JPH07258115A - 治療薬の経口投与方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 腸の管腔側に適用されるカチオン性治療薬と
して、適用部位において薬剤の放出が改良された経口投
与型の薬剤組成物に関する。 【構成】 カチオン性治療薬と、多価のカチオンで架橋
されたアルギン酸塩および上記アルギン酸塩の重量に対
して重量／重量比が75：２〜75：10の量で分子量が50〜
150 ｋＤａのポリアクリル酸とから調製された放出が持
続性の経口投与型の薬剤組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、治療を目的とするカチオン性
蛋白質を経口投与するための方法および組成物に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、ＴＧＦ−β₁ 等の治療
薬を、活性形態で投与するため合成重合体である添加剤
を含有するアルギン酸塩システムに関する。

【０００２】

【発明の背景】アルギン酸塩は、１、４−結合β−Ｄ−
マンヌロン酸およびα−Ｌ−グルロン酸の共重合体であ
る。それは、カルシウムのような二価のカチオンの存在
下において、ゲルの生成に独特の性質を有しており、細
胞の固定（M.F.A. Goosen et al., "Microencapsulatio
n of Living Tissue and Cells," Canadian Patent 1,2
15,922（1982））、有効な人工臓器（M.F.A. Goosen et
al., "Optimization ofMicroencapsulation parameter
s: Semipermeable Microcapsules as a Bioartificial
Pancreas," Biotech. Bioeng. 27 :146-150（198
5））、並びに薬剤（C.K. Kim and E.J. Lee, "The Con
trolled Release of Blue Dextran from Alginate Bead
s," Int. J. Pharm. 79:11-19（1992））、殺虫剤（A.
B. Pepperman etal., "Alginate Controlled Release F
ormulations of Metribuzin," J. Cont.Rel. 17 :105-1
12（1991））、および除草剤（G. Pfister et al., "Re
lease Characteristics of Herbicides from Ca Algina
te Gel Formulations, "J. Cont.Rel. 3 :229-233（198
6））用の投与システムとして使用されている。アルギ
ン酸塩のカルシウムとのゲル化および架橋は、グルロン
酸（Ｇ）ブロックの堆積により鶏卵箱のような結合を形
成することによる（A. Katchalsky et al., "Counter-I
on Fixation in Alginates," J. Chem. Soc. :5198-
5204（1961））。したがって、アルギン酸塩溶液を、攪
拌している塩化カルシウムおよび薬剤の溶液中に滴下す
ることにより、95％までの水を含むアルギン酸塩水性ゲ
ルビーズ内に薬剤が封入される（M.F.A. Goosen et a
l., "Microencapsulation of Living Tissue and Cell
s," Canadian Patent 1,215,922（1982））。

【０００３】精製したアルギン酸塩は、経口摂取した場
合に毒性がなく、生分解性であり、生物学的に許容可能
である（C.K. Kim and E.J. Lee, "The Controlled Rel
easeof Blue Dextran from Alginate Beads," Int. J.P
harm. 79 :11-19（1992）;O.N. Singh and D.J. Burges
s, "Characterization of Albumin-Alginic Acid Compl
ex Coacervation," J. Pharm. Pharmacol. 41 :670-673
（1989））。アルギン酸塩はまた、（人工膵臓材料とし
ての）合成膵臓β細胞の成分として臨床的に試験されて
いる。さらに、アルギン酸塩は、上部胃腸管の粘液性膜
上での保護効果を有していることが見出されており（D.
Koji et al., "Pharamacological Studies of Sodium
Alginate. I. Protective Effect of Sodium Alginate
on Mucous Membranes of Upper-Gastrointestinal Tra
ct," Yakugaku Zasshi 101:452-457（1981））、そして
生物学的接着剤として研究されている（D. Chickeringe
t al., "A Tensile Technique to Evaluate the Intera
ction of BioadhesiveMicrospheres with Intestinal M
ucosa," Proc. Int. Symp. Cont. Rel Bio Mater. 19:8
8-89（1992））。アルギン酸ビーズは、プロプラノロー
ル（N. Segi etal., "Interaction of Calcium-Induced
Alginate Gel Beads with Propranolol," Chem. Phar
m. Bull. 37 :3092-3195（1989））、クロロフェニラミ
ン（A.F.Stockwell et al., "In Vitro Evaluation of
Alginate Gel Systems as Sustained Release Drug Del
ivery Systems," J. Contr. Rel. 3 :167-175（198
6））、テオフィリン（M. Bhakoo et al., "Release of
Antibiotics and AntitumourAgents from Alginate an
d Gellan Gum Gels," Proc. Int. Symp. Cont. Rel.Bio
Mater. 18 :441-442（1991））および塩基性繊維芽細
胞成長因子（bFGF）等のタンパク質成長因子（E.C. Dow
ns et al., "Calcium Alginate Beads as a Slow-Relea
se System for Delivering Angiogenic Molecules In V
ivo and In Vitro," J. Cell. Phys. 152 :422-429（19
92）, E.R. Edelman et al., "Controlled and Modulat
ed Release of Basic Fibroblast Growth Factor," Bio
materials 12 :619-625 （1991））等のような多くのカ
チオン性薬剤のための有効な搬送システムとして使用さ
れている。腸の粘液性上皮は、「上皮更新」として知ら
れている連続的動的状態にあり（G.L. Eastwood, Gastr
oenterology 72:962（1980））、そこでは増殖性のクリ
プトゾーン（crypt zone）からの分化していない幹細胞
が分裂し、分化し、そして管腔表面に移動し、そこでは
一度最終的に分化した後、絨毛の先端から抜け変わる。
クリプト絨毛細胞個体群の入れ替わりは迅速で、２４〜
７２時間毎に起こる（H. Cheng and C. Leblond, Am.
J. Anat. 141:461 （1974））。絨毛先端における細胞
の連続的な剥落は、クリプトでの進行している増殖によ
り相殺されており、腸内の上皮の容量は相対的に一定に
保たれる。このバランスのポリジーンの規則は完全には
解明されていない（Physiologyof the Gastrointestina
l Tract、L.R. Johnson、Ed. （Raven Press 、New Yor
k）、pp. 69−196 （1987）））。しかしながら、それ
は、細胞外マトリックスの鍵となるペプチド成長因子お
よび成分の複合組み込みにより達成されるかもしれない
（D.K. Podolsky 、Am. J. Physiol. 264 :G179 （199
3））。酸および熱に安定で、ジスルフィド結合した、
ホモ二量体の25kDのタンパク質である、形質転換 （ト
ランスフォーミング）成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）は
殆どの組織に存在し、細胞の増殖、転移および分化に重
要な、調整の役割を担っていることが知られている（R.
K. Assoian et al. 、J. Biol. Chem. 258 :7155（198
3）; M.B. Sporn et al.,Science 233 :532（1986）;
J. Massague, Cell 49:437（1987））。

【０００４】ＴＧＦ−βは、ヒトおよび齧歯類動物から
誘導される腸内細胞を含む、上皮を起源とする多くの細
胞の成長を阻害することが示されている（M. Kurokawa
et al.、Biochem. Biophys. Res. Comm. 142 :775 （19
87）and J.A. Barnard et al. 、Proc. Natl. Acad. Sc
i.USA 86:1578 （1989））。ＴＧＦ−β mRNA は、胃腸
管上皮で発現され（R.P. McCabe et.,Clin Immunol Imm
unopathol.66 :52（1993））および非転換ラット空腸ク
リプトセルライン（ＩＥＣ−６）はＴＧＦ−βmＲＮＡ
（S. Koyama and D.K. Podolsky 、J. Clin. Invest. 8
3 :1768 （１９８９））を発現し、並びに潜在性ＴＧＦ
−β（Ｍ． Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．、Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 142:775（1987）およびJ.A. B
arnard et al. 、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:157
8 （1989））を分泌する。

【０００５】胃腸管の急速に増殖する上皮は、癌の化学
療法に広く使用されている細胞毒の薬剤に対し、非常に
感受性がある。それらの薬剤の許容可能な量は限られて
おり、腸の毒性のために、しばしば最善ではない投与量
で使用しなければならない。化学療法を受けている癌患
者に対する試みが、消化不良から、粘膜の潰瘍化による
生命をおびやかす出血に到るまでの、種々の胃腸の合併
症について説明されている。シスプラチンとエトポシド
を組み合わせた化学療法の試みに登録された肺癌患者の
５０％と同じくらいは、過剰の急性胃腸毒性のために、
処理プロトコールを完結させることができなかった（S.
Sartori et al. 、Oncology 48 :356（1991））。シ
トシン・アラビノシド、フロクスリジンおよびマイトマ
イシンＣを使用する連続的化学療法プロトコールは、連
鎖球菌、カンジダ菌および他の病原菌による重大な全身
性の感染にしばしば導く、表面および腺上皮の異型性、
未熟さおよび壊死（R.E. Slavin et al.、Cancer 42 :
1747（1978））により特徴付けられる胃腸の毒性変質を
引き起こす。

【０００６】ある成長因子が胃腸保護活性を示し、そし
て胃の病巣の治療を増大する（S.J.Konturek et al.、S
cand. J. Gastroenterol. 27 :649（1992））。ＴＧＦ
−βは、腸内の上皮細胞の増殖を阻害するので、活性形
態で胃腸管にＴＧＦ−β₁ を経口で投与するためのおよ
び／または他の投与対照領域へＴＧＦ−β₁ または他の
カチオン性薬剤を投与するための適当なシステムに近づ
く手段を得ることが非常に望ましい。その無毒性の性質
のために、アルギン酸塩基の投与システムはこの目的の
ために有用であるように思われる。

