JPH07265092A

JPH07265092A - 正しく連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得る方法

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Publication number: JPH07265092A
Application number: JP7028946A
Authority: JP
Inventors: Ranier Obermeier; ライナー・オーベルマイアー; Martin Gerl; マルテイン・ゲルル; Juergen Ludwig; ユルゲン・ルートヴイヒ; Walter Sabel; ヴアルター・ザーベル
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 1995-10-17
Anticipated expiration: 2021-12-27
Also published as: CA2142780A1; ATE166069T1; NO950592L; HK1010457A1; DK0668292T3; JP3863579B2; AU699817B2; EP0668292A3; IL112680A0; FI950699L; FI115916B; DE4405179A1; US5663291A; DE59502138D1; ES2119241T3; SG46683A1; FI950699A0; EP0668292B1; KR100371824B1; AU1228895A

Abstract

(57)【要約】【目的】正しく連結されたシスチン架橋を有するイン
シュリンを得る方法の提供。【構成】酵素を用いてプロインシュリンをインシュリ
ンに直接変換し、そして疎水性吸着樹脂を用いて反応混
合液からインシュリンを直接分離すると共に、メルカプ
タン、カオトロピック助剤の存在下及びpH１０〜１１に
おいて、相当するプロインシュリンアミノ酸鎖から正し
く連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ヒトインシュリンは全部で５１個のアミノ
酸残基を含む２個のアミノ酸鎖を有する蛋白質である。
６個のシステイン残基は２個のアミノ酸鎖に存在してお
り、各々２個のシステイン残基はジスルフィド架橋を通
じて互いに連結している。生物学的に活性なヒトインシ
ュリンでは、Ａ及びＢ鎖は２個のシスチン架橋を通じて
互いに連結され、そして更なるシスチン架橋がＡ鎖に存
在する。統計的にみれば、ヒトインシュリン分子内のジ
スルフィド架橋形成には１５の可能性がある。この１５
の可能性内の唯一つのものが生物学的活性ヒトインシュ
リン中に起こっている。以下のシステイン残基は、お互
いにヒトインシュリン中で連結している：Ａ６−Ａ１１Ａ７−Ｂ７Ａ２０−Ｂ１９文字Ａ及びＢは特定のインシュリンアミノ酸鎖を表し、
アミノ酸残基の位置の数字は特定のアミノ酸鎖のアミノ
末端よりカルボキシ末端に数えられたものである。ジス
ルフィド架橋は２個のヒトインシュリン分子間にも形成
され得るので無限の多くの異なるジスルフィド架橋が容
易に形成され得る。

【０００２】ヒトインシュリン製造の既知の方法はヒト
プロインシュリンを使用することに基づいている。ヒト
プロインシュリンは８６個のアミノ酸残基の線状のアミ
ノ酸鎖を有する蛋白質であり、ヒトインシュリンのＢ及
びＡ鎖は３５個のアミノ酸残基を有するＣペプチドを介
して互いに連結されている。ヒトインシュリン中に起こ
るジスルフィド架橋の形成は中間体を通じて形成され、
ヒトインシュリンのシステイン残基は、例えばＳ−スル
ホネート（−Ｓ−ＳＯ₃ ^-）基（EP 0 037 255）のような
硫黄保護基を具備する。正しく連結されたシステイン架
橋を有するプロインシュリンを得る方法もまた知られて
おり（Biochemistry, 60, 1968, 622〜629頁）、それは
システイン残基がチオール残基（−ＳＨ）として存在す
る豚の膵臓より得られるプロインシュリンを出発材料と
するものである。“正しく連結されたシスチン架橋”の
言葉は哺乳動物からの生物学的に活性なインシュリン中
に見い出されるジスルフィド架橋を意味するものと解釈
される。

【０００３】遺伝子工学の複数の方法がヒトインシュリ
ンと異なるアミノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を
有するヒトプロインシュリンまたはプロインシュリンを
微生物中で製造することを可能にしている。遺伝子工学
により改変された大腸菌細胞から製造されたプロインシ
ュリンが全て正しく連結されたシスチン架橋を持ってい
るものではない。大腸菌（EP 0 055 945）を用いてヒト
インシュリンを得る方法は以下の製造段階を基礎として
いる：微生物の発酵−細胞分裂−融合蛋白の単離−融合
蛋白の臭化シアン切断−プロインシュリン配列を含有す
る切断生成物の単離−S-スルホネート基によるプロイン
シュリンのシステイン残基の保護−正しく連結されたシ
スチン架橋の形成−亜硫酸分解−プロインシュリンの脱
塩−正しく連結されたシスチン架橋を含有するプロイン
シュリンのクロマトグラフィーによる精製−プロインシ
ュリン溶液の濃縮−濃縮プロインシュリン溶液のクロマ
トグラフィーによる精製−プロインシュリンの酵素切断
によるヒトインシュリンの取得−得られたヒトインシュ
リンのクロマトグラフィー精製。

