JPH0730118B2 - プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法 - Google Patents
プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法Info
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- JPH0730118B2 JPH0730118B2 JP2238976A JP23897690A JPH0730118B2 JP H0730118 B2 JPH0730118 B2 JP H0730118B2 JP 2238976 A JP2238976 A JP 2238976A JP 23897690 A JP23897690 A JP 23897690A JP H0730118 B2 JPH0730118 B2 JP H0730118B2
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- protease inhibitor
- bbrpi
- protease
- inhibitor
- amino acid
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規プロテアーゼインヒビター及びその製造方
法に関するものである。
法に関するものである。
（従来技術及び問題点） 細胞内の蛋白質分解は、細胞内で起こる非常に多くの生
理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回転、外来性蛋白
質、ペプチドの分解・異常蛋白質の除去、細胞内小器官
と分泌蛋白質のプロセッシング、情報伝達、細胞増殖・
分化などの酵素反応あるいは調節に関与している。細胞
内は多数のコンパートメントからなる複雑な構造をして
おり、直接、蛋白質分解に関与するプロテアーゼは厳密
なコントロールが必要となる。プロテアーゼインヒビタ
ーはプロテアーゼの作用をただちに抑制する物質として
きわめて有効であり、重要なプロテアーゼの制御系の一
要素である。
理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回転、外来性蛋白
質、ペプチドの分解・異常蛋白質の除去、細胞内小器官
と分泌蛋白質のプロセッシング、情報伝達、細胞増殖・
分化などの酵素反応あるいは調節に関与している。細胞
内は多数のコンパートメントからなる複雑な構造をして
おり、直接、蛋白質分解に関与するプロテアーゼは厳密
なコントロールが必要となる。プロテアーゼインヒビタ
ーはプロテアーゼの作用をただちに抑制する物質として
きわめて有効であり、重要なプロテアーゼの制御系の一
要素である。
また微生物工業や発酵工業において、微生物が目的とす
る蛋白質をたとえ分泌生産しても、プロテアーゼが存在
する場合は、このプロテアーゼによって目的蛋白質が分
解されてしまう。しかしながらこのような系においてプ
ロテアーゼインヒビターが存在すれば、プロテアーゼの
作用が抑制され、その結果として目的蛋白質が効率的に
得られることになる。
る蛋白質をたとえ分泌生産しても、プロテアーゼが存在
する場合は、このプロテアーゼによって目的蛋白質が分
解されてしまう。しかしながらこのような系においてプ
ロテアーゼインヒビターが存在すれば、プロテアーゼの
作用が抑制され、その結果として目的蛋白質が効率的に
得られることになる。
プロテアーゼインヒビターは動物・植物・微生物界に広
く存在し、特にトリプシン、キモトリプシン、パパイン
に対応するインヒビターの存在が良く知られている。し
かし、産業上必要な量を供給する迄に至っていないのが
現状である。
く存在し、特にトリプシン、キモトリプシン、パパイン
に対応するインヒビターの存在が良く知られている。し
かし、産業上必要な量を供給する迄に至っていないのが
現状である。
（問題点を解決するための手段） プロテアーゼインヒビターの有用性に鑑み、本発明者ら
は、プロテアーゼインヒビターの有利な製造方法を開発
するため鋭意検討を進めた所、バチルス・ブレビスが菌
体外にプロテアーゼインヒビターを生産していることを
見出した。
は、プロテアーゼインヒビターの有利な製造方法を開発
するため鋭意検討を進めた所、バチルス・ブレビスが菌
体外にプロテアーゼインヒビターを生産していることを
見出した。
ここに単離したプロテアーゼインヒビターは205から302