【０００７】しかしながら、ＴＧＦ−β₁ のようなカチ
オン性薬剤をカプセルに封入するために、アルギン酸塩
とカチオン性薬剤の間に強力な複合化を行うと、薬剤の
ビーズ中への装填量を増大するが、ビーズから外への拡
散速度を減少する。さらに、数人の著者は、アルギン酸
塩の有用なカルボン酸部位へのカルシウムイオンとカチ
オン性薬剤の間の競合を観察している（N. Segi et a
l., "Interaction of Calcium-Induced Alginate Gel B
eads with Propranolol," Chem. Pharm. Bull.37:3092-
3095）; A.F. Stockwell et al., "In Vitro Evaluatio
n of Alginate Gel Systems as Sustained Release Dru
g Delivery Systems," J. Contr. Rel. 3:167-175（198
6））。

【０００８】かくして、アルギン酸塩ビーズは種々の治
療薬剤の有効な投与システムとして当業界において知ら
れているが、アルギン酸塩とカチオン性治療薬の間の複
雑な相互関係が、治療薬を活性形態でアルギン酸塩ビー
ズから放出することを妨げていることが見出されてい
る。したがって、カチオン性治療薬のための改良された
アルギン酸塩投与システムが当業界において、強く必要
とされている。

【０００９】

【発明の要旨】独特のビーズ製造条件と共に、治療薬を
不活性化することから保護し、再現性よく且つ所望の動
力学で試薬を投与する安定化ポリアニオン性添加剤を共
にカプセルに封入させることにより、アルギン酸塩がカ
チオン性治療薬についての経口投与システムとして使用
できることが現在、見出されている。本発明の方法およ
び組成物は腸（たとえば、十二指腸および空腸に対し）
の管腔側に対する治療薬に的を絞った経口放出制御シス
テムを提供する。

【００１０】一つの態様において、本発明は、治療薬お
よびアニオン性保護ポリマーの存在下でビーズを形成
し、次いで、ビーズを酸性条件下で、治療薬のビーズか
らの放出を増大するに十分な時間、インキュベートする
ことを特徴とする、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に対する
治療が必要の場合にカチオン性治療薬を投与するための
アルギン酸塩ビーズの製造方法を提供する。得られた組
成物は、驚くべきことに、活性状態でのカチオン性治療
薬を高レベルで容易に放出することが見出された。

【００１１】

【詳細な説明】本発明によれば、アルギン酸塩、カチオ
ン性治療薬およびアニオン性保護ポリマーの混合物を形
成し、次いで、混合物を当業界で公知の工程を使用して
ビーズを形成する。たとえば、混合物を注入器、たとえ
ば、25−50Ｇの針穴を通して、多価カチオンを含有する
中性ｐＨの溶液中に押し出してもよい。均一な大きさの
微小ビーズを得るためには、アルギン酸塩混合物を、好
ましくは、一定で均一な圧力をかけることにより注入器
のプランジャーからカチオン性溶液中に、カチオン性溶
液を攪拌しながら導入する。或いは、混合物を、多価カ
チオン性溶液中にノズルまたは混合物を液滴に分散する
のに適した他のオリフィスを通してスプレーしてもよ
い。カチオン性溶液と接触することにより、アルギン酸
塩が多価カチオンと架橋し、ビーズを形成する。次いで
ビーズを回収し、次の分析または使用のために洗浄す
る。利便、低コストおよび生物的競合性のために、多価
カチオンは好ましくはＣａ⁺⁺であるが、他の多価カチオ
ン、好ましくはＰｂ²⁺、Ｃｕ²⁺、Ｃｄ²⁺、Ｂａ²⁺、Ｓｒ
²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、Ｚｎ²⁺またはＭｎ²⁺等の二価のカ
チオン、またはＡｌ³⁺またはＦｅ³⁺等の三価のカチオン
も使用できる。ここで好ましい実施態様において、アル
ギン酸塩混合物は、好ましくはＣａＣｌ₂ 溶液中に導入
してビーズを形成する。

【００１２】本発明の実施に際して有用なアニオン性保
護ポリマーには、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）等の酸性ポ
リマーが含まれる。アルギン酸塩ビーズから治療薬を活
性形態で最適に放出するために、ポリアクリル酸は、好
ましくは約10〜約250 ｋＤａ、より好ましくは約75〜約
150 ｋＤａの分子量を有する。カチオン性治療薬をアル
ギン酸塩とのイオン性相互作用から保護するために、好
ましくは十分な量のポリアクリル酸が予備混合物中に導
入される。しかしながら、ポリアクリル酸の量が多すぎ
るとビーズの形成が妨げられる。したがって、予備ビー
ズ混合物は、アルギン酸塩：ＰＡＡの比が75:2〜75:10
、より好ましくは75:5〜75:10 の範囲である。

【００１３】アルギン酸塩ビーズから治療薬の放出を増
大させるために、ビーズを使用に先立って酸処理する。
ビーズは、ビーズをｐＨ１〜４で、より好ましくは１〜
２で、ビーズからの治療薬の放出を増大させるに十分な
時間、インキュベート（incubate）とにより酸処理され
る。一般に、少なくとも0.25時間の酸処理時間は、所望
の効果を得るに十分であるが、それらの溶解プロフィー
ルまたは治療薬の放出速度に重大な影響を与えない限
り、所望によりビーズを24時間またはそれ以上、酸処理
してもよい。ビーズは、たとえば、ＨＣl 溶液中、37
℃、ｐＨ１で30分間、ビーズの十分な酸処理効果を得る
ために、インキュベートされる。

【００１４】本発明の製法および組成物は、カチオン性
タンパク質治療薬をヒトまたはヒト以外の哺乳動物対象
物に投与するのに特に適している。実施例に詳細に記載
したように、製法および組成物は、活性のＴＧＦ−
β₁ 、オンコスタチン−Ｍおよびアンフィレグリンの放
出に特に効果的であるが、本発明の実施に際しては、他
のカチオン性治療薬も同等に使用できる。

【００１５】操作の特別の理論を求めようとは思わない
が、予備ビーズアルギン酸塩混合物にポリアクリル酸
（ＰＡＡ）を導入することは、続いて形成されるビーズ
中のアルギン酸塩とのイオン性相互作用からカチオン性
治療薬を十分に保護する結果を与える。さらに、形成し
たビーズの酸処理は、アルギン酸塩マトリックス中の架
橋を減少させ、治療薬をビーズから活性形態で放出する
のを高度に容易にする。これは図１に絵で示したよう
に、アルギン酸塩ビーズは、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢ
Ｓ）（phosphate-buffered saline solution）中でイン
キュベートすることにより、治療薬ＴＧＦ−β₁ を放出
する。図１ＡはＴＧＦ−β₁ を含有する硬化したアルギ
ン酸塩ビーズを図示するが、重合性保護剤を含有してい
ない。図１ＢはＴＧＦ−β₁ を含有する酸処理した硬化
アルギン酸塩ビーズを図示する。図１Ａおよび図１Ｂに
示したように、放出されたＴＧＦ−β₁ の限定された免
疫活性は、治療薬とアルギン酸塩との進行する相互作用
により得られる。酸処理（図１Ｂに示したように）は、
アルギン酸塩の分子量を減少させるが、アルギン酸塩の
ＴＧＦ−β₁ との強力な相互作用を残す。ＰＡＡおよび
ＴＧＦ−β₁ を含有する硬化アルギン酸塩ビーズを図１
Ｃに図示し、ＰＡＡおよびＴＧＦ−β₁ を含有する酸処
理した硬化アルギン酸塩ビーズを図１Ｄに図示する。Ｐ
ＡＡのＴＧＦ−β₁からアルギン酸塩を保護する能力
（図１Ｃに示したように）は、たとえビーズが酸処理を
行っていないものであっても、放出されたＴＧＦ−β₁
の免疫活性を著しく増大する結果をもたらす。しかしな
がら、放出されるＴＧＦ−β₁ の免疫活性の最も高い程
度は、ＰＡＡを添加剤としてカプセル封入することに加
えて（図１Ｄに図示したように）酸処理工程を利用する
ことにより得られる。これはＰＡＡが酸処理したアルギ
ン酸塩フラグメントから保護することによる。

【００１６】本発明のアルギン酸塩ビーズ組成物は、カ
チオン性治療薬の経口投与用放出制御カプセルの製造に
特に適している。本発明の組成物の使用において、胃の
低いｐＨ環境中においては治療薬は放出されない。むし
ろ、治療剤の放出は、腸のより中性のｐＨ環境中におい
て、比較的直線的な状態で生ずる。治療薬のアルギン酸
塩とのイオン性相互作用を保護することに加えて、本発
明のポリアクリル酸はＴＧＦ−β₁ のエンテロサイト
（enterocytes ）に対する抑制された投与を与える生物
的接着剤として付加的に機能する。本発明のこれらのお
よび他の側面は、以下に記載した実施例により、よく理
解されるであろう。

【００１７】

【実施例】

材料 記載していない限り、以下の材料は、以下に記載した実
施例に使用した。ＴＧＦ−β₁ （５ｍＭのＨＣl 中、１
mg/mＬ）はＢristol−Ｍyers Ｓquibb （Seattle 、Ｗ
Ａ）から得た。

