JPH0727764A - Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬 - Google Patents
Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬Info
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- JPH0727764A JPH0727764A JP8990193A JP8990193A JPH0727764A JP H0727764 A JPH0727764 A JP H0727764A JP 8990193 A JP8990193 A JP 8990193A JP 8990193 A JP8990193 A JP 8990193A JP H0727764 A JPH0727764 A JP H0727764A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗体のＦｃ部位と特異的に結合する免疫グロ
ブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブロック試薬に
よってＦｃ部位がブロックされている、免疫学的測定法
用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該試薬を使
用する免疫学的測定法、及び、Ｆｃ部位をブロックする
該ブロック試薬。 【効果】 免疫学的測定法において、ＲＦ等の物質によ
る非特異的反応を排除できる。
ブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブロック試薬に
よってＦｃ部位がブロックされている、免疫学的測定法
用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該試薬を使
用する免疫学的測定法、及び、Ｆｃ部位をブロックする
該ブロック試薬。 【効果】 免疫学的測定法において、ＲＦ等の物質によ
る非特異的反応を排除できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定法におい
てリウマチ因子（以下、ＲＦという。）が抗体のＦｃ部
位と結合することによる偽反応を抑制するための抗体に
係わる。より詳細には、偽反応の原因となる非特異的反
応を引き起こすＦｃ部位をブロックした免疫学的測定用
抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該試薬を使用
する免疫学的測定法及び非特異反応を排除するための、
Ｆｃ部位をブロックするブロック試薬に係わる。
てリウマチ因子（以下、ＲＦという。）が抗体のＦｃ部
位と結合することによる偽反応を抑制するための抗体に
係わる。より詳細には、偽反応の原因となる非特異的反
応を引き起こすＦｃ部位をブロックした免疫学的測定用
抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該試薬を使用
する免疫学的測定法及び非特異反応を排除するための、
Ｆｃ部位をブロックするブロック試薬に係わる。
【０００２】
【従来の技術】抗原と抗体の結合反応を利用したin vit
roアッセイである免疫学的測定法は、微量成分を特異的
に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査
に広く応用されている。それらには、標識の仕方等によ
り、ＳＲＩＤ法、凝集法（血球、ラテックス等を坦体に
使用したもの）、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素
免疫学的測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫学的測定法（ＦＩ
Ａ）、ネフェロメトリー、免疫比濁法等がある。
roアッセイである免疫学的測定法は、微量成分を特異的
に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査
に広く応用されている。それらには、標識の仕方等によ
り、ＳＲＩＤ法、凝集法（血球、ラテックス等を坦体に
使用したもの）、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素
免疫学的測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫学的測定法（ＦＩ
Ａ）、ネフェロメトリー、免疫比濁法等がある。
【０００３】しかしながら、免疫学的測定法の臨床検査
への応用においては、患者から採取した、血液、尿など
の生物学的流体中に存在するＲＦや補体Ｃ１ｑなどによ
る非特異凝集反応が偽陽性を生じさせるという問題があ
った。
への応用においては、患者から採取した、血液、尿など
の生物学的流体中に存在するＲＦや補体Ｃ１ｑなどによ
る非特異凝集反応が偽陽性を生じさせるという問題があ
った。
【０００４】そこで、ＲＦ等の影響による非特異反応を
抑制するために、ジチオスレイトール、２−メルカプト
エタノールによる検体の前処理またはγ−グロブリンも
しくはその変性物の添加のような検体の前処理、抗体の
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 等のフラグメントの使用などの
免疫学的測定法の改良が提案されている。
抑制するために、ジチオスレイトール、２−メルカプト
エタノールによる検体の前処理またはγ−グロブリンも
しくはその変性物の添加のような検体の前処理、抗体の
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 等のフラグメントの使用などの
免疫学的測定法の改良が提案されている。
【０００５】例えば、Journal of Clinical Microbiolo
gy, Feb. 1976, p.157-160には、ジチオスレイトールに
よる検体の前処理が記載されている。特公昭６１−９４
２号公報は、未感作の正常動物γ−グロブリンまたはそ
の変性物を添加し、その存在下で検体中の抗原または抗
体を免疫学的に測定する方法を開示している。
gy, Feb. 1976, p.157-160には、ジチオスレイトールに
よる検体の前処理が記載されている。特公昭６１−９４
２号公報は、未感作の正常動物γ−グロブリンまたはそ
の変性物を添加し、その存在下で検体中の抗原または抗
体を免疫学的に測定する方法を開示している。
【０００６】抗体のフラグメントの使用については、例
えば、特公昭６３−３８６６８号公報は、Ｆｃ部位が非
特異的反応に関与することから、これを切断した免疫グ
ロブリンのＦ（ａｂ’）2 フラグメントを測定用抗体と
して使用する免疫検定を開示している。
えば、特公昭６３−３８６６８号公報は、Ｆｃ部位が非
特異的反応に関与することから、これを切断した免疫グ
ロブリンのＦ（ａｂ’）2 フラグメントを測定用抗体と
して使用する免疫検定を開示している。
【０００７】特に、ラテックスを使用した凝集法におい
ては、尿素、ホルムアミド等の誘導体及びジ低級アルキ
ルスルホキシド等を配合してＲＦ等による非特異的反応
を防止すること（特公昭６０−４９４１号公報）、及
び、免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）2 フラグメント（断
片）とＦｃフラグメントないしＦａｃｂフラグメントと
ｐＦｃ’フラグメントの混合物を感作したラテックス粒
子を使用してＲＦ等の干渉を避けること（特公昭６３−
６３８６３号公報及び特公昭６３−４１４２６号公報）
が知られている。
ては、尿素、ホルムアミド等の誘導体及びジ低級アルキ
ルスルホキシド等を配合してＲＦ等による非特異的反応
を防止すること（特公昭６０−４９４１号公報）、及
び、免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）2 フラグメント（断
片）とＦｃフラグメントないしＦａｃｂフラグメントと
ｐＦｃ’フラグメントの混合物を感作したラテックス粒
子を使用してＲＦ等の干渉を避けること（特公昭６３−
６３８６３号公報及び特公昭６３−４１４２６号公報）
が知られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、検体の
前処理による方法では、測定時の手順が増えるという問
題及び測定の感度低下の問題があり、また、免疫学的測
定用抗体を酵素加水分解的に処理して得たＦａｂ、Ｆ
（ａｂ’）2 等の抗体のフラグメントを用いる方法で
は、該処理における抗体への影響等の問題があった。
前処理による方法では、測定時の手順が増えるという問
題及び測定の感度低下の問題があり、また、免疫学的測
定用抗体を酵素加水分解的に処理して得たＦａｂ、Ｆ
（ａｂ’）2 等の抗体のフラグメントを用いる方法で
は、該処理における抗体への影響等の問題があった。
【０００９】本発明者らは、上記のような問題を解決す
