JPH0480886B2 - - Google Patents
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- JPH0480886B2 JPH0480886B2 JP58137892A JP13789283A JPH0480886B2 JP H0480886 B2 JPH0480886 B2 JP H0480886B2 JP 58137892 A JP58137892 A JP 58137892A JP 13789283 A JP13789283 A JP 13789283A JP H0480886 B2 JPH0480886 B2 JP H0480886B2
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Description
本発明はC1不活性化剤として特徴づけられる
蛋白質の調製方法に関する。 補体系のC1エステラーゼを不活性化する特性
から名づけられたC1不活性化剤は、また特に接
触相の血液凝固に重要な酵素すなわちプレカリク
レインならびにおよび因子さらにプラス
ミンをも「制御」する。この特異性を基礎とし
て、C1不活性化剤には特別な生理学的機能が与
えられる。一般的にはそれは血液と内腔表面との
接触（例えば心肺器官系における）に際してそこ
に成立する酵素の中和により消耗され、また例え
ば慢性の疾患特にリウマチ性の疾患と結びついて
出現する免疫複合体のように血液凝固を活性化さ
せる疾患の進行に際しても消耗される。C1不活
性化剤は遺伝的な血管性水腫に際して選ばれる薬
剤である。 ヒトの血漿からC1不活性化剤を調製するため
のいくつかの調製方法がある。例えばHaupt氏そ
の他〔（Eur.J.Biochem.」第17巻第254〜261頁
（1970年）〕による多段階的方法に加えて、親和性
クロマトグラフイーも用いられる〔「FEBS
Letters」第79巻第45頁（1977年）〕。このような
方法には若干の欠点がある。すなわちいまだに十
分なほど簡単化されておらず、ロスが多く、時間
を費やす。イオン交換クロマトグラフイー（場合
によりゲル過および親和性クロマトグラフイー
と組合わされる）もまた所望の成果をもたらすこ
とがない。E.F.Vogelaar氏その他〔「Vox.
Sang.」第26巻第118〜127頁（1974年）〕による
C1不活性化剤を臨床的使用のために多量に調製
する方法は、そのような生成物を提供すべき現今
の要求を実現しない。 このことから、C1不活性化剤を再現性よく、
収量がよく、純度が高く、治療的によく受容可能
な生成物をもたらす方法により調製するという課
題が設定された。 今や驚くべきことに、C1不活性化剤は比較的
親水性の蛋白質であり、また通常C1不活性化剤
に随伴してその比活性を低下させる蛋白質（随伴
蛋白質）は疎水性基特に芳香族化合物に対して親
和性を示し、従つて随伴蛋白質はそのような基で
実際上は水に不溶な担体に固定されているものを
用いて吸着され、これによりC1不活性化剤から
分離除去され得ることが見出された。好適な芳香
族化合物はフエニル化合物である。担体としては
それ自体既知の物質が適しており、疎水性クロマ
トグラフイーでの利用と同様に判別性のある活性
基が用いられる。好適なのは交叉結合したアガロ
ースでスペーサーを介して結合された芳香族基を
含有するものである。 C1不活性化剤の単離のためには、従つて下記
すなわち Ａ−Ｂ−Aro （ただし式中Ａは高分子の実際的には水に不溶
の担体例えば交叉結合されたアガロース好ましく
はセフアロース を表わしそしてＢはこの担体に
結合された芳香族基好ましくはフエニル基の脂肪
族性の結合相手である）の構造を有する担体化合
物が問題になる。またスペーサーと称せられる結
合の相手は好ましくは
蛋白質の調製方法に関する。 補体系のC1エステラーゼを不活性化する特性
から名づけられたC1不活性化剤は、また特に接
触相の血液凝固に重要な酵素すなわちプレカリク
レインならびにおよび因子さらにプラス
ミンをも「制御」する。この特異性を基礎とし
て、C1不活性化剤には特別な生理学的機能が与
えられる。一般的にはそれは血液と内腔表面との
接触（例えば心肺器官系における）に際してそこ
に成立する酵素の中和により消耗され、また例え
ば慢性の疾患特にリウマチ性の疾患と結びついて
出現する免疫複合体のように血液凝固を活性化さ
せる疾患の進行に際しても消耗される。C1不活
性化剤は遺伝的な血管性水腫に際して選ばれる薬
剤である。 ヒトの血漿からC1不活性化剤を調製するため
のいくつかの調製方法がある。例えばHaupt氏そ
の他〔（Eur.J.Biochem.」第17巻第254〜261頁
（1970年）〕による多段階的方法に加えて、親和性
クロマトグラフイーも用いられる〔「FEBS
Letters」第79巻第45頁（1977年）〕。このような
方法には若干の欠点がある。すなわちいまだに十
分なほど簡単化されておらず、ロスが多く、時間
を費やす。イオン交換クロマトグラフイー（場合
によりゲル過および親和性クロマトグラフイー
と組合わされる）もまた所望の成果をもたらすこ
とがない。E.F.Vogelaar氏その他〔「Vox.