【００１８】低粘度のアルギン酸ナトリウムはMacrocys
tis pyrifera kelp （Sigma からのLVM 、St. Louis 、
ＭＯ; ＦＧ＝43％；Ｍw=80ｋＤａ）から、塩化カルシウ
ム、塩化ナトリウム、ナトリウムカルボシキメチルセル
ロース（高粘度）およびポリアクリル酸（ＰＡＡ）重合
体（Ｍw ＝２、５、90、250 、450 および750 ｋＤａ）
はAldrich （Milwaukee 、WI）から購入した。塩化カリ
ウム、２−メルカプトメタノール98% およびクロラミン
−Ｔ水和物98％はまたAldrich から得た。低粘度、高グ
ルロン酸濃度（Ｆ_G ＝68％、Ｍw ＝170 −270 ｋＤ
ａ）、中粘度、高グルロン酸濃度（Ｆ_G ＝68％、Ｍw ＝
170 −270 ｋＤａ）、および低粘度、高マヌロン酸
（Ｍ）濃度（ＦＭ＝65％、Ｍw ＝270 −350 ｋＤａ）の
ものを含む他のアルギン酸ナトリウムはProtan（Woodin
ville 、ＷＡ）から供給される。Ｌ−グルタミン酸、Ｌ
−アスパラギン酸およびポリ−Ｌ−アルパラギン酸ナト
リウム（PLLA）（Ｍw ＝13ｋＤａ）、およびポリ−Ｌ−
リジン（ＰＬＬ）（Ｍw ＝123 ｋＤａ; Ｍw/Ｍn ＝1.3
2）はSigma （St. Louis 、ＭＯ）から購入した。リン
酸緩衝塩（PBS;ｐＨ7.4 ）、クエン酸リン酸緩衝液（CP
B ）およびＨＣl 溶液（ｐＨ 1.0、2.0 、3.0 および4.
0 ）は必要に応じて新たに調製した。使用した水の全て
は蒸留水またはイオン交換水である。

【００１９】実施例１ 処理していないＴＧＦ−β ₁ のカプセル封入および酸処
理アルギン酸塩ビーズ ＴＧＦ−β₁ のヨウ素標識化：ＴＧＦ−β₁ のヨウ素標
識化は、変性クロラミン−Ｔ法（A. Tuong et al., "Si
te Specific Radioiodination of RecombinantHirudi
n," Annal. Biochem. 189:186-191(1990)）を使用して
3.0mＬのエッペンドルフ管中で完結した。５mM HCl中の
ＴＧＦ−β₁ （１mg／1mＬ）に対し、10μＬの安定同位
元素を含まないＮａ¹²⁵ Ｉ（1.0mＣi ）を加え、５分間
攪拌した。100 μＬの0.1 ％クロラミン−Ｔを次いで加
え、そして60秒間攪拌した後、反応を100 μＬの水性0.
1 ％メルカプトメタノール、次いで100 μＬの0.1 ％KC
l を加えて停止した。 ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ を1.2mＬの
クエン酸リン酸緩衝液（ＣＰＢ）、ｐＨ 2.6を加えて希
釈した。

【００２０】遊離の ¹²⁵Ｉを ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ から
ＣＰＢで予備平衡化したPharmacia（Uppsala 、Swede
n）から市販の予備充填Sephadex G−25カラムでゲルロ
過により分離した。それぞれ0.5mＬの20留分を集め、ア
リコットをγ−シンチレーション計数管（Model 1185 G
amma Trac; Tm Analytic; Elk Grove Villege 、IL）を
用いてその活性を計数した。分離した ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−
β₁ （S.A.=0.72 nCi/ngまたは187ng/μＬ）を４℃で1.
5mＬのエッペンドルフ管内に貯蔵した。

【００２１】アルギン酸ナトリウム−ＴＧＦ−β₁ 予備
ビーズ混合物の形成：50μＬのＴＧＦ−β₁ または ¹²⁵
Ｉ−ＴＧＦ−β₁ （50μg ）を1.5mＬのエッペンドルフ
管内に移し、水（０−1100μＬ）を加えてＴＧＦ−β₁
を希釈した。次いで、250 または500 μＬ（3.75または
7.5mg ）の1.5 ％w/v のアルギン酸ナトリウム溶液を加
えて透明な予備ビーズ複合体混合物を製造した。添加剤
を含有する予備ビーズ混合物を、先ず添加剤（100 −10
00μＬの0.1 ％w/v 溶液）をＴＧＦ−β₁ に加え、次い
で水およびアルギン酸塩を加えることにより製造した。
全ての混合物に添加した水の容量は、最終予備ビーズの
容量が常に1.5mＬとなるように調整した。以下に記載す
る放出度の研究のために、ＴＧＦ−β₁ を混合前に ¹²⁵
Ｉ−ＴＧＦ−β₁ （400,000cpm）と結合させた。

【００２２】ビーズの形成：1.5mＬの予備ビーズ混合物
を30Ｇの針穴を有する注射器に入れた。混合物を、30 m
Ｌのポリプロピレンビーカー中の10 mＬの塩化カルシウ
ム溶液の上方約２−４cmに置いた針穴からゆっくりと押
し出した。塩化カルシウム溶液（1.0 ％w/v ）を電磁攪
拌機を用いて急速攪拌した。塩化カルシウム中でのアル
ギン酸塩ビーズの硬化時間は10分間であった。硬化工程
の完了時において、塩化カルシウムを除き、ビーズを10
mＬの水で３回洗浄し、付着したカルシウムを除去し
た。 ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ がビーズ中に導入されている
場合には、塩化カルシウムは保持されており、活性をビ
ーズ中のＴＧＦ−β₁ のカプセル封入％を定量するため
に1.5mＬのエッペンドルフ管で計数した。

【００２３】アルギン酸塩ビーズ中のＴＧＦ−β₁ の封
入効率を定量するために、 ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ を含有
するビーズのcpm を定量し、塩化カルシウムおよびビー
ズを形成し除去した後の容器中に残存する ¹²⁵Ｉ−ＴＧ
Ｆ−β₁ のcpm と比較した。カプセル封入％を、［（ビ
ーズ中の放射活性／ビーズおよび塩化カルシウム溶液中
の総放射活性）］ｘ100 で求めた。ＴＧＦ−β₁ のカプ
セル封入効率は、予備混合がポリプロピレン管内でなさ
れている場合、殆どの製剤について97.5％（48.75 μg
ＴＧＦ−β₁ ）よりも大きかった。ガラス製小瓶を使用
すると、恐らくはＴＧＦ−β₁ がガラスに結合すること
により、98％を超えるＴＧＦ−β₁ が損失した。アルギ
ン酸塩および塩化カルシウムの濃度を低くして製造に使
用した場合、非球状のビーズまたはゲル化さえしたアル
ギン酸塩の生成により、カプセル封入の効率が非常に減
少する結果となった。

【００２４】アルギン酸塩中へのＴＧＦ−β₁ （pI 9.8
2 ）の高いカプセル封入効率は、陽性に荷電した成長因
子と陰性に荷電した多糖類との強力な相互作用に多く依
存する。しかしながら、同様に荷電したbFGF（pI 9.6）
は、同様のカプセル封入技術を用いたカプセル封入効率
が、７−19％（E.C. Downs et al., "Calcium Alginate
Beads as a Slow-Release System for Delivering Ang
iogenic Molecules InVitro," J. Cell. Phys. 152 :42
2-429 （1992））または10％未満（E.R. Edelman et a
l., "Controlled and Modulated Release of Basic Fib
roblast Growth Factor," Biomaterials 12 :619-625
（1991））しか取り込むことができなかったと先の著者
は報告している。中性pHにおいて、ＴＧＦ−β₁ とbFGF
が同等の荷電を有しているが、当業界において報告され
ているｂＦＧＦよりもＴＧＦ−β₁ の方がアルギン酸塩
ビーズ中により多くの量でカプセル封入された。これら
の結果は、タンパク質の電荷がカプセル封入される能力
に影響を与える単一の因子ではないことを示唆してい
る。

【００２５】実施例２ カプセル封入ＴＧＦ−β ₁ の放出 実施例１の工程により製造した、3.75−7.5mg （アルギ
ン酸塩の初期重量）中に50μg の ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁
を含有するビーズを37℃で、13.0 mＬのＰＢＳまたは0.
1 N HCl を含有する15.0 mＬのポリプロピレン管に移し
た。ある場合には、放出媒体に１％ＢＳＡを加えた。ポ
リプロピレン管を軌道攪拌機（200 回転／分）を用いて
緩やかに攪拌した。設定した時間で100 μＬの分割量
（アリコート）を取り出し、放射活性を計測した。アリ
コートにはビーズまたはビーズ断片を含有しないように
注意しなければならない。ビーズから放出された ¹²⁵Ｉ
−ＴＧＦ−β₁ の累積量を、容量の変化を較正した後、
計算した。24時間後、0.1 NHCl 中のビーズをPBS に移
した。

【００２６】ＰＢＳまたは0.1 N HCl 中のアルギン酸塩
ビーズからの ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁放出プロフィールを
第２図に示す。４時間の遅延期間の後、 ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ
−β₁ は連続的にPBS 中に放出され（図２の■）、20時
間後に81％で平坦になった。24時間後、幾つかの溶解し
ていないそして不規則形状のアルギン酸塩ビーズ（9.5
μg の ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ を含有する）が残存してい
た。72時間後においてさえ、 ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ がも
はや全く放出されない（図示せず）ということは、残っ
ている ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ が残存するアルギン酸塩と
しっかりと結合していることを示唆している。

【００２７】比較として、0.1 N HCl 中のアルギン酸塩
ビーズ（図２の●）は24時間以内に実質的に全く ¹²⁵Ｉ
−ＴＧＦ−β₁ を放出しなかった。しかしながら、0.1
N HCl 中のアルギン酸塩ビーズをＰＢＳ中に移すと、ビ
ーズは非常に急速に膨潤し、且つ、溶解し、2.5 時間以
内に100 ％の ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ が放出された。

