JPS62265995A

JPS62265995A - 乾式液体分析要素の製造方法

Info

Publication number: JPS62265995A
Application number: JP10797686A
Authority: JP
Inventors: Kaoru Terajima; 薫寺島
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1986-05-12
Filing date: 1986-05-12
Publication date: 1987-11-18
Also published as: JPH0522518B2; DE3715245A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血清のような生物液体中のアルカリ性ホスファ
ターゼの活性を定量するのに有用な乾式分析要素の製造
方法に関する。

パラニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）の塩が
、アルカリ性ホスファターゼに対する基質として知られ
ている。ジナトリウム塩は乾燥状態における安定性がよ
くないことは昭和４０年ころすでによく知られていた。

また、ある種のアミン塩、例えばトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン塩、ジシクロヘキシルアンモニウム
塩は比較的安定な試薬であることが、特公昭４５−３４
８７２号で知られている。

同公報に見体例として記載されているアミンは上記のほ
か、メチルアミン、エチルアミン、ジプロピルアミン、
１〜リブチルアミン、ジクロヘキシルアミン、ジシクロ
ヘキシルアミン、トリシクロヘキシルアミン、モノエタ
ノールアミン、ベンジルアミン、ジメチルアミン、トリ
チルアミン、フルフリルアミン、アニリン、ジェタノー
ルアミン、モルホリンである。　そしてこれらのアミン
塩が水に容易に溶解し得ることが示されている。

しかし、これらの水溶性塩は、特公昭５３−２１６７７
号や特開昭５５−１６４３５６号に記載された乾式多層
液体分析要素に水溶液として適用した場合、安定性が良
くない、このことは特開昭６０−２３７９９９号明細書
にも指摘されている所である。

保存安定性のよいアルカリ性ホスファターゼ定１用屹弐
分析要素の実現が望まれており、その目的で、１１開昭
６０−２３７９９９号では基質を溶液に溶解せず粒末状
にして塗布液に分散する方法を提案している。しかし乾
燥状態あるいは貧溶媒中で基質をａ械的に分散するこの
方法では再現性のよい結果を得ることが容易でない、す
なわち、高い分析精度を得ることが難しい。

［発明の目的］本発明の目的は、保存安定性が良く、分析精度の高いア
ルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素と製造する
方法の提供にある。

［発明の要旨コ上記目的は、少なくとも液体展開層などの８Ｉ体透過性
層を有するアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要
素の製造にあたり、パラニトロフェニルホスフェート（
＋）−ＮＰＰ）のアミンまたはアミノアルコール塩を、
良溶媒（例えば水、メタノール）の溶液とし、貧溶媒（
例えばアセＩ・ン）と混合して析出させ、液相と固相を
分離し、分離した固相を溶解または分散して、液体展開
層などのような液体透過性層の塗布または浸漬組成物と
して用いたことを特徴とする、アルカリ性ホスファター
ゼ定量用乾式分析要素の製造方法によって、達成された
。

この方法によって製造された乾式分析要素は、保存安定
性が極めて良く、分析精度が高い。

ｐ−ＮＰＰのアミ、ンまたはアミノアルコール塩として
は、例えば前記の特公昭４５−３４８７２号公報に記載
されているトリス（しドロキシメチル）アミノメタン　
（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパ
ンジオール）、ジシクロヘキシルアミン、メチルアミン
、エチルアミン、ジプロピルアミン、トリブチルアミン
、シクロヘキシルアミン、シンクロヘキシルアミン、ト
リシクロヘキシルアミン、モノエタノールアミン、ベン
ジルアミン、ジメチルアミン、トリチルアミン、フルフ
リルアミン、アニリン、ジェタノールアミン、モルホリ
ン等の塩があげられる。これらは、水溶性である。また
アルコール、特にメタノールに可溶な塩は、２−アミノ
−２−メチルプロパン−１，３′−ジオール塩および２
−アミノ−２−エチルプロパン−１，３−ジオール塩で
ある。

これらの塩のいずれかを、良溶媒の適当な濃度の溶液と
する。

上記の塩は良溶媒が少ないので、貧溶媒としては広範囲
のものが用いられる０例えば、アセトン、メチルエチル
クトン、シクロヘキサン、ベンゼン′、！・ルエン等で
ある。ｉ溶媒は、塩溶液に塩が析出するに一トシ１な量
を加える。

