JPH0640938A - Ｈｇｆ含有製剤 - Google Patents
Ｈｇｆ含有製剤Info
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- JPH0640938A JPH0640938A JP4213438A JP21343892A JPH0640938A JP H0640938 A JPH0640938 A JP H0640938A JP 4213438 A JP4213438 A JP 4213438A JP 21343892 A JP21343892 A JP 21343892A JP H0640938 A JPH0640938 A JP H0640938A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）の作用時間の持続
性を図ることができる医薬製剤を提供することを目的と
する。 【構成】 本発明の医薬製剤は、ＨＧＦとヘパリンとを
含有することからなる。本発明によれば、低用量で有効
な持続性のあるＨＧＦ含有医薬品が得られ、投与回数及
び投与量を低減できるので、患者の苦痛の緩和、医療費
の低減などを図ることができる。
性を図ることができる医薬製剤を提供することを目的と
する。 【構成】 本発明の医薬製剤は、ＨＧＦとヘパリンとを
含有することからなる。本発明によれば、低用量で有効
な持続性のあるＨＧＦ含有医薬品が得られ、投与回数及
び投与量を低減できるので、患者の苦痛の緩和、医療費
の低減などを図ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＨＧＦ(Hepatocyto Gr
owth Factor、肝細胞増殖因子)を含有する医薬製剤に関
し、より詳細にはＨＧＦの作用時間の持続性を図ること
のできる医薬製剤に関するものである。
owth Factor、肝細胞増殖因子)を含有する医薬製剤に関
し、より詳細にはＨＧＦの作用時間の持続性を図ること
のできる医薬製剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＨＧＦは、中村らにより発見された、成
熟肝細胞に対して最も強力な増殖促進活性を持つ生理活
性ペプチドであり（例えば、Biochem. Biophys. Res. C
ommun., 122, 1450, 1984、FEBS Letter, 22, 311, 198
7など参照）、近年生物工学的手法により量産が可能に
なった（例えば、Nature, 342, 440, 1989、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990、Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 172, 321, 1990など参照)。本因子
は、肝炎や肝硬変のみならず、腎炎や癌などに対する治
療・予防薬として、また制癌剤の副作用抑制剤や創傷治
癒剤などへの適用が期待されている。
熟肝細胞に対して最も強力な増殖促進活性を持つ生理活
性ペプチドであり（例えば、Biochem. Biophys. Res. C
ommun., 122, 1450, 1984、FEBS Letter, 22, 311, 198
7など参照）、近年生物工学的手法により量産が可能に
なった（例えば、Nature, 342, 440, 1989、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990、Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 172, 321, 1990など参照)。本因子
は、肝炎や肝硬変のみならず、腎炎や癌などに対する治
療・予防薬として、また制癌剤の副作用抑制剤や創傷治
癒剤などへの適用が期待されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上述のように、ＨＧＦ
は医薬品としての利用が期待されている物質であるが、
本因子を単独で投与しても半減期数分で血中から消失す
ることが、本因子を医薬品として開発していく上での大
きな障害となっていた。因に、本因子の血中よりのクリ
アランスに関わる主要臓器は肝臓であることも既に知ら
れている。本因子は高分子ペプチドであり、例えば、注
射剤として患者に投与されることになるが、半減期の短
い薬剤はそのままでは頻回投与か持続投与を余儀なくさ
れる。従って、患者は治療に当たって、持続性の長い薬
剤に比べてより大きな苦痛を強いられることになる。ま
た、血中からのクリアランスが速ければ大量の薬剤投与
が必要となり、医療費の高騰を招来するとともに大量に
本因子を生産することが必要になる。一般的な製剤技術
でこの点を克服しようとする試みもあるが、本因子の特
性に対応して設計されたものではなく、十分な効果は得
られていない。本発明は上記の課題を解決すべくなされ
たもので、本発明の目的は、ＨＧＦの生物活性を維持さ
せたままで、血中からのクリアランスを低下させ、本因
子の作用持続時間を延長させることのできる製剤を提供
することにある。
は医薬品としての利用が期待されている物質であるが、
本因子を単独で投与しても半減期数分で血中から消失す
ることが、本因子を医薬品として開発していく上での大
きな障害となっていた。因に、本因子の血中よりのクリ
アランスに関わる主要臓器は肝臓であることも既に知ら
れている。本因子は高分子ペプチドであり、例えば、注
射剤として患者に投与されることになるが、半減期の短
い薬剤はそのままでは頻回投与か持続投与を余儀なくさ
れる。従って、患者は治療に当たって、持続性の長い薬
剤に比べてより大きな苦痛を強いられることになる。ま
た、血中からのクリアランスが速ければ大量の薬剤投与
が必要となり、医療費の高騰を招来するとともに大量に
本因子を生産することが必要になる。一般的な製剤技術
でこの点を克服しようとする試みもあるが、本因子の特
性に対応して設計されたものではなく、十分な効果は得
られていない。本発明は上記の課題を解決すべくなされ
たもので、本発明の目的は、ＨＧＦの生物活性を維持さ
せたままで、血中からのクリアランスを低下させ、本因
子の作用持続時間を延長させることのできる製剤を提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、本発明者らはＨＧＦの作用時間を持続させることを
鋭意検討したところ、ＨＧＦの持つヘパリン親和性の特
性を考慮してＨＧＦとヘパリンとを併用すること、即ち
ＨＧＦとヘパリンの複合体を形成させることにより、血
中よりのＨＧＦのクリアランスを低下させ得ることを見
出した。また、当該複合体の形成がＨＧＦの持つ生物活
性の発現に支障を与えないことも確認した。本発明はか
かる知見に基づいてなされたものである。即ち、本発明