【００２８】ビーズの酸処理：実施例１の工程により製
造した、ＴＧＦ−β₁ を含有するアルギン酸塩ビーズ
を、13.0 mＬの0.1 N HCl 中、37℃で、0.25−24時間置
いて、低分子量でより溶解性が高い画分を得た（A. Hau
g et al.、"Studies on the Sequence of Uronic Aoid
Residues in Alginic Acid," Acta Chem. Scand. 21 :6
91-704（1967）; A. Haug and B. Larsen, "Quantitati
ve Determination of the Uronic Acid Composition of
Alginates," Acta Chem. Scand. 16 :1908-1918（196
2）; A. Haug et al., "The Degradation of Alginates
at Different pHValues," Acta. Chem. Scang. 17 :14
66-1468 （1963）; A. Haug and B. Larsen, "The Solu
bility of Alginate at Low pH," Acta. Chem. Scand.
17:1653-1662（1963））。酸処理の後に、ビーズを除去
し、リン酸緩衝塩（ＰＢＳ）で数回洗浄した。ＰＢＳ洗
浄は、洗浄液のpHが7.4 になるまでｐＨメーターで監視
した。

【００２９】モノクローナル抗体に認識（結合）される
未処理のおよび酸処理のビーズ（上記した）からの放出
されたＴＧＦ−β₁ の能力を、以下のようにＥＬＩＳＡ
（酵素結合イムノソルベント検定法）（Enzyme linked
immunosorbent assay ）により分析した。ＥＬＩＳＡ
は、未処理（ＰＢＳ）および酸処理（HCl ）アルギン酸
塩ビーズから放出される免疫活性ＴＧＦ−β₁ の量を定
量するために使用される。ＥＬＩＳＡは、マウス抗−Ｔ
ＧＦ−β₁ モノクローナル抗体である、1D11（Bristol
−Myers Squibb、Seattle 、ＷＡ）、がＴＧＦ−β₁ 分
子に結合する能力に基づいている。1D11抗体を96−ウェ
ルの免疫分析プレートに被覆した場合、それは適用した
試料および標準溶液からＴＧＦ−β₁ を捕捉した。捕捉
したＴＧＦ−β₁ は、次いで、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ／アビジンＤ複合体（Vector Labs cat #A−2004）
により結合されたビオチン化1D11抗体と結合した。着色
反応が、過酸化水素を含有するCPB 中に３、３′、５、
５′−テトラメチルベンジジンの発色団／基質溶液を加
えることにより生ぜしめた。反応は、１Ｎ硫酸を添加す
ることにより停止し、Ａ450 をプレートリーダーにより
定量した。未知試料の濃度は、同一のプレートで測定し
たＴＧＦ−β₁ 標準曲線に対して定量した。結果を以下
の表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】ＥＬＩＳＡで測定した酸処理していない
（ＰＢＳ）アルギン酸塩ビーズから放出されたＴＧＦ−
β₁ の結合活性は０％であったが、ビーズを0.1 N HCl
中で酸処理したビーズの場合、14％の結合活性を有して
いた。ＥＬＩＳＡ分析はＴＧＦ−β₁ の生物活性を示す
ものではないが、タンパク質の配座または構造の変化に
関する情報を与える。ＥＬＩＳＡ結合活性の低下は、そ
れにモノクローナル抗体が結合している分子の部位が幾
つかのタイプの変化をしていることを示している。この
変化はタンパク質の変性、凝集または他の分子による結
合部位の遮蔽により引き起こされる。ＥＬＩＳＡのデー
タは、酸処理したアルギン酸塩が、未処理のアルギン酸
塩よりもより小さい程度で放出されたＴＧＦ−β₁ と相
互作用していることを示している。減少したＴＧＦ−β
₁ −アルギン酸塩の相互作用は、究極的には、免疫活性
をより大きく保持する結果を与えた。

【００３２】実施例３ ビーズの膨潤 先の著者により、低ｐＨでのアルギン酸塩ビーズは、そ
れらの含有物を大きな程度までは膨潤または放出しない
ことが報告されている（N. Segi et al.、"Interaction
of Calcium-Induced Alginate Gel Beads with Propra
nolol," Chem.Pharm. Bull. 37 :3092-3095（1989）;
R. Bodmeier and O. Paeratakul, "Spherical Agglomer
ates of Water-Insoluble Drugs," J. Pharm. Sci. 78
:964-967（1989））。しかしながら、中性ｐＨに移さ
れた後の酸処理したアルギン酸塩ビーズの急速な膨潤お
よび放出性能は、未だ報告されていない。PBS 中にアル
ギン酸塩ビーズのみ（ＴＧＦ−β₁ を導入していない）
（"Alg" と標記する）、ＰＢＳ中でＴＧＦ−β₁ を導入
したアルギン酸塩ビーズ（"TGF" と標記する）、および
0.1N HCl中でＴＧＦ−β₁ を導入したアルギン酸塩ビー
ズ（"HCl" と標記する）の膨潤性の研究を、アルギン酸
塩ビーズのこの独特の性質についての識見を得るために
行った。ＴＧＦ−β₁ なしに、PBS 中で実施例１により
製造したアルギン酸塩ビーズ（図３中の■）、50μg の
ＴＧＦ−β₁ でＰＢＳ中で製造したもの（図中３の●）
または50μg のＴＧＦ−β₁ で0.1N HCl中で製造したも
のを165 分間ＰＢＳ中に移したもの（図中３の▲）を選
択した時間の間隔で除去し、10個のビーズの平均直径を
キャリパーを用いて定量した。

【００３３】図３に示したように、ブランクのものもＴ
ＧＦ−β₁ を含有するビーズも共に、120 分間でそれら
のもとの大きさの1.4 倍の大きさにＰＢＳ中で連続的に
膨潤した。120 分後、ビーズは、正確な直径の測定がで
きなくなる程、水が充填され柔らかくなった。逆に、Ｔ
ＧＦ−β₁ を含有するビーズは、0.1N HCl中において、
40分間でそれらのもとの大きさの88％まで収縮した。PB
S に移した場合（120分間で）、0.1N HClにさらしたビ
ーズは、急速に膨潤し（しかし、それらのもとの大きさ
の1.1 倍のみである）溶解した。

【００３４】実施例１〜３の結果は、酸処理したビーズ
が、プロトンを触媒とする加水分解またはビーズからの
活性薬剤の放出に積極的な効果を有する幾つかの他の変
換が行われていることを示している。操作の如何なる特
別の理論にも結びつかないが、アルギン酸塩ビーズが0.
1N HCl中において収縮することは、−ＣＯＯＨ基がイオ
ン化されずに残り、それにより静電的反発が減少する結
果となっている事実に基づくと考えられる。しかしなが
ら、ｐＨ１においてさえ、アルギン酸塩は極めて不溶性
のまま存在し、ビーズはそれらの球状を維持する。低ｐ
Ｈでのアルギン酸塩処理の結果は、中性ｐＨに移した場
合に、少量のより溶解性が高いアルギン酸塩断片の存在
により、アルギン酸塩ビーズの膨潤性および溶解性を増
加する。0.1N HCl中、37℃で0.25−24時間の加水分解時
間は、ＥＬＩＳＡにおいて測定したＴＧＦ−β₁ の結合
活性（データは示さず）に、重大な相違がないことが観
察された。さらに、0.1N HCl中、37℃で0.25−24時間処
理したアルギン酸塩ビーズは、ｐＨ 7.4（データ図示せ
ず）のＰＢＳに移した場合の、それらの溶解プロフィー
ルおよびＴＧＦ−β₁ の放出速度に殆ど相違がないこと
を示していた。したがって、酸処理時間は0.25時間で十
分であるように思われ、より長い処理時間は、放出動力
学およびＴＧＦ−β₁ の免疫活性の維持に何らの利益が
ないように思われる。

【００３５】酸処理ビーズからのＴＧＦ−β₁ の放出速
度の増大に寄与するかもしれない他の機構は、酸処理時
（ｐＨ 1.0）のｐＨ、カルボン酸基の殆どがイオン化さ
れずに残り、もはやＣａ²⁺と相互作用しないことであ
る。かくして、幾つかの遊離Ｃａ²⁺は、ビーズの外に拡
散し、ｐＨ 7.4でより早く分解する弱く架橋したビーズ
となる。最もありそうなことは、酸処理ビーズからのＴ
ＧＦ−β₁ の増大した放出速度は、提案されたメカニズ
ム、即ち、酸加水分解および減少したカルシウムの架橋
の組合せによるということである。それに組み合わせ
て、このメカニズムは、より小さいアルギン酸塩断片お
よびより弱いカルシウムの架橋とにより形成される早く
放出するビーズという結果となることである。

【００３６】実施例４ アルギン酸塩の分子量の変動 ＥＬＩＳＡで測定されたＴＧＦ−β₁ の結合の増大につ
いての試みにおいて、アルギン酸塩の異なる分子量の効
果を研究した。この試みは、二つの理由により困難であ
った。一つは、分子量がよくわかっているアルギン酸塩
は市販されていないことである。一般に、種々のＧ／Ｍ
比を有するアルギン酸塩は、低、中または高粘度材料の
何れかとして有用である。二つ目は、アルギン酸塩の正
確な分子量の測定が、多糖類の自己会合および化学的並
びに物理的不均質性により困難であることである（G. B
erth, "Methodical Aspects of Characterization of A
lginate and Pectate by Light Scattering and Viscom
etry Coupled with GPC,"Carb. Poly. 19:1-9（199
2））。

