JPH07267997A - ＩｇＧ− モノクロナール抗体の精製方法及びその使用方法 - Google Patents
ＩｇＧ− モノクロナール抗体の精製方法及びその使用方法Info
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- JPH07267997A JPH07267997A JP4145807A JP14580792A JPH07267997A JP H07267997 A JPH07267997 A JP H07267997A JP 4145807 A JP4145807 A JP 4145807A JP 14580792 A JP14580792 A JP 14580792A JP H07267997 A JPH07267997 A JP H07267997A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＩｇＧ- モノクロナール抗体の精製方法及び
その使用方法 【構成】 本発明は、ＩｇＧ- モノクロナール抗体を３
つのクロマトグラフィー工程の組合せ、すなわちアニオ
ン交換体、カチオン交換体及び特異的滅菌- 工程を有す
る疎水性相で精製する方法であり、その際少なくとも９
９．５％の純度を有する抗体- 溶液が得られ、これを用
いて免疫治療で静脈内投与できる。
その使用方法 【構成】 本発明は、ＩｇＧ- モノクロナール抗体を３
つのクロマトグラフィー工程の組合せ、すなわちアニオ
ン交換体、カチオン交換体及び特異的滅菌- 工程を有す
る疎水性相で精製する方法であり、その際少なくとも９
９．５％の純度を有する抗体- 溶液が得られ、これを用
いて免疫治療で静脈内投与できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＧ- モノクロナー
ル抗体の、特許請求の範囲に記載した精製方法並びにこ
れを、特に免疫治療での静脈内投与に使用する方法に関
する。
ル抗体の、特許請求の範囲に記載した精製方法並びにこ
れを、特に免疫治療での静脈内投与に使用する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ
細胞から産生され、診断及び分析の範囲で並びに治療剤
として著しく使用されている。
細胞から産生され、診断及び分析の範囲で並びに治療剤
として著しく使用されている。
【０００３】抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、通
常生体内で腹水腫瘍として又は試験管内で栄養培地中で
増殖する。この方法で得られた抗体- 含有溶液は、腹水
液体及び培地の成分で汚染される。
常生体内で腹水腫瘍として又は試験管内で栄養培地中で
増殖する。この方法で得られた抗体- 含有溶液は、腹水
液体及び培地の成分で汚染される。
【０００４】治療上の使用で、特にモノクロナール抗体
の高純度が必要なので、精製方法が極めて重要となる。
ハイブリドーマ細胞の生体内増加で、収得すべき腹水腫
瘍の量が制限されるので、モノクロナール抗体の限定さ
れた量しか得ることができない。更に、モノクロナール
抗体は、特にたん白と可能な限り宿主微生物のウィルス
で汚染される。これによって効果的な精製法が要求され
る。
の高純度が必要なので、精製方法が極めて重要となる。
ハイブリドーマ細胞の生体内増加で、収得すべき腹水腫
瘍の量が制限されるので、モノクロナール抗体の限定さ
れた量しか得ることができない。更に、モノクロナール
抗体は、特にたん白と可能な限り宿主微生物のウィルス
で汚染される。これによって効果的な精製法が要求され
る。
【０００５】ハイブリドーマ細胞の増殖を試験管内で培
地中で実施する場合、モノクロナール抗体のほぼ任意の
量が生じる。通常培地は増殖因子として異種血清又はそ
の分画を含有する。これは精製工程で完全に再度除去さ
れねばならない。
地中で実施する場合、モノクロナール抗体のほぼ任意の
量が生じる。通常培地は増殖因子として異種血清又はそ
の分画を含有する。これは精製工程で完全に再度除去さ
れねばならない。
【０００６】治療剤としてモノクロナール抗体を使用す
るのに、純度、ＤＮＡ- 含有量、ウィルス安全性及び生
物学的作用に関して特別な要求がある。したがって抗体
製剤に対する精製方法は、ＤＮＡ- 含有が投薬量につき
１０ｐｇより小さく、純度は９９％より大きいことを保
証しなければならない。この方法は可能な限り存在する
ウィルスを少なくとも１２ｌｏｇ１０まで減少させ、生
物学的作用を保つ。
るのに、純度、ＤＮＡ- 含有量、ウィルス安全性及び生
物学的作用に関して特別な要求がある。したがって抗体
製剤に対する精製方法は、ＤＮＡ- 含有が投薬量につき
１０ｐｇより小さく、純度は９９％より大きいことを保
証しなければならない。この方法は可能な限り存在する
ウィルスを少なくとも１２ｌｏｇ１０まで減少させ、生
物学的作用を保つ。
【０００７】モノクロナールＩｇＧ- 抗体のクロマトグ
ラフィー精製法が文献に記載されている。現在使用され
る方法の概要は、サリー(Sally) Ｓ．シーバー、マーセ
ルテッカー、ニューヨーク、バーゼル、１９８７によっ
て編集されたモノクロナール抗体の商業上の製造中に記
載されている。
ラフィー精製法が文献に記載されている。現在使用され
る方法の概要は、サリー(Sally) Ｓ．シーバー、マーセ
ルテッカー、ニューヨーク、バーゼル、１９８７によっ
て編集されたモノクロナール抗体の商業上の製造中に記
載されている。
【０００８】上記文献及びヨーロッパ特許第３１０７１
９号明細書中に、プロテイン- Ａを基体とする親和性培
地を用いるモノクロナールＩｇＧに関する精製方法が記
載されている。しかしプロテイン -Ａ- カラムは、特に
治療上使用されるモノクロナール抗体の精製に使用する
のに不適当であるといういくつかの欠点を有する。親和
性基として使用される微生物性スタフィロコッケン- プ
ロテイン- Ａを、カラム往復で遊離し、注入すべきモノ
クロナール抗体- 溶液を汚染する。
９号明細書中に、プロテイン- Ａを基体とする親和性培
地を用いるモノクロナールＩｇＧに関する精製方法が記
載されている。しかしプロテイン -Ａ- カラムは、特に
治療上使用されるモノクロナール抗体の精製に使用する
のに不適当であるといういくつかの欠点を有する。親和
性基として使用される微生物性スタフィロコッケン- プ
ロテイン- Ａを、カラム往復で遊離し、注入すべきモノ
クロナール抗体- 溶液を汚染する。
【０００９】これはその点では問題となる。というのは
精製すべき培養液上澄みは、たん白質分解酵素で汚染さ
れるからである。この酵素はこのリガンドを分離するか
又は担体から遊離する。
精製すべき培養液上澄みは、たん白質分解酵素で汚染さ
れるからである。この酵素はこのリガンドを分離するか
又は担体から遊離する。
【００１０】結合されたモノクロナール抗体を親和性カ
ラムから溶離することは、低いｐＨ- 値で行われる。こ
の条件下で、特に不安定なモノクロナール抗体がその構
造を変え、しかも変性し、したがってその生物学的作用
を失うという危険がある。
ラムから溶離することは、低いｐＨ- 値で行われる。こ
の条件下で、特に不安定なモノクロナール抗体がその構
造を変え、しかも変性し、したがってその生物学的作用
を失うという危険がある。
【００１１】更に、精製に使用される装置及び材料のす
べて、特にクロマトグラフィー相は滅菌可能であること