の医薬製剤は、ＨＧＦとヘパリンを含有することからな
る。
め、本発明者らはＨＧＦの作用時間を持続させることを
鋭意検討したところ、ＨＧＦの持つヘパリン親和性の特
性を考慮してＨＧＦとヘパリンとを併用すること、即ち
ＨＧＦとヘパリンの複合体を形成させることにより、血
中よりのＨＧＦのクリアランスを低下させ得ることを見
出した。また、当該複合体の形成がＨＧＦの持つ生物活
性の発現に支障を与えないことも確認した。本発明はか
かる知見に基づいてなされたものである。即ち、本発明
の医薬製剤は、ＨＧＦとヘパリンを含有することからな
る。
【０００５】上記の構成からなる本発明の有効成分であ
るＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたも
のであれば、種々の方法で調製されたものを用いること
ができる。ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知
られており、例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなど
の哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤
等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清な
どから抽出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦ
を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物
（培養上清、培養細胞など）から分離精製してＨＧＦを
得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨ
ＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、こ
れを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体
の培養物から目的とする組換えＨＧＦを得ることができ
る(例えば、Nature, 342, 440, 1989など参照)。上記の
宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法
で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草
菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いること
ができる。
るＨＧＦは、医薬として使用できる程度に精製されたも
のであれば、種々の方法で調製されたものを用いること
ができる。ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知
られており、例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなど
の哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤
等の臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清な
どから抽出、精製して得ることができる。また、ＨＧＦ
を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物
（培養上清、培養細胞など）から分離精製してＨＧＦを
得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨ
ＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組込み、こ
れを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体
の培養物から目的とする組換えＨＧＦを得ることができ
る(例えば、Nature, 342, 440, 1989など参照)。上記の
宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法
で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草
菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いること
ができる。
【０００６】より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽
出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素
を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出し
て粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースな
どのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常
の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝
子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベ
クターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例
えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、
その培養上清より得ることができる。
出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素
を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出し
て粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースな
どのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常
の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝
子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベ
クターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例
えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、
その培養上清より得ることができる。
【０００７】かくして得られたＨＧＦは、そのアミノ酸
配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されてい