【００３７】しかしながら、アルギン酸塩の酸処理工程
は、低分子量のアルギン酸塩の形成に導く部分加水分解
工程であると考えられる。この結論は、文献の結果と一
致する（A. Haug et al., "Studies on the Wequence o
f Uronic Acid Residues inAlginic Acid," Acta Chem.
Scand. 21 :691-704（1967）; A. Haug and B. Larse
n, "Quantitative Deternation of the Uronic Acid Co
mposition of Alginates," Acta Chem. Scand. 16 :190
8-1918 （1962）; A. Haug et al., "The Degradation
of Alginates at Different pH Values," Acta. Chem.
Scand. 17:1466-1468（1963）; A. Haug and B. Larse
n, "The Solubility of Alginate at Low pH," Acta. C
hem. Scand. 17:1653-1662（1963））。実際、酸処理に
よる低分子量のアルギン酸塩は、行ったゲルクロマトグ
ラフィーによる研究において観察されたが、記載したよ
うに定量は困難さを包含している。他のアルギン酸塩は
また、より活性のＴＧＦ−β₁ のそれらの投与能力を研
究するために行った（データは示さず）。すべての場合
において、低粘度、高Ｍ比（LVM ）Sigma 製品は、最も
免疫反応性であるＴＧＦ−β₁ を放出したビーズ（特に
酸処理ビーズ）を形成させた。

【００３８】実施例５ 添加剤存在下におけるＴＧＦ−β ₁ の免疫反応性 アニオン性アミノ酸、ポリアニオンおよびポリカチオン
の存在下における溶液中でのＴＧＦ−β₁ の免疫反応性
を、実施例２に記載したＥＬＩＳＡ法を使用して調べ
た。

【００３９】５mM HCl中のＴＧＦ−β₁ １mg/mＬ溶液に
０〜0.14％（w/v ）のグルタミン酸、アスパラギン酸、
ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＬＡＡ、Ｍw ＝13ｋＤ
ａ）、ナトリウムカルボキシメチルセルローズ（ＮａＣ
ＭＣ、高粘度）、またはポリアクリル酸（ＰＡＡ、２、
90または750 ｋＤａ）を添加した。ＴＧＦ−β₁ の反応
性を、次いで、実施例２に記載したＥＬＩＳＡ法により
定量した。検討した添加剤の濃度（0.14％w/v まで）
は、予備ビーズに加えることができ、ビーズ形態での品
質を維持しうる添加剤の量と同等である。図４に示した
ように、溶液中において添加剤の濃度が上昇するに従
い、免疫反応性のＴＧＦ−β₁ のパーセントが減少し
た。また、データは、ＰＬＡＡ、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸およびＰＡＡ（２ｋＤａ）等の低分子量の添加
剤は、ＥＬＩＳＡで測定したＴＧＦ−β₁ の結合活性を
少ない程度にしか妨害しなかった。この傾向は、酸処理
していないビーズと比較して、酸処理したビーズ（低分
子量のアルギン酸塩から成る）から放出された場合にＴ
ＧＦ−β₁ がより大きい免疫反応性を有することを示し
た、図２からのデータと非常によく一致する。

【００４０】また、ＥＬＩＳＡで測定したより大きい結
合活性は、アニオン性種とＴＧＦ−β₁ の間の相互作用
が減少することに反映される。

【００４１】酸処理していないアルギン酸塩とＴＧＦ−
β₁ の間の強力な立体特異性についての証拠は、低濃度
のアルギン酸塩（80ｋＤａ）とＰＡＡ（90ｋＤａ）の比
較が、ＴＧＦ−β₁ のＥＬＩＳＡで測定した結合活性が
最も高いものであったことにより示される。ＴＧＦ−β
₁ の100 ％の活性を維持するために、ＰＡＡについて0.
02％であるのに比べ、アルギン酸塩の濃度を0.00015 ％
より低くしなければならない。アルギン酸塩とＰＡＡの
電荷および分子量は共に同等であるけれども、ＴＧＦ−
β₁ 活性を阻害するために必要とされるアルギン酸塩の
濃度は130 倍以上も低い。それらのデータは、アルギン
酸塩（80ｋＤａ）とＴＧＦ−β₁ （25ｋＤａ）の相互作
用が静電的および立体特異的相互作用の両者により影響
されるという仮説を支持している。したがって、アルギ
ン酸塩ビーズの酸処理は、ＴＧＦ−β₁ と殆ど相互作用
しない低分子量のアルギン酸塩の生成により、放出され
たＴＧＦ−β₁ の免疫反応性が増大した。

【００４２】次に、溶液中でＴＧＦ−β₁ からアルギン
酸塩を遮蔽する添加剤の能力について検討した。アルギ
ン酸塩溶液を実施例１の工程に従い調製し、50μg のＴ
ＧＦ−β₁ 、０−0.15％（w/v ）のアルギン酸ナトリウ
ムおよび0.1 −1.0mg （0.125 ％w/v まで）のＰＡＡ
（750 ｋＤａ）、ＰＬＡＡ（13ｋＤａ）、高粘度ＮａＣ
ＭＣまたはグルタミン酸を導入した。ＴＧＦ−β₁ の免
疫反応性は、実施例２に記載したＥＬＩＳＡ法により定
量した。使用した添加剤の濃度は、図４のデータに基づ
いて選択した（即ち、高濃度の添加剤はＴＧＦ−β₁ の
免疫反応性を阻害しない）。結果を表２に示す。

【００４３】

【表２】

【００４４】添加量を変えることにより、全ての添加剤
はアルギン酸塩からＴＧＦ−β₁ を遮蔽し、ＰＡＡが最
も効果的であった。たとえば、0.015 ％のアルギン酸塩
濃度において添加剤がない場合、ＴＧＦ−β₁ は免疫反
応性を有していなかった。しかしながら、0.0625％のＰ
ＡＡの添加により、ＴＧＦ−β₁ は60％近くの免疫反応
性を残していた。

【００４５】示されたデータから、ＴＧＦ−β₁ は溶液
中において、ＰＡＡまたは他の添加剤を加えることによ
り、アルギン酸塩から遮蔽できることが確認された。

【００４６】実施例６ ＴＧＦ−β ₁ および添加剤を含有するアルギン酸塩ビー
ズ 実施例１の工程に従い、50μg のＴＧＦ−β₁ および0.
1 −1.0mg の添加剤を導入してアルギン酸塩ビーズを調
製した。図４に示した結果に基づいて、ＰＡＡ（750 ｋ
Ｄａ）およびＰＬＡＡ（13ｋＤａ）を有効なポリアニオ
ン性保護剤として導入した。さらに、ポリ−Ｌ−リシン
（ＰＬＬ;123ｋＤａ）を有効なポリアニオン性競合剤と
して加えた。添加剤は、アルギン酸塩：添加剤のw/w 比
で75:10〜75:1の割合で、下記表３に記載したように加
えた。

【００４７】添加剤を添加したビーズからの放出された
ＴＧＦ−β₁ のＥＬＩＳＡで測定した結合活性は、以下
のようにして定量し、その結果を表３に示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】ポリアニオン性またはポリカチオン性添加
剤の何れかを伴う、すべてのアルギン酸塩ビーズは、よ
り免疫反応性あるＴＧＦ−β₁ を放出した。結果はＰＡ
ＡおよびＰＬＡＡが、アルギン酸塩に対する添加剤の比
が75:10 （w/w ）でビーズ中に加えた場合、同等の挙動
をすることを示している。しかしながら、もし、加えた
ＰＡＡを100 μg （または75:1w/w 比）まで減少させる
と、放出されるＴＧＦ−β₁ の免疫反応性は20％近くに
なる。実際、75:1（w/w ）ＰＡＡビーズから放出される
ＴＧＦ−β₁ の免疫反応性は、72時間のＥＬＩＳＡ分析
時において導入されたＴＧＦ−β₁ の僅か60％が放出さ
れたので、>33 ％であった。75:10 （w/w ）よりも75:1
（w/w ）のビーズから放出された場合に、ＴＧＦ−β₁
がより免疫反応性を有していたという事実は、図４に示
したように、ＴＧＦ−β₁ の免疫反応性が、全ての添加
剤の濃度が上昇するにつれ減少したという事実により、
驚くべきことではない。さらに、75:10 （w/w ）のビー
ズは、恐らくは、アルギン酸カルシウムの架橋メカニズ
ムとのＰＡＡの干渉により、形状が幾分不規則であっ
た。添加されたポリカチオンであるＰＬＬは、放出され
るＴＧＦ−β₁ の免疫反応性を少ない程度だが増加させ
たが、しかしながら、それらのビーズは、アルギン酸塩
とＰＬＬとの間の強い複合化の結果として、非常に不規
則であった。

【００５０】実施例７ 上記の結果に基づいて、二つの理由により、ＰＡＡの使
用についての更なる研究を行った。第一は、ＰＡＡが、
恐らくは放出されたＴＧＦ−β₁ からアルギン酸塩を遮
蔽することにより、ＥＬＩＳＡにより測定されたＴＧＦ
−β₁ の免疫反応性を増大できるという結果を示したこ
とである。第二は、ＰＡＡが強力なムコ接着剤として知
られているので、ビーズ中にＰＡＡを導入することが望
ましいであろうことである（C.M. Lehr et al., "Effec
ts of the Mucoadhesive PolymerPolycarbophil on the
Intestinal Absorption of a Peptide Drug in the Ra
t," J. Pharm. Phannacol. 44:402-407（1992）; D. Du
chene and G. Ponchel, "Principle and Investigation
of the Bioadhesion Mechanism of Solid DosageForm
s," Biomaterials 13:709-714（1992）; J.D. Smart, "
An In Vitro Assessment of Some Mucosa-Adhesive Dos
age Forms," Int. J. Pharm. 73:69-74（1991））。そ
れ故、エンテロサイト（enterocytes ）に対し効果的に
的を絞ったＴＧＦ−β₁ の投与は、生物接着結合を形成
することによって、腸の上皮への投与システムを局在化
させることにより容易にされるであろう。