と同時にＭＡＫ- 含有溶液は無菌かつ発熱性物質不含で
あることが必要であるので、これらを静脈内に投与しな
ければならない場合、この様な安定性を生じないという
危険がある。というのはプロテイン- Ａは必要な滅菌条
件下でそれ自体変性するからである。
べて、特にクロマトグラフィー相は滅菌可能であること
と同時にＭＡＫ- 含有溶液は無菌かつ発熱性物質不含で
あることが必要であるので、これらを静脈内に投与しな
ければならない場合、この様な安定性を生じないという
危険がある。というのはプロテイン- Ａは必要な滅菌条
件下でそれ自体変性するからである。
【００１２】ヨーロッパ特許公開第０１４４０２８号公
報及び米国特許第４７４６１８３号明細書中に、同様に
特異的に変性されたシリカゲルを用いる又はヒドロキシ
ルアパタイト並びにプロテインＡの使用下で、ＭＡＫの
精製のためのクロマトグラフィー方法が記載されてい
る。しかしこの際得られる純度（約９０％、ヨーロッパ
特許公開第０１４４０２８号公報参照）は治療上、特に
静脈内使用に対するＭＡＫ' ｓの品質要求を満足させる
には不十分である。更に、選ばれたクロマトグラフィー
材料は、極めて敏感で、高価である。
報及び米国特許第４７４６１８３号明細書中に、同様に
特異的に変性されたシリカゲルを用いる又はヒドロキシ
ルアパタイト並びにプロテインＡの使用下で、ＭＡＫの
精製のためのクロマトグラフィー方法が記載されてい
る。しかしこの際得られる純度（約９０％、ヨーロッパ
特許公開第０１４４０２８号公報参照）は治療上、特に
静脈内使用に対するＭＡＫ' ｓの品質要求を満足させる
には不十分である。更に、選ばれたクロマトグラフィー
材料は、極めて敏感で、高価である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、ＩｇＧ- モノクロナール抗体の精製方法を提供する
ことを課題とし、これによって確実にかつ経済的に高純
度抗体- 溶液が得られ、これは特に免疫治療で静脈内投
与に適する。
は、ＩｇＧ- モノクロナール抗体の精製方法を提供する
ことを課題とし、これによって確実にかつ経済的に高純
度抗体- 溶液が得られ、これは特に免疫治療で静脈内投
与に適する。
【００１４】
【問題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
れば、３つのクロマドグラフィー工程──アニオン交換
体、カチオン交換体及び疎水性相──を、特異的な滅菌
工程と共に夫々適する条件下に組合せることによって解
決される。この際、──安価かつ簡単に使用できる材料
の使用下──少なくとも９９．５％の純度を有する抗体
- 溶液が得られ、したがってこれは静脈内投与可能であ
る。
れば、３つのクロマドグラフィー工程──アニオン交換
体、カチオン交換体及び疎水性相──を、特異的な滅菌
工程と共に夫々適する条件下に組合せることによって解
決される。この際、──安価かつ簡単に使用できる材料
の使用下──少なくとも９９．５％の純度を有する抗体
- 溶液が得られ、したがってこれは静脈内投与可能であ
る。
【００１５】本発明によれば、先ずアニオン交換体クロ
マトグラフィーで開始し、次いで滅菌、カチオン交換体
クロマトグラフィー、次いで疎水性相の精製を続ける。
しかし場合により精製を先ずカチオン交換体で開始し、
次いで滅菌し、次いでアニオン交換体及び疎水性相の精
製を実施するのも有利である。その際夫々次に記載する
条件を選択する。
マトグラフィーで開始し、次いで滅菌、カチオン交換体
クロマトグラフィー、次いで疎水性相の精製を続ける。
しかし場合により精製を先ずカチオン交換体で開始し、
次いで滅菌し、次いでアニオン交換体及び疎水性相の精
製を実施するのも有利である。その際夫々次に記載する
条件を選択する。
【００１６】このことに無関係に、驚くべきことに本発
明者は、上記処理工程の組合せによってウィルス不活性
化が行われることを見い出した。たとえばこれは従来ク
ロマトグラフィー工程を基体とする公知方法で得ること
ができないことである。
明者は、上記処理工程の組合せによってウィルス不活性
化が行われることを見い出した。たとえばこれは従来ク
ロマトグラフィー工程を基体とする公知方法で得ること
ができないことである。
【００１７】本発明によれば、ＩｇＧ- ＭＡＫ、好まし
くはそのサブクラスＩｇＧ1 ，ＩｇＧ2 ，ＩｇＧ3 及び
ＩｇＧ4 が適し、この際これはヒト又は動物の、特にマ
ウス又はヒト- マウス走源であるのが好ましい。
くはそのサブクラスＩｇＧ1 ，ＩｇＧ2 ，ＩｇＧ3 及び
ＩｇＧ4 が適し、この際これはヒト又は動物の、特にマ
ウス又はヒト- マウス走源であるのが好ましい。
【００１８】その際抗体- 含有溶液として記載の腹水液
体を使用することができる。しかし血清不含又は限定さ
れた培地を、ハイブリドーマ細胞又はエブスタイン- バ
ーレ- ウィルス- 細胞（ＥＤＶ- 細胞）の培養から使用
する。
体を使用することができる。しかし血清不含又は限定さ
れた培地を、ハイブリドーマ細胞又はエブスタイン- バ
ーレ- ウィルス- 細胞（ＥＤＶ- 細胞）の培養から使用
する。
【００１９】これから得られるＭＡＫ- 含有溶液は、不
純物としてまたハイブリドーマの細胞たん白及びＤＮＡ
並びに培地に添加された増殖因子、たとえばヒトトラン
スフエリン及びリピド錯体化されたたん白、たとえばア
ルブミンを含有する。更に溶液は、ウィルスで汚染さ
れ、細胞増殖に不可欠な物質、たとえば塩、アミノ酸、
ビタミン及びリピドを含有する。
純物としてまたハイブリドーマの細胞たん白及びＤＮＡ
並びに培地に添加された増殖因子、たとえばヒトトラン
スフエリン及びリピド錯体化されたたん白、たとえばア
ルブミンを含有する。更に溶液は、ウィルスで汚染さ
れ、細胞増殖に不可欠な物質、たとえば塩、アミノ酸、
ビタミン及びリピドを含有する。
【００２０】本発明によれば、出発溶液を、３つのクロ
マトグラフィー工程にゆだね、その後低分子物質を５−
５００００ダルトンの除外限界を有する膜で透析濾過し
て除く。この際５- ないし１０- 倍容量と交換する。そ
の後先ずアニオン交換体クロマトグラフィー分離を行う
のが好ましい。使用される緩衝溶液──好ましくは５〜
５０ｍｍｏｌ／ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン
０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ食塩、ｐＨ６−８──を、モ
ノクロナール抗体がアニオン交換体と結合する様に選
ぶ。
マトグラフィー工程にゆだね、その後低分子物質を５−
５００００ダルトンの除外限界を有する膜で透析濾過し
て除く。この際５- ないし１０- 倍容量と交換する。そ
の後先ずアニオン交換体クロマトグラフィー分離を行う
のが好ましい。使用される緩衝溶液──好ましくは５〜
５０ｍｍｏｌ／ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン
０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ食塩、ｐＨ６−８──を、モ
ノクロナール抗体がアニオン交換体と結合する様に選
ぶ。
【００２１】アニオン交換体として、市場で得られるク
ロマトグラフィー相、特にＱ- セフアロース、ＱＭＡ-
アクセル、ＤＥＡＥ- トリスアクリル、ＤＥＡＥ- スフ
エロシル、Ｑ- スフエロテックス及びＤＥＡＥ- フラク
トゲルを使用することができる。Ｑ- セフアロース及び
