JPH04329357A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床診断の一助とするた
めに、生体の抗原性物質を免疫学的測定方法によって測
定することに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の中で生体試料の抗原性物質を
測定する必要性は年々増加している。その検体数は今や
小さな施設でも多数検体を短時間で測定できる自動分析
機を利用しなければ処理できない状況である。

【０００３】従来から免疫学的測定法はＳＲＩＤ法、凝
集反応法、免疫比濁法、免疫比ろう法、酵素免疫測定法
、およびＲＩＡなどが臨床検査法として汎用されてきた
。これらの中で検出系に比色計を搭載した汎用の自動分
析機で容易に利用できる方法は、ラテックス凝集反応法
と免疫比濁法である。ラテックス凝集反応法は測定感度
が免疫比濁法よりも高いことから、近年好んで利用され
るようになった。しかし、ラテックス凝集反応法は高度
に精製した抗体を必要とすることや、自然凝集の少ない
均一な粒径のラテックスが必要なことなどから、試薬の
コストが高くなることがよく知られている。この点、免
疫比濁法は低精製度の抗体を利用できるし、ほかに特に
高価な材料を必要としないことから前者よりは試薬のコ
ストを下げることは容易である。従って生体試料に含ま
れる抗原性物質の濃度が高い場合にはラテックス凝集反
応法よりも免疫比濁法を利用する方が経済的に有利であ
る。

【０００４】免疫比濁法は安価ではあるが、抗原抗体反
応によって生成した免疫複合体粒子が光を乱反射するこ
とを利用して光学的な透過率（吸光度）を測定する方法
であるがために、脂質による試料の濁りやリウマチ因子
（ＲＦ）や補体をはじめその他原因が未だに不明な反応
による微弱な濁りによって妨害されることがある。脂質
の濁りは、例えば特開昭６４−１５６５６号公報では試
薬中に界面活性剤を添加することで解決している。しか
し、ＲＦや補体をはじめその他原因が不明な濁りについ
ては効果的な対策が行われていないか、あるいは不十分
なことが現状である。

【０００５】特公昭６２−２９７４６号公報は、赤血球
を担体とする凝集反応試薬に塩酸グアニジンまたはヨウ
化塩またはチオシアン酸塩を添加し、非特異的反応を防
止し得ることを報告している。また、特公平２−４０９
８３号公報はラテックス凝集反応等、タンパク質をコー
ティングした粒子を試薬とした中に塩酸グアニジンやチ
オシアン酸塩あるいはカオトロピック剤を添加して非特
異的反応を防止することに成功している。しかし、これ
らの特許出願の公報には、抗体を溶解した試薬に抗原を
含む試料を添加し、生じた免疫複合体の濁度を測定して
試料中の抗原濃度を求める免疫比濁法は論じられていな
い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は前項で説明したように、抗体を溶解した試薬
に抗原を含む試料を添加し、一定時間後に生じた免疫複
合体の濁度を測定し、濃度既知の試料によってあらかじ
め測定された濁度と比較することによって、試料中の抗
原濃度を求める免疫比濁法において、リウマチ因子や補
体をはじめその他原因が不明な反応によって引き起こさ
れる非特異的な妨害を防止することである。

【０００７】免疫学的測定法において、非特異的反応の
防止法は重要な問題である。リウマチ因子や補体等非特
異的反応物質が特定できる場合は、抗体の動物種を変更
するとか、抗体の部分例えばＦ（ａｂ’）２フラグメン
ト（特公昭６３−６３８６３号公報）を用いるなどの方
法が試されている。しかし、その他原因が不明な反応は
前記の方法では解決されないことが多い。この様な原因
が不明な反応を防止する目的で、従来から試薬中の塩類
の濃度を高める方法がよく検討されてきた。塩類として
塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、お
よびリン酸カリウムなどはよく利用されている。しかし
、この方法は塩類の濃度を生理的な濃度以上に上げると
非特異的反応を減じることもできるが、一方では抗原抗
体反応を妨害して測定感度を著しく低下させることが知
られている。