析出した固相を液相から分離するには、周知の方法を用
いることができる。すなわち重力沈降、遠心沈降、慣性
衝突、ろ過のいずれの方法も用いることができるが、重
力沈降、遠心沈降、またはろ過が簡便である。ろ過には
、加圧ろ過または減圧ろ過も用いることができる。

良溶媒に再度溶解するよりは貧溶媒に分散する方が好ま
しい、析出した塩の分散には、特別な分散機（コロイド
ミルなと）を必要とせず、かくはん棒を用いて軽くかく
はんする程度で十分である。

液体展開層は織物、編み物またはセルロース不織布から
成る展開層であることが好ましい、しかし、プラッシュ
ポリマーや粒状構造物から成る展開層を有する乾式分析
要素にも適用可能である。

本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。特に自己原色性基質と被検液がいずれも透過し得
る固体担体を含む要素に適用することが出来る。要素は
光透過性・液不透過性の支持体上に、多孔性液体展開層
のほかに下塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、光道
へい層、ろ過層、および公知のその他の層を有する多層
福運であってもよい、かような分析要素として、米国特
許第３，９９２，１５８号、同４，０４２，３３５号お
よび特開昭５５−１６４３５６号各明細書に開示された
ものがある。

支持体を用いる場合、本発明で製造される乾式分析要素
の実用的に採りつる構成は（１）支持体上に液体展開層を有するもの。

（２）支持体上に試薬層、液体展開層をこの順に有する
もの、この場合ＮＰＰ基質は試薬層、Ｗｔ体展Ｉ７１層
いずれに含まれてもよいが、液体展開層に含まれるのが
好ましい、試薬層は２以上の試薬層から成ってもよい。

（３）支持体上に試薬層、光道へい層、液体展開層をこ
の順に有するもの、この場合ＮＰＰ基質は試′ＸＮｌ、
光道へい層、液体展開層いずれに含まれてもよいが、液
体層１７ＦＩＪＣｉｌに含まれるのが好ましい。

（４）支持体上に検出層、光道へい層、液体展開層をこ
の順に有するもの、ＮＰＰ基質は光道へい層、液体展開
層いずれに含まれてもよいが、液体展開層に含まれるの
が好ましい。

（５）支持体上に検出層、光道へい層、試薬層、液体展
開層をこの順に有するもの、ＮＰＰ基冒は試薬層、光道
へい層、液体展開層いずれに含まれてもよいが、液体展
開層に含まれるのが好ましい。

（６）支持体上に検出層、第二試薬層、光道へい層、第
一試薬層、液体展開層をこの順に有するもの。ＮＰＰ基
質は試薬層のいずれか、光道へい層、液体展開層いずれ
に含まれてもよいが、液体展開層に含まれるのが好まし
い。

上記（１）ないしく６）において検出層と試薬層もしく
は液体展開層の間、試薬層と液体展開層の間、光道へい
層と検出層、試薬層もしくは液体展開層の間、または二
つの試薬層の間に、ろ過層を設けてもよい。支持体と検
出層、試薬層または液体展開層の間に吸水層を有しても
よい、また、支持体と検出層、試薬層もしくは液体展開
層の間、試薬層と液体展開層の間、光道へい層と検出層
、試薬層もしくは液体展開層の間、または二つの試薬層
の間にｐＨ）ｌ’ｆＦｒ層あるいは硬膜層等を設けても
よい０本発明で好ましいのは上記（１）（２）または（
３）の層構成である。

本発明により製造される乾式分析要素においてＮＰＰ基
質は二つ以上のＮ（例えば試薬層と液体展開層、あるい
は第二試薬層と第一試薬層、第一試薬層と液体展開層）
に含有されてもよい、この場合に、基質のそれぞれ一方
を支持体から遠い層か支持体に近い層のいずれかに、よ
り多く分布させることもできる。

本発明で製造される乾式分析要素に用いることができる
光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレ
ンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネー
ト、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセデートプロピオネー
ト等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｌから約１１
′Ｍ、好ましくは約　８０μｍから約３００μｌの範囲
のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げること
ができる。　これら支持体の表面には必要により下塗層
を設けて、支持体の上に設けられる吸水層、試薬層笠の
層と支持体との接着を強固なものにすることができる。

また、下塗層の代りに、支持体の表面に物理的（たとえ
ばグロー放電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処
理を施して接着力の向上を図ってもよい。

本発明で製造される一体型多層分析要素には、光透過性
・水不透過性支持体の上に（場合によっては下塗層等の
他の層を介して）吸水層を設けてもよい０本発明の乾式
分析要素に備えられる吸水層は、親水性結合剤よりなり
、水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを層形成成分と
する層であることが好ましい。