特にＱＭＡ- アクセルを使用するのが好ましい。
ロマトグラフィー相、特にＱ- セフアロース、ＱＭＡ-
アクセル、ＤＥＡＥ- トリスアクリル、ＤＥＡＥ- スフ
エロシル、Ｑ- スフエロテックス及びＤＥＡＥ- フラク
トゲルを使用することができる。Ｑ- セフアロース及び
特にＱＭＡ- アクセルを使用するのが好ましい。
【００２２】モノクロナールＩｇＧ- 抗体で負荷された
アニオン交換体カラムを、次いでＵＶ- シグナルが出発
値に再び達するまでの間緩衝液で洗浄する。その際すべ
ての塩基性たん白を分離する。次いでモノクロナールＩ
ｇＧ- 抗体の溶離は、適当な緩衝液、特に組成がｐＨ
６．０〜８．０で５−５０ｍｍｏｌ／ｌトリスヒドロキ
シメチルアミノメタン、１００−３００ｍｍｏｌ／ｌ食
塩である緩衝液を用いて行われる。
アニオン交換体カラムを、次いでＵＶ- シグナルが出発
値に再び達するまでの間緩衝液で洗浄する。その際すべ
ての塩基性たん白を分離する。次いでモノクロナールＩ
ｇＧ- 抗体の溶離は、適当な緩衝液、特に組成がｐＨ
６．０〜８．０で５−５０ｍｍｏｌ／ｌトリスヒドロキ
シメチルアミノメタン、１００−３００ｍｍｏｌ／ｌ食
塩である緩衝液を用いて行われる。
【００２３】次いで予め精製されたモノクロナールＩｇ
Ｇ- 分画を、透析濾過又はゲル濾過によって、酢酸ナト
リウム５〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、塩化ナトリウム０−１０
０ｍｍｏｌ／ｌ及びｐＨ- 値６．０〜８．０の塩濃度に
緩衝する。たん白濃度は、０．５〜２％である。その際
このことに関して再度通常の膜又はゲルを使用する。
Ｇ- 分画を、透析濾過又はゲル濾過によって、酢酸ナト
リウム５〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、塩化ナトリウム０−１０
０ｍｍｏｌ／ｌ及びｐＨ- 値６．０〜８．０の塩濃度に
緩衝する。たん白濃度は、０．５〜２％である。その際
このことに関して再度通常の膜又はゲルを使用する。
【００２４】出発材料はハイブリドーマ系統の起源に応
じて、ヒト病原体ウィルスで汚染されうるので、この最
初のクロマトグラフィー工程後、次いで特異的滅菌を行
う。このことに特にβ- プロピオラクトン、ＴＮＢＰ
（トリ -ｎ- ブチルホスフアート）／トウィーン、ＴＮ
ＢＰ／ナトリウムクロラート、ＴＮＢＰを用いて、場合
によりＵＶ- 照射と組合せて処理を行うことができる。
じて、ヒト病原体ウィルスで汚染されうるので、この最
初のクロマトグラフィー工程後、次いで特異的滅菌を行
う。このことに特にβ- プロピオラクトン、ＴＮＢＰ
（トリ -ｎ- ブチルホスフアート）／トウィーン、ＴＮ
ＢＰ／ナトリウムクロラート、ＴＮＢＰを用いて、場合
によりＵＶ- 照射と組合せて処理を行うことができる。
【００２５】その際β- プロピオラクトンを、０．０２
〜０．１％の量で、ＴＮＢＰを０．１〜１％の量で、場
合により０．１〜１％ナトリウムクロラートと組合せて
使用し、溶液を室温で約８〜２０時間、通常の条件下で
選択的にＵＶ- 照射して処理する。
〜０．１％の量で、ＴＮＢＰを０．１〜１％の量で、場
合により０．１〜１％ナトリウムクロラートと組合せて
使用し、溶液を室温で約８〜２０時間、通常の条件下で
選択的にＵＶ- 照射して処理する。
【００２６】特に好ましくは、ウィルス不活性化を０．
１〜１％ＴＮＢＰ及び０．５〜２％トウィーンで５〜４
０℃、特に２０〜３０℃で、８〜２０時間かけて行う。
その後溶液を０．０５〜１％たん白に希釈し、ｐＨ- 値
を４．５〜７に調整する。この条件下、モノクロナール
ＩｇＧ- 抗体が、次のクロマトグラフィー工程でカチオ
ン交換体と結合する。
１〜１％ＴＮＢＰ及び０．５〜２％トウィーンで５〜４
０℃、特に２０〜３０℃で、８〜２０時間かけて行う。
その後溶液を０．０５〜１％たん白に希釈し、ｐＨ- 値
を４．５〜７に調整する。この条件下、モノクロナール
ＩｇＧ- 抗体が、次のクロマトグラフィー工程でカチオ
ン交換体と結合する。
【００２７】出発材料に応じて、カチオン交換体工程を
先ず──したがって滅菌前に──実施するのが有利であ
る。この際その時このことに関して記載された条件を選
択し、次いでウィルス不活性化された溶液を、ＭＡＫが
その時使用されるアニオン交換体と結合する様に調整す
る。
先ず──したがって滅菌前に──実施するのが有利であ
る。この際その時このことに関して記載された条件を選
択し、次いでウィルス不活性化された溶液を、ＭＡＫが
その時使用されるアニオン交換体と結合する様に調整す
る。
【００２８】カチオン交換体として、市場で得られるク
ロマトグラフィー相、特にＳ- セフアロース、ＣＭ- ア
クセル、ＣＭ- トリスアクリル、ＳＰ- トリスアクリ
ル、ＳＰ- スフエロデックス及びＳＰ- フラクトゲル、
好ましくはＳ- セフアロース、及び特にＣＭ- アクセル
を使用する。
ロマトグラフィー相、特にＳ- セフアロース、ＣＭ- ア
クセル、ＣＭ- トリスアクリル、ＳＰ- トリスアクリ
ル、ＳＰ- スフエロデックス及びＳＰ- フラクトゲル、
好ましくはＳ- セフアロース、及び特にＣＭ- アクセル
を使用する。
【００２９】この工程で、すべての酸性たん白及び好ま
しくはウィルス不活性剤として使用されるＴＮＢＰ／ト
ウィーンを除去する。結合された抗体を適する緩衝液で
溶離する。その液は１０〜４０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリ
ウム及び５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムをｐ
Ｈ４．５〜９．０で含有する。
しくはウィルス不活性剤として使用されるＴＮＢＰ／ト
ウィーンを除去する。結合された抗体を適する緩衝液で
溶離する。その液は１０〜４０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリ
ウム及び５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムをｐ
Ｈ４．５〜９．０で含有する。
【００３０】この処理工程で、アニオン交換体を使用す
る場合、滅菌剤をそこで除去する。この条件下で溶離さ
れたモノクロナール抗体を、透析濾過又はゲル濾過によ
って５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌリン酸水素二カリウムの
塩濃度に及びｐＨ- 値５．０〜８．０に緩衝する。
る場合、滅菌剤をそこで除去する。この条件下で溶離さ
れたモノクロナール抗体を、透析濾過又はゲル濾過によ
って５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌリン酸水素二カリウムの
塩濃度に及びｐＨ- 値５．０〜８．０に緩衝する。
【００３１】次いでクロマトグラフィー分離を疎水性相
で行う。本発明による方法でこの最後の精製工程の前
に、溶液の塩濃度を使用されるクロマトグラフィー相に
応じて１．１〜１．５Ｍ／ｌの値に、固形の硫酸アンモ
ニウムを用いて調整する。
で行う。本発明による方法でこの最後の精製工程の前
に、溶液の塩濃度を使用されるクロマトグラフィー相に
応じて１．１〜１．５Ｍ／ｌの値に、固形の硫酸アンモ
ニウムを用いて調整する。
【００３２】疎水性相と結合するモノクロナールＩｇＧ
- 抗体の溶液は、適当なカラムの激しい洗浄後溶離緩衝
