移植後早期においては、移植後の急性拒絶反応に
起因する腎機能不全との識別が困難であることが問題と
なる。そのため、血中シクロスポリン濃度を常にモニタ
リングし、投与量を注意深くコントロールすることが不
可欠であり、シクロスポリンの副作用が認められたら投
与量を減少するか投与を中止せねばならず、副作用に対
する移植後管理が必要がある。なお、カルシウム-チャ
ンネル ブロッカーやプロスタグランジンが、シクロス
ポリンに起因する腎毒性を防止する上で有用であるとの
報告もされている(Transplantation 51, 293-295, 199
1; Clin. Nephrol 25 [suppl.1], S89-S94, 1986)。し
かし、これらの薬剤は効果が十分でなく、更に多臓器的
又は全身的な副作用を抑制することはできない。

【０００５】上述のように、現在用いられている免疫抑
制剤は重篤な多臓器的又は全身的副作用を有しており、
そのため用法及び用量に多くの制限があり、免疫抑制剤
の多臓器的又は全身的副作用を著しく低減し得る薬剤が
強く求められている。本発明者は、上記の問題を解決す
るため、免疫抑制剤の副作用を軽減し得る薬剤について
鋭意検討した結果、ＨＧＦが免疫抑制剤の多臓器的又は
全身的副作用を著しく低減し得ることを見出した。より
詳細には、ＨＧＦは、本発明者らが再生肝ラット血清中
から成熟肝実質細胞をin vitroで増殖させる因子として
見出した蛋白質である（Biochem BiophysRes Commun, 1
22, 1450, 1984）。本発明者らは更に、ＨＧＦをラット
血小板より単離することに成功し（Proc. Natl. Acad.
Sci, 83, 6489, 1986, FEBS Letters, 22, 311, 198
7）、そのアミノ酸配列を一部決定した。さらに、本発
明者らは解明されたＨＧＦアミノ酸配列をもとにヒト及
びラット由来のＨＧＦｃＤＮＡクローニングを行い、こ
のｃＤＮＡを動物細胞に組換え技術により導入してＨＧ
Ｆを蛋白質として得ることに成功した（ヒトＨＧＦ：Na
ture, 342, 440, 1989；ラットＨＧＦ：Proc. Natl. Ac
ad. Sci, 87, 3200, 1990）。

【０００６】肝実質細胞を特異的に増殖させる因子とし
て発見されたＨＧＦは、本発明者をはじめとする多くの
研究者による最近の研究成果によって、生体内で種々の
生理活性を示し、種々の臓器・組織の傷害治癒に働いて
いる因子であることが明らかとなり、研究対象としての
みならずヒトや動物の治療薬などへの応用に期待が集ま
っている。このようなＨＧＦの作用からして、本発明者
はＨＧＦが免疫抑制剤による副作用の軽減に有用であろ
うと思料し、免疫抑制剤の副作用に対するＨＧＦの効果
を検討したところ、ＨＧＦは免疫抑制剤による多臓器的
又は全身的な副作用を著しく軽減し得ることが判明し
た。免疫抑制剤による副作用の軽減にＨＧＦが有効であ
ることは新たな知見であり、従来知られていなかったＨ
ＧＦの作用である。本発明はかかる知見に基づいてなさ
れたもので、本発明は免疫抑制剤による副作用を緩和し
得る副作用の軽減剤（以下、便宜上、副作用軽減剤とい
う）を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の副作用軽減剤は、ＨＧＦを有効成
分として含有することからなり、特に抗生物質系免疫抑
制剤による副作用の軽減に顕著な効果を奏する。上記の
構成からなる本発明の有効成分であるＨＧＦは、医薬と
して使用できる程度に精製されたものであれば、種々の
方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦの
調製方法としては、各種の方法が知られており、例え
ば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝
臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小
板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精
製して得ることができる。また、ＨＧＦを産生する初代
培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養
細胞など）から分離精製してＨＧＦを得ることもでき
る。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードす
る遺伝子を適切なベクターに組込み、これを適当な宿主
に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から
目的とする組換えＨＧＦを得ることができる(例えば、N
ature, 342, 440, 1989、特開平５−１１１３８３号公
報、Biochem. Biophys. Res. Commun., 163,967, 1989
など参照)。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来か
ら遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、
例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細
胞などを用いることができる。

【０００８】より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽
出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素
を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出し
て粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースな
どのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常
の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝
子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベ
クターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例
えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、
その培養上清より得ることができる。

【０００９】かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質
的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又
は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸
配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端
に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは
糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。