Sang.」第26巻第118〜127頁（1974年）〕による
C1不活性化剤を臨床的使用のために多量に調製
する方法は、そのような生成物を提供すべき現今
の要求を実現しない。 このことから、C1不活性化剤を再現性よく、
収量がよく、純度が高く、治療的によく受容可能
な生成物をもたらす方法により調製するという課
題が設定された。 今や驚くべきことに、C1不活性化剤は比較的
親水性の蛋白質であり、また通常C1不活性化剤
に随伴してその比活性を低下させる蛋白質（随伴
蛋白質）は疎水性基特に芳香族化合物に対して親
和性を示し、従つて随伴蛋白質はそのような基で
実際上は水に不溶な担体に固定されているものを
用いて吸着され、これによりC1不活性化剤から
分離除去され得ることが見出された。好適な芳香
族化合物はフエニル化合物である。担体としては
それ自体既知の物質が適しており、疎水性クロマ
トグラフイーでの利用と同様に判別性のある活性
基が用いられる。好適なのは交叉結合したアガロ
ースでスペーサーを介して結合された芳香族基を
含有するものである。 C1不活性化剤の単離のためには、従つて下記
すなわち Ａ−Ｂ−Aro （ただし式中Ａは高分子の実際的には水に不溶
の担体例えば交叉結合されたアガロース好ましく
はセフアロース を表わしそしてＢはこの担体に
結合された芳香族基好ましくはフエニル基の脂肪
族性の結合相手である）の構造を有する担体化合
物が問題になる。またスペーサーと称せられる結
合の相手は好ましくは
【式】および
【式】である。式Ａ−Ｂ−
Aroの適当な市販製品は、フエニルセフアロース
CL−4Bである。好ましい製品はこれと同種の
製品であつて、例えば交叉結合アガロース（例え
ばセフアロース 4B）のブロムシアンとの反応
および更に芳香族アミン（例えばフエニルエチル
アミン）との反応により得られる製品である。 C1不活性化剤の随伴蛋白質のこのような疎水
性担体への吸着およびそこからの脱離は、純粋な
生成物を調製するための方法における本発明の本
質的な段階であり、それに場合によつてはそれ自
体既知の前処理または後処理段階が加えられるこ
ともあり得る。 C1不活性化剤の取得のために好適な出発材料
はヒトの血漿であるが、本発明による調製方法は
C1不活性化剤および随伴蛋白質を含有する他の
水性溶液にも応用可能である。 本発明による調製方法と特にジエチルアミノエ
チル基を有する非疎水性の吸着剤好適にはイオン
交換剤との組合わせは有利である。QAE基を含
有するイオン交換剤もまた例えば燐酸カルシウム
のような無機性の吸着剤と同様にC1不活性化剤
の富化をもたらす。中性塩例えば硫酸アンモニウ
ムを用いる沈殿操作もまたC1不活性化剤の精製
法として知られ、そして適当である。 C1不活性化剤の治療的応用に際しては、それ
が患者に対して危険なく行なえることが本質的な
条件である。肝炎の伝染を排除するためには、約
60℃に数時間も保たれた蛋白質溶液はそれが加熱
する前には感染性のＢ型肝炎ウイルスを含有して
いてももはやＢ型肝炎を伝染させ得ないというこ
とが前提条件に該当する。上記の本発明の進展に
おいては従つて本発明により得られる生成物を投
与のために無肝炎のものにするという課題は生じ
た。C1不活性化剤を含有する溶液は、それがC1
不活性化作用を安定化する化合物を含有する場合
には、活性を喪失することなしに約60℃に数時間
も保たれ得る。このような化合物とはアミノ酸、
糖、糖アルコールあるいはそれらの混合物であ
る。C1不活性化剤を含有する溶液は、グリシン
２モル／とサツカロース60％（ｗ／ｖ）との混
合物と共に60℃において10時間以上加熱しても活
性喪失することはない。一般的にアミノ酸は１〜