るため鋭意研究した結果、今までに知られていなかった
原理に基づき、免疫学的測定法において、ＲＦの干渉に
よる非特異的反応を排除する方法を知見した。
るため鋭意研究した結果、今までに知られていなかった
原理に基づき、免疫学的測定法において、ＲＦの干渉に
よる非特異的反応を排除する方法を知見した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、抗体のＦｃ部
位と特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合部位を
少なくとも含むブロック試薬によってＦｃ部位がブロッ
クされている、免疫学的測定法用抗体を提供する。すな
わち、抗原抗体反応に基づいてＦｃ部位がブロックされ
た、ＲＦ等の物質と非特異的反応をしない抗体を提供す
る。
位と特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合部位を
少なくとも含むブロック試薬によってＦｃ部位がブロッ
クされている、免疫学的測定法用抗体を提供する。すな
わち、抗原抗体反応に基づいてＦｃ部位がブロックされ
た、ＲＦ等の物質と非特異的反応をしない抗体を提供す
る。
【００１１】また、本発明は上記の抗体を含む免疫学的
測定用試薬を提供する。
測定用試薬を提供する。
【００１２】さらに、本発明は、上記の免疫学的測定用
試薬を使用する免疫学的測定法を提供する。本発明の免
疫学的測定法によれば、ＲＦ等の物質との非特異的反応
が排除される。
試薬を使用する免疫学的測定法を提供する。本発明の免
疫学的測定法によれば、ＲＦ等の物質との非特異的反応
が排除される。
【００１３】その他、本発明は、免疫学的測定法に使用
される抗体のＦｃ部位をブロックする、ＲＦ等の物質の
干渉を排除するための、抗体のＦｃ部位と特異的に結合
する免疫グロブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブ
ロック試薬を提供する。
される抗体のＦｃ部位をブロックする、ＲＦ等の物質の
干渉を排除するための、抗体のＦｃ部位と特異的に結合
する免疫グロブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブ
ロック試薬を提供する。
【００１４】本発明において、免疫学的測定法とは、免
疫反応（抗原抗体反応）を利用した方法であり、定性法
及び定量法の両方を含むものである。免疫学的測定法の
例として、一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、凝集
法（ラテックス、血球等の担体 を用いた凝集法）、放
射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫学的測定法（Ｅ
ＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、免疫比ろう法（Immuno
nephelometry）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッ
セイ、凝集法に基づいた比濁法、比ろう法、粒度分布測
定法等が挙げられる。
疫反応（抗原抗体反応）を利用した方法であり、定性法
及び定量法の両方を含むものである。免疫学的測定法の
例として、一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、凝集
法（ラテックス、血球等の担体 を用いた凝集法）、放
射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫学的測定法（Ｅ
ＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、免疫比ろう法（Immuno
nephelometry）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッ
セイ、凝集法に基づいた比濁法、比ろう法、粒度分布測
定法等が挙げられる。
【００１５】本発明のＦｃ部位がブロックされる抗体
は、これらの免疫学的測定法において用いられる、検体
中の測定物質と結合する抗体である。例えば、マウス、
ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ等由来のもの、ま
た、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のクラスのものが使用されてい
る。
は、これらの免疫学的測定法において用いられる、検体
中の測定物質と結合する抗体である。例えば、マウス、
ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ等由来のもの、ま
た、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のクラスのものが使用されてい
る。
【００１６】この抗体は、ＲＦがそのＦｃ部位と結合し
やすいため、本来の抗原抗体反応がＲＦによって干渉を
受け、生物学的流体中の物質の測定に際して誤った結
果、特に、凝集法では非特異的な凝集による偽陽性を与
えがちであった。
やすいため、本来の抗原抗体反応がＲＦによって干渉を
受け、生物学的流体中の物質の測定に際して誤った結
果、特に、凝集法では非特異的な凝集による偽陽性を与
えがちであった。
【００１７】本発明は、この問題を、予め、ＲＦが特異
的に結合する抗体のＦｃ部位をブロックすることにより
解決するものである。
的に結合する抗体のＦｃ部位をブロックすることにより
解決するものである。
【００１８】本発明のブロック試薬は、免疫学的測定法
に使用される抗体のＦｃ部位をブロックする、ＲＦの干
渉を排除するためのものであって、抗体のＦｃ部位と特
異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合部位を少なく
とも含むものである。抗原結合部位は、抗原を認識し、
抗原に結合できる可変部（ＶL 、ＶH 領域）である。
に使用される抗体のＦｃ部位をブロックする、ＲＦの干
渉を排除するためのものであって、抗体のＦｃ部位と特
異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合部位を少なく
とも含むものである。抗原結合部位は、抗原を認識し、
抗原に結合できる可変部（ＶL 、ＶH 領域）である。
【００１９】このブロック試薬の例としては、免疫グロ
ブリン全体またはそのフラグメントが挙げられる。フラ
グメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｃｂ、Ｆａｂ／ｃである。
ブリン全体またはそのフラグメントが挙げられる。フラ
グメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）2、Ｆａｃｂ、Ｆａｂ／ｃである。
【００２０】該免疫グロブリンまたはそのフラグメント
はＲＦの干渉を妨げるものであるから、自体がＲＦと結
合する部位を有さないものが好ましい。たとえば、Ｆ
ｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメントを
使用することができる。好ましくは、小分子例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ等のフラグメントを使用する。ま
た、凝集法においてはブロック試薬の副次の作用を少な
くするために、一フラグメント当たり抗原結合部位が一
つのもの、例えば、ヒンジ領域のＳ−Ｓ結合が切断され
ているものが好ましい。特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等のフ
ラグメントが代表的である。さらに、これらのフラグメ
ントは別の化合物などで修飾されていてもよい。
はＲＦの干渉を妨げるものであるから、自体がＲＦと結
合する部位を有さないものが好ましい。たとえば、Ｆ
ｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 フラグメントを
使用することができる。好ましくは、小分子例えばＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ等のフラグメントを使用する。ま
た、凝集法においてはブロック試薬の副次の作用を少な
くするために、一フラグメント当たり抗原結合部位が一
つのもの、例えば、ヒンジ領域のＳ−Ｓ結合が切断され
ているものが好ましい。特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’等のフ
ラグメントが代表的である。さらに、これらのフラグメ
ントは別の化合物などで修飾されていてもよい。
【００２１】ブロック試薬に使用される免疫グロブリン
の由来及びクラスは特に制限されないが、マウス、ウサ
ギ、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリの免