【００１０】上記のＨＧＦは、後記実施例に示されるよ
うに、免疫抑制剤による多臓器的又は全身的な種々の副
作用を軽減することができ、より具体的には、腎毒性、
肝毒性、胃腸疾患（例えば、食欲不振、下痢等）、神経
障害（例えば、脱力状態、イライラ、痙攣等）及び臓器
の傷害を防止でき、また臓器の修復を促進し、更に副作
用による死亡率を低減することができる。ＨＧＦの作用
する細胞は、例えば、肝細胞、腎尿細管上皮細胞、肺胞
上皮、胃粘膜上皮、血管上皮、皮膚ケラチノサイトな
ど、極めて広範囲の臓器・組織に及んでいる。従って、
ＨＧＦは、免疫抑制剤による多臓器的又は全身的な副作
用を効果的に軽減することができる。更に、ＨＧＦの医
薬品としての実用性を考える上でさらに重要な点は、Ｈ
ＧＦは動物に長期間投与しても殆ど副作用が認められな
いことである。また、ＨＧＦがＧ１期、すなわち増殖期
に入った細胞のみを増殖促進し、Ｇ０期、すなわち静止
期にある細胞には作用しないことも大きな特長である。
このことは、傷害のある組織の増殖再生は促進するが、
傷害を受けていない組織に対しては全く作用を及ぼさな
いことを意味する。従って、過剰にＨＧＦを投与して
も、あるいは血液などを介して非患部にＨＧＦが到達し
ても、正常組織にガン化を誘導したり過剰な増殖を起こ
すことがないと考えられる。

【００１１】本発明の副作用軽減剤は、ヒトをはじめと
する哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イ
ヌ、ネコ等）における、前述の非特異的免疫抑制剤及び
特異的免疫抑制剤による副作用の軽減に適用され、特に
シクロスポリン、ＦＫ５０６、マイトマイシンＣ、ダウ
ノルビシン等の抗生物質系免疫抑制剤による副作用の軽
減に顕著な効果を示す。また、上述のように、ＨＧＦの
作用は広範囲の臓器・組織に及ぶので、局所的な副作用
軽減を超えた多臓器的又は全身的な副作用軽減を図るこ
とができる。

【００１２】本発明の副作用軽減剤は種々の製剤形態
（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうる
が、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣
用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体と共
に経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製するこ
とができ、例えば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌
水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター
等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填するこ
とにより調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量
としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.0
01〜0.1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬として
は、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カ
プセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形
に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調
製することができる。製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、適
用疾患などに応じて適宜調整することができる。

【００１３】製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添
加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロ
ブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキス
トラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さら
に、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦
形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等
を含んでいてもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、
又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ま
しい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加
え、再溶解して使用される。

【００１４】本発明の副作用軽減剤は、その製剤形態に
応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注
射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与す
ることができる。その投与量は、患者の症状、年齢、体
重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01
mg〜100mgであり、これを１日１回ないし数回に分けて
投与するのが適当である。

【００１５】

【発明の効果】本発明の副作用軽減剤の有効成分である
ＨＧＦは、免疫抑制剤による副作用を著しく軽減するこ
とができる。特に、ＨＧＦの作用は広範囲の臓器・組織
に及ぶので、局所的な副作用軽減を超えた多臓器的又は
全身的な副作用軽減を図ることができる。従って、本発
明によれば、副作用に起因する免疫抑制剤の用法・用量
の制約が少なくなり、免疫抑制剤が用いられる各種疾患
の治癒率及び臓器移植の成功率を向上させることができ
ると共に患者の負担を著しく軽減することができる。

【００１６】

【実施例】以下、試験例及び実施例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、試験例で使用したヒト組換体Ｈ
ＧＦ（以下、ｈｒ−ＨＧＦという）は、ヒト組換体ＨＧ
Ｆ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培養
上清から精製したものを用いた(Nakamura et al., Natu
re 342, 440-443, 1989; Seki etal., Biochem. Biophy
s. Res. Commun. 172, 321-327, 1990)。

【００１７】試験例１ シクロスポリンの副作用に対するＨＧＦの軽減作用を下
記の方法で試験した。 １．方法 まず、本試験の実験計画を図１に示した。急性臓器不全
は、ＩＣＲマウスに１００ｍｇ／ｋｇのシクロスポリン
Ａ（以下、ＣｓＡという）を毎日腹腔内投与することに
より作成した。ｈｒ−ＨＧＦ（１回１匹当り５μｇ）又
はコントロールとしての生理食塩水（０．１ｍｌ）は、
最初のＣｓＡ投与の３０分前及びその後は１２時間おき
に尾静脈より投与した。図１において、上記薬剤の投与
時は黒三角印（ＣｓＡ）及び白三角印（ｈｒ−ＨＧＦ／
生理食塩水）で示した。また、マウスは、最初のＣｓＡ
投与後６０時間及び１０８時間後に犠牲死させ、血液検
査、病理組織検査及び臓器修復検査に供した。図１にお
いて、犠牲死は星印で示した。

【００１８】２．結果 生存率 試験マウスの生存率を図１の下図に示した。コントロー
ル群では、３日間生存したマウスは８３．３％であり、
５日間生存したマウスは５０％であった。それに対し
て、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では全例生存した。この２群間
の生存率には、logrank testにおいて５％の危険率で有
意差があった。このように、ｈｒ−ＨＧＦの投与は、Ｃ
ｓＡにより急性臓器不全を起したマウスの生存を著しく
延長することが判明した。