【０００４】この方法の不利な点は多数の製造段階より
なっていることと、精製段階での損失があることで、こ
れらがインシュリンの低収率をもたらしている。この多
段階製法ゆえに多大なる損失が危惧されねばならない。
分離された融合蛋白の段階から、臭化ジシアン切断、亜
硫酸分解及びプロインシュリンの精製の段階（EP 0 055
945）を通じ、４０％迄のプロインシュリン損失を見込
まなければならない。同様に最終生成物に至るまでの以
下の精製段階の間で大きな損失が生じる。遺伝子工学的
方法により、もし必要とする製造段階が相当減らせるな
らば、ヒトインシュリン又はインシュリン誘導体製造に
おける収率増加が達成できる。本発明の目的は、製造段
階がより少なく、そして全体としての精製損失がより少
ない、インシュリンアミノ酸鎖中で正しく連結されたシ
スチン架橋を有するインシュリンを得るための方法を開
発するにある。

【０００５】本発明によれば、次の一般式（Ｉ）

【化２】のインシュリンの製造方法が見出されたのである。そし
てこの方法は

【０００６】Ａ）次の式（II）Ｒ²−Ｒ¹−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ20−Ｒ³ （II）の蛋白質を水性媒質１リットル当たり０.０５〜０.３ｇ
の式（II）の蛋白質濃度で、水性媒質中でpH１０〜１１
において、少なくとも１つのカオトロピック助剤（chao
tropic auxiliary）の存在下に、式（II）の蛋白質のシ
ステイン残基当たり２〜１０個のメルカプタンの−ＳＨ
基を産生する量のメルカプタンと反応させ、そしてＢ）正しく連結されたシスチン架橋を有する得られた
プロインシュリンとトリプシン、トリプシン様の酵素及
び場合によっては追加的にカルボキシペプチダーゼＢま
たは前述した酵素の混合物と反応させて、正しく連結さ
れたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンを製
造し、Ｃ）このようにして得られた反応生成物を水性媒質１
リットル当たり疎水性吸着樹脂３〜５０ｇとpH４〜７に
おいて処理し、Ｄ）式（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する吸
着樹脂を分離し、そしてＥ）この吸着樹脂から式（Ｉ）のインシュリンを脱着
することよりなるものである。ここで、上記した式
（Ｉ）及び式（II）において、

【０００７】Ｘはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇよりなる群のア
ミノ酸残基、またはｂ) ペプチドのＮ−末端及びカルボキシル末端にアミノ
酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３５個のアミ
ノ酸残基を有するペプチドであり、Ｙは遺伝子的にコー
ド可能なアミノ酸残基であり、Ｚはａ) Ａｒｇ及びＬｙｓよりなる群のアミノ酸残基、ｂ) ペプチドのカルボキシ末端にアミノ酸残基Ａｒｇま
たはＬｙｓを含有する２〜３個のアミノ酸残基を有する
ペプチド、またはｃ) ＯＨでありＲ¹はフェニルアラニン残基または共有結合であり、Ｒ²はａ) 水素原子、ｂ) ＬｙｓおよびＡｒｇよりなる群のアミノ酸残基、ま
たはｃ) ペプチドのカルボキシ末端にアミノ酸残基Ｌｙｓ又
はＡｒｇを含有する２〜４５個のアミノ酸残基を有する
ペプチドであり、Ｒ³は遺伝子的にコード可能なアミノ
酸残基、ヒトインシュリン、動物インシュリンまたはイ
ンシュリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応する残基
Ａ２−Ａ２０、およびヒトインシュリン、動物インシュ
リンまたはインシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に
対応する残基Ｂ２−Ｂ２９であるものとする。

【０００８】好ましく用いられる式（II）の蛋白質は、
式中、Ｘがアミノ酸残基Ａｒｇまたはヒトインシュリン
のＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ＹがＡ
ｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒよりなる群のアミノ酸残基で
あり、Ｒ¹がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、Ｒ²がａ) 水素原子、またはｂ) カルボキシル末端にＡｒｇを含有する２〜２５個の
アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ³がＡｓｎ、
ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群のアミノ酸残基、および
ヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列に対
応する残基Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９であり、そ
して得られる正しく連結されたシスチン架橋を有する式
（Ｉ）のインシュリンは、式中、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、
Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９が前述の定義を有する
ものであり、そしてＺがアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド
残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＯＨであるものである。