疫グロブリンが使用でき、また、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のク
ラスのものが使用できる。また、キメラ免疫グロブリン
の使用も可能である。
の由来及びクラスは特に制限されないが、マウス、ウサ
ギ、ラット、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリの免
疫グロブリンが使用でき、また、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のク
ラスのものが使用できる。また、キメラ免疫グロブリン
の使用も可能である。
【００２２】ＲＦと反応しないニワトリのＩｇＧをブロ
ック試薬として使用する場合には、ブロック試薬とＲＦ
の干渉を考慮しなくてよいので、それ全体及びその任意
のフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）2 、Ｆａｃｂ、Ｆａｂ／ｃ）を使用すること
ができる。
ック試薬として使用する場合には、ブロック試薬とＲＦ
の干渉を考慮しなくてよいので、それ全体及びその任意
のフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）2 、Ｆａｃｂ、Ｆａｂ／ｃ）を使用すること
ができる。
【００２３】このような免疫グロブリンは、市販品とし
て得ることもでき、また、Ｆｃフラグメントを抗原とし
て動物から得ることもできる。例えば、市販品には、ヤ
ギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント（γchain specifi
c）（オルガノンテクニカ社製）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ
Ｆｃフラグメント（γchain specific）（オルガノンテ
クニカ社製）等があり、目的の抗体に応じて選択され
る。また、動物から所望の特異性を有する免疫グロブリ
ンを得る方法は当業者に公知である。該ブロック用免疫
グロブリンを得るために動物に与える抗原となる抗体の
Ｆｃフラグメントは、免疫学的測定用抗体と同種の動物
から得られたものであればよく、該測定用抗体を抗原と
して使用する必要はない。
て得ることもでき、また、Ｆｃフラグメントを抗原とし
て動物から得ることもできる。例えば、市販品には、ヤ
ギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント（γchain specifi
c）（オルガノンテクニカ社製）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ
Ｆｃフラグメント（γchain specific）（オルガノンテ
クニカ社製）等があり、目的の抗体に応じて選択され
る。また、動物から所望の特異性を有する免疫グロブリ
ンを得る方法は当業者に公知である。該ブロック用免疫
グロブリンを得るために動物に与える抗原となる抗体の
Ｆｃフラグメントは、免疫学的測定用抗体と同種の動物
から得られたものであればよく、該測定用抗体を抗原と
して使用する必要はない。
【００２４】免疫グロブリンのフラグメントは、免疫グ
ロブリンをプロテアーゼで消化することによって得るこ
とができる。免疫グロブリンのフラグメントの製造方法
は当業者に公知であり、「続生化学実験講座５−免疫生
化学研究法」東京化学同人発行、1986年、89〜99頁及び
R.R. Porter, Biochem. J., 73, 119(1959) が参照でき
る。
ロブリンをプロテアーゼで消化することによって得るこ
とができる。免疫グロブリンのフラグメントの製造方法
は当業者に公知であり、「続生化学実験講座５−免疫生
化学研究法」東京化学同人発行、1986年、89〜99頁及び
R.R. Porter, Biochem. J., 73, 119(1959) が参照でき
る。
【００２５】通常、使用されるプロテアーゼは、パパイ
ン、ペプシン、プラスミン、トリプシン等である。例え
ば、パパインによる消化によってＦａｂフラグメントを
得ることができ、また、ペプシンによる消化によってＦ
（ａｂ’）2 フラグメントを得ることができる。
ン、ペプシン、プラスミン、トリプシン等である。例え
ば、パパインによる消化によってＦａｂフラグメントを
得ることができ、また、ペプシンによる消化によってＦ
（ａｂ’）2 フラグメントを得ることができる。
【００２６】免疫グロブリンまたはそのフラグメントの
ヒンジ領域のＳ−Ｓ結合の切断方法は、当業者に公知で
ある。例えば、ジチオスレイトール、２−メルカプトエ
タノールのような還元剤で処理し、続いて、ヨードアセ
トアミドのようなＳＨ試薬で処理することによってＳ−
Ｓ結合を切断できる。
ヒンジ領域のＳ−Ｓ結合の切断方法は、当業者に公知で
ある。例えば、ジチオスレイトール、２−メルカプトエ
タノールのような還元剤で処理し、続いて、ヨードアセ
トアミドのようなＳＨ試薬で処理することによってＳ−
Ｓ結合を切断できる。
【００２７】得られたフラグメントの分離精製は必須で
はないが、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル瀘
過クロマトグラフィー等によってフラグメントを分離精
製することが好ましい。
はないが、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル瀘
過クロマトグラフィー等によってフラグメントを分離精
製することが好ましい。
【００２８】本発明のブロックされた免疫学的測定用抗
体は、通常の免疫測定用抗体とブロック試薬を結合さ
せ、抗体のＦｃ部位をブロック試薬によってブロックす
ることによって得ることができる。
体は、通常の免疫測定用抗体とブロック試薬を結合さ
せ、抗体のＦｃ部位をブロック試薬によってブロックす
ることによって得ることができる。
【００２９】本発明の免疫学的測定用抗体とブロック試
薬は、通常、免疫学的測定用抗体１分子当たり、ブロッ
ク試薬の数が、平均で０．５〜６となるように結合させ
る。好ましくは、免疫学的測定用抗体１分子当たり、ブ
ロック試薬の数が、平均で約３となるように結合させ
る。
薬は、通常、免疫学的測定用抗体１分子当たり、ブロッ
ク試薬の数が、平均で０．５〜６となるように結合させ
る。好ましくは、免疫学的測定用抗体１分子当たり、ブ
ロック試薬の数が、平均で約３となるように結合させ
る。
【００３０】例えば、ラテックス凝集法において使用さ
れるラテックスに吸着された抗体とＦａｂまたはＦａ
ｂ’フラグメントを含むブロック試薬を結合する場合に
は、抗体一分子当たりのＦａｂまたはＦａｂ’フラグメ
ントの数は平均で 1.0〜3.5 とするのが好ましい。ま
た、ＥＩＡ法で使用される抗体溶液とＦａｂまたはＦａ
ｂ’フラグメントを含むブロック試薬を用いる場合に
は、抗体一分子当たりのＦａｂまたはＦａｂ’フラグメ
ントの数を平均で 5.0〜6.0 としてもよい。
れるラテックスに吸着された抗体とＦａｂまたはＦａ
ｂ’フラグメントを含むブロック試薬を結合する場合に
は、抗体一分子当たりのＦａｂまたはＦａｂ’フラグメ
ントの数は平均で 1.0〜3.5 とするのが好ましい。ま
た、ＥＩＡ法で使用される抗体溶液とＦａｂまたはＦａ
ｂ’フラグメントを含むブロック試薬を用いる場合に
は、抗体一分子当たりのＦａｂまたはＦａｂ’フラグメ
ントの数を平均で 5.0〜6.0 としてもよい。
【００３１】免疫学的測定用抗体とブロック試薬との結
合は通常溶液中で両者を混和することによって行なわ
れ、混和温度は、通常、２〜５０℃であり、好ましくは
４〜３７℃である。また、混和時間は、通常、１分〜２
日である。混和比、混和温度、混和時間等の条件は、抗
体のＦｃ部位に特異的に結合する免疫グロブリンの親和
性、抗体価、純度、免疫学的測定用試薬中の抗体の濃度
あるいは密度などによって異なる。例えば、免疫グロブ
リン原料のロットごとの抗体価の違いなどは、当業者に
はよく知られていることであり、当業者であれば、上記
の混和温度、混和時間を容易に決定でき、また、混和比
を改変することができる。
合は通常溶液中で両者を混和することによって行なわ
れ、混和温度は、通常、２〜５０℃であり、好ましくは
４〜３７℃である。また、混和時間は、通常、１分〜２
日である。混和比、混和温度、混和時間等の条件は、抗
体のＦｃ部位に特異的に結合する免疫グロブリンの親和
性、抗体価、純度、免疫学的測定用試薬中の抗体の濃度
あるいは密度などによって異なる。例えば、免疫グロブ
リン原料のロットごとの抗体価の違いなどは、当業者に
はよく知られていることであり、当業者であれば、上記
の混和温度、混和時間を容易に決定でき、また、混和比
を改変することができる。
【００３２】本発明の免疫学的測定用試薬は、上記のＦ
ｃ部位がブロックされた抗体を含むものである。
ｃ部位がブロックされた抗体を含むものである。
【００３３】このような免疫学的測定用試薬の例として
