JPH0728726B2

JPH0728726B2 - 新規微生物

Info

Publication number: JPH0728726B2
Application number: JP9259586A
Authority: JP
Inventors: 千晶杉本; 完治西澤; 雅子杉本; 一美園田; 文貴岸本
Original assignee: 住友化学工業株式会社
Priority date: 1986-04-22
Filing date: 1986-04-22
Publication date: 1995-04-05
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: JPS62248482A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、バシラス（Bacillus）属に属する新規な微生
物に関する。

従来技術及び問題点下記式（Ｉ）で示されるジクロルビニル菊酸の光学活性
体を取得する。

方法としては、有機合成化学的分割法および酵素を用い
た分割法が知られているが、前者では、比較的高価な光
学活性試薬および煩雑な工程を必要とすること、後者で
は、高価な豚肝エステラーゼを必要とする（例えばSchn
eiderら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.（1984）23:64−66
参照）ことなどの点から、有利な光学分割法の開発が望
まれている。

豚肝エステラーゼの代わりに微生物菌体を用いた方法も
試みられている（公開特許公報60−244295）が、その収
量は微生物培養液100ml当たり31.2mg程度であり、工業
的に使用するには不十分なものである。

本発明の説明そこで本発明者らは、斯かる現状に臨み、下記式（II）
で示されるジクロルビニル菊酸エチルを効率良く、また光学選択性よく、不斉加水分解する能力
を有する微生物を自然界より広く検索した結果、バシラ
ス（Bacillus）属に属する微生物中に斯かる能力を有す
るものがあることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、バシラス（Bacillus）属に属し、
ジクロルビニル菊酸エチルを不斉加水分解して、（＋）
−トランス−ジクロルビニル菊酸を生成する能力を有す
る新規なバシラスエスピーDC−１（Bacillus sp.DC−
１）（微工研菌寄第8719号）に関するものである。

次に、本発明者らが、分離・採取した本菌株の菌学的性
質を詳述する。

（ａ）形態１）細胞の形態および大きさ：桿状で（0.5〜0.6）μｍ
×（1.2〜1.7）μｍ。単独または２〜３個の連鎖をな
す。

２）多形性：なし３）運動性：あり周鞭毛を有する４）胞子の形状：あり形状あるいはやや卵形で、直径
0.4〜0.6μｍ。栄養細胞の末端に形成されふくらみを有
する。

５）グラム染色：陰性６）抗酸性：なし（ｂ）各種培地における生育状態１）肉汁寒天平板培地（35℃、24時間）形状：円形周縁：なし隆起：凸状光沢：あり表面：平滑色調：半透明で黄白色２）肉汁寒天斜面培養（35℃、24時間）生育度：普通拡布状またはじゅず状に生育表面：平滑色調：半透明で黄白色光沢：あり３）肉汁液体培養（35℃、24時間）生育度：普通着色・脱色：なし表面生育：菌環は形成しない沈渣：生じる４）肉汁ゼラチン穿刺培養（35℃、14日間）ゼラチンを液化しない５）リトマスミルク培地（35℃、14日間）わずかにアルカリ化し、凝固およびペプトン化しない。

（ｃ）生理学的性質 35℃、１〜５日間培養。陰性のものは14日間まで観察。

１）硝酸塩の還元：陽性硝酸を還元し、亜硫酸を生成する。

２）脱窒反応：陰性３）MRテスト：陰性４）VPテスト：陰性５）インドールの生成：陰性６）硫化水素の生成：陰性７）デンプンの加水分解：陰性８）クエン酸の利用 Koserの培地：陰性 Christensenの培地：陽性９）無機・窒素源の利用山里らによるStanierらの培地の変法（Yamazato et al.
J.Gen.Appl.Microbiol.（1982）28:195−213）を用い、
コハク酸ナトリウムを炭素源として使用した。