吸水層に用いることができる親水性ポリマーは、一般に
は水吸収時の膨潤率が３０℃で約１，５から２０、好ま
しくは約２．５から１５の範囲の天然または合成親水性
ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例として
は、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラ
チン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フ
タル化ゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン
誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

吸水層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μβの範
囲であることが好ましく、より好ましくは約３μ５から
約３０μｌの範囲である。さらに吸水層には、必要に応
じて界面活性剤（カチオン性、両性、又は、非イオン性
）やｙ１衝剤を含有させることらできる。

本発明で製造される乾式分析要素の吸水層には、光！！
蔽性（反射性または吸収性）微粒子を必要に応じてき有
させることができる。

吸水層、試薬層、場きによっては光道へい層、ＦＡＮ、
等の層の上には、展開層を接着し積層するための接着層
を設けてもよい、接着層は水で湿潤しているとき、また
は水を含んで！１ｉｌＪ潤したときにｒｘ開層を接着す
ることができるような親水性ポリマーからなることが好
ましい、接着層に用いることができる親水性ポリマーの
例としては、吸水層に用いられると同様な親水性ポリマ
ーがあげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン
誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい、接着層の乾
煙膜厚は一般に約０．５μｌから約２０μｍ、好ましく
は約１μｓから約１０μｌの範囲である。なお、接着層
は展ｒＭＮ以外の他の眉間の接着力を向上させるため、
所望の層上に設けてもよい、接着層は親水性ポリマーと
、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を
公知の方法で、吸水層等の上に塗布する方法などにより
設けることができる。

本発明で製造される乾式分析要素の試薬層に含有させる
ことができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、
燐酸塩やグツド（Ｇｏ　ｏ　ｄ　）の緩衝剤などの公知
のｔｌｌ’Ｉ剤を挙げることができる。

これらの緩衝剤はｒ蛋白質・酵素の基礎実験法」（堀尾
武−１他著、南江堂、１９８１）等の公知文献を参考に
して選択し、使用することができる。

光遮蔽層は、皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、光反射性微粒子が分散されている水浸透
性の屑であることが好ましい、光反射性微粒子は、検出
層に生じた検出可能な変ｆヒ（色変化、発色等）を光透
過性を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に
点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場
合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層
または背景層としても機能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、顔料微粒子たと
えば二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型また
はブルツカイト型の、粒子径が約０．１μｌから約１．
２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウｌ、微粒子や、ア
ルミニウム微粒Ｔ１を挙げることができる。これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ま
しい。特に好ましいのは、ルチル型二酸化チタン微粒子
である。

皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例とし
ては、前述の検出層の製造に用いられる親水性ポリマー
のほかに弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテ
ート等を挙げることができ、これらのうちではゼラチン
、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい、
なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添
加することかで二・る。

光！！蔽層は、光反射性微粒子と親水性ポリマ−との水
性分散液を公知の方法により検出層、試薬層等の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。

本発明において、必要に応じ展開層中にも上記のごとき
光反射性微粒子を含有させてもよい。

展開層は、液体計１作用を有する展開層であることが好
ましい、ｉ木２ｔＺ作用を有するとは、その表面に点着
供給された１１体試料を、その中に含有している部分を
実質的に偏在させることなく、構（水平）方向に単位面
碩当りほぼ一定量の割合で広げる作用を有することであ
る。

展＃ＩＮのマトリックスを構成する材料としては、２紙
、不織布、ｌａ物生地（例、ブロード、ボブリン等の平
織等）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコッ
ト編、ミラニーズ編等）、ガラス繊維ｒ紙、プラッシュ
ポリマーより形成されるメンブランフィルタ−１あるい
はポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物
等を用いることができる。これらのうちでは、織物生地
および編物生地に代表される繊維質層を用いることが好
ましい。これらの詳細については特開昭５５−１６４３
５Ｇ号、同５７−６６３５９号および同６０−２２２７
６９号を参照すればよい。

本発明で製造される乾式分析要素に用いることができる
ｍ物生地ｉたは編物生地は水洗等の脱脂処理により糸、
織物あるいは編物の製造時に付着した油脂類が実質的に
除去されていることが好ましい。