は、坦体あるいは基質に吸着した抗体を含むものがあ
る。坦体の例としては、ラテックス、血球、金コロイ
ド、ゼラチン粒子等が挙げられ、基質の例としては、ガ
ラス、プラスチック、膜等が挙げられる。また、酵素な
どにより標識された抗体を含むものもある。特には、ラ
テックス試薬、マイクロプレートに吸着した抗体、酵素
標識抗体等が挙げられる。
は、坦体あるいは基質に吸着した抗体を含むものがあ
る。坦体の例としては、ラテックス、血球、金コロイ
ド、ゼラチン粒子等が挙げられ、基質の例としては、ガ
ラス、プラスチック、膜等が挙げられる。また、酵素な
どにより標識された抗体を含むものもある。特には、ラ
テックス試薬、マイクロプレートに吸着した抗体、酵素
標識抗体等が挙げられる。
【００３４】本発明の免疫学的測定用試薬は、通常使用
される、抗体を含む免疫学的測定用試薬とブロック試薬
を混和して、上記のように抗体とブロック試薬を結合さ
せることによって得ることができる。
される、抗体を含む免疫学的測定用試薬とブロック試薬
を混和して、上記のように抗体とブロック試薬を結合さ
せることによって得ることができる。
【００３５】本発明の免疫学的測定試薬は、牛血清アル
ブミン等の安定化剤の添加等の、通常に行なわれる処理
を受けていてもよい。
ブミン等の安定化剤の添加等の、通常に行なわれる処理
を受けていてもよい。
【００３６】本発明の免疫学的測定法は、上記のような
本発明の免疫学的測定用試薬を使用した測定法である。
本発明の免疫学的測定用試薬を使用した測定法である。
【００３７】本免疫学的測定法は、通常の免疫学的測定
用試薬を使用した測定法と同じ手順で行なうことができ
る。
用試薬を使用した測定法と同じ手順で行なうことができ
る。
【００３８】例として挙げると、ラテックス凝集法は、
（１） 血清等の検体１滴（例えば２０μｌ）を判定用
スライド板のサークル内に滴下し、（２） Ｆｃ部位を
ブロックした抗体を含むラテックス試薬１滴を判定用ス
ライド板のサークル内に滴下し、（３） 撹拌棒で検体
とラテックス試薬を混和し、判定用スライド板をゆるや
かに揺動し、（４） 数分間（例えば１〜５分間）揺動
後に凝集の有無を肉眼的に判定し、凝集を認めた場合、
陽性と判定することによって行なうことができる。
（１） 血清等の検体１滴（例えば２０μｌ）を判定用
スライド板のサークル内に滴下し、（２） Ｆｃ部位を
ブロックした抗体を含むラテックス試薬１滴を判定用ス
ライド板のサークル内に滴下し、（３） 撹拌棒で検体
とラテックス試薬を混和し、判定用スライド板をゆるや
かに揺動し、（４） 数分間（例えば１〜５分間）揺動
後に凝集の有無を肉眼的に判定し、凝集を認めた場合、
陽性と判定することによって行なうことができる。
【００３９】また、ＥＩＡ法の例としては、マイクロプ
レート・サンドイッチ法を、（１） Ｆｃ部位をブロッ
クした抗体を含む抗体固相マイクロプレートの各ウェル
にキャリブレータ及び検体を入れインキュベーションし
（例えば３７℃で１５分間）、（２） 各ウェルの溶液
を吸引し、洗浄液を加え、（３） 手順（２）の操作を
数回（例えば４回）繰り返し、ウェルを洗浄し、（４）
水分を除き、Ｆｃ部位をブロックした抗体を含む酵素
標識抗体を各ウェルに加え、インキュベーションし（例
えば３７℃で１５分間）、（５） 手順（２）の操作を
数回（例えば４回）繰り返し、ウェルを洗浄し、（６）
酵素反応試薬を各ウェルに加え、インキュベーション
し（例えば３７℃で１０分間）、（７） 酵素反応停止
液を加え、反応を停止させ、（８） 試薬ブランクを対
照に各ウェルの吸光度（例えば４５０ｎｍにおいて）を
測定し、（９） キャリブレータの測定値から検量線を
作成し、検体中の物質の定量を行なうことによって行な
うことができる。この例の場合、手順（１）の抗体固相
マイクロプレート、または、手順（４）の酵素標識抗体
溶液の抗体のどちらか片方がそのＦｃ部位をブロックさ
れていれば、充分な効果が得られるが、片方のみをブロ
ックするときには抗体固相マイクロプレートの抗体がそ
のＦｃ部位をブロックされている方が好ましい。
レート・サンドイッチ法を、（１） Ｆｃ部位をブロッ
クした抗体を含む抗体固相マイクロプレートの各ウェル
にキャリブレータ及び検体を入れインキュベーションし
（例えば３７℃で１５分間）、（２） 各ウェルの溶液
を吸引し、洗浄液を加え、（３） 手順（２）の操作を
数回（例えば４回）繰り返し、ウェルを洗浄し、（４）
水分を除き、Ｆｃ部位をブロックした抗体を含む酵素
標識抗体を各ウェルに加え、インキュベーションし（例
えば３７℃で１５分間）、（５） 手順（２）の操作を
数回（例えば４回）繰り返し、ウェルを洗浄し、（６）
酵素反応試薬を各ウェルに加え、インキュベーション
し（例えば３７℃で１０分間）、（７） 酵素反応停止
液を加え、反応を停止させ、（８） 試薬ブランクを対
照に各ウェルの吸光度（例えば４５０ｎｍにおいて）を
測定し、（９） キャリブレータの測定値から検量線を
作成し、検体中の物質の定量を行なうことによって行な
うことができる。この例の場合、手順（１）の抗体固相
マイクロプレート、または、手順（４）の酵素標識抗体
溶液の抗体のどちらか片方がそのＦｃ部位をブロックさ
れていれば、充分な効果が得られるが、片方のみをブロ
ックするときには抗体固相マイクロプレートの抗体がそ
のＦｃ部位をブロックされている方が好ましい。
【００４０】上記から理解されるように、本発明の免疫
学的測定用試薬で、従来の免疫学的測定用試薬を置き換
えることにより、本発明の免疫学的測定法を従来の免疫
学的測定法と同様の手順で行なうことができ、かつ、Ｒ
Ｆの干渉を抑制することができるのである。
学的測定用試薬で、従来の免疫学的測定用試薬を置き換
えることにより、本発明の免疫学的測定法を従来の免疫
学的測定法と同様の手順で行なうことができ、かつ、Ｒ
Ｆの干渉を抑制することができるのである。
【００４１】本発明のブロックされた抗体が使用される
免疫学的測定法においては、検体は特に制限されず、通
常の免疫学的測定法で対象となる検体に適用できる。検
体としては、ヒト由来のもの、特に、ヒトの血液、尿、
糞便等が挙げられる。特に、血液のようにＲＦの含量が
高い検体の場合には有利である。
免疫学的測定法においては、検体は特に制限されず、通
常の免疫学的測定法で対象となる検体に適用できる。検
体としては、ヒト由来のもの、特に、ヒトの血液、尿、
糞便等が挙げられる。特に、血液のようにＲＦの含量が
高い検体の場合には有利である。
【００４２】本発明の免疫学的測定法における測定対象
の物質は、特に制限されず、通常の免疫学的測定法で測
定されるものが測定できる。例としては、ＣＥＡ、ＡＦ
Ｐ、ＣＡ１９−９、ｈＣＧ、β2m、フェリチン等の腫瘍
マーカー、プロテインＣ、プロテインＳ、ＡＴIII 、Ｆ
ＤＰ、Ｄ−ダイマー等の凝固線溶系マーカー、ＣＲＰ、
ＡＳＯ、ＨＢｓ抗原等の感染症マーカー、ＴＳＨ、プロ
ラクチン、インシュリン等のホルモン、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ、Ｃ３、Ｃ４等の免疫グロブリン及び補体成
分、ミオグロビン、ミオシン等の組織成分が挙げられ
る。
の物質は、特に制限されず、通常の免疫学的測定法で測
定されるものが測定できる。例としては、ＣＥＡ、ＡＦ
Ｐ、ＣＡ１９−９、ｈＣＧ、β2m、フェリチン等の腫瘍
マーカー、プロテインＣ、プロテインＳ、ＡＴIII 、Ｆ
ＤＰ、Ｄ−ダイマー等の凝固線溶系マーカー、ＣＲＰ、
ＡＳＯ、ＨＢｓ抗原等の感染症マーカー、ＴＳＨ、プロ
ラクチン、インシュリン等のホルモン、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ、Ｃ３、Ｃ４等の免疫グロブリン及び補体成
分、ミオグロビン、ミオシン等の組織成分が挙げられ
る。
【００４３】本発明は、検体中に含まれ、免疫学的測定
用抗体のＦｃ部位に結合し、測定のための免疫反応に干
渉して、非特異的反応をもたらす、ＲＦ以外の物質（Ｆ
ｃ結合物質）にも応用できる。このようなＦｃ結合物質
の例としては、補体Ｃ１ｑ、Ｆｃレセプター等がある。
用抗体のＦｃ部位に結合し、測定のための免疫反応に干
渉して、非特異的反応をもたらす、ＲＦ以外の物質（Ｆ
ｃ結合物質）にも応用できる。このようなＦｃ結合物質
の例としては、補体Ｃ１ｑ、Ｆｃレセプター等がある。
【００４４】
【実施例】以下の実施例によって、さらに詳しく本発明
を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもの
ではない。
を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもの
ではない。
【００４５】調製例１ ヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のパパイン消
化によるＦａｂブロック試薬の調製 ヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（免疫グロブ
リン）50mgとパパイン0.5mg を10mMシステイン−2mM Ｅ