たり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末
端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合し
ていたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されてい
てもよい。かかるＨＧＦ同効物としては、例えば、特開
平３−１３００９１号公報、国際公開ＷＯ９０／１０６
５１号公報などに記載の物質が挙げられ、これらも本発
明に適用でき、本発明の範囲に含まれる。
配列の一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されてい
たり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末
端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合し
ていたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されてい
てもよい。かかるＨＧＦ同効物としては、例えば、特開
平３−１３００９１号公報、国際公開ＷＯ９０／１０６
５１号公報などに記載の物質が挙げられ、これらも本発
明に適用でき、本発明の範囲に含まれる。
【０００８】本発明の他の成分であるヘパリンとして
は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれ
ばいずれのものも用いることができ、その由来（例え
ば、ウシ、ブタなど）も特に限定されない。また、使用
されるヘパリンの分子量も特に限定されず、高分子量ヘ
パリン、低分子量ヘパリン及びそれらの混合物のいずれ
も使用することができる。ＨＧＦに対するヘパリンの使
用割合としては、ＨＧＦ１ｐｍｏｌに対して、ヘパリン
を0.01〜50ｍｇ程度とされる。ヘパリンの使用量が0.01
ｍｇ未満では十分なＨＧＦクリアランス低下効果を発現
できないことがあり、また50ｍｇを超えても問題はない
がそれまでの量で効果を発揮できるので、その量を超え
て加える必要性は少ない。
は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれ
ばいずれのものも用いることができ、その由来（例え
ば、ウシ、ブタなど）も特に限定されない。また、使用
されるヘパリンの分子量も特に限定されず、高分子量ヘ
パリン、低分子量ヘパリン及びそれらの混合物のいずれ
も使用することができる。ＨＧＦに対するヘパリンの使
用割合としては、ＨＧＦ１ｐｍｏｌに対して、ヘパリン
を0.01〜50ｍｇ程度とされる。ヘパリンの使用量が0.01
ｍｇ未満では十分なＨＧＦクリアランス低下効果を発現
できないことがあり、また50ｍｇを超えても問題はない
がそれまでの量で効果を発揮できるので、その量を超え
て加える必要性は少ない。
【０００９】本発明の目的は、予め調製されたＨＧＦ及
びヘパリンを含有する製剤を投与するか、又はＨＧＦと
ヘパリンを含む製剤を用時に調製して投与することによ
り達成される。適用症状としては、肝炎、肝硬変、腎
炎、癌などの治療・予防、制癌剤の副作用抑制、創傷治
癒の促進などが挙げられる。
びヘパリンを含有する製剤を投与するか、又はＨＧＦと
ヘパリンを含む製剤を用時に調製して投与することによ
り達成される。適用症状としては、肝炎、肝硬変、腎
炎、癌などの治療・予防、制癌剤の副作用抑制、創傷治
癒の促進などが挙げられる。
【００１０】本発明の製剤は種々の製剤形態（例えば、
液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一般的
には有効成分であるＨＧＦ及びヘパリンのみ又はそれら
と慣用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体
と共に外用薬とされる。当該注射剤は常法により調製す
ることができ、例えば、ＨＧＦ及びヘパリンを適切な溶
剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解し
た後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な
容器に充填することにより調製することができる。注射
剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程
度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整され、ヘパ
リン含量はＨＧＦ含量に応じて適宜調整される。また、
外用薬としては、例えば、軟膏状、ゲル状、液状などの
剤形に製剤化され、製剤中のＨＧＦ含量は、外用薬の適
用疾患、適用部位などに応じて適宜調整することができ
る。製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、
安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、
ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、
エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明
の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解
補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでい
てもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾
燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結
乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解し
て使用される。
液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一般的
には有効成分であるＨＧＦ及びヘパリンのみ又はそれら
と慣用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体
と共に外用薬とされる。当該注射剤は常法により調製す
ることができ、例えば、ＨＧＦ及びヘパリンを適切な溶
剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解し
た後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な
容器に充填することにより調製することができる。注射