【０００９】特に好ましく用いられる式（II）の蛋白質
は、式中、Ｘがアミノ酸残基Ａｒｇ、または２〜３５個
のアミノ酸残基を有し、２個の塩基性アミノ酸残基、特
にＡｒｇおよび／またはＬｙｓがペプチドの初めと末端
に存在するペプチドであり、Ｙがアミノ酸残基Ｔｈｒで
あり、Ｒ¹がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、Ｒ²がａ) 水素原子、またはｂ) カルボキシ末端がアミノ酸残基Ａｒｇである２〜１
５個のアミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ³がア
ミノ酸残基ＧｌｙまたはＡｓｎ、およびヒトインシュリ
ンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２
−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９であり、また得られる正し
く連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュ
リンは、式中、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ２−Ａ２０およ
びＢ２−Ｂ２９が上述の定義を有するものであり、そし
てＺがアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−Ａｒ
ｇまたはＬｙｓ−ＬｙｓまたはＯＨであるものである。

【００１０】驚くべきことに、式（II）の蛋白質は慣習
的に“再生(refolding)”（R. Jaenicke, R. Rudolph,
1989, Folding Proteins, in Protein Structure, a pr
actical Approach; Ed. Creighton, T.E., 191-224頁,
JRL Press Oxford; EP 0 219874）に先立つ反応段階で
完全に還元される必要のないことが見出されているが、
前述の方法においては異質蛋白質の割合が高い（５０〜
９０％）にも拘わらず、−ＳＨ保護基を含有する適切に
精製されたプロインシュリンの折りたたみに比肩しうる
水準で折りたたみ収率が達成されていることである。さ
らに驚くべきことに、正しく連結されたシスチン架橋を
有する式（Ｉ）のインシュリンを産するために正しく折
りたたまれたプロインシュリンの酵素的反応が５０〜９
０％の異質蛋白質の存在下に、高収率で可能であること
も見出され、式（Ｉ）のインシュリンは疎水性吸着樹脂
と選択的によく結合することが判った。

【００１１】既知の方法と比較し、本発明の方法は尚一
層高収率で、かなり速い製造を可能にする。その理由は
亜硫酸分解の回避と、場合によっては臭化シアン切断方
法段階及び以前には未知のプロインシュリンを限定量の
カオトロピック塩の存在下で、その変性した状態から正
しく結合されたシスチン架橋を有するプロインシュリン
に変換し、そして次にそのプロインシュリンを酵素的に
変換して、それ以上の精製を必要とせず式（Ｉ）のイン
シュリンにするからである。こうして吸着により折りた
たみ溶液から式（Ｉ）のインシュリンを分離することが
可能となる。脱着後、中間的分離又は精製をすることな
く吸着剤より式（Ｉ）のインシュリンをこのように得る
ことが出来る。本発明による方法は、既知の方法に比
し、立ち上がり時間が短いために実質的に短時間製法で
あり、そして損失が避けられるため既知の方法に較べて
２５〜１００％の収率増加を可能にする。

【００１２】ペプチドと蛋白質のアミノ酸配列は、アミ
ノ酸鎖Ｎ−末端から指定される。式（Ｉ）の括弧内に与
えられた情報、つまりＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７又はＢ
１９はインシュリンのＡ鎖又はＢ鎖中のアミノ酸残基の
位置に対応する。アミノ酸Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔ
ｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ
ｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ及びセレノシステ
インは、“遺伝子的にコード可能なアミノ酸基”という
意味を表す。動物インシュリンの“残基Ａ２〜Ａ２０”
及び“残基Ｂ２〜Ｂ２９”という言葉は、例えば牛、豚
又は雌鳥のアミノ酸配列という意味に理解される。イン
シュリン誘導体のＡ２〜Ａ２０及びＢ２〜Ｂ２９基とい
う言葉は、他の遺伝子的にコード可能なアミノ酸により
アミノ酸を置換して形成された対応するヒトインシュリ
ンのアミノ酸配列を表す。

【００１３】残基Ｚは常にＸのアミノ酸配列の一部であ
り、トリプシン、トリプシン様の酵素又はカルボキシペ
プチダーゼＢのようなプロテアーゼ活性により形成され
る。残基Ｒ³はインシュリンのＡ鎖の位置Ａ２１のアミ
ノ酸残基である。残基ＹはインシュリンのＢ鎖の位置Ｂ
３０のアミノ酸残基である。トリプシン又はトリプシン
様酵素はアルギニン又はリジンでアミノ酸鎖を切断する
プロテアーゼである。カルボキシペプチダーゼＢはアミ
ノ酸鎖のカルボキシ末端にあるＡｒｇ又はＬｙｓのよう
な塩基性アミノ酸残基を切断するエクソプロテアーゼで
ある（Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, 6786〜67
91頁）。