ＤＴＡ−0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）に溶
解し、37℃で75分間消化した後、暗所でヨードアセトア
ミド6.3mg を加え、37℃で15分間インキュベーションし
た。反応液を0.01M リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ8.0
）に透析し、内液を取り出し、ＤＥＡＥ−セファロー
スカラムを用いてＦａｂフラグメント（ブロック試薬）
を分離精製した。
化によるＦａｂブロック試薬の調製 ヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（免疫グロブ
リン）50mgとパパイン0.5mg を10mMシステイン−2mM Ｅ
ＤＴＡ−0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.0 ）に溶
解し、37℃で75分間消化した後、暗所でヨードアセトア
ミド6.3mg を加え、37℃で15分間インキュベーションし
た。反応液を0.01M リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ8.0
）に透析し、内液を取り出し、ＤＥＡＥ−セファロー
スカラムを用いてＦａｂフラグメント（ブロック試薬）
を分離精製した。
【００４６】調製例２ ヤギＩｇＧ−抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のペプシン消
化及びＳ−Ｓ結合切断によるＦａｂ’ブロック試薬の調
製 ヤギＩｇＧ−抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（免疫グロブ
リン）50mgとペプシン1.7mg を0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ4.0 ）に溶解し、37℃で18時間消化した後、10
mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）に透析した。内液に
２−メルカプトエタノールを10mMに添加し、37℃で75分
間インキュベーションした後、暗所でヨードアセトアミ
ドを11mMに添加し、４℃で40分間反応させた。反応液を
50mMグリシン緩衝液（ｐＨ8.6 ）に透析し、内液を取り
出しゲル瀘過によってＦａｂ’フラグメント（ブロック
試薬）を分離精製した。
化及びＳ−Ｓ結合切断によるＦａｂ’ブロック試薬の調
製 ヤギＩｇＧ−抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（免疫グロブ
リン）50mgとペプシン1.7mg を0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ4.0 ）に溶解し、37℃で18時間消化した後、10
mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）に透析した。内液に
２−メルカプトエタノールを10mMに添加し、37℃で75分
間インキュベーションした後、暗所でヨードアセトアミ
ドを11mMに添加し、４℃で40分間反応させた。反応液を
50mMグリシン緩衝液（ｐＨ8.6 ）に透析し、内液を取り
出しゲル瀘過によってＦａｂ’フラグメント（ブロック
試薬）を分離精製した。
【００４７】実施例１ （１）抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体感作ラテックス試薬の調製 マウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体0.75mgをリン酸ナ
トリウム緩衝液9.5mlに溶解し、0.65μm のポリスチレ
ンラテックス（固形分10重量％懸濁液）0.5mlを加え、
室温で２時間撹拌した後、感作したラテックスを遠心分
離して上清を分取した。この上清から、以下の方法によ
り、吸着したＩｇＧ抗体量を算出した。
トリウム緩衝液9.5mlに溶解し、0.65μm のポリスチレ
ンラテックス（固形分10重量％懸濁液）0.5mlを加え、
室温で２時間撹拌した後、感作したラテックスを遠心分
離して上清を分取した。この上清から、以下の方法によ
り、吸着したＩｇＧ抗体量を算出した。
【００４８】(a) 上清を0.1 μｍのフィルターで瀘過
し、混入していると思われる微量のラテックスを除去す
る。
し、混入していると思われる微量のラテックスを除去す
る。
【００４９】(b) 瀘液中に残存している未吸着のＩｇＧ
抗体濃度を280nm の吸光度を測定して算出する。
抗体濃度を280nm の吸光度を測定して算出する。
【００５０】(c) 用いたＩｇＧ抗体量から、(b) で算出
された未吸着量を差し引いてラテックスに吸着したＩｇ
Ｇ抗体量とする。
された未吸着量を差し引いてラテックスに吸着したＩｇ
Ｇ抗体量とする。
【００５１】一方、沈澱を、調製例１で得られたＦａｂ
フラグメント2.25mgを含むグリシン緩衝液10mlに懸濁さ
せ、マウスＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックした。さら
に遠心分離して上清を分取した。この上清から、上記と
同様にして、結合したＦａｂフラグメントの量を算出し
た。
フラグメント2.25mgを含むグリシン緩衝液10mlに懸濁さ
せ、マウスＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックした。さら
に遠心分離して上清を分取した。この上清から、上記と
同様にして、結合したＦａｂフラグメントの量を算出し
た。
【００５２】沈澱を牛血清アルブミン溶液（0.1Mグリシ
ン、0.05M 塩化ナトリウム、0.05％アジ化ナトリウム、
0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体感作
ラテックス試薬を調製した。
ン、0.05M 塩化ナトリウム、0.05％アジ化ナトリウム、
0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体感作
ラテックス試薬を調製した。
【００５３】また、前記のように算出されたラテックス
に吸着したＩｇＧ抗体の量とそのＩｇＧ抗体に結合した
Ｆａｂフラグメントの量からモル比を計算し、マウスＩ
ｇＧ抗体１分子当たりに結合している抗マウスＩｇＧ
（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントの数（平均）とし
た。
に吸着したＩｇＧ抗体の量とそのＩｇＧ抗体に結合した
Ｆａｂフラグメントの量からモル比を計算し、マウスＩ
ｇＧ抗体１分子当たりに結合している抗マウスＩｇＧ
（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントの数（平均）とし
た。
【００５４】（２）ＲＦとの非特異的反応 ＲＦ陽性ヒト血清653IU/ml（International Immunology
Corporation）と、前記のように調製した抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬とを一滴ずつ混和した後、
反応板をゆるやかに揺動し、10分間凝集像を観察した。
なお、マウスＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックするＦａ
ｂフラグメント（調製例１）の数の異なる抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬を用いて比較した結果を表
１に示す。
Corporation）と、前記のように調製した抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬とを一滴ずつ混和した後、
反応板をゆるやかに揺動し、10分間凝集像を観察した。
なお、マウスＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックするＦａ
ｂフラグメント（調製例１）の数の異なる抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬を用いて比較した結果を表
１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】マウスＩｇＧ抗体のＦｃ部位が抗マウスＩ
ｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントによりブロック
されている抗体により調製されたラテックス試薬は、Ｒ
Ｆの非特異的凝集凝集反応が観察されなかった。
ｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントによりブロック
されている抗体により調製されたラテックス試薬は、Ｒ
Ｆの非特異的凝集凝集反応が観察されなかった。