硝酸塩：利用しないアンモニウム塩：利用する 10）色素の生成生成しない 11）ウレアーゼ Christensenの尿素培地：陽性 12）オキシターゼ：陽性 13）カラターゼ：陽性 14）生育の範囲生育温度:10〜45℃（最適30〜35℃）生育pH:6.0〜9.5（最適8.5〜9.0） 15）酸素に対する態度：好気的にのみ生育する 16）OFテスト：陰性 17）糖類からの酸・ガスの生成酸ガスＬ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース − − Ｄ−ガラクトース − − 麦芽糖 − − ショ糖 − − 乳糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニット − − イノシット − − グリセリン − − デンプン − − 以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイズ・
マニュアル・オブ・デターミィネィティブ・バクテリオ
ロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriol
ogy）第８版（1974年）に基づき検索した結果、好気的
条件下に生育する有胞子桿菌であることから、バシラス
（Bacillus）属に属する菌株と同定した。また、本菌株
を同属中の菌種と比較すると、バシラス・スファエリカ
ス（Bacillus sphaericus）およびバシラス・パステウ
リー（Bacillus pasteurii）に近似しているが、表１に
示す点で、これらの菌種とは異なっている。

以上のことから、本菌株をバシラス（Bacillus）属に属
する新菌種と認め、バシラスエスピーDC−１（Bacill
us sp.DC−１）と命名した。なお、本菌株は、工業技術
院微生物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第87
19号として寄託されている。

また、前記の菌株から紫外線、Ｘ線、γ線の照射などの
物理的処理、もしくはニトロソグアニジンなどによる薬
剤処理など、一般的変異誘導法による誘発突然変異また
は自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導され
た変異株も本発明の範囲内である。

分類源の土壌からの本菌株の分離は、ジクロルビニル菊
酸エチルエステル含有培地を用い、醗酵学の分野で公知
の常法に従って行った。

本菌株の培養は、醗酵学の分野で公知の常法に従って行
う事ができる。培地としては、この菌株が資化可能な炭
素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、
微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用さ
れる。具体的には、炭素源としてはグルコース、フラク
トース・マルトース、ガラクトース、リボース、サッカ
ロース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖
類、麦、米などの天然炭水化物、グリセロール、マンニ
トール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、
グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの脂肪酸
類、ノルマルパラフィン、ケロシンなどの炭化水素類、
グリシン、グルタミン酸、グルタミン、アラニン、アス
パラギンなどのアミノ酸類など一般的な炭素源より使用
する微生物の資化性を考慮して、一種または二種以上を
適宜選択して使用すれば良い。

窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、フ
ィッシュミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿
素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮
し、一種または二種以上を適宜選択して使用する。

さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、
鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カリウムなど
のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの一
種または二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、
界面活性剤などの消泡剤を添加しても良い。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培
養、通気撹拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培
養法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すれば
良く、本菌株が増殖し、ジクロルビニル菊酸エチルを不
斉加水分解できる条件であれば特に制限はない。通常
は、培養開始のpHを８〜９に調製し、30〜35℃の温度条
件下で培養することが好ましい。培養日数は通常１〜２
日が適当である。

以上のように、本菌株を培養した後、得られた培養物、
培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離などの通常の
方法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処
理を施して得られる菌体処理物を前記のようなジクロル
ビニル菊酸エチルの不斉加水分解反応に使用することが
できる。

ここで、培養物とは培養後の培地と培養菌体が未分解の
状態のものをいい、菌体処理物とは、乾燥菌体、細胞膜
および／または壁変性菌体、固定化菌体などをいう菌体処理物を得るための方法を例示すれば以下の通りで
ある。すなわち、（１）生菌体に対し、たとえば凍結融
解処理、アセトン乾燥処理、磨砕処理、超音波処理、浸
透圧差処理などの物理的処理手段、もしくはたとえば、
リゾチーム、細胞壁溶解酸素などの酸素処理、界面活性
剤との接触処理などの化学的ないし生物化学的処理を単
独もしくは組み合わせて施すことにより、また、（２）
生菌体、乾燥菌体、細胞膜および／または壁変性菌株な
どに包括処理、架橋処理、単体への吸着処理などの固定
化手段を施すことにより、菌体処理物を得ることができ
る。