３モル／、単糖類および寡糖類は20〜60％
（ｗ／ｖ）、そして糖アルコールは75％（ｗ／ｖ）
にいたる濃度で用いられる。加熱のためには、
C1不活性化剤および安定剤を含有する溶液はPH
5.5〜8.5、好ましくは6.5〜7.5に調整される。好
適に用いられるアミノ酸グリシンのほかに下記の
アミノ酸類すなわちＬ−アスパラギン酸、Ｌ−セ
リン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−アルギ
ニン、α−またはβ−アラニン、グルタミン、α
−、β−またはγ−アミノ酪酸、またサツカロー
スのほかにアラビノース、グルコース、ガラクト
ース、フルクトース、リボース、マンノース、ラ
ムノース、マルトースおよびラフイノース、また
糖アルコールとしてはエリスリトール、リビトー
ル、ソルビトールおよびマニトールが適当であ
る。 上記の安定化物質により、C1不活性化剤を含
有する溶液は１分間〜48時間、30〜100℃に加熱
され得る。そして肝炎の伝染を避ける観点からは
10時間60℃に加熱される。 本発明の一層広い対象は従つて、C1不活性化
剤を含有する溶液が安定剤の存在下でＢ型肝炎ウ
イルスの存在による感染性が失われるまで加熱せ
られることを特徴とする調製方法である。 これに対応して、予備的に精製され、場合によ
り数時間約60℃に保たれたC1不活性化剤の純度
が約23〜25単位／mg（比活性）のC1不活性化剤
および随伴蛋白質を水性溶液中に含有する材料
は、本発明に従い疎水性に置換された吸着剤Ａ−
Ｂ−Aro例えばフエニルセフアロース を用いて
処理される。C1不活性化剤の随伴蛋白質の吸着
は弱酸性から中性ないし弱塩基性のPH値好ましく
は６〜９において生ずる。溶液の伝導度は60〜
120mSにあることが適当である。疎水性の担体物
質を用いる吸着操作段階はC1不活性化剤が溶液
から沈殿分離される濃縮のための沈殿操作と組合
わせられることが有利である。しかる後沈降した
C1不活性化剤は、C1不活性化剤を沈殿せしめる
に至らない濃度の沈殿剤を含有する水性溶液に採
取される。 例えばC1不活性化剤が硫酸アンモニウムのよ
うな中性塩により沈殿せしめられるならば、沈殿
物は沈殿と直接に関連して例えば硫酸アンモニウ
ム濃度７〜14％のようにその濃度ではC1不活性
化剤は溶液中にとどまる中性塩の水性溶液中に採
取される。このような溶液を用いて通常C1不活
性化剤に不純物として随伴する蛋白質は疎水性の
担体に結合され、C1不活性化剤は不純物を保持
し続けている吸着剤から増大した純度で分離され
る。 治療的応用のためには、C1不活性化剤にはそ
れ自体既知の蛋白質安定剤例えばアミノ酸の１種
であるグリシンが添加される。疎水クロマトグラ
フイーにより最終的に精製された生成物は、除菌
過の後治療に有効な所望の濃度に調整され、容
器に充填され、そして望ましい場合には真空凍結
乾燥される。添加されたアミノ酸は凍結乾燥の際
にC1不活性化剤を安定化する。 一般的に記述された好適な調製方法は、例えば
下記の通りに実施され、そこにおいてはC1不活
性化剤の基礎物質であるヒトの血漿が出発物質と
して使用のために十分である。 例えばくえん酸塩を含み且つクリオグロブリン
およびプロスロンビン因子を除去されたヒトの血
漿は、アニオン交換剤で処理され、そしてC1不
活性化剤を含有する溶離物は中性塩を用いて分画
される。C1不活性化剤の随伴蛋白質は他の血漿
蛋白質の大部分と共に疎水性吸着剤に吸着され
る。従つてただ１段階操作の疎水クロマトグラフ
イーによりC1不活性化剤は高い純度および良好
な収率で随伴蛋白質から分離されて取得される。
C1不活性化剤は、当該濃度の塩を含む溶液中に