【００５７】実施例２ （１）抗ミオグロビン抗体感作ラテックス試薬の調製 ウサギＩｇＧ−抗ミオグロビン抗体1.5mg をグリシン緩
衝液9.5ml に溶解し、0.46μm のポリスチレンラテック
ス（固形分10重量％懸濁液）0.5ml を加え、室温で２時
間撹拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清
を分取した。沈澱を、調製例２によって得られたＦａ
ｂ’フラグメント1.5mg を含むグリシン緩衝液10mlに懸
濁させ、ウサギＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックした。
さらに、遠心分離して上清を分取した。沈澱を牛血清ア
ルブミン溶液（0.1Mグリシン、0.05M 塩化ナトリウム、
0.05％アジ化ナトリウム、0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、
抗ミオグロビン抗体感作ラテックス試薬を調製した。
衝液9.5ml に溶解し、0.46μm のポリスチレンラテック
ス（固形分10重量％懸濁液）0.5ml を加え、室温で２時
間撹拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清
を分取した。沈澱を、調製例２によって得られたＦａ
ｂ’フラグメント1.5mg を含むグリシン緩衝液10mlに懸
濁させ、ウサギＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックした。
さらに、遠心分離して上清を分取した。沈澱を牛血清ア
ルブミン溶液（0.1Mグリシン、0.05M 塩化ナトリウム、
0.05％アジ化ナトリウム、0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、
抗ミオグロビン抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【００５８】また、実施例１と同様に、ラテックスに吸
着したＩｇＧ抗体の量とそのＩｇＧ抗体に結合したＦａ
ｂ’フラグメントの量を算出し、モル比を計算し、ウサ
ギＩｇＧ抗体１分子当たりに結合している抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｆｃ）抗体のＦａｂ’フラグメントの数（平均）と
した。
着したＩｇＧ抗体の量とそのＩｇＧ抗体に結合したＦａ
ｂ’フラグメントの量を算出し、モル比を計算し、ウサ
ギＩｇＧ抗体１分子当たりに結合している抗ウサギＩｇ
Ｇ（Ｆｃ）抗体のＦａｂ’フラグメントの数（平均）と
した。
【００５９】（２）ＲＦとの非特異的反応 ＲＦ陽性ヒト血清653IU/ml（International Immunology
Corporation）と前記のように調製した抗ミオグロビン
抗体感作ラテックス試薬を一滴ずつ混和した後、反応板
をゆるやかに揺動し、10分間凝集像を観察した。なお、
ウサギＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックするＦａｂ’フ
ラグメント（調製例２）の数の異なる抗ミオグロビン抗
体感作ラテックス試薬を用いて比較した結果を表２に示
す。
Corporation）と前記のように調製した抗ミオグロビン
抗体感作ラテックス試薬を一滴ずつ混和した後、反応板
をゆるやかに揺動し、10分間凝集像を観察した。なお、
ウサギＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブロックするＦａｂ’フ
ラグメント（調製例２）の数の異なる抗ミオグロビン抗
体感作ラテックス試薬を用いて比較した結果を表２に示
す。
【００６０】
【表２】
【００６１】ウサギＩｇＧ抗体のＦｃ部位が抗ウサギＩ
ｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂ’フラグメントによりブロッ
クされている抗体により調製されたラテックス試薬は、
ＲＦの非特異的凝集凝集反応が観察されなかった。
ｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂ’フラグメントによりブロッ
クされている抗体により調製されたラテックス試薬は、
ＲＦの非特異的凝集凝集反応が観察されなかった。
【００６２】（３）血清中ミオグロビンの測定 被検者の血清と（１）で調製したラテックス試薬を一滴
ずつ混和した後に反応板をゆるやかに揺動し、５分間の
凝集像を観察した。このようにして測定した凝集像と、
対照として、抗ミオグロビンＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブ
ロック処理していない感作ラテックス試薬を用いて全く
同様に測定して得られた凝集像、及び、被検者の血清に
変性γ−グロブリンを２mg／mlの濃度になるように添加
し、そして１時間静置するという前処理を行なって得ら
れた凝集像とを比較した結果、並びにＲＦ−ラテックス
「生研」を用いてＲＦを定量した結果と共に表３に示
す。
ずつ混和した後に反応板をゆるやかに揺動し、５分間の
凝集像を観察した。このようにして測定した凝集像と、
対照として、抗ミオグロビンＩｇＧ抗体のＦｃ部位をブ
ロック処理していない感作ラテックス試薬を用いて全く
同様に測定して得られた凝集像、及び、被検者の血清に
変性γ−グロブリンを２mg／mlの濃度になるように添加
し、そして１時間静置するという前処理を行なって得ら
れた凝集像とを比較した結果、並びにＲＦ−ラテックス
「生研」を用いてＲＦを定量した結果と共に表３に示
す。
【００６３】
【表３】
【００６４】対照方法（Ｆｃ部位のブロック無し）は、
ＲＦが高値である検体 No.３及び４において、ＲＦによ
る非特異的凝集反応が認められる。また、検体 No.８及
び９においても非特異的凝集反応の影響を受けていると
考えられる。一方、変性γ−グロブリンを添加して、検
体の前処理を行なった後の測定では、ＲＦの非特異的凝
集反応は観察されず、本発明の試薬による測定でもＲＦ
の非特異的凝集反応は観察されなかった。
ＲＦが高値である検体 No.３及び４において、ＲＦによ
る非特異的凝集反応が認められる。また、検体 No.８及
び９においても非特異的凝集反応の影響を受けていると
考えられる。一方、変性γ−グロブリンを添加して、検
体の前処理を行なった後の測定では、ＲＦの非特異的凝
集反応は観察されず、本発明の試薬による測定でもＲＦ
の非特異的凝集反応は観察されなかった。
【００６５】実施例３ （１）ヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のパパ
イン消化によるＦａｂブロック試薬の調製 調製例１と同様にヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）
抗体をパパイン消化した後、暗所でヨードアセトアミド
を10mMに加え、37℃で15分間インキュベーションした。
反応液を100mM グリシン緩衝液（ｐＨ8.6 ）に透析し、
Ｆａｂフラグメント（ブロック試薬）とＦｃフラグメン
トの共存物質を得た。
イン消化によるＦａｂブロック試薬の調製 調製例１と同様にヤギＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）
抗体をパパイン消化した後、暗所でヨードアセトアミド
を10mMに加え、37℃で15分間インキュベーションした。
反応液を100mM グリシン緩衝液（ｐＨ8.6 ）に透析し、
Ｆａｂフラグメント（ブロック試薬）とＦｃフラグメン
トの共存物質を得た。
【００６６】（２）抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体感作ラテック
ス試薬（Ａ試薬）の調製（対照法） マウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体1.25mgをリン酸ナ
トリウム緩衝液9.5mlに溶解し、0.65μm のポリスチレ
ンラテックス（固形分10重量％緩衝液）0.5mlを加え、
室温で２時間撹拌した後、感作したラテックス試薬を遠
心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブミン溶液
（0.1Mグリシン、0.05M 塩化ナトリウム、0.05％アジ化
ナトリウム、0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
ス試薬（Ａ試薬）の調製（対照法） マウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体1.25mgをリン酸ナ
トリウム緩衝液9.5mlに溶解し、0.65μm のポリスチレ
ンラテックス（固形分10重量％緩衝液）0.5mlを加え、
室温で２時間撹拌した後、感作したラテックス試薬を遠
心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブミン溶液