液──その硫酸アンモニウム- 濃度は０．７〜１．１Ｍ
／ｌである──によってｐＨ- 値５〜８で行われる。
- 抗体の溶液は、適当なカラムの激しい洗浄後溶離緩衝
液──その硫酸アンモニウム- 濃度は０．７〜１．１Ｍ
／ｌである──によってｐＨ- 値５〜８で行われる。
【００３３】疎水性クロマトグラフィー相として、市場
で得られる材料、たとえばポリプロピル- Ａ、ポリメチ
ル- Ａ、ポリエチル- Ａ、アルキル- セフアロース及び
ブチル- セフアロースを使用することができる。ポリプ
ロピル- Ａを使用するのが好ましい。この場合、相を
１．３−１．４Ｍ／ｌに硫酸アンモニウムで、ｐＨ- 値
を７に調整する。溶離緩衝液として、０．１Ｍ／ｌ（Ｎ
Ｈ4)2 ＳＯ4 を有する０．１モルＫ2 ＨＰＯ4-溶液が適
する。
で得られる材料、たとえばポリプロピル- Ａ、ポリメチ
ル- Ａ、ポリエチル- Ａ、アルキル- セフアロース及び
ブチル- セフアロースを使用することができる。ポリプ
ロピル- Ａを使用するのが好ましい。この場合、相を
１．３−１．４Ｍ／ｌに硫酸アンモニウムで、ｐＨ- 値
を７に調整する。溶離緩衝液として、０．１Ｍ／ｌ（Ｎ
Ｈ4)2 ＳＯ4 を有する０．１モルＫ2 ＨＰＯ4-溶液が適
する。
【００３４】この最後の精製工程で、培養液中に得られ
るトランスフエリン及びモノクロナール抗体の様な通常
の等電点を有する他のたん白汚染物を完全に分離するこ
とができる。
るトランスフエリン及びモノクロナール抗体の様な通常
の等電点を有する他のたん白汚染物を完全に分離するこ
とができる。
【００３５】得られた高純度抗体- 分画を、公知方法に
よって生態学的に相容な条件に緩衝し、滅菌濾過し、ビ
ンに詰める。本発明による方法のすべてのクロマトグラ
フィー工程を、同一の方法に従って実施する。先ず抗体
の結合、次いで激しい洗滌工程、段階的勾配で溶離を行
う。この方法は、直線状勾配での通常適用される溶離に
比して、夫々使用されるクロマトグラフィー相の容量を
完全に使い果たすことができる利点を有する。それによ
って多量のモノクロナールＩｇＧ- 抗体を短時間で経済
的に精製することができる。
よって生態学的に相容な条件に緩衝し、滅菌濾過し、ビ
ンに詰める。本発明による方法のすべてのクロマトグラ
フィー工程を、同一の方法に従って実施する。先ず抗体
の結合、次いで激しい洗滌工程、段階的勾配で溶離を行
う。この方法は、直線状勾配での通常適用される溶離に
比して、夫々使用されるクロマトグラフィー相の容量を
完全に使い果たすことができる利点を有する。それによ
って多量のモノクロナールＩｇＧ- 抗体を短時間で経済
的に精製することができる。
【００３６】使用されるクロマトグラフィー相に応じ
て、クロマトグラフィー工程を、常圧- 又は高圧液体ク
ロマトグラフィーとして実施することができる。有効性
及び速度の理由から、ＨＰＬＣ- 法が好ましい。
て、クロマトグラフィー工程を、常圧- 又は高圧液体ク
ロマトグラフィーとして実施することができる。有効性
及び速度の理由から、ＨＰＬＣ- 法が好ましい。
【００３７】純度、ＤＮＡ- 含有量、ウィルス減少及び
生物学的作用に関する本発明による方法の高価は、次の
実験によって認められる：分析クロマトグラフィー法
（排除 (Ausschluβ) クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフ
ィー）を用いて例１に従って製造された生成物に於て、
全く不純物が認められなかった。
生物学的作用に関する本発明による方法の高価は、次の
実験によって認められる：分析クロマトグラフィー法
（排除 (Ausschluβ) クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフ
ィー）を用いて例１に従って製造された生成物に於て、
全く不純物が認められなかった。
【００３８】ＳＤＳ- 電気泳動で、２つのバンドが分
る。これらはＩｇＧ- 分子の軽い及び重い鎖を類別す
る。等電点電気泳動で、多くのバンドが認められ、これ
はウエスタンブロット法によって示される様に、抗体の
微小不均一性を調べることができる。
る。これらはＩｇＧ- 分子の軽い及び重い鎖を類別す
る。等電点電気泳動で、多くのバンドが認められ、これ
はウエスタンブロット法によって示される様に、抗体の
微小不均一性を調べることができる。
【００３９】したがってこの処理は、種々の分析法の検
出限界の考慮下に、少なくとも９９．５％の純度を有す
る生成物を生じる。ＤＮＡ- 除去に関する精製法の有効
性を、放射性- 標識されたＤＮＡを用いて調べる。
出限界の考慮下に、少なくとも９９．５％の純度を有す
る生成物を生じる。ＤＮＡ- 除去に関する精製法の有効
性を、放射性- 標識されたＤＮＡを用いて調べる。
【００４０】夫々個々のクロマトグラフィー工程に対す
る減少因子は、抗体分画中のＤＮＡ- 含有量に対する標
識されたＤＮＡの記載量の商から得られる。全体の減少
が個々の工程の対数付加によって得られる。
る減少因子は、抗体分画中のＤＮＡ- 含有量に対する標
識されたＤＮＡの記載量の商から得られる。全体の減少
が個々の工程の対数付加によって得られる。
【００４１】この試験の結果を、表Ｉ中にまとめて示
す。 表 Ｉ クロマトグラフィー相 減少因子 例１によるアニオン交換体 ２．５×１０2 例１によるカチオン交換体 ６×１０0 例１による疎水性相 ２．５８×１０2 全還元 ３．５×１０5 このことから明らかな様に、ＤＮＡ- 含有量の有効な減
少に、少なくとも２個の異なるクロマトグラフィー工程
が不可欠である。しかし本発明による方法で最終生成物
中のＤＮＡ- 含有量──これは必要とされる１０ｐｇ／
投薬量以下である──が得られる。このことは全減少因
子を明らかに示す。
す。 表 Ｉ クロマトグラフィー相 減少因子 例１によるアニオン交換体 ２．５×１０2 例１によるカチオン交換体 ６×１０0 例１による疎水性相 ２．５８×１０2 全還元 ３．５×１０5 このことから明らかな様に、ＤＮＡ- 含有量の有効な減
少に、少なくとも２個の異なるクロマトグラフィー工程
が不可欠である。しかし本発明による方法で最終生成物
中のＤＮＡ- 含有量──これは必要とされる１０ｐｇ／
投薬量以下である──が得られる。このことは全減少因
子を明らかに示す。
【００４２】本発明による方法でウィルス減少に関して
モデルウィルスを用いる実験を、夫々個々の処理工程に
関して実施する。試験のために、４つの異なるテストウ
ィルスを使用する。これらはリピド- 、たん白- 、ＤＮ
Ａ- 及びＤＮＡ- ウィルスに対するモデルとして使用す
る。
モデルウィルスを用いる実験を、夫々個々の処理工程に
関して実施する。試験のために、４つの異なるテストウ
ィルスを使用する。これらはリピド- 、たん白- 、ＤＮ
Ａ- 及びＤＮＡ- ウィルスに対するモデルとして使用す
る。
【００４３】その際マウスＩｇＧ- モノクロナール抗体
を、本発明による方法に従って例１に於ける様に精製す
る。治療用投与のためのモノクロナールＩｇＧ- 抗体の
製造方法は、すべて４つのウィルスに対して夫々少なく
とも１２ｌｏｇ- 段階の減少割合を生じなければならな
い。
を、本発明による方法に従って例１に於ける様に精製す
る。治療用投与のためのモノクロナールＩｇＧ- 抗体の
製造方法は、すべて４つのウィルスに対して夫々少なく
とも１２ｌｏｇ- 段階の減少割合を生じなければならな
い。