おいて疎水性の例えばフエニルセフアロース の
カラムを通過するが、これに対して随伴蛋白質の
大部分特にこの分画に通常高度に富化されるセル
ロプラズミンは保持される。 所望の場合には沈殿残留物中のC1不活性化剤
は蒸留水に溶解しそして糖例えばサツカロース60
％（ｗ／ｖ）を加えた後の本質的な活性喪失なし
に10時間60℃に加熱され得る。硫酸アンモニウム
により希薄溶液からサツカロースを除去した後
に、最終的にC1不活性化剤は疎水クロマトグラ
フイー技術により１段階のみの操作により高い純
度および良好な収率で随伴蛋白質から分離され取
得され得る。 下記の実施例は本発明を明示する。 実施例 クリオグロブリンを除去され且つ因子、Cig
およびヒトフイブリノゲンが単離されている凍結
保存されたくえん酸塩含有血漿は、プロスロンビ
ン濃縮物を取得するためにDEAE−セフアデツク
ス を用いて吸着された（西ドイツ特許出願
P3043857.7、P3045153.7およびP3101752.5参照）。
DEAE−セフアデツクス の分離除去後に血漿上
清にQAE−セフアデツクス を血漿１当り10
ｇの量で添加し、懸濁液を60分間12℃において攪
拌し、しかる後QAE−セフアデツクスを分離し
て0.15モル濃度のNaCl液で洗浄した。 溶離のためにはPH8.0の1.0モル濃度のNaClおよ
び0.0025モル／のEDTA液を血漿１当り緩衝
液0.45の量で用いた。QAE溶離液はセルロプ
ラスミンの他に特にC1不活性化剤および因子
を含有する濃青色の液である。溶離液は液体状の
硫酸アンモニウムにより20℃において分画され
た。すなわち溶離液１当り硫酸アンモニウム飽
和溶液1500mlを加えることにより60％飽和が達成
される。 C1不活性化剤が富化された60％（飽和）硫酸
アンモニウム残留物は次いでフエニルセフアロー
ス による疎水クロマトグラフイーに付された。
沈殿物は蒸留水中にOD280onが〜55の溶液となる
ように採取され、硫酸アンモニウム濃度は７％そ
してPHは7.2〜7.6に調整された。澄明および除菌
過の後にこの溶液1.3がフエニルセフアロー
ス のゲルカラム（高さ31cm、幅12cm）中におい
て分離された。最初の澄明な通過液は、青色のバ
ンドとしてカラムを通過するセルロプラスミンか
らよく分離されたC1不活性化剤を含有した。C1
不活性化剤を含有する分画は固体状の硫酸アンモ
ニウムを加えることにより濃縮された。すなわち
６℃において通過する分画１当り硫酸アンモニ
ウム340ｇが加えられた。沈殿物は遠心分離され、
蒸留水に溶解された。澄明および除菌過を行な
つた後、続いてその液を1.5％グリセリン緩衝
液に対して透析に付した。溶液の一部分からC1
不活性化剤における蛋白質がラジアル免疫拡散法
により定量され、活性がLevyおよびLepow両氏
の方法〔「Proc.Soc.Exp.Biol.Med.」第101巻第
608頁（1959年）〕に従いＮ−アセチル−Ｌ−チロ
シンエチルエステルを基質に用いて測定された。
活性はC1不活性化剤単位として示され、１単位
はその際10単位のC1エステラーゼを阻害するこ
とをもつて特徴づけられた。平均してC1不活性
化剤蛋白質１mg当りC1不活性化剤活性約40単位
の標品が、出発物質の血漿量に対し20％の収率で
得られた。得られた生成物は90％純粋であり、発
熱性物質を含まず、動物試験において副作用がな
く、血管性水腫の治療に使用可能であつた。 60％硫酸アンモニウム液の沈殿残留物は、所望
の場合には蒸留水に溶解し、60％（ｗ／ｖ）のサ
ツカロースを混合し、PH７〜7.5に調整し、そし
て10時間60℃に加熱した。溶液は冷却後蒸留水で