【０００８】特公昭６２−２９７４６号公報および特公
平２−４０９８３号公報で問題にしている凝集反応は担
体に固定された抗体と試料中の抗原が反応し結合するこ
とを測定に利用している。本発明で問題としている免疫
比濁法と担体を用いた凝集反応法は本質的には同じ免疫
学的反応であるが（大原編集、免疫の科学１、文永堂書
店発行、１９７７年）、しかし、担体を用いた凝集反応
法、とりわけ抗体を担体に結合させた物を試薬とする受
身凝集反応法では、抗体は固体として存在している。こ
のため試薬盲検値が高く再現性を向上させることが困難
であるほか、臨床検査の場で汎用されている自動分析機
の試薬ノズルを詰まらせたり（特開昭６４−１５６５６
号公報）、特にラテックス担体は反応槽のスチロール製
のセルに溶融してセルを破壊してしまうことも経験され
る。また、担体を用いた凝集反応は固体の抗体と溶液の
抗原の反応であることに対し、本発明で問題にしている
免疫比濁法は抗体分子が溶液に溶解したものである。従
って、担体を用いた凝集法でなし得た技術がそのまま本
発明で問題にしている免疫比濁法に適用できるとは考え
られない。担体を用いた凝集反応に尿素をはじめ塩酸グ
アニジンあるいはチオシアン酸塩（以下、これら薬剤と
省略する）を添加することを思い付いても、免疫比濁法
にこれら薬剤を添加しようとは誰しも考えなかった。な
ぜなら、これら薬剤は水素結合やイオン的結合をはじめ
、分子の会合体の形成を妨害する一種のカオトロピック
イオンとしての作用があることが知られているからであ
る。

【０００９】抗原抗体反応あるいは免疫複合体が集合し
て沈降物を形成する反応は水素結合をはじめ分子の会合
力も大きく作用している。従って、これら薬剤を含む溶
液の中では抗原抗体反応や沈降物の形成が妨害されるこ
とは当業者の間ではよく知られている。この性質を利用
してアフィニティークロマトグラフィーでは、適当な担
体に固定した抗体や抗原で試料中の抗原や抗体をトラッ
プし、未結合成分を洗浄した後３ｍｏｌ／Ｌチオシアン
酸ナトリウムや８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶液を通して抗原や抗
体を溶出させる方法を日常的に利用している。

【００１０】一般に、これら薬剤は免疫学的な反応を妨
害する物質として認識されている。しかし、本発明者は
鋭意研究の結果これら薬剤の濃度を限定し至適濃度で使
用することで、免疫比濁法の測定感度をほとんど減じる
ことなく非特異的反応を防止できることを見いだしこの
発明を完成させた。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を解決
するために、抗体を溶解した試薬に抗原を含む試料を添
加し、一定時間後に生じた免疫複合体の濁度を測定し、
濃度既知の試料によってあらかじめ測定された濁度と比
較することによって試料中の抗原濃度を求める免疫比濁
法において、試薬中に尿素、チオシアン酸塩および塩酸
グアニジンの少なくとも１種類を非特異的反応を防止す
るのに至適な濃度で添加することを特徴とする免疫学的
測定方法を提供する。

【００１２】本発明において、試料としては、ヒトある
いは動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗、腹
水、羊水、ヒトあるいは動物の細胞あるいは臓器の抽出
液等が対象となる。

【００１３】抗原としては、免疫比濁法により測定可能
なものであればいかなるものも対象となるが、例として
は、イムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、補
体Ｃ３、補体Ｃ４、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ト
ランスフェリン、α１−アシドグリコプロテイン、ハプ
トグロブリンなどが挙げられる。

【００１４】抗体は、試料に含まれる抗原に対して特異
的な抗体であれば良い。

【００１５】一定時間とは、抗体を溶解した試薬に抗原
を含む試料を添加することによって生成する免疫複合体
の濁度が測定可能な範囲にある任意の時間でよい。また
、濁度の測定は、１回でも良いし、免疫反応中複数回測
定しても良い。

【００１６】チオシアン酸塩としては、チオシアン酸ナ
トリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸カルシ
ウム、チオシアン酸アンモニウム等のチオシアン酸塩を
用いることができる。