剤中のＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程
度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整され、ヘパ
リン含量はＨＧＦ含量に応じて適宜調整される。また、
外用薬としては、例えば、軟膏状、ゲル状、液状などの
剤形に製剤化され、製剤中のＨＧＦ含量は、外用薬の適
用疾患、適用部位などに応じて適宜調整することができ
る。製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、
安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、
ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、
エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明
の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解
補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでい
てもよい。液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾
燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結
乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解し
て使用される。
【００１１】本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適
当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形
態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することが
できる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などに
より適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01mg〜100m
gであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与する
のが適当である。
当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形
態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することが
できる。その投与量は、患者の症状、年齢、体重などに
より適宜調整されるが、通常ＨＧＦとして0.01mg〜100m
gであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与する
のが適当である。
【００１２】
【実施例】以下、実施例及び試験例に基づいて本発明を
詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。なお、以下に述べる実施例では中村らの総
説（例えば、Critical Reviews in Oncogenesis, 3, 27
-54, 1992、代謝 28, 599-608, 1991など参照）に述べ
られているタイプ１のＨＧＦを使用したが、既にタイプ
２及びタイプ３のＨＧＦもタイプ１のＨＧＦと同等の活
性を有することが知られており、タイプ２及びタイプ３
並びに各タイプの誘導体を用いても同様の効果が得られ
ることは明らかである。
詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。なお、以下に述べる実施例では中村らの総
説（例えば、Critical Reviews in Oncogenesis, 3, 27
-54, 1992、代謝 28, 599-608, 1991など参照）に述べ
られているタイプ１のＨＧＦを使用したが、既にタイプ
２及びタイプ３のＨＧＦもタイプ１のＨＧＦと同等の活
性を有することが知られており、タイプ２及びタイプ３
並びに各タイプの誘導体を用いても同様の効果が得られ
ることは明らかである。
【００１３】実施例１ 生理食塩水100ml中にＨＧＦ１mg、ヘパリン４ｇ、マン
ニトール１ｇ及びポリソルベート80 10mgを含む溶液を
無菌的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注
し、常法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
ニトール１ｇ及びポリソルベート80 10mgを含む溶液を
無菌的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注
し、常法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
【００１４】実施例２ 0.15M ＮａＣｌと0.01%ポリソルベート80を含むpH7.4の
0.02Mリン酸緩衝液100mlに、ＨＧＦ１mg、ヘパリン４ｇ
及びヒト血清アルブミン100mgを添加した水溶液を無菌
的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注し、常
法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
0.02Mリン酸緩衝液100mlに、ＨＧＦ１mg、ヘパリン４ｇ
及びヒト血清アルブミン100mgを添加した水溶液を無菌
的に調製し、バイアル瓶に１mlずつ無菌的に分注し、常
法に準じて凍結乾燥し、凍結乾燥製剤を得た。
【００１５】以下、試験例に基づいて、本発明を説明す
る。なお、試験に用いたヘパリンは以下のとおりであ
る。 高分子量ヘパリン：シグマ製、製品番号 H 7005［ナト
リウム塩、グレード II、ブタ腸粘膜由来、分子量:２５
０００−３５０００（レーザー光散法）、１８０００−
２３０００（ゲル濾過法）］ 低分子量ヘパリン：シグマ社製、製品番号 H 5640（ナ
トリウム塩、ブタ腸粘膜由来、分子量:４０００−６０
００）
る。なお、試験に用いたヘパリンは以下のとおりであ
る。 高分子量ヘパリン：シグマ製、製品番号 H 7005［ナト
リウム塩、グレード II、ブタ腸粘膜由来、分子量:２５
０００−３５０００（レーザー光散法）、１８０００−
２３０００（ゲル濾過法）］ 低分子量ヘパリン：シグマ社製、製品番号 H 5640（ナ
トリウム塩、ブタ腸粘膜由来、分子量:４０００−６０
００）
【００１６】試験例１ラット肝臓にＨＧＦ−ヘパリン複合体を灌流したときの
流出液中に出現した放射活性の割合及び肝抽出率 125 Ｉで標識したトレーサー濃度（０．８ｐＭ）のＨＧ