【００１４】ヒトインシュリンのＡ鎖は以下の配列（配
列番号１）を有する：Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｉｌ
ｅ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｅ
ｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎヒトインシュリンのＢ鎖は以下の配列（配列番号２）を
有する：Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌ
ｅｕ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｖａ
ｌ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｐｈ
ｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＴｈｒヒトインシュリンのＣ鎖は以下の配列（配列番号３）を
有する：Ａｒｇ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａ
ｓｐ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒ
ｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌ
ｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌ
ｙ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ

【００１５】カオトロピツク助剤は例えば、硫酸アンモ
ニウム、塩酸グアニジン、炭酸エチレン、チオシアネー
ト、ジメチルスルホキシド及び尿素のような水性溶液中
で水素結合を破る化合物である。疎水性吸着樹脂という
用語は例えば、ポリアクリレート又はポリスチレン又は
スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、殊に大きな表
面積と多くの大きな空孔（large pores）を有する高分
子吸着樹脂、例えば商業製品としてのロームアンドハ
ース社又は三菱化成株式会社のXAD16、XAD1600又はHP20
のような非イオン性で疎水性の架橋された重合体及び／
又は共重合体を表す。メルカプタンという用語は、少な
くとも１個の−ＳＨ基を有する化合物を意味するものと
理解される。水溶性のメルカプタンが好ましい。これ等
化合物の例としてはジチオトレイトール、ジチオエリト
リトール、２−メルカプトエタノール、システイン、グ
ルタチオン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト
−１,２−プロパンジオール及び３−メルカプトプロピ
オン酸がある。

【００１６】式（II）の蛋白質は多くの遺伝子工学構築
法の助けにより微生物中で形成出来る（EP 0 489 780、
EP 0 347 781、EP 0 453 969）。遺伝子工学構築法は大
腸菌又はストレプトマイセテスのような微生物を発酵さ
せて発現できる。形成された蛋白質は微生物内に保持さ
れ（EP 0 489 780）又は発酵溶液に排出される。本発明
による方法では、式（II）の蛋白質は、細胞を破壊した
直後であって発酵溶液及び微生物に由来する多数の蛋白
質が夾雑したものが使用できる。式（II）の蛋白質は、
しかしながら、例えば沈澱又はクロマトグラフィーによ
る精製後のように予め精製された形でも使用できる。

【００１７】製造段階Ａ）の工程は次のとおりである。
蛋白質をカオトロピツク助剤又は種々のカオトロピツク
助剤の混合液に溶解する。好ましくは尿素又は塩酸グア
ニジンを水を溶媒として濃度６〜９Ｍ、好ましくは８Ｍ
で用いる。反応混合物のpHは８.５〜１０.８である。使
用できる緩衝剤の例としてはリン酸塩、トリ（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（tris）、ホウ酸塩又はグリシ
ン緩衝剤である。水性媒質中の緩衝剤物質の濃度は０.
５Ｍまでであり、好ましくは０.００５Ｍ〜０.５Ｍ、特
に好ましくは０.０５〜０.１Ｍである。蛋白質混合液は
次に水性メルカプタン溶液と混合される。この手段によ
り以下の濃度が反応液中（水に基づいて）で確立する。

【００１８】式（II）の蛋白質濃度は０.０５〜０.６ｇ
／リットルで、好ましくは０.１〜０.３ｇ／リットルで
ある。メルカプタンの量は式(II）の蛋白質のシステイ
ン残基当たり２〜１０のメルカプタンの−ＳＨ残基であ
り、好ましくは６〜９である。溶液のpHは１０〜１１
で、好ましくは１０.８である。上述の緩衝液成分が用
いられる。正確なpHは水酸化ナトリウム溶液を加えるこ
とにより確立する。緩衝液成分の濃度は０.００５〜０.
５Ｍで、好ましくは０.０５〜０.１Ｍである。メルカプ
タンを含有する反応混合液中のカオトロピツク助剤の濃
度は１Ｍ以下で、好ましくは０.１〜０.８Ｍ、特に好ま
しくは０.３〜０.６Ｍである。使用するメルカプタンは
好ましくはシステイン又は２−メルカプトエタノールの
単独又は混合物である。製造段階Ａ）における折りたた
み中の温度は０℃〜５０℃で、好ましくは２℃〜３０
℃、特には４℃〜１０℃である。反応時間は３〜１２時
間で、好ましくは４〜８時間、特には５時間である。製
造段階Ａ）の結果として正しく連結されたシスチン架橋
を含有するプロインシュリンが得られる。