個のアミノ酸から構成される蛋白質で、そのアミノ酸配
列から、今までに知られているプロテアーゼインヒビタ
ーとは相違する新規なプロテアーゼインヒビターと認
め、このインヒビターをプロテアーゼインヒビターBbrP
Iと命名するに至った。
個のアミノ酸から構成される蛋白質で、そのアミノ酸配
列から、今までに知られているプロテアーゼインヒビタ
ーとは相違する新規なプロテアーゼインヒビターと認
め、このインヒビターをプロテアーゼインヒビターBbrP
Iと命名するに至った。
本発明は、上記新知見を基礎とし、更に研究した結果完
成されたものであって、新規プロテアーゼインヒビター
BbrPI及びその製造法に関するものである。
成されたものであって、新規プロテアーゼインヒビター
BbrPI及びその製造法に関するものである。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明に係るプロテアーゼインヒビターBbrPI（以下、
プロテアーゼインヒビターないし単にインヒビターとい
うこともある）は、トリプシン、プラスミン、α−キモ
トリプシン、ズブチリシン等の蛋白質分解酵素を阻害す
る作用するものであり、その主要な性質は次のとおりで
ある。
プロテアーゼインヒビターないし単にインヒビターとい
うこともある）は、トリプシン、プラスミン、α−キモ
トリプシン、ズブチリシン等の蛋白質分解酵素を阻害す
る作用するものであり、その主要な性質は次のとおりで
ある。
ａ）第１図のアミノ酸配列で示されるBbrPI。
ｂ）第１図のアミノ酸配列を含有する第２図のアミノ酸
配列で示されるBbrPIb。
配列で示されるBbrPIb。
ｃ）第２図のアミノ酸配列を含有する第３図のアミノ酸
配列で示されるBbrPId。
配列で示されるBbrPId。
ｄ）阻害作用スペクトル トリプシン、プラスミン、α−キモトリプシン、ズブチ
リシンに作用し、その酵素活性を阻害する。
リシンに作用し、その酵素活性を阻害する。
ｅ）作用至適pH;6〜９ ｆ）作用至適温度;20〜40℃ また、このプロテアーゼインヒビターは、セリンプロテ
アーゼの中でもカリクレインについては、その酵素活性
は阻害しない。そしてまた、金属プロテアーゼであるサ
ーモライシンや、チオールプロテアーゼであるブロメラ
イン、パパインについても、その酵素活性は阻害しな
い。
アーゼの中でもカリクレインについては、その酵素活性
は阻害しない。そしてまた、金属プロテアーゼであるサ
ーモライシンや、チオールプロテアーゼであるブロメラ
イン、パパインについても、その酵素活性は阻害しな
い。
本発明に係るインヒビターは、バチルス属に属するイン
ヒビター生産菌を培養することによって得られる。
ヒビター生産菌を培養することによって得られる。
このプロテアーゼインヒビターBbrPI生産菌としては、
例えばバチルス ブレビス（Bacillus brevis）が好適
であって、具体的には、バチルス・ブレビスHPD31（な
お、この菌株はバチルス・ブレビスH102,FERM BP−1087
と同一菌株である。）、バチルス ブレビス47（FERM P
−7224）が例示される。
例えばバチルス ブレビス（Bacillus brevis）が好適
であって、具体的には、バチルス・ブレビスHPD31（な
お、この菌株はバチルス・ブレビスH102,FERM BP−1087
と同一菌株である。）、バチルス ブレビス47（FERM P
−7224）が例示される。
プロテアーゼインヒビターBbrPIを製造するには、この
インヒビター生産菌であるバチルス属菌を培養し、培養
物から目的とするインヒビターを分離、採取すればよ
い。
インヒビター生産菌であるバチルス属菌を培養し、培養
物から目的とするインヒビターを分離、採取すればよ
い。
これらの処理は常法にしたがって行えばよく、例えばバ
チルス ブレビスを生育する培地に接種し、20〜50℃で
12〜150時間、好ましくは24〜120時間培養するが、それ
には通気攪拌培養等各種の培養法が適宜利用される。
チルス ブレビスを生育する培地に接種し、20〜50℃で
12〜150時間、好ましくは24〜120時間培養するが、それ
には通気攪拌培養等各種の培養法が適宜利用される。
培地としては、グルコース、マルトース、澱粉、コーン
スターチ等の炭素源、ペプトン、肉エキス、尿素、アン
モニア、無機窒素化合物等の窒素源、酵母エキス、コー
ンスティープリカーなどの栄養素等から選ばれたものを
適宜含むものがよい。