Ｆのみ、及びこの標品とそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ、１
ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリンをそれぞ
れ混合した後、室温で５０分インキュベートして作成し
た各複合体をラットに一回通過で灌流させた（灌流速
度、１２ｍｌ／分）。灌流液は２０％（Ｖ／Ｖ）の牛赤
血球、２％（Ｗ／Ｖ）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、
５ｍＭグルコースを含む中性緩衝液［１２０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭＫＨ2ＰＯ4、１．２
ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、２０ｍＭ
ＭＥＳ（ｐＨ７．４）］を用いた。流入液中のトリクロ
ル酢酸（ＴＣＡ）−沈殿性の放射活性に対する肝静脈中
のＴＣＡ−沈殿性の放射活性の割合の時間推移（図１左
側）及びその肝抽出率（図１右側）を測定した。なお、
肝抽出率は、定常状態下での（流入液中放射能−肝静脈
中放射能）／（流入液中放射能）より計算した。図１に
示されるように、１ｍｇ／ｍｌ以上のヘパリンと混合し
たとき、肝抽出率が顕著に低下した。また、ＨＧＦの血
中からのクリアランスに関わる主要臓器が肝臓であるこ
とを併せ考えると、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でも、ヘパリン
によりＨＧＦの血中からのクリアランスも顕著に低下す
ることが示唆された。
流出液中に出現した放射活性の割合及び肝抽出率 125 Ｉで標識したトレーサー濃度（０．８ｐＭ）のＨＧ
Ｆのみ、及びこの標品とそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ、１
ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリンをそれぞ
れ混合した後、室温で５０分インキュベートして作成し
た各複合体をラットに一回通過で灌流させた（灌流速
度、１２ｍｌ／分）。灌流液は２０％（Ｖ／Ｖ）の牛赤
血球、２％（Ｗ／Ｖ）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、
５ｍＭグルコースを含む中性緩衝液［１２０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭＫＨ2ＰＯ4、１．２
ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．２ｍＭ ＣａＣｌ2、２０ｍＭ
ＭＥＳ（ｐＨ７．４）］を用いた。流入液中のトリクロ
ル酢酸（ＴＣＡ）−沈殿性の放射活性に対する肝静脈中
のＴＣＡ−沈殿性の放射活性の割合の時間推移（図１左
側）及びその肝抽出率（図１右側）を測定した。なお、
肝抽出率は、定常状態下での（流入液中放射能−肝静脈
中放射能）／（流入液中放射能）より計算した。図１に
示されるように、１ｍｇ／ｍｌ以上のヘパリンと混合し
たとき、肝抽出率が顕著に低下した。また、ＨＧＦの血
中からのクリアランスに関わる主要臓器が肝臓であるこ
とを併せ考えると、ｉｎ ｖｉｖｏ条件でも、ヘパリン
によりＨＧＦの血中からのクリアランスも顕著に低下す
ることが示唆された。
【００１７】試験例２ 125Ｉ−ＨＧＦ−ヘパリン複合体を静注したときの血漿
中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移 125 Ｉで標識したトレーサー濃度（５００ｐＭ）のＨＧ
Ｆのみ、及びこの標品とそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌ、４０
ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリン、ある
いは８０ｍｇ／ｍｌの低分子量ヘパリンをそれぞれ混合
した後、室温で５０分インキュベートして作成した各複
合体を、ラットに大腿静脈より約０．２５ｍｌ静注し
た。次いで、大腿動脈より採血を行い、血漿中ＴＣＡ−
沈殿性放射濃度の推移を測定した。なお、この条件下で
は、ＨＧＦの投与量は、０．１３ｐｍｏｌ／ラット、ヘ
パリンの投与量は、高分子量ヘパリンでそれぞれ、５ｍ
ｇ／ラット、１０ｍｇ／ラット、２０ｍｇ／ラット、及
び低分子量ヘパリンで、２０ｍｇ／ラットに相当する。
得られた結果を図２に示す。なお、結果として得られた
血漿中濃度を投与量で規格化して示した。図２に示され
るように、高分子量ヘパリンでは５ｍｇ／ラット以上、
低分子ヘパリンでは２０ｍｇ／ラットで著明な血中から
のＨＧＦクリアランスの低下がみられた。
中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移 125 Ｉで標識したトレーサー濃度（５００ｐＭ）のＨＧ
Ｆのみ、及びこの標品とそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌ、４０
ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌの高分子量ヘパリン、ある
いは８０ｍｇ／ｍｌの低分子量ヘパリンをそれぞれ混合
した後、室温で５０分インキュベートして作成した各複
合体を、ラットに大腿静脈より約０．２５ｍｌ静注し
た。次いで、大腿動脈より採血を行い、血漿中ＴＣＡ−
沈殿性放射濃度の推移を測定した。なお、この条件下で
は、ＨＧＦの投与量は、０．１３ｐｍｏｌ／ラット、ヘ
パリンの投与量は、高分子量ヘパリンでそれぞれ、５ｍ
ｇ／ラット、１０ｍｇ／ラット、２０ｍｇ／ラット、及
び低分子量ヘパリンで、２０ｍｇ／ラットに相当する。
得られた結果を図２に示す。なお、結果として得られた
血漿中濃度を投与量で規格化して示した。図２に示され
るように、高分子量ヘパリンでは５ｍｇ／ラット以上、
低分子ヘパリンでは２０ｍｇ／ラットで著明な血中から
のＨＧＦクリアランスの低下がみられた。
【００１８】試験例３ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成促進（ＨＧＦ
との接触時間の影響） コラゲナーゼ灌流法により調製したラット遊離肝細胞
（２．５×１０5細胞／ｍｌ）を、培養用ディッシュに
１ｃｍ2当りの細胞数が７×１０4個になるように入れ、
Williams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデ
キサメサゾン、５％（Ｖ／Ｖ）子ウシ血清、３０ｍｇ／
ｌカナマイシン モノサルフェートを含む）中で２４時
間培養した。途中、培養開始２時間後に同じ培地の新鮮