【００５１】放出されるＴＧＦ−β₁ の免疫反応性を増
大させる高分子量のＰＡＡ（750 ｋＤａ）の能力は興味
深い。アルギン酸カルシウムビーズからまたはアルギン
酸塩のみの存在下で放出されるＴＧＦ−β₁ は殆ど免疫
反応性を有していない。同様に、ＰＡＡ（750 ｋＤａ）
存在下におけるＴＧＦ−β₁ は制限された反応性を有す
る。しかしながら、ＰＡＡをアルギン酸塩ビーズに導入
した場合には、ＴＧＦ−β₁ はそのＥＬＩＳＡ結合活性
を33％以上保持した。得られた結果は、成分の分子量と
それらのビーズ中での濃度の間には微妙なバランスが存
在することが示唆された。この理由のために、アルギン
酸塩ビーズ中に、アルギン酸塩：ＰＡＡの比が75:1〜7
5:10 で、分子量が２、90、250 および450 ｋＤａのＰ
ＡＡを加えた。ビーズの一部は上記したようにして酸処
理を行い、放出されたＴＧＦ−β₁の結合活性はＥＬＩ
ＳＡで測定した。結果を表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】アルギン酸塩とＰＡＡの比が75:6（w/w ）
および75:10 （w/w ）のＰＡＡ（90ｋＤａ）を含有する
酸処理ビーズは、80％の免疫反応性を有するＴＧＦ−β
₁ を与えることが可能であった。さらに、ＰＡＡの濃度
が酸処理ビーズ中において、100 μg （75:1 w/wビー
ズ）から600 μg （75:6 w/wビーズ）に増加するに従
い、放出されたＴＧＦ−β₁ の免疫反応性は劇的に増大
した。これは、表３に示した結果と反対のものであっ
た。また、結果はＰＡＡとアルギン酸塩の両者の分子量
および濃度の間の微妙なバランスを示唆している。ＰＡ
Ａと共に硬化したアルギン酸塩ビーズの物理的状態につ
いて注目するのも興味深い。添加したＰＡＡの分子量が
増加するに従い、ビーズはより不規則な形状になった。
これは、特に250 および450 ｋＤａの高濃度のＰＡＡに
おいて真実であった。

【００５４】実施例８ 放出されるＴＧＦ−β₁ の免疫反応性についてのＰＡＡ
の添加量の効果をさらに検討するために、ＴＧＦ−β₁
とＰＡＡ（90 kDa）のw/w 比が75:1、75:6および75:10
のものを５分間または60分間インキュベートし、次い
で、希釈、アルギン酸塩の添加および１％ＣａＣｌ₂ 中
でのビーズ形成により、アルギン酸塩ビーズを調製し
た。ビーズは0.1N HCl中、37℃で30分間、酸処理し、次
いで37℃、ＰＢＳ中、ｐＨ 7.4でインキュベートした。
２時間後、放出されたＴＧＦ−β₁ の免疫反応性を、実
施例２に記載したＥＬＩＳＡにより定量した。結果を図
５に示す。図中、（■）はＴＧＦ−β₁ とＰＡＡのイン
キュベーションを５分間行ったものを表し、（●）は60
分間のインキュベーションを表す。図５に示したよう
に、ＰＡＡとＴＧＦ−β₁ についての５および60分のイ
ンキュベーション時間には殆ど差がなかった。しかしな
がら、添加したＰＡＡの量と放出されたＴＧＦ−β₁ の
究極的な免疫反応性の間には、正比例する関係が存在し
ていた。75:6（w/w）および75:10 （w/w ）ビーズの間
に重大な相違が見られなかったことは、アルギン酸塩の
ＰＡＡに対する比が75:6（w/w ）を超えても利点がない
ことを示唆している。しかしながら、ＰＡＡの濃度を高
くすると、ビーズの生物接着性を増大するのに有用であ
ろう。アルギン酸塩：ＰＡＡ比が75:10 より大きいとこ
ろでは、ビーズを形成することが困難になる。

【００５５】実施例９ 酸処理の効果を確認するために、ＰＡＡをＴＧＦ−β₁
とインキュベートし、次いで、希釈し、アルギン酸塩を
添加し、そして実施例１に記載したようにビーズの形成
を行い、添加剤としてＰＡＡを加えたアルギン酸塩ビー
ズを製造した。ビーズはｐＨ１〜７で、37℃で30分間、
インキュベートすることにより酸処理し、放出されたＴ
ＧＦ−β₁ の免疫反応性を、上記したようにＥＬＩＳＡ
により定量した。図６において、酸処理ビーズから放出
された、ＥＬＩＳＡで測定したＴＧＦ−β₁ の累積結合
活性は、加水分解媒体のｐＨの関数として定量した。予
想されたように、ｐＨ１（▲）およびｐＨ２（○）で処
理されたアルギン酸塩ビーズは、ＥＬＩＳＡでの測定に
より、２〜３時間以内に80％の免疫反応性ＴＧＦ−β₁
を放出した。実際、それらのビーズは、低分子量アルギ
ン酸塩断片の存在により、急速に膨潤し、そして完全に
溶解した。比較として、ｐＨ３（■）、ｐＨ４（◆）お
よびｐＨ７（□）で処理したアルギン酸塩ビーズは、少
ない量で、且つ、少ない免疫反応性でＴＧＦ−β₁ を放
出した。処理溶液のｐＨが増大するに従い、免疫活性Ｔ
ＧＦ−β₁ の放出量が減少した。それ故、高分子量のア
ルギン酸塩のより大きい留分が、高いｐＨにさらされる
ビーズ中に残存していて、その結果、ビーズは腸内に長
く残存し、そして、ＴＧＦ−β₁ とアルギン酸塩の相互
作用が増大される。ビーズが処理されるｐＨは、また、
ＴＧＦ−β₁ 放出速度に影響する。低ｐＨ（１と２の
間）で処理されたビーズは２〜３時間以内にＴＧＦ−β
₁ を放出した。処理溶液のｐＨが増加するに従い、ＴＧ
Ｆ−β₁ の放出時間もまた増加した。

【００５６】実施例１０ ＴＧＦ−β₁ および90ｋＤａのＰＡＡ（アルギン酸塩：
ＰＡＡで75:10 w/w ）を含有するアルギン酸塩ビーズ
を、実施例１の工程に従い調製し、次いで、実施例２に
記載したように、0.1N HCl中、37℃で30分間、酸処理を
行った。ビーズは、次いで、ｐＨ 7.4のPBS 中に移し、
放出されたＴＧＦ−β₁ の免疫反応性を、実施例２に記
載したように、 ¹²⁵Ｉで放射標識化し、ＥＬＩＳＡ法に
より定量した。さらに、ＴＧＦ−β₁ の生物活性を定量
するために、成長抑制分析法（ＧＩＡ）を使用した。Ｇ
ＩＡは、ＴＧＦ−β₁ のミンクの肺上皮細胞（ATCC #CC
L64） （T. Ikeda et al., "Human Transforming Grow
th Factor Type β2: Production By a Prostatic Aden
ocarcinoma Cell Line, Purfication and Intial Chara
cteriation," Biochemistry 26 :2406-2410（1987））
の成長を阻害する能力を測定するものである。

【００５７】成長因子の活性は、細胞のＴＧＦ−β₁ の
異なる濃度に対する阻害応答により定量される。細胞の
生存能力は、オレンジ／レッドホルマザン生成物中への
テトラゾリウム塩の代謝活性細胞の酵素的開裂に基づい
ている。分析に先立ち、細胞はトリプシン処理され、96
−ウェルの平底プレート（Costar）に1000細胞／ウェル
の濃度で加えた。細胞を付着させた後、ＴＧＦ−β₁ を
含有する試料および対照標準試料を、1000〜1.95 pg/ml
の範囲の濃度に希釈し、ウェルに加えた。細胞を４日
間、インキュベートし、その後、それぞれのウェルに、
媒体中に25μg のナトリウム3"−[1−（フェニルアミ
ノ）−カルボニル］３、４−テトラゾリウム−ビス（４
−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸水和物
（Diagnostic Chemicals、Ltd.）および５ mＭのフェナ
ジンメトサルフェート（Aldrich ）を含有する100 μＬ
の溶液を加えた。細胞を、次いで、７時間インキュベー
トし、プレートはマイクロプレートリーダーで630 nmの
参照フィルターに対する450 nmでの吸収を読んだ。試料
の特異的活性を参照材料に対する相対値として計算し
た。

【００５８】結果を図７に示す。 ¹²⁵Ｉ放射標識により
測定することにより、総放出量の90％のＴＧＦ−β₁ が
得られた。ＥＬＩＳＡで測定したように、80％を超える
ＴＧＦ−β₁ が放出され、免疫反応性であった。ＧＩＡ
の結果は、85％を超えるＴＧＦ−β₁ が生物活性である
ことを示した。