スターチ等の炭素源、ペプトン、肉エキス、尿素、アン
モニア、無機窒素化合物等の窒素源、酵母エキス、コー
ンスティープリカーなどの栄養素等から選ばれたものを
適宜含むものがよい。
得られた培養液は、菌体を除き、上清にプロテアーゼイ
ンヒビターを含有しているので、上清そのままで使用す
ることができる。また、使用する微生物によっては、プ
ロテアーゼインヒビターを菌体内に含有することがあ
る。その場合には、培養液を遠心分離等に付して菌体を
分離、取得し、菌体を超音波や細胞壁溶解酵素等で処理
し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗インヒビター液と
すればよい。
ンヒビターを含有しているので、上清そのままで使用す
ることができる。また、使用する微生物によっては、プ
ロテアーゼインヒビターを菌体内に含有することがあ
る。その場合には、培養液を遠心分離等に付して菌体を
分離、取得し、菌体を超音波や細胞壁溶解酵素等で処理
し、破砕菌体を遠心分離して除き、粗インヒビター液と
すればよい。
このようにして得たインヒビター含有上清や粗インヒビ
ター液は、蛋白質精製の常法にしたがい、塩析、透析、
イオン交換樹脂、ゲル濾過、クロマトグラフ処理、電気
泳動等によって単離、精製することができる。
ター液は、蛋白質精製の常法にしたがい、塩析、透析、
イオン交換樹脂、ゲル濾過、クロマトグラフ処理、電気
泳動等によって単離、精製することができる。
例えば、プロテアーゼインヒビターは上清から硫安沈澱
法によって沈澱させて、透析したりして粗プロテアーゼ
インヒビターを得ることができ、更には、透析内液をDE
AE−セルロースカラムクロマトグラフィー、トヨパール
HW−55カラムクロマトグラフィーなどにより精製プロテ
アーゼインヒビターを得ることができる。
法によって沈澱させて、透析したりして粗プロテアーゼ
インヒビターを得ることができ、更には、透析内液をDE
AE−セルロースカラムクロマトグラフィー、トヨパール
HW−55カラムクロマトグラフィーなどにより精製プロテ
アーゼインヒビターを得ることができる。
次に本発明の実施例を示すが、プロテアーゼインヒビタ
ー活性は0.01Mの塩化カルシウムを含む0.1Mトリス・塩
酸（pH7.5）緩衝液600μｌ、プロテアーゼインヒビター
を含有する試料10μｌ、トリプシン（200μg/ml）５μ
ｌを混合、５分後、基質（0.02M N−benzoyl−Ｌ−argi
nine−ｐ−nitroanilide）10μｌを加え直ちに405nmの
吸光度を測定する。
ー活性は0.01Mの塩化カルシウムを含む0.1Mトリス・塩
酸（pH7.5）緩衝液600μｌ、プロテアーゼインヒビター
を含有する試料10μｌ、トリプシン（200μg/ml）５μ
ｌを混合、５分後、基質（0.02M N−benzoyl−Ｌ−argi
nine−ｐ−nitroanilide）10μｌを加え直ちに405nmの
吸光度を測定する。
対照としてプロテアーゼインヒビターを含まない時の活
性（OD値の増加）を測定し、１μｇのトリプシンの活性
を50％抑える時のプロテアーゼインヒビターの量を1uni
tとして示した。
性（OD値の増加）を測定し、１μｇのトリプシンの活性
を50％抑える時のプロテアーゼインヒビターの量を1uni
tとして示した。
実施例1. Bacillus brevis HPD31（FERM BP−1087）を液体培地20
0ml（グルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス
0.2％、肉エキス0.5％、pH7.0）で30℃、３日間培養
後、遠心分離することによって菌体を除き、培養上澄を
得た。この培養上澄のプロテアーゼインヒビター活性を
測定したところ90U/mlの活性を示した。
0ml（グルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス
0.2％、肉エキス0.5％、pH7.0）で30℃、３日間培養
後、遠心分離することによって菌体を除き、培養上澄を
得た。この培養上澄のプロテアーゼインヒビター活性を
測定したところ90U/mlの活性を示した。
この上澄液に0.8飽和になるように硫安を加え、遠心分
離することによってこの沈澱画分を集めた。
離することによってこの沈澱画分を集めた。
この沈澱画分を透析後、Sephacry1 S−200にゲル濾過を
２回行った。この活性画分に0.8飽和になるように硫安
を加え、遠心分離によって沈澱を集め、透析後、モノＱ