なものに交換した。培養開始２４時間後に、培地をWill
iams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデキサ
メサゾン、５Ｕ／ｍｌアプロチニン、３０ｍｇ／ｌカナ
マイシン モノサルフェートを含む）に交換するととも
に、ＨＧＦ（０−２５０ｐＭ）を種々の時間（０．３−
２８時間）インキュベートした後に細胞を洗浄し、同培
養用メディウムを加え、合計２８時間になるまでインキ
ュベートを続けた。インキュベーションの途中２２時間
後に、125Ｉでラベルしたデオキシウリジン（採取濃
度、０．３μＣｉ／ｍｌ、０．１４ｎＭ）を非標識体
（最終濃度、４８０ｎＭ）と共に加えた。２８時間後（
125Ｉ−デオキシウリジン添加６時間後）に、125Ｉ−デ
オキシウリジンの取り込み量を測定することによりＤＮ
Ａ合成を評価した。その結果を図３に示した。なお、結
果は、９０ｐＭのＨＧＦを２８時間接触させたときに得
られた最大活性を１００として表した。図３から明らか
なように、ＨＧＦと標的細胞である肝細胞との接触時間
が長いほどＤＮＡ合成が増大していた。このことは、Ｈ
ＧＦを血中により長時間にわたって存在させた方が、そ
の有効性の増強につながることを示している。
との接触時間の影響） コラゲナーゼ灌流法により調製したラット遊離肝細胞
（２．５×１０5細胞／ｍｌ）を、培養用ディッシュに
１ｃｍ2当りの細胞数が７×１０4個になるように入れ、
Williams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデ
キサメサゾン、５％（Ｖ／Ｖ）子ウシ血清、３０ｍｇ／
ｌカナマイシン モノサルフェートを含む）中で２４時
間培養した。途中、培養開始２時間後に同じ培地の新鮮
なものに交換した。培養開始２４時間後に、培地をWill
iams' medium E培地（１ｎＭインスリン、１ｎＭデキサ
メサゾン、５Ｕ／ｍｌアプロチニン、３０ｍｇ／ｌカナ
マイシン モノサルフェートを含む）に交換するととも
に、ＨＧＦ（０−２５０ｐＭ）を種々の時間（０．３−
２８時間）インキュベートした後に細胞を洗浄し、同培
養用メディウムを加え、合計２８時間になるまでインキ
ュベートを続けた。インキュベーションの途中２２時間
後に、125Ｉでラベルしたデオキシウリジン（採取濃
度、０．３μＣｉ／ｍｌ、０．１４ｎＭ）を非標識体
（最終濃度、４８０ｎＭ）と共に加えた。２８時間後（
125Ｉ−デオキシウリジン添加６時間後）に、125Ｉ−デ
オキシウリジンの取り込み量を測定することによりＤＮ
Ａ合成を評価した。その結果を図３に示した。なお、結
果は、９０ｐＭのＨＧＦを２８時間接触させたときに得
られた最大活性を１００として表した。図３から明らか
なように、ＨＧＦと標的細胞である肝細胞との接触時間
が長いほどＤＮＡ合成が増大していた。このことは、Ｈ
ＧＦを血中により長時間にわたって存在させた方が、そ
の有効性の増強につながることを示している。
【００１９】試験例４ＨＧＦ−ヘパリン複合体による初代培養肝細胞のＤＮＡ
合成 ＨＧＦ１ｎＭ又は１２．５ｎＭと、ヘパリン（濃度、０
−１００ｍｇ／ｍｌ）を室温で５０分間プレインキュベ
ートして、複合体を形成させた。この混合溶液２０μｌ
を、試験例３に示した培地５００μｌ中の培養肝細胞に
加え、２８時間インキュベートした。従って、培地中で
の最終濃度としては、ＨＧＦで約４０ｐＭ及び５００ｐ
Ｍ、ヘパリンで０−４ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。
途中、ＨＧＦ−ヘパリン混合液添加２２時間後に、試験
例３と同様に125Ｉ−デオキシウリジンを添加し、ＤＮ
Ａ合成能を測定した。その結果を図４に示す。なお、図
４においては、ヘパリン非存在下のＤＮＡ合成能を１０
０とし、それに対する割合（％）で表示した。図４から
明らかなように、高濃度のヘパリンとの複合体でも十分
に高い生物活性がされていた。因に、試験例２で示され
たＨＧＦの血中クリアランス低下に十分な１０ｍｇ／ラ
ットというハペリンの量は、循環血漿の容積（約１０ｍ
ｌ／ラット）を考慮すると、ほぼ１ｍｇ／ｍｌに相当す
る。
合成 ＨＧＦ１ｎＭ又は１２．５ｎＭと、ヘパリン（濃度、０
−１００ｍｇ／ｍｌ）を室温で５０分間プレインキュベ
ートして、複合体を形成させた。この混合溶液２０μｌ
を、試験例３に示した培地５００μｌ中の培養肝細胞に
加え、２８時間インキュベートした。従って、培地中で
の最終濃度としては、ＨＧＦで約４０ｐＭ及び５００ｐ
Ｍ、ヘパリンで０−４ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。
途中、ＨＧＦ−ヘパリン混合液添加２２時間後に、試験
例３と同様に125Ｉ−デオキシウリジンを添加し、ＤＮ
Ａ合成能を測定した。その結果を図４に示す。なお、図
４においては、ヘパリン非存在下のＤＮＡ合成能を１０
０とし、それに対する割合（％）で表示した。図４から
明らかなように、高濃度のヘパリンとの複合体でも十分
に高い生物活性がされていた。因に、試験例２で示され
たＨＧＦの血中クリアランス低下に十分な１０ｍｇ／ラ
ットというハペリンの量は、循環血漿の容積（約１０ｍ
ｌ／ラット）を考慮すると、ほぼ１ｍｇ／ｍｌに相当す
る。
【００２０】試験例５ 125Ｉ−ＨＧＦ静注後にヘパリンを静注したときの血漿
中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移 正常ラット及び四塩化炭素処理ラット（オリーブ油で１
０倍に希釈した四塩化炭素を、ラット腹腔に１ｍｌ／１
００ｇ体重投与し、２４時間後のラットを用いた）に、
125Ｉ−標識したトレーサー量（０．１３ｐｍｏｌ／ラ
ット）のＨＧＦを大腿静脈より静注した後１１〜１６分
後に高分子量ヘパリンを種々の投与量（０、１０、２
５、５０ｍｇ／ラット）で静注したときの血漿中のＴＣ
Ａ−沈殿性放射活性の時間推移を測定した。なお、採血
は大腿動脈より行った。図５に、正常ラットに125Ｉ−
ＨＧＦを静注後、１６分してヘパリンを静注したときの
血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。ま
た、図６に、正常ラット（コントロール）及び四塩化炭
素処理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘ
パリン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中の
ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。図５及び６に
示されるように、ヘパリン投与により125Ｉ−ＨＧＦの
血漿中濃度が一過的に上昇することが明らかである。こ
の理由としては、ヘパリンによりＨＧＦの血中クリアラ
ンスが低下すること、及び各組織表面に結合している