【００４４】記載した試験の結果を、表ＩＩ中に示す： 表 ＩＩ 工程 パラインフル レオウィルス シンドビス マウス- ロイケミ エンザ タイプ３ - ウィルス エウィルス タイプ３ SV 40 (MuLV-Mov-3) アニオン交換体 >7.9×104 3.7 1.9×102 2.6×105 滅菌（TNBP/ トウィーン) >9.0×103 1.2×101 3.5×102 >5.7×106 カチオン交換体 >7.1×104 3.7×105 4.8×104 2.3×105 疎水性クロマト グラフィー相 >8.7×103 4.3×105 8.2×102 5.6×104 全減少 >4.4×1017 7.1×1012 2.6×1012 >1.9×1022 表ＩＩから、必要な減少割合が本発明による方法で得ら
れる、すなわち３つのクロマトグラフィー工程がこれに
不可欠であることが明白である。というのは従来文献中
に記載されている様に唯一工程で、必要な減少は得られ
ないからである。
れる、すなわち３つのクロマトグラフィー工程がこれに
不可欠であることが明白である。というのは従来文献中
に記載されている様に唯一工程で、必要な減少は得られ
ないからである。
【００４５】したがって本発明に従う処理工程の組合せ
は、モノクロナールＩｇＧ- 生成物を生じ、これは静脈
内投与に対するすべての要求を、考慮しその生物学的活
性が完全に得られる。
は、モノクロナールＩｇＧ- 生成物を生じ、これは静脈
内投与に対するすべての要求を、考慮しその生物学的活
性が完全に得られる。
【００４６】生成物は、少なくとも９９．５％の純度を
有し、免疫治療で、たとえば移植の際の拒絶反応で、リ
ーサス- 予防又はウィルス疾患（たとえばＣＭＶ、肝
炎）で静脈内に使用することができる。
有し、免疫治療で、たとえば移植の際の拒絶反応で、リ
ーサス- 予防又はウィルス疾患（たとえばＣＭＶ、肝
炎）で静脈内に使用することができる。
【００４７】更にこの生成物を常法で免疫診断にも使用
することができる。処理に使用されるクロマトグラフィ
ー材料は、安価で、容易に入手され、有利に除かれる。
それによって価格上有利にかつ経済的に高純度のＩｇＧ
- ＭＡＫ'ｓを多量に製造することができる。この際驚
くべきことに最も進歩したウィルス不活性化が行われ
る。
することができる。処理に使用されるクロマトグラフィ
ー材料は、安価で、容易に入手され、有利に除かれる。
それによって価格上有利にかつ経済的に高純度のＩｇＧ
- ＭＡＫ'ｓを多量に製造することができる。この際驚
くべきことに最も進歩したウィルス不活性化が行われ
る。
【００４８】
【実施例】本発明を、次の例によって説明する。 〔例１〕ヒト- インターロイキン -２- レセプターに対
するモノクロナールＩｇＧ1-抗体を産生する、マウスハ
イブリドーマ細胞- 径を、血清の少ない培地で培養す
る。細胞不含培養液上澄み５１８ｌを、０．０２２Ｍ／
ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）ｐＨ
７．５で透析濾過し、３１ｌの容量に濃縮する。この溶
液中のＩｇＧ- 含有量は、１．７５ｍｇ／ｍｌである。
するモノクロナールＩｇＧ1-抗体を産生する、マウスハ
イブリドーマ細胞- 径を、血清の少ない培地で培養す
る。細胞不含培養液上澄み５１８ｌを、０．０２２Ｍ／
ｌトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）ｐＨ
７．５で透析濾過し、３１ｌの容量に濃縮する。この溶
液中のＩｇＧ- 含有量は、１．７５ｍｇ／ｍｌである。
【００４９】最初のクロマトグラフィー工程は、５ｌＱ
- セフアロースで急速流動的に充填し、０．０２２ｍ／
ｌトリス、ｐＨ７．５で平衡されているカラムで行う。
緩衝された溶液をカラムに装填し、この際この条件下に
抗体がアニオン交換体と結合する。同一緩衝液５０ｌで
洗浄し、次いで０．０２２Ｍ／ｌトリス、０．１５Ｍ／
ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．５で抗体を溶離する。
- セフアロースで急速流動的に充填し、０．０２２ｍ／
ｌトリス、ｐＨ７．５で平衡されているカラムで行う。
緩衝された溶液をカラムに装填し、この際この条件下に
抗体がアニオン交換体と結合する。同一緩衝液５０ｌで
洗浄し、次いで０．０２２Ｍ／ｌトリス、０．１５Ｍ／
ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．５で抗体を溶離する。
【００５０】残存たん白を、０．０２２Ｍ／ｌトリス、
０．６Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶離する。モノク
ロナール抗体を含有する、集められた抗体を０．０２０
Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０で透析濾過し、たん
白濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２μフィルターを
介して滅菌濾過する。
０．６Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶離する。モノク
ロナール抗体を含有する、集められた抗体を０．０２０
Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０で透析濾過し、たん
白濃度１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２μフィルターを
介して滅菌濾過する。
【００５１】処理された溶液４．４６ｌを、２５℃でＴ
ＮＢＰを用いて０．３％の濃度に、トウィーン８０で１
％の濃度に調整して、１６時間撹拌する。０．０２２Ｍ
／ｌ酢酸ナトリウム- 溶液、ｐＨ７．０、１７．５ｌを
用いてＩｇＧ- 濃度２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ｐＨ- 値を
０．１Ｍ酢酸でｐＨ５．５に調整する。
ＮＢＰを用いて０．３％の濃度に、トウィーン８０で１
％の濃度に調整して、１６時間撹拌する。０．０２２Ｍ
／ｌ酢酸ナトリウム- 溶液、ｐＨ７．０、１７．５ｌを
用いてＩｇＧ- 濃度２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ｐＨ- 値を
０．１Ｍ酢酸でｐＨ５．５に調整する。
【００５２】この溶液を、５ｌＳ- セフアロースで急速
流動的に充填され、０．０２２Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、
ｐＨ５．５で平衡されたカラムでクロマトグラフィー分
離し、この際この条件下で抗体をクロマトグラフィー相
に結合させる。
流動的に充填され、０．０２２Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、
ｐＨ５．５で平衡されたカラムでクロマトグラフィー分
離し、この際この条件下で抗体をクロマトグラフィー相
に結合させる。
【００５３】滅菌剤の除去及び酸性たん白の除去のため
に、５０ｌ緩衝液で洗浄する。抗体含有分画が、０．０
２２Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０７Ｍ／ｌＮａＣｌ、
ｐＨ８．５を含有する緩衝液で溶離することによって得
られる。
に、５０ｌ緩衝液で洗浄する。抗体含有分画が、０．０