【００１７】非特異的反応を防止するのに至適な濃度に
ついて以下説明を行う。表１は後述の実施例１に示した
免疫比濁法の基礎試薬に至適量の抗ヒトＣＲＰウサギ抗
体および、Ａは尿素、Ｂはチオシアン酸ナトリウム（チ
オシアン酸Ｎａ），Ｃは塩酸グアニジンを添加した試薬
で、ヒト血清試料中のＣＲＰ値を免疫比濁法によって測
定したデータである。

【００１８】

【表１】

【００１９】Ａでは非特異的反応の影響をほとんど受け
ないと言われているＳＲＩＤ法で測定した値は９±３ｍ
ｇ／Ｌであるも、尿素を添加しない免疫比濁法では１２
ｍｇ／Ｌに測定され平均３ｍｇ／Ｌの正誤差を確認した
。ＢではＳＲＩＤ法の測定値は１９±３ｍｇ／Ｌに対し
て、チオシアン酸ナトリウムがないと２４ｍｇ／Ｌに測
定され平均５ｍｇ／Ｌの正誤差を確認した。ＣではＳＲ
ＩＤ法の測定値は３９±４ｍｇ／Ｌに対して、塩酸グア
ニジンを添加しないと５７ｍｇ／Ｌに測定され、平均１
８ｍｇ／Ｌの正誤差を確認した。

【００２０】表２は前記のＣＲＰ測定試液中の抗体を補
体成分Ｃ３またはＣ４に対する抗体に変えて、各々血清
試料中のＣ３値およびＣ４値を測定した時のデータであ
る。

【００２１】

【表２】

【００２２】Ｄでは添加薬剤として尿素、Ｅはチオシア
ン酸ナトリウムを添加した。ＳＲＩＤ法ではＣ３は９４
０±３０ｍｇ／Ｌに、Ｃ４は２７０±３０ｍｇ／Ｌと測
定された。しかし、これら薬剤を添加しない免疫比濁法
では各々、９８０〜１０００ｍｇ／Ｌと３００〜３１０
ｍｇ／Ｌとやや高値となることが分かる。しかし、いず
れの測定系でもこれら薬剤を多量に添加すると、測定値
は低下することも分かる。

【００２３】これら薬剤の至適濃度は以上のデータから
も示されるように、測定する抗原の種類およびこれら薬
剤の種類によって異なる。ＣＲＰの測定系で尿素の至適
量はおおよそ０．２５から０．７５ｍｏｌ／Ｌ、望まし
くは０．３から０．５８ｍｏｌ／Ｌの範囲内である。ま
たチオシアン酸ナトリウムはおおよそ０．０９から０．
３１ｍｏｌ／Ｌ、望ましくは０．１２から０．２２ｍｏ
ｌ／Ｌの範囲内である。更に塩酸グアニジンは０．０９
から０．４８ｍｏｌ／Ｌ望ましくは０．１０から０．４
０ｍｏｌ／Ｌである。Ｃ３およびＣ４測定系において、
尿素の至適量はおおよそ０．０５から０．３３ｍｏｌ／
Ｌ、望ましくは０．０８から０．２５ｍｏｌ／Ｌである
。また、チオシアン酸ナトリウムではおおよそ０．０４
から０．０９ｍｏｌ／Ｌ、望ましくは０．０６ｍｏｌ／
Ｌ付近である。しかし、ここに示した数値によって本発
明の薬剤の至適濃度は特に限定されるものではなく、実
際には薬剤の種類および測定すべき抗原物質やそれに対
する抗体の種類によって至適濃度は決定されるものであ
る。更に、実施例によってその効果を説明する。

【００２４】

【実施例】以下、実施例に従って本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例によって何等限定されるものでは
ない。

【００２５】実施例１ 免疫比濁法の基礎試薬として、以下の組成の溶液を調製
した。 　　　　　　免疫比濁法の基礎試薬 　　　　　　　　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃
６０００　　　　　　３．５％　　　　　　　　ｐＨ８
．０　　トリス塩酸緩衝液　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ　　　　　　　　塩化
ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　０．９％