１：５に希釈し、サツカロースの分離除去のため
に硫酸アンモニウム飽和溶液を60％飽和にまで加
えることにより新たに沈降せしめた。これに続き
疎水クロマトグラフイーに付した。
CL−4Bである。好ましい製品はこれと同種の
製品であつて、例えば交叉結合アガロース（例え
ばセフアロース 4B）のブロムシアンとの反応
および更に芳香族アミン（例えばフエニルエチル
アミン）との反応により得られる製品である。 C1不活性化剤の随伴蛋白質のこのような疎水
性担体への吸着およびそこからの脱離は、純粋な
生成物を調製するための方法における本発明の本
質的な段階であり、それに場合によつてはそれ自
体既知の前処理または後処理段階が加えられるこ
ともあり得る。 C1不活性化剤の取得のために好適な出発材料
はヒトの血漿であるが、本発明による調製方法は
C1不活性化剤および随伴蛋白質を含有する他の
水性溶液にも応用可能である。 本発明による調製方法と特にジエチルアミノエ
チル基を有する非疎水性の吸着剤好適にはイオン
交換剤との組合わせは有利である。QAE基を含
有するイオン交換剤もまた例えば燐酸カルシウム
のような無機性の吸着剤と同様にC1不活性化剤
の富化をもたらす。中性塩例えば硫酸アンモニウ
ムを用いる沈殿操作もまたC1不活性化剤の精製
法として知られ、そして適当である。 C1不活性化剤の治療的応用に際しては、それ
が患者に対して危険なく行なえることが本質的な
条件である。肝炎の伝染を排除するためには、約
60℃に数時間も保たれた蛋白質溶液はそれが加熱
する前には感染性のＢ型肝炎ウイルスを含有して
いてももはやＢ型肝炎を伝染させ得ないというこ
とが前提条件に該当する。上記の本発明の進展に
おいては従つて本発明により得られる生成物を投
与のために無肝炎のものにするという課題は生じ
た。C1不活性化剤を含有する溶液は、それがC1
不活性化作用を安定化する化合物を含有する場合
には、活性を喪失することなしに約60℃に数時間
も保たれ得る。このような化合物とはアミノ酸、
糖、糖アルコールあるいはそれらの混合物であ
る。C1不活性化剤を含有する溶液は、グリシン
２モル／とサツカロース60％（ｗ／ｖ）との混
合物と共に60℃において10時間以上加熱しても活
性喪失することはない。一般的にアミノ酸は１〜
３モル／、単糖類および寡糖類は20〜60％
（ｗ／ｖ）、そして糖アルコールは75％（ｗ／ｖ）
にいたる濃度で用いられる。加熱のためには、
C1不活性化剤および安定剤を含有する溶液はPH
5.5〜8.5、好ましくは6.5〜7.5に調整される。好
適に用いられるアミノ酸グリシンのほかに下記の
アミノ酸類すなわちＬ−アスパラギン酸、Ｌ−セ
リン、Ｌ−バリン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−
プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−アルギ
ニン、α−またはβ−アラニン、グルタミン、α
−、β−またはγ−アミノ酪酸、またサツカロー
スのほかにアラビノース、グルコース、ガラクト
ース、フルクトース、リボース、マンノース、ラ
ムノース、マルトースおよびラフイノース、また
糖アルコールとしてはエリスリトール、リビトー
ル、ソルビトールおよびマニトールが適当であ
る。 上記の安定化物質により、C1不活性化剤を含
有する溶液は１分間〜48時間、30〜100℃に加熱
され得る。そして肝炎の伝染を避ける観点からは
10時間60℃に加熱される。 本発明の一層広い対象は従つて、C1不活性化
剤を含有する溶液が安定剤の存在下でＢ型肝炎ウ
イルスの存在による感染性が失われるまで加熱せ