【００５９】ＴＧＦ−β₁ を含有するアルギン酸塩ビー
ズを実施例１の工程にしたがって調製した。即ち、Ａ：
ＰＡＡおよび他の添加剤を含有せず、酸処理もしていな
いもの（第１Ａ図の条件と同様）；Ｂ：ＰＡＡを含有せ
ず、0.1N HCl中、37℃で30分間、酸処理したもの（図１
Ｂの条件と同様）；Ｃ：90ｋＤａのＰＡＡ（アルギン酸
塩：ＰＡＡが75:6 w/w）を含有するが、酸処理はしてい
ないもの（図１Ｃの条件と同様）またはＤ：Ｃに記載し
たＰＡＡを含有し、Ｂに記載した酸処理を行ったもの。
免疫反応性ＴＧＦ−β₁ の総パーセントを、それぞれの
試料について、実施例２に記載したＥＬＩＳＡで測定
し、結果を表５に記載した。表５から判るように、ＰＡ
Ａの保護と酸処理の組合せは、最も高い免疫反応性ＴＧ
Ｆ−β₁ を放出する結果を与えた。

【００６０】

【表５】

【００６１】実施例１１ 実施例１の工程に従い、アルギン酸塩のビーズを、25μ
g のオンコスタチン−Ｍ（サイトソース；部位の起源）
および3750μg のアルギン酸ナトリウム（Sigma 、低粘
度）を含有する800 μl の水溶液から調製した。溶液の
一部に、ビーズの形成に先立って300 μg のＰＡＡ（Ja
nnsen 、90ｋＤａ）を加えた。ＰＡＡを添加したおよび
添加していない、ビーズの試料を、実施例２に記載した
ように、ビーズを0.1N HCl中、37℃で30分間、インキュ
ベートすることにより酸処理を行った。ビーズを次いで
ＰＢＳ中に入れ、免疫反応性オンコスタチン−Ｍのパー
セント量を、ＥＬＩＳＡ法により実施例２の工程に従
い、マウス抗−オンコスタチン−Ｍ抗体の11R2（Bristo
l −Myers Squibb、Seattle 、ＷＡ）を捕捉抗（captur
e antibody）として、およびビオチン化1R10マウス抗−
オンコスタチン−Ｍ抗体（Bristol −Myers Squibb、Se
attle 、ＷＡ）をプローブとして、次いで、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ／アビジンＤを使用して定量した。結
果を図８に示す。ここで、（□）はＰＡＡを含有する酸
処理ビーズを表し、（◇）はＰＡＡを含有するが酸処理
していないビーズを表し、（■）はＰＡＡを含有しない
が酸処理したビーズを表し、そして◆はＰＡＡを含有せ
ず、酸処理もしていないビーズを表す。図８に示したよ
うに、ＰＡＡを含有する酸処理ビーズは、85％の免疫反
応性オンコスタチン−Ｍを急速に放出するのに対し、酸
処理をしていないＰＡＡを含有するビーズでは38％の放
出、酸処理をせず、ＰＡＡを含有しないビーズでは20％
の放出、そして酸処理をし、ＰＡＡを含有していないビ
ーズでは18％の放出であった。

【００６２】実施例１２ 実施例１１のオンコスタチン−Ｍの代わりに25μg のア
ンフィレグリンに変え、マウス抗アンフィレグリンモノ
クローナル抗体6R1C1 （Bristol −Myers Squibb、Seat
tle 、ＷＡ）を捕捉抗体として使用し、次いでヤギ抗−
マウス西洋ワサビペルオキシダーゼプローブを使用し
て、実施例１０の工程を繰り返した。結果を図９に示
す。図中の印は図８と同一である。図１０に示したよう
に、ＰＡＡを含有する酸処理ビーズからは、67％の免疫
反応性アンフィレグリンを放出するのに対し、酸処理を
していないＰＡＡを含有するビーズからは52％の放出、
酸処理をし、ＰＡＡを含有しないビーズからは31％、そ
して酸処理をせず、ＰＡＡを含有していないビーズから
は22％の放出であった。

【００６３】実施例１３ 成体雄スプラグ−ダウレイラット（250 ±30g ）を個々
にかごに入れ、American Association for the Accredi
tation of Laboratory Animal Care（AAALAC）のガイド
ラインに従い取り扱った。ＴＧＦ−β₁ の口を経由した
投与のために、ラットを塩酸ケタミン（40mg/kg ）（Ve
talar ^R 、Aveco Inc.、Fort Dodge、Iowa）を筋肉内注
射することにより麻酔し、製剤が胃および腸に到達する
のを失敗しないように、口を経由してカテーテルを挿入
した。腹腔内注射を、腹の右下部1/4 の場所に行った。
ＴＧＦ−β₁ を投与するための投与量、処理時間および
経路に関する予備研究（データは示さず）に基づいて、
実験動物を４グループ（１グループ当たり５〜６匹）に
分け、以下のように処理した。１）実施例７により調製
したアルギン酸塩ビーズ中のＴＧＦ−β₁ を経口投与
（P.O.）（25μg を１日１回、５日間）；２）ＰＢＳ中
のＴＧＦ−β₁ をＰ．Ｏ．（25μg を１日１回、５日
間）；３）ＰＢＳ中のＴＧＦ−β₁ を腹腔内投与（I.
P.）（12.5μg を１日２回、10日間）；４）１mlのＰＢ
ＳをＰ．Ｏ．またはＩ．Ｐ．で対照動物に投与。５また
は10日の処理後、ラットを麻酔薬の過剰量で殺した。腸
を除去し、内腔を冷PBS で洗浄した。切片（それぞれ総
長さの約10％）を十二指腸、空腸、回腸および結腸から
切り取った。腸を長手方向に開き、形態が影響を受けな
いよう維持するために、硬質紙に針で取り付け、Met Ca
rnoys 定着剤（60％メタノール、30％クロロホルム、10
％酢酸）で一昼夜固定し、そして70％エタノール中で変
性した。組織をパラフィン中に埋め込み、ミクロトーム
で５μm の細片に切断した。試料を次いで組織形態学的
分析のためにヘマトキシリンエオシンで染色し、または
免疫組織化学的研究のために調製した。絨毛の高さ（50
−70％）の著しい減少が、アルギン酸塩ビーズ中のＴＧ
Ｆ−β₁ を口を経由して摂取した動物の十二指腸および
空腸において観察された。

【００６４】細胞増殖は、増殖する細胞核抗原（ＰＣＮ
Ａ）、増殖する細胞の内因性マーカーを検出するための
免疫組織化学的技術を用いて定量した。ＰＣＮＡの陽性
染色は、細胞分布および細胞サイクルの異なる相と関連
する茶色から黒色の反応生成物の強度に基づいて判断し
た。増殖指数（PI）は、計数した小嚢腺の長さ（mm）当
たりの細胞サイクルのＧ１、Ｓ、Ｇ２またはＭ相中の上
皮細胞の数として計算した。細胞の増殖について、４つ
の0.25mmの領域（計１mm）を計数した。結果を図１０に
示す。ＰＩは、アルギン酸塩ビーズ中のＴＧＦ−β₁ を
口を経由して摂取した動物の十二指腸および空腸におい
て、非常に減少（p<0.05）していた。

【００６５】分裂指数（ＭＩ）は、ＰＩについて計数し
たのと同一の領域でmm当たりの分裂形態の数として定量
した。細胞増殖データは、処理および対照動物群の間の
組になっていないデータのセットの知見について、スチ
ューデントのｔ試験を用いて統計的に分析した。５％の
有意差レベルは統計的有意性の判断基準として使用し
た。結果を第11図に示す。ＭＩは、アルギン酸塩ビーズ
中のＴＧＦ−β₁ を口を経由して摂取した動物の十二指
腸および空腸において、非常に減少（p<0.05）してい
た。

【００６６】対照として、著しい細胞増殖活性に対応す
る大量のPCNA着色が観察された。PBS 中の、ＴＧＦ−β
₁ で処理した動物のＩ．Ｐ．またはＰ．Ｏ．において、
中程度の着色が存在した。ＴＧＦ−β₁ アルギン酸塩ビ
ーズで処理した動物において、最小限の着色が観測され
たことは、小嚢腺幹細胞の静止状態を示している。

【００６７】以上から、アルギン酸塩−カルシウムビー
ズが、本発明の実施のためのカチオン性治療薬のための
効果的な経口投与システムに使用することができる。ビ
ーズのみから放出されたＴＧＦ−β₁ は、ＥＬＩＳＡ法
により測定したところ結合活性を有していなかった。し
かしながら、酸処理と組み合わせて、ＰＡＡをポリアニ
オン性添加剤として添加することにより、高いＴＧＦ−
β₁ 結合活性を保持するに至った。アルギン酸塩ビーズ
処理のｐＨは、ビーズからのＴＧＦ−β₁ の放出速度を
制御するために使用される。ＴＧＦ−β₁ およびＰＡＡ
を含有する調製されたアルギン酸塩ビーズは、調節され
た酸処理工程にさらされ、単離され、凍結乾燥され、硬
質ゼラチンカプセルに経口投与のために封入される。カ
プセルを使用する場合、胃のｐＨ１の環境中においては
ＴＧＦ−β₁ は全く放出されないが、腸内のｐＨ７にお
いては、活性でＰＡＡにより保護されたＴＧＦ−β
₁ が、２〜３時間にわたって直線的に放出される。さら
に、ＰＡＡは、腸の腸内細胞に対するＴＧＦ−β₁ の目
的とする投与を行うための生物接着剤として機能するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】前述の態様および本発明の多くの付加的な利点
は、添付した図面を考慮して、詳細な説明を参照するこ
とにより、よりよく理解されるようになるに従い、より
容易に認識されるであろう。図１Ａ〜１Ｄは、ｐＨ 7.
4、37℃でＰＢＳ中に入れた場合のアルギン酸塩ビーズ
の絵による表示であり、図１ＡはＴＧＦ−β₁ を含有す
る硬化したアルギン酸塩ビーズを表し、図１ＢはＴＧＦ
−β₁ を含有する硬化した酸処理アルギン酸塩ビーズを
表し、図１ＣはＰＡＡおよびＴＧＦ−β₁ を含有する硬
化したアルギン酸塩ビーズを表し、そして図１ＤはＰＡ
ＡおよびＴＧＦ−β₁ を含有する硬化した酸処理アルギ
ン酸塩ビーズを表す。図１Ａ〜１Ｄにおける印（■）は
カルシウム架橋を表す。