【００１９】製造段階Ｂ）においては、製造段階Ａ）か
らの反応溶液はpHを６.５〜９.０、好ましくは８〜９に
調整する。これにトリプシン又はトリプシン様酵素を正
しく連結されたシスチン架橋を有するプロインシュリン
３ｇに対し１〜３mgの量を加える。これに場合により、
カルボキシペプチダーゼＢを式（Ｉ）のインシュリン１
ｇに対し、３〜８単位の量で加える。トリプシン及びカ
ルボキシダーゼＢの混合液もまた加えてもよい。得られ
た溶液を次に４℃〜１５℃で４〜１６時間撹拌する。製
造段階Ｂ）の結果として正しく連結されたシスチン架橋
を含有する式Ｉのインシュリンが得られる。製造段階
Ｃ）においては、製造段階Ｂ）の反応液を塩酸又は硫酸
のような酸を用いてpH２.５〜４.５に調整する。もし溶
液に濁りが生じるなら場合によりそれを濾過又は遠心分
離により除去する。残っている溶液を疎水性吸着樹脂で
処理する。ＸＡＤ又はＨＰ２０タイプの樹脂が適切であ
る。樹脂量は反応液１リットル当たり３〜５０ｇで、好
ましくは２０〜４０ｇ／リットルである。

【００２０】得られた懸濁液を０.１Ｍの濃度までの塩
化ナトリウムのような塩で処理し、次に３〜４時間撹拌
する。樹脂の式Ｉのインシュリンの吸着はサンプリング
し、高速液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ分析）
によりチェックする。溶液中にインシュリンが残ってい
ないのを確認後、即座に吸着樹脂を水性反応溶液かせ分
離する（製造段階Ｄ）。これは例えば、すでに知られて
いる方法により濾過又は遠心分離により行われる。式
（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する樹脂を純水
性又は水性溶液を含む緩衝液で洗浄する。特に、洗浄溶
液中の伝導性が０.４mS／cmになるまで洗浄する。

【００２１】式（Ｉ）のインシュリンの脱着（製造段階
Ｅ）は使用される疎水性吸着樹脂の如何に応じた既知の
方法により行われる。脱着がＸＡＤ又はＨＰ２０吸着樹
脂を用いた場合には、例えば（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルカノール
のような水混和性で非イオン有機溶剤を２０〜６５％含
有する水性溶液により行われる。好ましくはイソプロパ
ノール又はｎ−プロパノールの３５％が溶媒の水中で使
用される。式（Ｉ）のインシュリンの脱着は、例えばイ
ソプロパノール溶剤で洗浄することにより行われる。こ
の洗浄はイソプロパノール溶液と混合しながら撹拌圧力
フィルター上で洗浄するか又はカラム中でクロマトグラ
フィーにより行われる。樹脂／イソプロパノールの量比
は１：１〜１：１０であり、好ましくは１：１１〜１：
２である。洗浄段階は１〜５回好ましくは２回繰り返さ
れる。一緒にしたイソプロパノール画分は直接又は水で
希釈後、更にクロマトグラフィーによる精製に用いられ
る。次の実施例中で本発明の方法を詳述する。百分率の
データは別に記載しない場合は重量によるものである。

【００２２】実施例１遺伝子工学により変性した大腸菌（EP 0 489 780）の発
酵によって次のアミノ酸配列を有する融合蛋白質を調製
した。プロインシュリン配列１（配列番号４）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

【００２３】プロインシュリン配列１は式（II）に対応
するもので、式中、Ｘは、ヒトインシュリン由来のＣペ
プチドであり、Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、Ｒ¹は、
Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、Ｒ²は、アミノ酸残基１１個を有
するペプチドであり、Ｒ³は、Ｇｌｙ(Ａ２１)であり、
そしてＡ２−Ａ２０はヒトインシュリンのＡ鎖（アミノ
酸残基２〜２０）のアミノ酸配列であり、そしてＢ２−
Ｂ２９はヒトインシュリンのＢ鎖（アミノ酸残基２〜２
９）のアミノ酸配列である。