125Ｉ−ＨＧＦがヘパリンにより除去され循環血中に移
行することの両原因が考えられる。ここで、重要なこと
は、四塩化炭素処理をして肝炎惹起ラットでも正常ラッ
トと同様なヘパリンの効果がみられている点である。
中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移 正常ラット及び四塩化炭素処理ラット（オリーブ油で１
０倍に希釈した四塩化炭素を、ラット腹腔に１ｍｌ／１
００ｇ体重投与し、２４時間後のラットを用いた）に、
125Ｉ−標識したトレーサー量（０．１３ｐｍｏｌ／ラ
ット）のＨＧＦを大腿静脈より静注した後１１〜１６分
後に高分子量ヘパリンを種々の投与量（０、１０、２
５、５０ｍｇ／ラット）で静注したときの血漿中のＴＣ
Ａ−沈殿性放射活性の時間推移を測定した。なお、採血
は大腿動脈より行った。図５に、正常ラットに125Ｉ−
ＨＧＦを静注後、１６分してヘパリンを静注したときの
血漿中のＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。ま
た、図６に、正常ラット（コントロール）及び四塩化炭
素処理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘ
パリン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中の
ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す。図５及び６に
示されるように、ヘパリン投与により125Ｉ−ＨＧＦの
血漿中濃度が一過的に上昇することが明らかである。こ
の理由としては、ヘパリンによりＨＧＦの血中クリアラ
ンスが低下すること、及び各組織表面に結合している
125Ｉ−ＨＧＦがヘパリンにより除去され循環血中に移
行することの両原因が考えられる。ここで、重要なこと
は、四塩化炭素処理をして肝炎惹起ラットでも正常ラッ
トと同様なヘパリンの効果がみられている点である。
【００２１】
【発明の効果】以上説明したように、ＨＧＦをヘパリン
と混合して複合体を形成させることにより、さらに通常
用いられる各種の賦形剤や安定化剤を添加することで、
低用量で有効な持続性のあるＨＧＦ含有医薬品を得るこ
とができる。従って、本発明によれば、投与回数及び投
与量を低減できるので、患者の苦痛の緩和、医療費の低
減などを図ることができる。
と混合して複合体を形成させることにより、さらに通常
用いられる各種の賦形剤や安定化剤を添加することで、
低用量で有効な持続性のあるＨＧＦ含有医薬品を得るこ
とができる。従って、本発明によれば、投与回数及び投
与量を低減できるので、患者の苦痛の緩和、医療費の低
減などを図ることができる。
【図１】ラット肝臓にＨＧＦ−ヘパリン複合体を灌流し
たときの流出液中に出現した放射活性の割合（左側）及
び肝抽出率（右側）を示す図である。
たときの流出液中に出現した放射活性の割合（左側）及
び肝抽出率（右側）を示す図である。
【図２】125Ｉ−ＨＧＦ−ヘパリン複合体を静注したと
きの血漿中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す図で
ある。
きの血漿中ＴＣＡ沈殿性放射活性の時間推移を示す図で
ある。
【図３】ＨＧＦによる初代培養肝細胞のＤＮＡ合成促進
におけるＨＧＦとの接触時間の影響を示す図である。
におけるＨＧＦとの接触時間の影響を示す図である。
【図４】ＨＧＦ−ヘパリン複合体による初代培養肝細胞
のＤＮＡ合成を示す図である。左側の図はＨＧＦ濃度４
０ｐＭの場合を、右側の図はＨＧＦ濃度５００ｐＭの場
合を示す。
のＤＮＡ合成を示す図である。左側の図はＨＧＦ濃度４
０ｐＭの場合を、右側の図はＨＧＦ濃度５００ｐＭの場
合を示す。
【図５】正常ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１６分
してヘパリンを静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放
射活性の時間推移を示す図である。
してヘパリンを静注したときの血漿中のＴＣＡ沈殿性放
射活性の時間推移を示す図である。
【図６】正常ラット（コントロール）及び四塩化炭素処
理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘパリ
ン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中のＴＣ
Ａ沈殿性放射活性の時間推移を示す図である。
理ラットに125Ｉ−ＨＧＦを静注後、１１分してヘパリ
ン（２５ｍｇ／ラット）を静注したときの血漿中のＴＣ
Ａ沈殿性放射活性の時間推移を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉山 雄一 東京都武蔵野市西久保３丁目４番10号 (72)発明者 花野 学 船橋市松ケ丘１丁目24番３号
Claims (4)
- 【請求項１】 ＨＧＦとヘパリンを含有すること
を特徴とする医薬製剤。 - 【請求項２】 ＨＧＦが、ヒト又は動物の組織又
は血液成分由来である請求項１記載の医薬製剤。 - 【請求項３】 ＨＧＦが、遺伝子組換により製造
したものである請求項１記載の医薬製剤。 - 【請求項４】 使用時にＨＧＦとヘパリンとを混
合して調製される請求項１から４のいずれかに記載の医
薬製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21343892A JP3697460B2 (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | Ｈｇｆ含有製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21343892A JP3697460B2 (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | Ｈｇｆ含有製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0640938A true JPH0640938A (ja) | 1994-02-15 |
| JP3697460B2 JP3697460B2 (ja) | 2005-09-21 |
Family
ID=16639236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21343892A Expired - Fee Related JP3697460B2 (ja) | 1992-07-17 | 1992-07-17 | Ｈｇｆ含有製剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3697460B2 (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997002832A1 (fr) * | 1995-07-11 | 1997-01-30 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Preparations lyophilisees de hgf |