（0.1Mグリシン、0.05M 塩化ナトリウム、0.05％アジ化
ナトリウム、0.2 ％ＢＳＡ）に懸濁させ、抗Ｄ−Ｄｉｍ
ｅｒ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【００６７】（３）Ａ試薬におけるラテックスに吸着し
ているマウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体のＦｃ部位
の、（１）で調製した未精製Ｆａｂフラグメントによる
ブロック Ａ試薬0.5ml に（１）で調製した未精製Ｆａｂフラグメ
ント2.25mgを加え、37℃で30分間インキュベーションし
た後、遠心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブミ
ン溶液に懸濁させＢ試薬を調製した。
ているマウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体のＦｃ部位
の、（１）で調製した未精製Ｆａｂフラグメントによる
ブロック Ａ試薬0.5ml に（１）で調製した未精製Ｆａｂフラグメ
ント2.25mgを加え、37℃で30分間インキュベーションし
た後、遠心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブミ
ン溶液に懸濁させＢ試薬を調製した。
【００６８】（４）Ａ試薬におけるラテックスに吸着し
ているマウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体のＦｃ部位
の、調製例１で得られた精製Ｆａｂフラグメントによる
ブロック Ａ試薬0.5ml に調製例１で得られた精製Ｆａｂフラグメ
ント300 μg を加え、37℃で30分間インキュベーション
した後、遠心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブ
ミン溶液に懸濁させＣ試薬を調製した。
ているマウスＩｇＧ−抗Ｄ−Ｄｉｍｅｒ抗体のＦｃ部位
の、調製例１で得られた精製Ｆａｂフラグメントによる
ブロック Ａ試薬0.5ml に調製例１で得られた精製Ｆａｂフラグメ
ント300 μg を加え、37℃で30分間インキュベーション
した後、遠心分離して上清を捨て、沈澱を牛血清アルブ
ミン溶液に懸濁させＣ試薬を調製した。
【００６９】（５）ＲＦとの非特異的反応 ＲＦ陽性コントロール100IU/ml（日本ロッシュ株式会
社）と前記のように調製したＡ試薬、Ｂ試薬及びＣ試薬
との反応性を比較した。ＲＦ陽性コントロールの１滴ず
つに、各々１滴ずつ、Ａ試薬、Ｂ試薬及びＣ試薬を加
え、混和した後、反応板をゆるやかに揺動し、５分間凝
集像を観察した結果を表４に示す。
社）と前記のように調製したＡ試薬、Ｂ試薬及びＣ試薬
との反応性を比較した。ＲＦ陽性コントロールの１滴ず
つに、各々１滴ずつ、Ａ試薬、Ｂ試薬及びＣ試薬を加
え、混和した後、反応板をゆるやかに揺動し、５分間凝
集像を観察した結果を表４に示す。
【００７０】
【表４】
【００７１】Ａ試薬（対照）は、ＲＦの非特異的凝集反
応が認められる。一方Ａ試薬にブロック試薬（抗マウス
ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメント）を添加処理
したＢ試薬及びＣ試薬ではＲＦの非特異的凝集反応は観
察されなかった。
応が認められる。一方Ａ試薬にブロック試薬（抗マウス
ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメント）を添加処理
したＢ試薬及びＣ試薬ではＲＦの非特異的凝集反応は観
察されなかった。
【００７２】実施例４ （１）ＥＩＡ法（サンドイッチ法）における固相抗体の
Ｆｃ部位のブロック マウスモノクローナル抗体（抗ＦｇＤＰ／抗ＦｂＤＰ抗
体）がコートされたマイクロプレートの各ウエルに調製
例１で得られたブロック試薬１００μｌを分注し、室温
で３０分間振盪した後各ウエルの溶液を吸引し、リン酸
緩衝液を加え洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返し、
固相抗体のＦｃ部位をブロックしたウエル（Ｂ群）を得
た。
Ｆｃ部位のブロック マウスモノクローナル抗体（抗ＦｇＤＰ／抗ＦｂＤＰ抗
体）がコートされたマイクロプレートの各ウエルに調製
例１で得られたブロック試薬１００μｌを分注し、室温
で３０分間振盪した後各ウエルの溶液を吸引し、リン酸
緩衝液を加え洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返し、
固相抗体のＦｃ部位をブロックしたウエル（Ｂ群）を得
た。
【００７３】なお、このＦｃ部位をブロックした抗マウ
スＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントの分子数を
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯＲＡＤ社）
を用いて推定したところ、Ｂ群の固相抗体（マウスＩｇ
Ｇ）のＦｃ部位には、約１分子の抗マウスＩｇＧ（Ｆ
ｃ）抗体のＦａｂフラグメントが結合している。
スＩｇＧ（Ｆｃ）抗体のＦａｂフラグメントの分子数を
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（ＢＩＯＲＡＤ社）
を用いて推定したところ、Ｂ群の固相抗体（マウスＩｇ
Ｇ）のＦｃ部位には、約１分子の抗マウスＩｇＧ（Ｆ
ｃ）抗体のＦａｂフラグメントが結合している。
【００７４】また、前記のブロック試薬のかわりにリン
酸緩衝液１００μｌを加え、同様に処理したウエル（Ａ
群）を対照として得た。
酸緩衝液１００μｌを加え、同様に処理したウエル（Ａ
群）を対照として得た。
【００７５】（２）ＲＦとの非特異反応 ＲＦ陽性ヒト血清１４２１ IU/ml（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）とリン酸緩衝液を用いて、ＲＦ濃度１４２１ IU/
ml，７１０ IU/ml，８９ IU/ml，０ IU/mlのサンプルを
調整した。
ｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）とリン酸緩衝液を用いて、ＲＦ濃度１４２１ IU/
ml，７１０ IU/ml，８９ IU/ml，０ IU/mlのサンプルを
調整した。
【００７６】各サンプル１００μｌを（１）で得たウエ
ル（Ａ群）及び（Ｂ群）にそれぞれ分注し、３７℃で１
５分間インキュベーションした。
ル（Ａ群）及び（Ｂ群）にそれぞれ分注し、３７℃で１
５分間インキュベーションした。
【００７７】ウエル洗浄操作を４回繰り返した後、ペル
オキシダーゼで標識されたマウスモノクローナル抗体
（抗ＦｂＤＰ抗体−ＨＲＰ）１００μｌを各ウエルに分
注し、３７℃で１５分間インキュベーションした。
オキシダーゼで標識されたマウスモノクローナル抗体
（抗ＦｂＤＰ抗体−ＨＲＰ）１００μｌを各ウエルに分
注し、３７℃で１５分間インキュベーションした。
【００７８】その後、ウエル洗浄操作を４回行ない、テ
トラメチルベンジジン溶液１００μｌを分注し、３７℃
で１０分間インキュベーションした。
トラメチルベンジジン溶液１００μｌを分注し、３７℃
で１０分間インキュベーションした。
【００７９】次に、各ウエルに１Ｍ硫酸１００μｌを加
えることによって酵素反応を停止させた。反応停止後、
マイクロタイタープレートリーダー（Ｒｅａｄｅｒ ５
１０オルガノンテクニカ社）を用いて４５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。
えることによって酵素反応を停止させた。反応停止後、
マイクロタイタープレートリーダー（Ｒｅａｄｅｒ ５
１０オルガノンテクニカ社）を用いて４５０ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。
【００８０】その測定結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
【００８２】上記表５の結果から、ＥＩＡ法において、
固相抗体にブロック試薬を添加処理したＢ群は、非処理
であるＡ群（対照）と比較してＲＦの非特異反応を抑制
していることが判る。
固相抗体にブロック試薬を添加処理したＢ群は、非処理
であるＡ群（対照）と比較してＲＦの非特異反応を抑制
していることが判る。
【００８３】
【発明の効果】本発明によれば、ＲＦ等の物質による非
特異反応を排除できるため、偽陽性の削減及び特異性の
向上が達成され、信頼性のより高い臨床検査が可能にな
る。
特異反応を排除できるため、偽陽性の削減及び特異性の
向上が達成され、信頼性のより高い臨床検査が可能にな
る。
【００８４】さらに、本発明によれば、検体自体の前処
理が必要なくなり、迅速な検査が可能になり、また、測
定感度の低下の問題が解消する。さらに、検体中の測定
成分と直接反応する該測定用抗体自体を、ＲＦ等の物質