【００２４】発現されたプロインシュリン配列１を有す
る融合蛋白質を大腸菌細胞中で集め、そして封入体を作
成する。発酵完了後、大腸菌細胞を遠心分離により除去
し、そして慣用の高圧ホモジナイゼイションにより破砕
する。遊離された融合蛋白質封入体を遠心分離する。プ
ロインシュリン配列１を有する分離された融合蛋白質封
入体２６００ｇ（冷凍乾燥後の乾燥重量）をpH１０.８
の８Ｍ塩酸グアニジン溶液２００リットルに溶解する。
場合により少量の懸濁物質を遠心分離後、清澄溶液をpH
１０.８の水性システイン溶液（塩酸システイン水和物
２５０ｇ）１８００リットルに４℃で撹拌注入する。イ
ンシュリン含有融合蛋白質の比率はＳＤＳ電気泳動走査
（U.K.Laemmli, Nature, 227巻, 680〜685頁, 1970）に
より測定され、それは４５％であった。折りたたみ反応
終結後、反応混合液中の正しく連結されたシスチン架橋
を有するプロインシュリン配列１の含有量がＨＰＬＣ分
析により測定され７６０ｇであった。

【００２５】この溶液の２０００リットルを６Ｎ塩酸を
用いてpH８.５に調整した。次にトリプシン５００mgを
加えた。ＨＰＬＣ測定によればインシュリン２が３５０
mg形成されていた。インシュリン２は式（Ｉ）に対応す
るもので、式中、Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、Ｚは、
Ａｒｇ−Ａｒｇであり、Ｒ¹は、Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、
Ｒ³は、Ｇｌｙ(Ａ２１)であり、そしてＡ２−Ａ２０は
ヒトインシュリンのＡ鎖（アミノ酸残基２〜２０）のア
ミノ酸配列であり、そしてＢ２−Ｂ２９はヒトインシュ
リンのＢ鎖（アミノ酸残基２〜２９）のアミノ酸配列で
ある。

【００２６】インシュリン２は配列表の配列番号６及び
９よりなり、正しく結合されたシスチン架橋を通じて互
いに連結されたものである。この溶液を６Ｎ塩酸を用い
てpH３.５に調整し、そして伝導度の値を飽和塩化ナト
リウム溶液を用いて約１０mS／cmに調整した。僅かな濁
りを遠心分離により除去した。ＨＰ２０（三菱化成社
製、ドイツ−デュッセルドルフ）７５kgを澄んだ溶液に
加えた。インシュリン２が上清中に検出されなくなるま
で懸濁液を徐々に４℃で１６時間撹拌した。吸入フィル
ターによる濾過で樹脂を除去し、そして洗浄液中の伝導
度が０.４mS／cm以下になるまで水で洗浄した。生成物
を５０％濃度の水性イソプロパノール溶液７５リットル
中で樹脂を懸濁させて脱着した。濾過及びイソプロパノ
ールでのインキュベーションを２回反復する。６０分
後、樹脂を濾過しそして次に３５％濃度のイソプロパノ
ール溶液中でインキュベーションを数回反復し、そして
濾過した。インシュリン２の収量は２８８ｇであった。
インシュリン２を含有する溶出液は水で希釈及びpH調整
後に直ちにクロマトグラフィーカラム上で更に精製し得
る。

【００２７】ＨＰＬＣ分析蛋白質０.５ｇを６Ｍ塩酸グアニジン、５０mM tris、pH
８.５、５mMエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤ
ＴＡ）、１％２−メルカプトエタノール及び１０mMジ
チオトレイレールの溶液４０mlに９５℃で２分間溶解
し、そして次に１４０００ｇで２０分間遠心分離した。
澄んだ上清０.０２mlを高速液体クロマトグラフィーカ
ラムに付した。カラム：ニュークリオゲル(^RNucleogel）RP 300-5/46
（マカリー＆ネルゲル社製，アーヘン，ドイツ）勾配：緩衝液Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０.０９％ＴＦＡ温度：５５℃ 合計溶出時間：４０分間勾配は溶出時間後の下記の緩衝液Ｂの量を特徴とする。
１０分間２５％、１２分間６０％、１３分間９０％、１
５分間１００％流速：１ml／分検出：２１５nm インシュリンの保持時間：約１９分間

【００２８】実施例２遺伝子工学により変性した大腸菌（EP 0 347 781）の発
酵によって次のアミノ酸配列を有する融合蛋白質を調製
した。融合蛋白質３（配列番号５）： Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