| US5654404A (en) * | 1992-09-16 | 1997-08-05 | Genentech, Inc. | Protection against liver damage by HGF |
| WO1998024467A1 (en) * | 1996-12-05 | 1998-06-11 | Toshikazu Nakamura | Remedies for fulminant hepatitis |
| WO1998040096A1 (en) * | 1997-03-11 | 1998-09-17 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Preventives and/or remedies for multiple organ failure |
| US6033688A (en) * | 1995-09-12 | 2000-03-07 | Genentech, Inc. | Cystic fibrosis therapy |
| WO2000072873A1 (fr) * | 1999-05-31 | 2000-12-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | Preparations lyophilisees de hgf |
| JP2005168654A (ja) * | 2003-12-09 | 2005-06-30 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | 増殖因子結合低分子ヘパリン修飾体 |
| JP2006076968A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物 |
| US7115568B2 (en) | 1997-03-14 | 2006-10-03 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Methods using TCF II |
| AU2005200353B2 (en) * | 1995-07-11 | 2008-03-06 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd | Lyophilized HGF preparations |
-
1992
- 1992-07-17 JP JP21343892A patent/JP3697460B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR100705997B1 (ko) * | 1995-07-11 | 2007-07-09 | 나카무라 도시카즈 | 안정화된 hgf 동결건조제제 및 그 제조방법 |
| WO1997002832A1 (fr) * | 1995-07-11 | 1997-01-30 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Preparations lyophilisees de hgf |
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| AU725441B2 (en) * | 1997-03-11 | 2000-10-12 | Atlas Pharmaceuticals Inc. | An agent for preventing and/or treating multiple organ failure |
| WO1998040096A1 (en) * | 1997-03-11 | 1998-09-17 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Preventives and/or remedies for multiple organ failure |
| US7306791B2 (en) | 1997-03-11 | 2007-12-11 | Daiichi Sankyo Co., Ltd. | Agent for preventing and/or treating multiple organ failure |
| US7115568B2 (en) | 1997-03-14 | 2006-10-03 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Methods using TCF II |
| US7138372B2 (en) | 1997-03-14 | 2006-11-21 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Agent for preventing and/or treating cachexia |
| WO2000072873A1 (fr) * | 1999-05-31 | 2000-12-07 | Mitsubishi Chemical Corporation | Preparations lyophilisees de hgf |
| KR100767473B1 (ko) * | 1999-05-31 | 2007-10-17 | 미쯔비시 가가꾸 가부시끼가이샤 | 간실질세포 증식인자 동결건조 제제 |
| CN100448482C (zh) * | 1999-05-31 | 2009-01-07 | 三菱化学株式会社 | Hgf冻干制剂 |
| JP4635340B2 (ja) * | 1999-05-31 | 2011-02-23 | 三菱化学株式会社 | Ｈｇｆ凍結乾燥製剤 |
| JP2005168654A (ja) * | 2003-12-09 | 2005-06-30 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | 増殖因子結合低分子ヘパリン修飾体 |
| JP2006076968A (ja) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 生理活性分子含有架橋ヘパリンゲル組成物 |
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|---|---|
| JP3697460B2 (ja) | 2005-09-21 |
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