本発明で製造される一体型多層分析要素は、−通約１５
ｉ＋ａ＋から約３０ａｘの正方形またはほぼ同サイズ円
形等の小片に裁断し、特開昭５７−６３４５２３．０開
昭５４−１５６０７９号、実開昭５６−１２５４２４号
、実開昭５８−３２３５０号および？？？３昭５８−５
０１１４４号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分
析スライドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存お
よび測定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明で製造される乾式分析要素は、約５μｌから約３
０μ！、好ましくは約８μｌから約１５μｒの水性液体
試料を展開層に点着供給し、必要に応じて約　２０℃か
ら約４５℃の範囲の実質的に一定の温度でインキュベー
ションする。その後、一方の側から（一体型多層分析要
素においては光透過性支持体側から）乾式分析要素内の
色変化、発色等の検出可能な変化を反射測光し比色法の
原理により液体試料中の測定対象成分を分析する。

〔実施例１〕ｆｉｌ　　ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（ト
リス）塩の再結晶化ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス［）　ＩＪス（
ヒドロキシメチル）アミン〕塩１３．ｒｔｆ≠Ｏｄｌの
蒸留水に完全に溶解させる。この溶液にアセトン３００
１１５（良く攪拌しながら加える。約１分経過したら沈
殿物を吸引口遇し、エタノールで数回洗浄する。嘔らに
アセトンで洗浄して吸引乾燥する。

（２）分析要素の製作（そのｌ）透明ポリエチレンテレフタレート支持体（厚さ：／１０
μｍ）の表面全親水化処理し、その処理表面上に下記の
組成の塗布液を塗布、乾燥して乾燥膜厚ｉｓμｍの緩衝
層を形成した。

緩衝層形成用塗布液：アルカリ処理脱イオンゼラチン　　　　　　　　　−４ｔｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ユ弘Ｏｇノニルフェ
ノキシ・ポリグリシトール　　　　　　　／、Ｇｇポリ（Ｎ−［
［ジメチルアミノプロピルコアクリルアミド１１％水溶液（平均分子量約ｉｏ万）　　　　　　ＪＯｇＮ−（２−
ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ　、　Ｎ’　。

Ｎ′−三酢酸　　　　　　　　２ミリモルＺｎ（ＣＨ３
ＣＯＯ１２−２Ｈ２０／ミリモルＭｇＳＯ２・７Ｈ２０
λミリモル以上の溶液によＮのＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを／１
．０に調整し次。

上記緩衝層の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３．６μ
ｍになるように塗布、乾燥して硬膜層を形底した。

硬膜層形成用塗布液：ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　１２ｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　２６？ｇノニルフェ
ノキシ・ポリグリシトール　　　　　　　ｌ・３ｇ１ｌコービス
（ヒニルスルホニルアセトアミド）エタン　　　　０．７λｇ水／アセトン（混合比＝／：／）　　　　　　　　／Ｉｇ上記硬膜層
の上に、下記の塗布液を乾燥膜厚が３μｍになるように
塗布し、接着層とした。

ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　１２ｇ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　、２ｒＪ、７ｇノニルフ
ェノキシφ ポリグリシトール　　　　　　ｌ・３ｇ上記接着層の上
に、Ｏ９≠チノニルフエノキシ・ポリグリシトール水溶
液を塗布し、次に３６ゲージｊＯＤポリエチレンテレフ
タレート紡績糸からなるトリコット編物を圧着して展開
層とした。

（３）分析要素の製作（そのλ）上記展開層に、前記＋１１の再結晶化した基質を用い、
下記の組成の塗布液ｆ／２０４／ｒｒＬ　となるように
塗布、乾燥した。

自己顕色性基質含有塗布液（１）で調製したｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス）塩　　　　　　　　　　／Ｊ、１ｇポリビニ
ルピロリドン（平均分子量１０万）　　　　　　１００ｇエタノール
　　　　　　　　　　　≠００ｇアセトン　　　　　　
　　　　　　１００ｇ以上の方法にＸｔ）、本発明に従
うＡＬＰ活性測定用一体型多層分析要素を作製した（以
下、アルカリ性ホスファターゼ１ＡＬＰと略記する）。

〔比較例１〕実施例１において、自己顕色性基質含有塗布液中の基質
であるｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス
）塩の再結晶化法を下記に示す粉砕法に変えた以外は、
実施例１と同様にして、本発明に従うＡＬＰ測定用分析
要素を調製した。

ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（）　ＩＪス）
塩／Ｊ、Ｉｔｆ先づ乳鉢で粉砕し、嘔らにこｎｆ２００
メツシュのふるいでふるいにかける。