【００２９】この融合蛋白質はプロインシュリン３のア
ミノ酸配列を含有している。発現された融合蛋白質３を
大腸菌細胞内で集め、そして封入体を作成する。細胞の
破砕を実施例１のように行った。このようにして得られ
た融合蛋白質３を臭化シアン開裂に付し、プロインシュ
リンを作成した（配列番号：８）。プロインシュリン３
は式IIに対応するもので、式中、Ｘは、Ａｒｇであり、
Ｙは、Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、Ｒ¹は、Ｐｈｅ(Ｂ１)で
あり、Ｒ²は、４個のアミノ酸残基を有するペプチドで
あり、Ｒ³は、Ａｓｎ(Ａ２１)であり、そしてＡ２−Ａ
２０及びＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリンのＡ及びＢ鎖
のアミノ酸配列に対応するものである。

【００３０】臭化シアン開裂の後、プロインシュリン３
の含量を９.２％インシュリン含有蛋白質を含む冷凍乾
燥試料中でＳＤＳ電気泳動により定量分析した。実施例
１のようにプロインシュリン３の２０００ｇを塩化シス
テイン水和物と共にインキュベートする。次に正しく連
結されたシスチン架橋を有するプロインシュリン３の１
２６０ｇの含量をＨＰＬＣ分析により全反応混合液中で
測定した。この生成物を実施例１のようにトリプシン５
００mgで処理した。インシュリン４が作成された。この
インシュリン４は式Ｉに対応するもので、式中、Ｙは、
Ｔｈｒ(Ｂ３０)であり、Ｚは、Ａｒｇであり、Ｒ¹は、
Ｐｈｅ(Ｂ１)であり、Ｒ³は、Ａｓｎ(Ａ２１)であり、
そしてＡ２−Ａ２０及びＢ２−Ｂ２９はヒトインシュリ
ンのＡ及びＢ鎖のアミノ酸配列に対応するものである。

【００３１】インシュリン４は配列表の配列番号：１及
び７よりなり、そり等は正しく結合されたシスチン架橋
により互いに連結されていた。得られた溶液（２m³）は
インシュリン誘導体８００ｇを含有し、それを実施例１
のようにＨＰ２０７５kgで処理した。吸着及び脱着後
合体した溶出液はインシュリン４を７０３ｇ含有してい
た（収率８８％）。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：アミノ酸２１個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．２１配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20

【００３３】配列番号：２配列の長さ：アミノ酸３０個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．３０配列 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

【００３４】配列番号：３配列の長さ：アミノ酸３５個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．３５配列 Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 20 25 30 Gln Lys Arg 35

【００３５】配列番号：４配列の長さ：アミノ酸９７個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．９７配列 Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Gly

【００３６】配列番号：５配列の長さ：アミノ酸９６個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．９６配列 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln 35 40 45 His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly 50 55 60 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln 65 70 75 80 Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 90 95

【００３７】配列番号：６配列の長さ：アミノ酸３２個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．３２配列 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg 20 25 30

【００３８】配列番号：７配列の長さ：アミノ酸３１個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．３１配列 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg 20 25 30

【００３９】配列番号：８配列の長さ：アミノ酸５６個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．５６配列 Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55