２２Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０７Ｍ／ｌＮａＣｌ、
ｐＨ８．５を含有する緩衝液で溶離することによって得
られる。
【００５４】ｐＨ- 値を７．０に修正後新たに変換溶液
として０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．０で透析濾
過し、滅菌濾過する。ポリプロピル- Ａで第三クロマト
グラフィー工程を実施する前に、最終濃度１．３Ｍ／ｌ
が得られるまで固体の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を加える。７．
０にｐＨ- 修正及び滅菌濾過が行われる。
として０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．０で透析濾
過し、滅菌濾過する。ポリプロピル- Ａで第三クロマト
グラフィー工程を実施する前に、最終濃度１．３Ｍ／ｌ
が得られるまで固体の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を加える。７．
０にｐＨ- 修正及び滅菌濾過が行われる。
【００５５】ポリプロピル- Ａ４００ｍｌで充填され、
０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、１．３Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０で平衡されたＨＰＬＣ- カラムで、溶
液を３．４ｌの割合でクロマトグラフィー分離する。
０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、１．３Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０で平衡されたＨＰＬＣ- カラムで、溶
液を３．４ｌの割合でクロマトグラフィー分離する。
【００５６】汚染しうるたん白を、特にトランスフエリ
ンを分離するために、ＵＶ- シグナルがベースラインに
達するまで緩衝液４ｌで洗浄する。溶離は、０．１Ｍ／
ｌＫ 2 ＨＰＯ4 ／０．１Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、ｐＨ
７．０から成る緩衝液を用いて行われる。
ンを分離するために、ＵＶ- シグナルがベースラインに
達するまで緩衝液４ｌで洗浄する。溶離は、０．１Ｍ／
ｌＫ 2 ＨＰＯ4 ／０．１Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、ｐＨ
７．０から成る緩衝液を用いて行われる。
【００５７】集められた抗体分画を０．４５％ＮａＣｌ
で透析濾過し、固体グリシンで０．１５Ｍ／ｌグリシン
に調整し、抗体濃度を１．１ｍｇ／ｍｌに調整し、滅菌
濾過する。
で透析濾過し、固体グリシンで０．１５Ｍ／ｌグリシン
に調整し、抗体濃度を１．１ｍｇ／ｍｌに調整し、滅菌
濾過する。
【００５８】モノクロナールＩｇＧ- 抗体溶液は、次の
性質を有する： 収率（％） ７４．６ ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ） １．３ たん白（ｍｇ／ｍｌ） １．２６ 発熱性物質試験 検出されず 滅菌度 〃 ＳＤＳ- ゲル（％） ＞９８ 異常 毒性 検出されず ＨＰＳＥＣ（％） １００ ＤＮＡ（ｐｇ／ｍｌ） ０．８８ 生物学的活性 １．２５ （５０％コンＡ- ブラステン阻止） マイコプラズマ − リピド − 〔例２〕マウスハイブリドーマ系から産生された、ヒト
インターロイキン- ６に対するモノクロナールＩｇＧ-
１- 抗体を含有する、細胞不含培養液上澄み１．６４ｌ
を、０．０２０Ｍ／ｌトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン（トリス）及び０．０５Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．
０で透析濾過し、０．９３ｌに濃縮する。この溶液中で
ＩｇＧ- 含有量は、２．３５ｍｇ／ｍｌである。
性質を有する： 収率（％） ７４．６ ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ） １．３ たん白（ｍｇ／ｍｌ） １．２６ 発熱性物質試験 検出されず 滅菌度 〃 ＳＤＳ- ゲル（％） ＞９８ 異常 毒性 検出されず ＨＰＳＥＣ（％） １００ ＤＮＡ（ｐｇ／ｍｌ） ０．８８ 生物学的活性 １．２５ （５０％コンＡ- ブラステン阻止） マイコプラズマ − リピド − 〔例２〕マウスハイブリドーマ系から産生された、ヒト
インターロイキン- ６に対するモノクロナールＩｇＧ-
１- 抗体を含有する、細胞不含培養液上澄み１．６４ｌ
を、０．０２０Ｍ／ｌトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン（トリス）及び０．０５Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．
０で透析濾過し、０．９３ｌに濃縮する。この溶液中で
ＩｇＧ- 含有量は、２．３５ｍｇ／ｍｌである。
【００５９】最初のクロマトグラフィーは、５０ｍｌＱ
ＭＡ- アクセルプラスで充填され、０．０２０Ｍ／ｌト
リス、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡さ
れた鋼製カラムで行われる。
ＭＡ- アクセルプラスで充填され、０．０２０Ｍ／ｌト
リス、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡さ
れた鋼製カラムで行われる。
【００６０】緩衝された溶液を、カラムに装填し、この
際この条件下に抗体をアニオン交換体を結合させる。同
一緩衝液５００ｍｌで洗浄し、次いで０．０２０Ｍ／ｌ
トリス、０．２５Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて
抗体を溶離する。
際この条件下に抗体をアニオン交換体を結合させる。同
一緩衝液５００ｍｌで洗浄し、次いで０．０２０Ｍ／ｌ
トリス、０．２５Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いて
抗体を溶離する。
【００６１】残存するたん白は、０．０２０Ｍ／ｌトリ
ス、０．６Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶離する。モ
ノクロナール抗体を含有する、集められた分画を、０．
０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．０で透析濾過し、１０ｍｇ／ｍｌのたん白
濃度に濃縮し、０．２μ- フィルターで滅菌濾過する。
ス、０．６Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶離する。モ
ノクロナール抗体を含有する、集められた分画を、０．
０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣ
ｌ、ｐＨ７．０で透析濾過し、１０ｍｇ／ｍｌのたん白
濃度に濃縮し、０．２μ- フィルターで滅菌濾過する。
【００６２】得られた溶液１９５ｍｌを、２５℃でＴＮ
ＢＰで０．３％の濃度に、トウィーン８０で１％の濃度