【００２６】こ
の免疫比濁法の基礎試薬に尿素を０．４２ｍｏｌ／Ｌに
なるように添加した試薬と尿素を添加しない試薬のそれ
ぞれを第一試液とし、次にベッカー単位４ｍｇ／ｍＬの
抗ヒトＣＲＰウサギ抗体液を６ｖ／ｖ％になるように免
疫比濁法の基礎試薬に添加したものを第二試液とした。 第一試液２６０μＬに試料血清またはＣＲＰ標準液１４
μＬを混合後、３７℃で４分３０秒後に波長３４０ｎｍ
で吸光度Ａ１を測定し、第二試液１３０μＬを添加して
から３７℃で５分後に再び３４０ｎｍの吸光度Ａ２を測
定した。試料血清のＣＲＰ濃度は（Ａ２−０．６７８Ａ
１）を真の濁度として標準液の濁度から換算した。測定
操作は汎用の自動分析機を利用した。患者血清５５例に
ついてＣＲＰ濃度５ｍｇ／Ｌをカットオフ値としＳＲＩ
Ｄ法の測定値を真値として本免疫比濁法の測定感度（真
の陽性の検出度）および特異度（真の陰性の検出度）を
計算した。この結果を表３に示した。

【００２７】

【表３】

【００２８】尿素の非添加と添加で免疫比濁法の測定感
度は１００％と変わらないが、特異度は８２．９％、お
よび９４．３％と尿素を添加することで１１．４ポイン
ト上昇した。

【００２９】実施例２ 実施例１の免疫比濁法の基礎試薬に尿素を０．５０ｍｏ
ｌ／Ｌになるように添加した試薬と尿素を添加しない試
薬のそれぞれを第一試液とし、次にベッカー単位４ｍｇ
／ｍＬの抗ヒトＣＲＰウサギ抗体液を１２ｖ／ｖ％にな
るように免疫比濁法の基礎試薬に添加したものを第二試
液とした。第一試液２６０μＬに試料血清またはＣＲＰ
標準液１２μＬを混合後、３７℃で４分３０秒後に波長
３４０ｎｍで吸光度Ａ１を測定し、第二試液６５μＬを
添加してから３７℃で５分後に再び３４０ｎｍの吸光度
Ａ２を測定した。試料血清のＣＲＰ濃度は（Ａ２−０．
８０７Ａ１）を真の濁度とし、標準液の濁度から換算し
た。測定操作は汎用の自動分析機を利用した。患者血清
５５例についてＣＲＰ濃度５ｍｇ／Ｌをカットオフ値と
しＳＲＩＤ法の測定値を真値として本免疫比濁法の測定
感度および特異度を計算した。この結果を表４に示した
。

【００３０】

【表４】

【００３１】尿素の非添加と添加で免疫比濁法の測定感
度は１００％と変わらないが、特異度は８５．７％、お
よび９４．３％と尿素を添加することで８．６ポイント
上昇した。

【００３２】

【発明の効果】抗体を溶解した試薬に抗原を含む試料を
添加し、一定時間後に生じた免疫複合体の濁度を測定し
、濃度既知の試料によってあらかじめ測定された濁度と
比較することによって、試料中の抗原濃度を求める免疫
比濁法において、試薬中に尿素、チオシアン酸塩および
塩酸グアニジンの少なくとも１種類を至適濃度で添加す
ることによって、非特異的反応を抑制し、測定感度（真
の陽性の検出度）を低下させることなく特異度（真の陰
性の検出度）を有意に上昇させることを可能にした。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　抗体を溶解した試薬に抗原を含む試料
   を添加し、一定時間後に生じた免疫複合体の濁度を測定
   し、濃度既知の試料によってあらかじめ測定された濁度
   と比較することによって試料中の抗原濃度を求める免疫
   比濁法において、試薬中に尿素、チオシアン酸塩および
   塩酸グアニジンの少なくとも１種類を非特異的反応を防
   止するのに至適な濃度で添加することを特徴とする免疫
   学的測定方法。