【００４０】配列番号：９配列の長さ：アミノ酸２１個配列の型：アミノ酸鎖の数：単鎖トポロジー：直鎖状分子型：蛋白質起源：生物名：大腸菌配列の特徴：名称／記号：蛋白質存在位置：１．．２１配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Gly 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ユルゲン・ルートヴイヒドイツ連邦共和国デー−63636ブラハトタール．リングシユトラーセ13 (72)発明者ヴアルター・ザーベルドイツ連邦共和国デー−65520バートカムベルク．ノイガセ４ツエー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の式（Ｉ）【化１】のインシュリンを得る方法であって、Ａ）次の式（II）Ｒ²−Ｒ¹−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ａ２−Ａ20−Ｒ³ （II）の蛋白質を水性媒質１リットル当たり０.０５〜０.３ｇ
の式（II）の蛋白質濃度で、水性媒質中でpH１０〜１１
において少なくとも１つのカオトロピック助剤の存在下
に、式（II）の蛋白質のシステイン残基当たり２〜１０
個のメルカプタンの−ＳＨ基を産生する量のメルカプタ
ンと反応させ、そしてＢ）正しく連結されたシスチン架橋を有する得られる
プロインシュリンをトリプシン、トリプシン様の酵素及
び場合によっては追加的にカルボキシペプチダーゼＢ、
または前述した酵素の混合物と反応させて、正しく連結
されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンを
製造し、Ｃ）このようにして得られた反応生成物を水性媒質１
リットル当たり疎水性吸着樹脂３〜５０ｇとpH４〜７に
おいて処理し、Ｄ）式（Ｉ）の吸着されたインシュリンを含有する吸
着樹脂を分離し、そしてＥ）該吸着樹脂から式（Ｉ）のインシュリンを脱着す
ることよりなる上記式（Ｉ）のインシュリンを得る方
法。ここで、上記した式（Ｉ）及び式（II）において、Ｘはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇからなる群からのアミノ酸残
基、またはｂ) ペプチドのＮ−末端及びカルボキシル末端にアミノ
酸残基ＡｒｇまたはＬｙｓを含有する２〜３５個のアミ
ノ酸残基を有するペプチドであり、Ｙは遺伝子的にコード可能なアミノ酸残基であり、Ｚはａ) Ｌｙｓ及びＡｒｇよりなる群からのアミノ酸残
基、ｂ) ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基Ａｒｇ
またはＬｙｓを含有する２〜３個のアミノ酸残基を有す
るペプチド、またはｃ) ＯＨでありＲ¹はフェニルアラニン残基または共有結合であり、Ｒ²はａ) 水素原子、ｂ) ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群からのアミノ酸残
基、またはｃ) ペプチドのカルボキシル末端にアミノ酸残基Ａｒｇ
またはＬｙｓを含有する２〜４５アミノ酸残基を有する
ペプチドであり、Ｒ³は遺伝子的コード可能なアミノ酸残基、およびヒト
インシュリン、動物インシュリンまたはインシュリン誘
導体のＡ鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２−Ａ２
０、およびヒトインシュリン、動物インシュリンまたは
インシュリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に対応する残
基Ｂ２−Ｂ２９であるものとする。
【請求項２】式（II）の蛋白質を用いる請求項１の方
法。ここで式（II）の式中、Ｘはアミノ酸残基ＡｒｇまたはヒトインシュリンのＣ鎖
のアミノ酸配列を有するペプチドであり、ＹはＡｌａ、ＴｈｒおよびＳｅｒからなる群からのアミ
ノ酸残基であり、Ｒ¹はアミノ酸残基Ｐｈｅであり、Ｒ²はａ) 水素原子、またはｂ) ペプチドのカルボキシル末端にＡｒｇを含有する２
〜２５アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ³はＡｓｎ、ＳｅｒおよびＧｌｙからなる群からなる
アミノ酸残基、およびヒトインシュリンのＡ鎖およびＢ
鎖のアミノ酸配列に対応する残基Ａ２−Ａ20およびＢ２
−Ｂ29であり、そして得られる正しく連結されたシスチ
ン架橋を有する式（Ｉ）のインシュリンは式中のＹ、Ｒ
¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29が前述の定
義を有するものであり、そしてＺはアミノ酸残基Ａｒ
ｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−ＡｒｇまたはＯＨであるもの
とする。
【請求項３】式（II）の蛋白質を用いる請求項１の方
法。ここで式（II）の式中、Ｘはアミノ酸残基Ａｒｇ、または２〜３５アミノ酸残基
を有するペプチド、２個の塩基性アミノ酸残基、特にペ
プチドの初めと末端にＡｒｇおよび／またはＬｙｓを有
するアミノ酸残基であり、Ｙはアミノ酸残基Ｔｈｒであり、Ｒ¹はアミノ酸残基Ｐｈｅであり、Ｒ²はａ) 水素原子、またはｂ) カルボキシル末端がアミノ酸残基Ａｒｇである２〜
１５アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ³はアミノ酸残基ＧｌｙまたはＡｓｎ、およびヒトイ
ンシュリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列に対応する
残基Ａ２−Ａ20およびＢ２−Ｂ29であり、そして得られ
る正しく連結されたシスチン架橋を有する式（Ｉ）のイ
ンシュリンは、式中Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ａ２−Ａ20お
よびＢ２−Ｂ29が前述の定義を有するものであり、そし
てＺはアミノ酸残基Ａｒｇ、ペプチド残基Ａｒｇ−Ａｒ
ｇまたはＬｙｓ−ＬｙｓまたはＯＨであるものとする。
【請求項４】システインまたは塩酸システイン水和物
がメルカプタンとして用いられる請求項１ないし３のい
ずれか１つに記載の方法。
【請求項５】架橋結合したポリスチレン、ポリアクリ
レートまたはポリスチレンとジビニルベンゼンとの共重
合体が疎水性吸着樹脂として用いられる請求項１ないし
４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】式（Ｉ）のインシュリンをイソプロパノ
ールまたはｎ−プロパノールを使用して吸着樹脂から脱
着する請求項１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】０.０１〜０.１Ｍの塩が製造段階Ｃ）に
おいて加えられる請求項１ないし６のいずれか１つに記
載の方法。
【請求項８】請求項１ないし７のいずれか１つに記載
の方法で得られた式（Ｉ）のインシュリン。