【図２】実施例２に記載したように定量した、ｐＨ 7.4
で37℃での（図１中、■として示した）、そして24時間
後に0.1N HCl、ｐＨ 1.0のＰＢＳに移した場合（図１
中、●として示した）の ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ の生体外
での放出の累積パーセントをグラフにより示した。50.0
μg の ¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−β₁ を含有するアルギン酸塩ビ
ーズ（75:0 w/w）は、１％ＣａＣｌ₂ 中において10分間
硬化した。

【図３】実施例３に記載したように定量した、ｐＨ 7.4
でＰＢＳ中での空のビーズ（図２中、■として示し
た）、ＰＢＳ中、50.0μg のＴＧＦ−β₁ を含有するビ
ーズ（図２中、●として示した）、そして0.1N HCl中
で、50.0μg のＴＧＦ−β₁ を含有し、165 分間ＰＢＳ
に移したビーズ（図２中、▲として示した）の37℃での
アルギン酸塩ビーズ（75:0 w/w）の膨潤をグラフにより
示した。図２の誤差線は、10個のビーズの平均直径から
の標準偏差を表す。全てのビーズは１％ＣａＣｌ ₂ 中に
おいて10分間硬化した。

【図４】実施例５に記載したように定量した、アルギン
酸塩を含有しない溶液中での添加剤（% w/v ）の存在下
において、放出されるＴＧＦ−β₁ の免疫反応性をELIS
A 法により測定したような、免疫反応性形態で放出され
た総ＴＧＦ−β₁ のパーセントをグラフにより示した。
以下の添加剤は第４図に示した％w/v の量で使用した。
グルタミン酸（■）、アスパラギン酸（●）、ポリ−Ｌ
−アスパラギン酸（ＰＬＡＡ、▲）、ナトリウムカルボ
シキメチルセルロース（ＮａＣＭＣ、高粘度、◆）、ポ
リアクリル酸（Ｍw ＝750 ｋＤａ、□）、ＰＡＡ（90ｋ
Ｄａ、○）、およびＰＡＡ（２ｋＤａ、△）。

【図５】添加したＰＡＡ（90ｋＤａ）のモルも関数とし
て、ｐＨ 7.4でＰＢＳ中、37℃において、アルギン酸塩
ビーズから、免疫反応性形態として有用な、放出された
ＴＧＦ−β₁ の結合活性をＥＬＩＳＡで測定したグラフ
を示したものである。アルギン酸塩の添加に先立ち、１
％ＣａＣｌ₂ 中において10分間硬化し、そして0.1N HCl
中、37℃で30分間、酸処理した、ＰＡＡおよびＴＧＦ−
β₁ のインキュベーション時間は：５分間（図５中、■
として示した）および60分間（図５中、●として示し
た）であった。放出された免疫反応性ＴＧＦ−β₁ の絶
対量は、２時間の時点で分析した。

【図６】ｐＨ 7.4でＰＢＳ中、37℃において、ＰＡＡ
（90ｋＤａ）と共にアルギン酸塩ビーズ（75:6 w/w）か
ら、免疫反応性形態として有用な、放出されたＴＧＦ−
β₁ の結合活性をＥＬＩＳＡで測定したグラフを示した
ものである。ビーズは、実施例８に記載したように37℃
で30分間、ｐＨ１（図６中、▲で示した）、ｐＨ２
（○）、ｐＨ３（■）、ｐＨ４（◆）またはｐＨ７
（□）中で、酸処理した。放出された免疫反応性ＴＧＦ
−β₁ の絶対量を、図６に示した時間において分析し
た。

【図７】¹²⁵Ｉ（放出されたＴＧＦ−β₁ の総量）、Ｅ
ＬＩＳＡ法（免疫反応性形態で有用な放出されたＴＧＦ
−β₁ の総量）、および成長阻害分析（ＧＩＡ）生物学
的定量法（生物活性形態で放出されたＴＧＦ−β₁ の総
量）により測定された、ｐＨ 7.4でＰＢＳ中、37℃にお
いて、ＰＡＡ（90ｋＤａ）と共にアルギン酸塩ビーズ
（75:10 w/w ）から放出されたＴＧＦ−β₁ のパーセン
トを示すグラフである。ビーズは0.1N HCl中、37℃で30
分間、酸処理した。

【図８】実施例１１に記載したようにアルギン酸塩ビー
ズから、ＥＬＩＳＡで測定したように、免疫反応性形態
で放出された、総オンコスタチン−Ｍのパーセントをグ
ラフで示すものである。実施例１１に記載したように、
図中、（□）はＰＡＡを含有する酸処理ビーズを表し、
（◇）はＰＡＡを含有するが酸処理していないビーズを
表し、（■）はＰＡＡを含有しないが酸処理したビーズ
を表し、そして◆はＰＡＡを含有せず、酸処理もしてい
ないビーズを表す。

【図９】実施例１０に記載したように、アルギン酸塩ビ
ーズから、ＥＬＩＳＡにより測定したように、免疫反応
性形態で放出された、総アンフィレグリンのパーセント
をグラフで示すものである。図中、印は図８における対
応するものと同じ意味を有する。

【図１０】実施例１３に記載したように、ＴＧＦ−β₁
なし（図１０の白棒）、腹腔内ＴＧＦ−β₁ （ハーフト
ーンの棒）、経口ＴＧＦ−β₁ 、リン酸緩衝塩（斜線の
棒）またはアルギン酸塩ビーズ中のＴＧＦ−β₁ （黒色
の棒）で処理したスプラグ−ダウレイ（Sprague-Dawle
y）ラットから取り出した十二指腸、空腸および結腸組
織試料からの細胞の増殖指数（ＰＩ）についてグラフで
示したものである。

【図１１】実施例１３に記載したように、図１０の組織
試料からの細胞の分裂指数をグラフで表すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 38/22 ＡＣＪ 47/32 Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/495 8318−4Ｈ (71)出願人 594169754 ユニバーシテイ オブ ワシントン Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉ ｎｇｔｏｎ アメリカ合衆国，ワシントン州 98105, シアトル，エヌイー 45ス ストリート 1107，スイート 200 (72)発明者 ウエイン アール．ゴムボツ アメリカ合衆国，98034 ワシントン州, カークランド，エヌ．イー．129ス プレ イス 6406 (72)発明者 ラッセル ジェイ．マンパー アメリカ合衆国，27858 ノースカロライ ナ州，グリーンヴィル，クルックド クリ ード ロード 1812 (72)発明者 アラン エス．ホフマン アメリカ合衆国，98105 ワシントン州, シアトル，ウエスト ローレル ドライブ エヌ．イー．4528 (72)発明者 リサ エス．ボウチャード アメリカ合衆国，98055 ワシントン州, レントン，ベンソンロード エス 2223, アパートメント テー202

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カチオン性治療薬、多価カチオンで架橋
   されたアルギン酸塩およびアルギン酸塩の重量に対し重
   量／重量比が約75：２〜約75：10で、約50〜150 ｋＤａ
   の分子量を有するポリアクリル酸とから成る放出持続性
   組成物。
2. 【請求項２】 アルギン酸塩の重量に対し重量／重量比
   が約75：６〜約75：10で、約75〜100 ｋＤａの分子量を
   有するポリアクリル酸から成る請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 アルギン酸塩が約２未満のｐＨでインキ
   ュベートされたものである請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 治療薬がＴＧＦ−β₁ 、オンコスタチン
   −Ｍおよびアンフィレグリンから成る群より選ばれる請
   求項１記載の組成物。
5. 【請求項５】 ＴＧＦ−β₁ 、カルシウムイオンで架橋
   されたアルギン酸塩およびアルギン酸塩の重量に対し重
   量／重量比が約75：６〜約75：10で、約75〜100 ｋＤａ
   の分子量を有するポリアクリル酸とから成り、組成物か
   ら生物活性状態のＴＧＦ−β₁ の放出を増大させるため
   に、該アルギン酸塩が約２未満のｐＨでインキュベート
   されたものであることを特徴とする放出持続性組成物。
6. 【請求項６】 治療薬、アニオン性ポリアクリル酸保護
   ポリマーおよびアルギン酸塩の混合物を形成させ、該混
   合物の液滴を多価カチオンの溶液中に導入してアルギン
   酸塩を架橋せしめてビーズを形成させ、次いで、ビーズ
   からの治療薬の放出を増大させる為に十分な時間、ビー
   ズを酸性ｐＨでインキュベートすることを特徴とする、
   ヒトまたは非ヒト哺乳動物の必要に対応した治療薬を経
   口投与するためのアルギン酸塩ビーズの製造方法。
7. 【請求項７】 混合物がアルギン酸塩の重量に対し重量
   ／重量比が約75：６〜約75：10で、約75〜100 ｋＤａの
   分子量を有するポリアクリル酸から成る請求項６記載の
   方法。
8. 【請求項８】 ビーズが約２未満のｐＨにおいてインキ
   ュベートされたものである請求項６記載の方法。
9. 【請求項９】 ビーズが約１のｐＨにおいて少なくとも
   約15分間インキュベートされたものである請求項８記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 治療薬がＴＧＦ−β₁ 、オンコスタチ
    ン−Ｍおよびアンフィレグリンから成る群より選ばれる
    請求項６記載の方法。