以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明する
が、これらはいずれも実施の一態種を示すものであっ
て、本発明の範囲をなんら制限するものではない。

実施例１兵庫県宝塚市で採取した土壌の小スパーテル１杯分（約
0.5g）をジクロルビニル菊酸エチルを唯一の炭素源とす
る分離用培地（表１）10mlに添加し、30℃で３日間振と
う培養した後、培養液0.1mlを新しい分離用培地に接種
し、同様に培養した。

表１分離用培地組成ジクロルビニル菊酸エチル 60mg KH₂PO₄ 0.5g K₂HPO₄ 0.5g （NH₄）₂SO₄ 2.0g 酵母エキス 1.0g MgSO₄・7H₂O 0.2g CuSO₄・5H₂O 5mg MuCl₂・4H₂o 5mg ZnSO₄・7H₂O 1mg FeSO₄・7H₂O 2mg 蒸留水１ pH 9.0（10％Na₂CO₃で調整）この操作を３回繰り返した後、増殖を示した培養液を滅
菌水により適度に希釈し、分離用培地に寒天を２％濃度
になるように加えた分離用寒天平板培地に塗株し、30℃
で４日間培養した。生じた複数のコロニーが相互に相違
しないことを肉眼的および顕微鏡的に確認できるまで、
分離用寒天平板培地への移植を繰り返し、本菌株を得
た。

この菌株の各種培地における生育状態および生理学的性
質は、前述した通りである。

次いで、本菌株を利用して、ジクロルビニル菊酸エチル
の不斉加水分解反応を実施した例を参考例として挙げ
る。

参考例１酵母エキス5g、ポリペプトン5g、リン酸−カリウム1g、
硫酸マグネシウム（７水塩）0.2gを蒸留水１に溶か
し、10％炭酸ナトリウム水溶液でpHを9.0に調整した。
この液体培地10mlを直径24mmの試験管に入れ、120℃で1
5分間高圧蒸気滅菌した後、バシラスエスピーDC−１
（Bacillus sp.DC−１）を１白金耳接種し、30℃で24時
間振とう培養し、前培養とした。

上記と同じ組成の培地100mlを500ml容の三角フラスコに
入れ、同様に滅菌した後、前培養液1mlを接種し、30℃
で24時間振とう培養した後、ラセミ−ジクロルビニル菊
酸エチル（シス／トランス比＝45/55）0.6gを添加し、
さらに30℃で96時間振とうし、反応させた。

この反応液に35％HCl 1mlを加え、メチルイソブチルケ
トン50mlで生成したジクロルビニル菊酸と未反応のジク
ロルビニル菊酸エチルを抽出した。

抽出物をガスクロマトグラフィー（カラム:30％Thermon3000,1.1m,140℃）で分析し、ジ
クロルビニル菊酸とジクロルビニル菊酸エチルのピーク
面積比より、収率を算出した。

上記の抽出液に、IN NaOH 20mlを加え、アルカリ抽出を
行い、遊離のジクロルビニル菊酸を単離した。得られた
ジクロルビニル菊酸のうち5mgをトルエン1mlに溶解し、
等モルの塩化チオニル、ピリジン、ジクロルアニリンを
加えて反応させ、アニリドとし高速液体クロマトグラフ
ィー（カラム:SUMIPAX OA−2100、移動相ｎ−ヘキサン
−ジクロロエタン（17:3,v/v）流速:1.0ml/min）で異性体分析を行った。以上の結果を表２に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者園田一美兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号住友化学工業株式会社内 (72)発明者岸本文貴兵庫県宝塚市高司４丁目２番１号住友化学工業株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジクロルビニル菊酸エチルを不斉加水分解
して、ジクロルビニル菊酸の光学活性体に変換する能力
を有する、バシラス・エスピーDC−１株（微工研菌寄第
8719号）