このものを基質として使用する。

〔比較例２〕実施例１において、自己顕色性基質含有塗布液中のアセ
トンｚｏｏｔ１（水ｊｏｏｔに変え、さらに再結晶化の
操作を行なわず、基質そのまマヲ上記水！００？中に溶
解でせ溶液として塗布液を調製した以外は、実施例１と
同様にして本発明に従う、ＡＬＰ活性測定用分析要素を
調製した。

〔測定例１〕実施例１お工び比較例１．２において製作し念ＡＬＰ活
性測定用分析要素の保存性を比較検討するため、製作直
後お工び弘０Ｃ１２よＱＣ１≠！０Ｃに３日、５日およ
び７日保存した後にＮＬＰを含まない液体試料全点着し
た際の反射光学濃度を測定した。結果を第１表に示す。

第１表に示す各△ＯＤの値は、液体試料ｆＡＬＰを含ま
ない生理食塩水）を点着したとき、〔各温度（≠６ＣＳ
コ！０Ｃ１≠ｊ０ｃ）で各日数（３、！、７日）保存し
た分析要素に液体試料点着後３７°Ｃで６分間インキュ
ベーションした蒔の反射光学濃度値〕と〔製作直後の分
析要素を３７°Ｃで６分間インキュベーションした時の
反射光学濃度〕との差（反射光学濃度の増加）である。

以上の結果より明らかなように、本発明の方法で製造場
ｎた実施例１のＡＬＰ活性測定用分析要素の保存性は、
非常に良好であることが判明した。

〔実施例２〕実施例１において、自己顕色性基質含有塗布液中の基質
であるｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（トリス
）塩ｋｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（コープ
ミノ−２−エチルー／１３−プロノξンジオール）塩に
変え、下記に示す再結晶化を行なつ念以外は実施例１と
同様にして、本発明に従うＡＬＰ測定用分析要素を調製
した。

アミン−２−エチル−７，３−プロ／ξンジオール）塩
の再結晶化ｐ−ニトロフェニルホスフェート・ビス（２−アミノー
コーエチルー／、！−プロパンジオール塩／３．７ｔを
２００１１１のメタノールに完全に溶解はせる。この溶
液にアセトン２ｏｏｍ１２良く攪拌しながら加える。約
よ分経過後、沈殿物全吸引口過し、エタノールで数回洗
浄。きらにアセトンで洗浄して戸紙上で吸引乾燥した。

〔測定例２〕実施例２のＡＬＰ活性測定用分析袂累についても同様な
保存性の試験を行なったところ、下記第２表に示すよう
に良好な保存性をＭすることが中間した。

第λ表

Claims

【特許請求の範囲】

（１）パラニトロフェニルホスフェートのアミン塩また
はアミノアルコール塩を良溶媒の溶液とし、貧溶媒と混
合して析出させ、液相と固相を分離し、分離した固相を
溶解または分散して、液体透過性層の塗布または浸漬組
成物として用いることを特徴とする、液体透過性層を有
するアルカリ性ホスファターゼ定量用乾式分析要素の製
造方法。
（２）パラニトロフェニルホスフェートのアミン塩また
はアミノアルコール塩を良溶媒の溶液とし、貧溶媒と混
合して析出させ、液相と固相を分離し、分離した固相を
分散して、液体展開層の塗布または浸漬組成物として用
いることを特徴とする、特許請求の範囲（１）の製造方
法。
（３）パラニトロフェニルホスフェートのアルコール可
溶性塩をアルコール類の溶液とし、貧溶媒と混合して析
出させ、液相と固相を分離し、分離した固相を溶解また
は分散して、液体透過性層の塗布または浸漬組成物とし
て用いることを特徴とする、特許請求の範囲（１）の製
造方法。
（４）パラニトロフェニルホスフェートの２−アミノ−
２−メチルプロパン−１，３−ジオール塩または２−ア
ミノ−２−エチルプロパン−１，３−ジオール塩をアル
コール類の溶液とし、貧溶媒と混合して析出させ、液相
と固相を分離し、分離した固相を溶解または分散して、
液体透過性層の塗布または浸漬組成物として用いること
を特徴とする、特許請求の範囲（１）の製造方法。
（５）パラニトロフェニルホスフェートのアルコール可
溶性塩をアルコール類の溶液とし、貧溶媒と混合して析
出させ、液相と固相を分離し、分離した固相を分散して
、展開層の塗布または浸漬組成物として用いることを特
徴とする、特許請求の範囲（１）の製造方法。