【００１９】徴候及び症状 ｈｒ−ＨＧＦ投与群及びコントロール群のマウスの徴候
及び症状の概要を表１に示した。コントロール群におい
ては、ＣｓＡ投与１日目より全例に、中程度から重症な
下痢が認められた。また、起毛、運動機能減少及び脱力
状態は、一時的な過剰運動に引き続き殆どのマウスで同
時に認められた。その後、摂餌しなくなり、何匹かのマ
ウスは強度の痙攣を伴い死亡した。一方、ｈｒ−ＨＧＦ
処理群において、下痢はコントロール群に比べて軽症で
あった。また、脱力状態、起毛及び痙攣は認められず、
摂餌も良好であり、活発な状態が維持された。なお、体
重変動については、コントロール群では５日間で初期体
重の９３．６±９．６％に減少したが、ｈｒ−ＨＧＦ処
理群では１０２．５±３．０％に増加し、unpaired Wil
coxon testにて５％の危険率で有意差があった。このよ
うに、ｈｒ−ＨＧＦの投与は、ＣｓＡによる副作用の徴
候及び症状を緩和し得ることが判明した。

【００２０】

【表１】

【００２１】血液検査 コントロール群においては、ＧＰＴ(Glutamate pyruvat
e transaminase)値及び総ビリルビン値の僅かな上昇が
認められ、若干の肝障害を起していた。血中尿素窒素値
及び血中クレアチニン値についは、コントロール群とｈ
ｒ−ＨＧＦ処理群との間には統計的に有意な差は認めら
れなかった。

【００２２】病理組織学的所見 上記のように、血中尿素窒素値及び血中クレアチニン値
についは、コントロール群とｈｒ−ＨＧＦ処理群との間
には統計的に有意な差は認められなかったが、組織学的
には差異が認められた。コントロール群においては、全
マウスについて３日目に、近位尿細管における広範囲な
弱から中程度の空胞化が認められ、この変化は５日目ま
で生存した３匹のマウスにおいても認められた。一方、
ｈｒ−ＨＧＦ処理群においては、弱い空胞化が３日目に
は５匹の内の４匹に認められたが、５日目になると組織
学的には局所性のわずかな尿細管壊死が２匹のマウスに
認められた以外は、腎臓は正常であった。また、中程度
から重症の空胞形成及び巣状細胞の変化については表２
に示す。上記及び表２の結果に示されるように、ｈｒ−
ＨＧＦの投与は、ＣｓＡによる臓器不全を防止し得るこ
とが判明した。

【００２３】

【表２】

【００２４】臓器修復検査（ＤＮＡ合成） ＨＧＦが腎臓及び肝臓の修復を促進しているかを検討す
るため、ＢｒｄＵ(5-bromo-2'-deoxyuridine)をマウス
に取り込ませ、続いてＢｒｄＵ特異的な免疫組織染色法
で腎臓及び肝臓を染色することにより、腎臓及び肝臓に
おけるＤＮＡ合成を測定した。その結果を表３に示す。
ＤＮＡ合成期の細胞の割合(ラベリング インデックス:l
abeling index)は、腎臓に関し、０．１４％から３日目
のコントロール群では０．４％に上昇し、ｈｒ−ＨＧＦ
処理群では０．８８％にまで上昇した。また、肝臓に関
して、コントロール群のラベリング インデックスは３
日目において０．１％以下であり、この値は正常マウス
の値と略同じであった。一方、ｈｒ−ＨＧＦ処理群では
０．５５％にまで上昇した。これはunpaired Wilcoxont
estにて５％の危険率で有意差があった。このように、
ｈｒ−ＨＧＦ処理群ではラベリング インデックスの上
昇が認められ、ＤＮＡ合成が活発に行われており、腎臓
及び肝臓の修復が促進されていることが明らかとなっ
た。なお、ラベリング インデックスの測定は、Ishiki
らの方法(Hepatology 16, 1227-1235, 1992)により行っ
た。

【００２５】

【表３】

【００２６】実施例１ 生理食塩水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、マンニトール
１ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍｇを含む溶液を無
菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに分注した後、凍結
乾燥して密封することにより凍結乾燥製剤を得た。

【００２７】実施例２ ０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ及び
０．０１％ポリソルベート８０含有、ｐＨ７．４）１０
０ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇとヒト血清アルブミン１００ｍ
ｇを含む水溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアル
に分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾
燥製剤を得た。

【００２８】実施例３ 注射用蒸留水１００ｍｌ中にＨＧＦ１ｍｇ、ソルビトー
ル２ｇ、グリシン２ｇ及びポリソルベート８０ １０ｍ
ｇを含む溶液を無菌的に調製し、１ｍｌずつバイアルに
分注した後、凍結乾燥して密封することにより凍結乾燥
製剤を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例１における実験計画及びマウスの生存率
（％）を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＧＦを有効成分として含有するこ
   とを特徴とする免疫抑制剤による副作用の軽減剤。
2. 【請求項２】 免疫抑制剤が、抗生物質系免疫抑制
   剤である請求項１記載の免疫抑制剤による副作用の軽減
   剤。
3. 【請求項３】 抗生物質系免疫抑制剤が、シクロス
   ポリン又はＦＫ５０６である請求項２記載の免疫抑制剤
   による副作用の軽減剤。