に調整し、１６時間撹拌する。７８０ｍｌ０．０２０Ｍ
／ｌ酢酸ナトリウム、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ
７．０を用いて、ＩｇＧ- 濃度２ＭＧ／ｍｌに希釈し、
ｐＨ- 値を０．１Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調整する。
ＢＰで０．３％の濃度に、トウィーン８０で１％の濃度
に調整し、１６時間撹拌する。７８０ｍｌ０．０２０Ｍ
／ｌ酢酸ナトリウム、０．０５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ
７．０を用いて、ＩｇＧ- 濃度２ＭＧ／ｍｌに希釈し、
ｐＨ- 値を０．１Ｍ酢酸でｐＨ５．０に調整する。
【００６３】この溶液を、ＣＭ- アクセルプラス５０ｍ
ｌで充填し、０．０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０
５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡された鋼カラム
でクロマトグラフィー分離する。この際この条件下で抗
体をクロマトグラフィー相に結合させる。滅菌剤及び酸
性たん白の除去のために緩衝液５００ｍｌで洗浄する。
抗体含有分画が、０．０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、
０．１５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する緩衝
液で溶離して得られる。
ｌで充填し、０．０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、０．０
５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ５．０で平衡された鋼カラム
でクロマトグラフィー分離する。この際この条件下で抗
体をクロマトグラフィー相に結合させる。滅菌剤及び酸
性たん白の除去のために緩衝液５００ｍｌで洗浄する。
抗体含有分画が、０．０２０Ｍ／ｌ酢酸ナトリウム、
０．１５０Ｍ／ｌＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する緩衝
液で溶離して得られる。
【００６４】ｐＨ- 値を７．０に修正した後、変換溶液
として０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．０を用いて
新たに透析濾過し、滅菌濾過する。ポリプロピル- Ａで
第三クロマトグラフィーを実施する前、最終濃度１．４
Ｍ／ｌに達するまで固形（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を加える。
７．０にｐＨ- 修正及び滅菌濾過を行う。
として０．１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．０を用いて
新たに透析濾過し、滅菌濾過する。ポリプロピル- Ａで
第三クロマトグラフィーを実施する前、最終濃度１．４
Ｍ／ｌに達するまで固形（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を加える。
７．０にｐＨ- 修正及び滅菌濾過を行う。
【００６５】ポリプロピル- Ａ５０ｍｌを充填し、０．
１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、１．４Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０で平衡されたＨＰＬＣ- カラムで、溶
液を４８０ｍｌの割合でクロマトグラフィー分離する。
１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 、１．４Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０で平衡されたＨＰＬＣ- カラムで、溶
液を４８０ｍｌの割合でクロマトグラフィー分離する。
【００６６】汚染しうるたん白を、特にトランスフエリ
ンを分離するために、ＵＶ- シグナルがベースラインに
達するまで緩衝液４００ｍｌで洗浄する。溶離は、０．
１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 ／０．１Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０から成る緩衝液を用いて行われる。
ンを分離するために、ＵＶ- シグナルがベースラインに
達するまで緩衝液４００ｍｌで洗浄する。溶離は、０．
１Ｍ／ｌＫ2 ＨＰＯ4 ／０．１Ｍ／ｌ（ＮＨ4)2 Ｓ
Ｏ4 、ｐＨ７．０から成る緩衝液を用いて行われる。
【００６７】集められた抗体分画を０．４５％ＮａＣｌ
で透析濾過し、固体グリシンで０．１５Ｍ／ｌグリシン
に調整し、抗体濃度を１．１ｍｇ／ｍｌに調整し、滅菌
濾過する。
で透析濾過し、固体グリシンで０．１５Ｍ／ｌグリシン
に調整し、抗体濃度を１．１ｍｇ／ｍｌに調整し、滅菌
濾過する。
【００６８】モノクロナールＩｇＧ- 抗体溶液は、次の
性質を有する： 収率（％） ６８ ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ） １．２ たん白（ｍｇ／ｍｌ） １．２２ 発熱性物質試験 検出されず 滅菌 〃 ＳＤＳ- ゲル（％） ＞９８ 異常な毒性 検出されず ＨＰＳＥＣ（％） １００ リピド −
性質を有する： 収率（％） ６８ ＩｇＧ（ｍｇ／ｍｌ） １．２ たん白（ｍｇ／ｍｌ） １．２２ 発熱性物質試験 検出されず 滅菌 〃 ＳＤＳ- ゲル（％） ＞９８ 異常な毒性 検出されず ＨＰＳＥＣ（％） １００ リピド −
【００６９】
【発明の効果】本発明によれば、価格上有利にかつ経済
的に高純度のＩｇＧ- モノクロナール抗体が得られる。
的に高純度のＩｇＧ- モノクロナール抗体が得られる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デトレーフ・ローム ドイツ連邦共和国、ダルムシユタット、ケ ッテンウイーゼンストラーセ、44 (72)発明者 ウルフ・ベートケ ドイツ連邦共和国、レーデルマルク、ゲル ツリッツエル・ストラーセ、16 (72)発明者 ミッヒヤエル・クロフト ドイツ連邦共和国、ダルムシユタット、グ ラインストラーセ、44
Claims (13)
- 【請求項１】 透析された抗体含有出発溶液をアニオン
交換体、カチオン交換体及び疎水性相でクロマトグラフ
ィー分離し、この際モノクロナール抗体は夫々のクロマ
トグラフィー相と結合し、これを次いで洗滌し、段階的
勾配で溶離し、モノクロナール抗体は付加的に特異的な
滅菌工程にゆだねることを特徴とする、ＩｇＧ- モノク
ロナール抗体の精製方法。 - 【請求項２】 出発溶液を先ずアニオン交換体クロマト
グラフィー分離し、次いで滅菌にゆだね、次いでカチオ
ン交換体、次いで疎水性相でクロマトグラフィー分離す
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 出発溶液を、先ずカチオン交換体でクロ
マトグラフィー分離し、次いで滅菌し、次いでアニオン
交換体で、次いで疎水性相でクロマトグラフィー分離す