られることを特徴とする調製方法である。 これに対応して、予備的に精製され、場合によ
り数時間約60℃に保たれたC1不活性化剤の純度
が約23〜25単位／mg（比活性）のC1不活性化剤
および随伴蛋白質を水性溶液中に含有する材料
は、本発明に従い疎水性に置換された吸着剤Ａ−
Ｂ−Aro例えばフエニルセフアロース を用いて
処理される。C1不活性化剤の随伴蛋白質の吸着
は弱酸性から中性ないし弱塩基性のPH値好ましく
は６〜９において生ずる。溶液の伝導度は60〜
120mSにあることが適当である。疎水性の担体物
質を用いる吸着操作段階はC1不活性化剤が溶液
から沈殿分離される濃縮のための沈殿操作と組合
わせられることが有利である。しかる後沈降した
C1不活性化剤は、C1不活性化剤を沈殿せしめる
に至らない濃度の沈殿剤を含有する水性溶液に採
取される。 例えばC1不活性化剤が硫酸アンモニウムのよ
うな中性塩により沈殿せしめられるならば、沈殿
物は沈殿と直接に関連して例えば硫酸アンモニウ
ム濃度７〜14％のようにその濃度ではC1不活性
化剤は溶液中にとどまる中性塩の水性溶液中に採
取される。このような溶液を用いて通常C1不活
性化剤に不純物として随伴する蛋白質は疎水性の
担体に結合され、C1不活性化剤は不純物を保持
し続けている吸着剤から増大した純度で分離され
る。 治療的応用のためには、C1不活性化剤にはそ
れ自体既知の蛋白質安定剤例えばアミノ酸の１種
であるグリシンが添加される。疎水クロマトグラ
フイーにより最終的に精製された生成物は、除菌
過の後治療に有効な所望の濃度に調整され、容
器に充填され、そして望ましい場合には真空凍結
乾燥される。添加されたアミノ酸は凍結乾燥の際
にC1不活性化剤を安定化する。 一般的に記述された好適な調製方法は、例えば
下記の通りに実施され、そこにおいてはC1不活
性化剤の基礎物質であるヒトの血漿が出発物質と
して使用のために十分である。 例えばくえん酸塩を含み且つクリオグロブリン
およびプロスロンビン因子を除去されたヒトの血
漿は、アニオン交換剤で処理され、そしてC1不
活性化剤を含有する溶離物は中性塩を用いて分画
される。C1不活性化剤の随伴蛋白質は他の血漿
蛋白質の大部分と共に疎水性吸着剤に吸着され
る。従つてただ１段階操作の疎水クロマトグラフ
イーによりC1不活性化剤は高い純度および良好
な収率で随伴蛋白質から分離されて取得される。
C1不活性化剤は、当該濃度の塩を含む溶液中に
おいて疎水性の例えばフエニルセフアロース の
カラムを通過するが、これに対して随伴蛋白質の
大部分特にこの分画に通常高度に富化されるセル
ロプラズミンは保持される。 所望の場合には沈殿残留物中のC1不活性化剤
は蒸留水に溶解しそして糖例えばサツカロース60
％（ｗ／ｖ）を加えた後の本質的な活性喪失なし
に10時間60℃に加熱され得る。硫酸アンモニウム
により希薄溶液からサツカロースを除去した後
に、最終的にC1不活性化剤は疎水クロマトグラ
フイー技術により１段階のみの操作により高い純
度および良好な収率で随伴蛋白質から分離され取
得され得る。 下記の実施例は本発明を明示する。 実施例 クリオグロブリンを除去され且つ因子、Cig
およびヒトフイブリノゲンが単離されている凍結
保存されたくえん酸塩含有血漿は、プロスロンビ
ン濃縮物を取得するためにDEAE−セフアデツク
ス を用いて吸着された（西ドイツ特許出願
P3043857.7、P3045153.7およびP3101752.5参照）。
DEAE−セフアデツクス の分離除去後に血漿上
清にQAE−セフアデツクス を血漿１当り10
ｇの量で添加し、懸濁液を60分間12℃において攪
拌し、しかる後QAE−セフアデツクスを分離し