の影響を避けるために酵素加水分解的に処理する必要が
ないため、測定用抗体への酵素加水分解的処理に伴う影
響（測定感度の低下、抗体の安定性の低下）を避けるこ
とができる。
理が必要なくなり、迅速な検査が可能になり、また、測
定感度の低下の問題が解消する。さらに、検体中の測定
成分と直接反応する該測定用抗体自体を、ＲＦ等の物質
の影響を避けるために酵素加水分解的に処理する必要が
ないため、測定用抗体への酵素加水分解的処理に伴う影
響（測定感度の低下、抗体の安定性の低下）を避けるこ
とができる。
Claims (18)
- 【請求項１】 抗体のＦｃ部位と特異的に結合する免疫
グロブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブロック試
薬によってＦｃ部位がブロックされている、免疫学的測
定法用抗体。 - 【請求項２】 前記ブロック試薬が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ
ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 、ＦａｃｂまたはＦａｂ／ｃフ
ラグメントを含む試薬である請求項１に記載の抗体。 - 【請求項３】 前記ブロック試薬が、抗原結合部位を一
フラグメント当たり一つ含む免疫グロブリンのフラグメ
ントである請求項１に記載の抗体。 - 【請求項４】 前記ブロック試薬が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ
ａｂ’フラグメントである請求項３に記載の抗体。 - 【請求項５】 前記抗体のＦｃ部位が、該部位当たり平
均0.5 〜６のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントでブロ
ックされた請求項４に記載の抗体。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗
体を含む免疫学的測定用試薬。 - 【請求項７】 前記抗体が坦体上に吸着されている請求
項６に記載の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項８】 前記坦体が、ラテックス、ガラスまたは
プラスチックである請求項７に記載の免疫学的測定用試
薬。 - 【請求項９】 前記坦体が、ラテックスである請求項８
に記載の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項１０】 前記抗体が基質上に吸着されている請
求項６に記載の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項１１】 前記抗体が標識されている請求項６に
記載の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項１２】 ＩｇＧ抗体を感作したラテックス坦体
からなり、前記ＩｇＧ抗体のＦｃ部位が異種の抗ＩｇＧ
（Ｆｃ）抗体のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントでブ
ロックされているラテックス試薬である請求項６に記載
の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項１３】 請求項６〜１２のいずれか一項に記載
の免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法。 - 【請求項１４】 一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ
法）、凝集法、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素免
疫学的測定法（ＥＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、免疫
比ろう法（Immunonephelometry）、蛍光イムノアッセ
イ、発光イムノアッセイ、または、凝集法に基づいた比
濁法、比ろう法もしくは粒度分布測定法である請求項１
３に記載の免疫学的測定法。 - 【請求項１５】 抗体のＦｃ部位と特異的に結合する免
疫グロブリンの抗原結合部位を少なくとも含む、免疫学
的測定法用抗体のＦｃ部位をブロックするブロック試
薬。 - 【請求項１６】 Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａ
ｂ’）2 、ＦａｃｂまたはＦａｂ／ｃフラグメントを含
む請求項１５に記載のブロック試薬。 - 【請求項１７】 抗原結合部位を一フラグメント当たり
一つ含む免疫グロブリンのフラグメントである請求項１
５に記載のブロック試薬。 - 【請求項１８】 Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメント
である請求項１７に記載のブロック試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8990193A JPH0727764A (ja) | 1992-04-17 | 1993-04-16 | Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9823992 | 1992-04-17 | ||
| JP4-98239 | 1992-04-17 | ||
| JP8990193A JPH0727764A (ja) | 1992-04-17 | 1993-04-16 | Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0727764A true JPH0727764A (ja) | 1995-01-31 |
Family
ID=26431300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8990193A Pending JPH0727764A (ja) | 1992-04-17 | 1993-04-16 | Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0727764A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1090268A (ja) * | 1996-09-18 | 1998-04-10 | Eiken Chem Co Ltd | 免疫学的粒子凝集反応方法 |
| WO2014065312A1 (ja) * | 2012-10-23 | 2014-05-01 | デンカ生研株式会社 | 尿を変性剤で前処理することによる免疫測定系の感度を上げる方法 |
| WO2021039492A1 (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | コニカミノルタ株式会社 | 検体希釈液、標識化抗体分散液、サンドイッチ法 |
| CN113049834A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-29 | 捷和泰（北京）生物科技有限公司 | 胱抑素c胶乳增强免疫比浊试剂 |
| JP2022500677A (ja) * | 2018-09-18 | 2022-01-04 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | ジカウイルスイムノアッセイの方法および試薬 |
| WO2022065052A1 (ja) * | 2020-09-24 | 2022-03-31 | 株式会社Ｊｖｃケンウッド | 捕捉用抗体、固相担体、検出用抗体、固相担体粒子、並びに検出対象物質の測定キット及び測定方法 |
-
1993
- 1993-04-16 JP JP8990193A patent/JPH0727764A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2023027183A (ja) * | 2018-09-18 | 2023-03-01 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド | ジカウイルスイムノアッセイの方法および試薬 |
| US11959917B2 (en) | 2018-09-18 | 2024-04-16 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Methods and reagents for Zika virus immunoassays |
| WO2021039492A1 (ja) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | コニカミノルタ株式会社 | 検体希釈液、標識化抗体分散液、サンドイッチ法 |
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