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 出発物質としてＩｇＧ1 ，ＩｇＧ2 ，Ｉ
ｇＧ3 又はＩｇＧ4-含有溶液を使用し、この際ＩｇＧは
ヒト又は動物起源であってよい請求項１ないし３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項５】 出発溶液としてハイブリドーマ細胞又は
ＥＢＶ- 細胞の培養から成る細胞不含培養液上澄みを使
用する、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 アニオン交換体として、Ｑ- セフアロー
ス、ＱＭＡ- アクセル、ＤＥＡＥ- トリスアクリル、Ｄ
ＥＡＥ- スフエロシル、Ｑ- スフエロデックス又はＤＥ
ＡＥ- フアクトゲル、カチオン交換体としてＳ- セフア
ロース、ＣＭ- アクセル、ＣＭ- トリスアクリル、ＳＰ
- トリスアクリル、ＳＰ- スフエロデックス又はＳＰ-
フラクトゲル及び疎水性相としてポリプロピル- Ａ、ポ
リメチル- Ａ、ポリエチル- Ａ、アルキル- セフアロー
ス又はブチル- セフアロースを使用する、請求項１ない
し５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 ＱＭＡ- アクセル、ＣＭ- アクセル及び
ポリプロピル- Ａを夫々のクロマトグラフィー材料とし
て使用する、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 モノクロナール抗体を先ず夫々のクロマ
トグラフィー相と結合させ、次いでこれを洗滌し、次い
で段階的勾配で溶離する、請求項１ないし７のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項９】 クロマトグラフィー分離を、アニオン交
換体でｐＨ６〜８で、カチオン交換体でｐＨ４．５〜７
で及び疎水性相でｐＨ５〜８で開始し、ｐＨ６〜８、
４．５〜９又は５〜８で溶離する、請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】 クロマトグラフィー分離工程を夫々高
圧液体クロマトグラフィーとして実施する、請求項１な
いし９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 滅菌をトリ -ｎ- ブチルホスフアー
ト、トリ -ｎ- ブチルホスフアート／トウィーン、トリ
-ｎ- ブチルホスフアート／ナトリウムクロラート又は
β- プロピオラクトンを用いて、場合によりＵＶ- 照射
と共に行う、請求項１ないし１０のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１２】 滅菌を、０．０１〜１％トリ -ｎ- ブ
チルホスフアート／０．５〜２％トウィーン８０を用い
て５℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３０℃で、８〜２
０時間行う、請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 請求項１による方法で製造された、Ｉ
ｇＧ- モノクロナール抗体を、免疫治療での静脈内投与
剤又は免疫診断剤の製造に使用する方法。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (19)
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|---|---|---|---|---|
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| US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| DE3640513A1 (de) * | 1986-11-27 | 1988-06-09 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur herstellung eines virussicheren, lagerstabilen und intravenoes vertraeglichen immunglobulin-g-praeparates |
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| US5118796A (en) * | 1987-12-09 | 1992-06-02 | Centocor, Incorporated | Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives |
| CA2005600A1 (en) * | 1988-12-20 | 1990-06-20 | Cal-Henrik Heldin | Endothelial cell growth factor |
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-
1997
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002517516A (ja) * | 1998-06-09 | 2002-06-18 | スタテンズ セーラム インスティテュート | 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法 |
| JP4685238B2 (ja) * | 1998-06-09 | 2011-05-18 | ツエー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシヤフト | 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法 |
| JP2011102314A (ja) * | 1998-06-09 | 2011-05-26 | Csl Behring Ag | 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法 |
| JP2013106947A (ja) * | 2011-11-22 | 2013-06-06 | Heraeus Medical Gmbh | 重合性モノマーの滅菌 |
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| US10350327B2 (en) | 2011-11-22 | 2019-07-16 | Heraeus Medical Gmbh | Method and composition for sterilization of a polymerizable monomer |
| WO2015137530A1 (ko) * | 2014-03-11 | 2015-09-17 | 주식회사 녹십자홀딩스 | 면역글로불린의 정제방법 |
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| JP2024119910A (ja) * | 2019-01-30 | 2024-09-03 | アムジエン・インコーポレーテツド | アフリベルセプトの属性、並びにその特性決定及び修飾方法 |
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