て0.15モル濃度のNaCl液で洗浄した。 溶離のためにはPH8.0の1.0モル濃度のNaClおよ
び0.0025モル／のEDTA液を血漿１当り緩衝
液0.45の量で用いた。QAE溶離液はセルロプ
ラスミンの他に特にC1不活性化剤および因子
を含有する濃青色の液である。溶離液は液体状の
硫酸アンモニウムにより20℃において分画され
た。すなわち溶離液１当り硫酸アンモニウム飽
和溶液1500mlを加えることにより60％飽和が達成
される。 C1不活性化剤が富化された60％（飽和）硫酸
アンモニウム残留物は次いでフエニルセフアロー
ス による疎水クロマトグラフイーに付された。
沈殿物は蒸留水中にOD280onが〜55の溶液となる
ように採取され、硫酸アンモニウム濃度は７％そ
してPHは7.2〜7.6に調整された。澄明および除菌
過の後にこの溶液1.3がフエニルセフアロー
ス のゲルカラム（高さ31cm、幅12cm）中におい
て分離された。最初の澄明な通過液は、青色のバ
ンドとしてカラムを通過するセルロプラスミンか
らよく分離されたC1不活性化剤を含有した。C1
不活性化剤を含有する分画は固体状の硫酸アンモ
ニウムを加えることにより濃縮された。すなわち
６℃において通過する分画１当り硫酸アンモニ
ウム340ｇが加えられた。沈殿物は遠心分離され、
蒸留水に溶解された。澄明および除菌過を行な
つた後、続いてその液を1.5％グリセリン緩衝
液に対して透析に付した。溶液の一部分からC1
不活性化剤における蛋白質がラジアル免疫拡散法
により定量され、活性がLevyおよびLepow両氏
の方法〔「Proc.Soc.Exp.Biol.Med.」第101巻第
608頁（1959年）〕に従いＮ−アセチル−Ｌ−チロ
シンエチルエステルを基質に用いて測定された。
活性はC1不活性化剤単位として示され、１単位
はその際10単位のC1エステラーゼを阻害するこ
とをもつて特徴づけられた。平均してC1不活性
化剤蛋白質１mg当りC1不活性化剤活性約40単位
の標品が、出発物質の血漿量に対し20％の収率で
得られた。得られた生成物は90％純粋であり、発
熱性物質を含まず、動物試験において副作用がな
く、血管性水腫の治療に使用可能であつた。 60％硫酸アンモニウム液の沈殿残留物は、所望
の場合には蒸留水に溶解し、60％（ｗ／ｖ）のサ
ツカロースを混合し、PH７〜7.5に調整し、そし
て10時間60℃に加熱した。溶液は冷却後蒸留水で
１：５に希釈し、サツカロースの分離除去のため
に硫酸アンモニウム飽和溶液を60％飽和にまで加
えることにより新たに沈降せしめた。これに続き
疎水クロマトグラフイーに付した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 沈殿および吸着操作の組合わせにより補体系
C1エステラーゼの不活性作用（C1不活性化剤）
を調製する方法において、該組合わせ中で吸着剤
として疎水性基を含有する担体を使用することを
特徴とする方法。 ２ 前記C1不活性化剤が肝炎ウイルスを含有し
ないものである特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ３ 前記C1不活性化剤が凍結乾燥可能なもので
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 前記疎水性基がフエニル基である特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ５ 前記担体が交叉結合されたアガロースである
特許請求の範囲第１項記載の方法。
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