カラムによるイオン交換カラムクロマトグラフィーを行
い、その活性画分を集めてから、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、その活性のあるバンドを切り
出し、プロテアーゼインヒビターBbrPIを電気溶出した
後透析した。透析内液を凍結乾燥後、活性を測定した結
果、約280倍に精製されたプロテアーゼインヒビターBbr
PIを0.079mg得た。精製の過程を第１表に示した。
２回行った。この活性画分に0.8飽和になるように硫安
を加え、遠心分離によって沈澱を集め、透析後、モノＱ
カラムによるイオン交換カラムクロマトグラフィーを行
い、その活性画分を集めてから、SDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、その活性のあるバンドを切り
出し、プロテアーゼインヒビターBbrPIを電気溶出した
後透析した。透析内液を凍結乾燥後、活性を測定した結
果、約280倍に精製されたプロテアーゼインヒビターBbr
PIを0.079mg得た。精製の過程を第１表に示した。
実施例2.プロテアーゼインヒビターBbrPIのアミノ酸配
列の決定 実施例１で精製したプロテアーゼインヒビターBbrPIを
トリス塩酸緩衝液に溶解し、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った所、プロテアーゼインヒビターは
活性のある各々分子量約30000のａ、ｂ、ｃの三つのバ
ンドに分かれた（第４図）。更にWestern blotを行うこ
とにより更に分子量40000程のバンドｄに分かれた（第
５図）。
列の決定 実施例１で精製したプロテアーゼインヒビターBbrPIを
トリス塩酸緩衝液に溶解し、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を行った所、プロテアーゼインヒビターは
活性のある各々分子量約30000のａ、ｂ、ｃの三つのバ
ンドに分かれた（第４図）。更にWestern blotを行うこ
とにより更に分子量40000程のバンドｄに分かれた（第
５図）。
ａ、ｂ、ｃ、ｄは、各々、プロテアーゼインヒビター活
性を有しており、その比活性は分子量の一番少ないａが
一番大きく、次いでｂ、ｃ、ｄの順であり、ｄは弱い活
性を示した。
性を有しており、その比活性は分子量の一番少ないａが
一番大きく、次いでｂ、ｃ、ｄの順であり、ｄは弱い活
性を示した。
ａ、ｂ、ｃ、ｄ各々のアミノ酸配列を自動分析機（ABI
477A−120A プロテインシーケンサー）で分析した結
果ａ（第１図）、ｂ（＝ｃ）（第２図）、ｄ（第３図）
のアミノ酸配列を得た。
477A−120A プロテインシーケンサー）で分析した結
果ａ（第１図）、ｂ（＝ｃ）（第２図）、ｄ（第３図）
のアミノ酸配列を得た。
ｄのアミノ酸配列が一番長く、順にｄのＮ末端より削れ
たものがｂ＝ｃ、それに更にＮ末端が削れたものがａで
あり、また活性もｄが微弱で、ａが一番強いことから、
プロテアーゼインヒビターBbrPIは、第３図に示される
ｄが成熟蛋白質として生産され、一部自己消化のような
修飾過程を得てｂ（＝ｃ）、ａが同時に生じるものと推
定された。
たものがｂ＝ｃ、それに更にＮ末端が削れたものがａで
あり、また活性もｄが微弱で、ａが一番強いことから、
プロテアーゼインヒビターBbrPIは、第３図に示される
ｄが成熟蛋白質として生産され、一部自己消化のような
修飾過程を得てｂ（＝ｃ）、ａが同時に生じるものと推
定された。
（発明の効果） 本発明によって、新規物質であるプロテアーゼインヒビ
ターBbrPI、同ｂ＝ｃ、同ｄを大量に生産することがは
じめて可能となった。
ターBbrPI、同ｂ＝ｃ、同ｄを大量に生産することがは
じめて可能となった。
BbrPI、同ｂ＝ｃ、同ｄは、それぞれ単独又は混合物と
して使用することが可能であり、目的に応じて非常に有
効に利用できるものと大いに期待される。
して使用することが可能であり、目的に応じて非常に有
効に利用できるものと大いに期待される。
したがって、本発明は、プロテアーゼ制御系の解明に有
用であるばかりでなく、医薬としての利用も大いに期待
することはできる。またこのインヒビターを利用すれ
ば、微生物利用工業において、分泌生産された目的とす
る蛋白質がプロテアーゼによって破壊変成することがな
くなるので、従来得られなかったりあるいは充分量得る
ことができなかった蛋白質も自由に得ることも可能とな
る。
用であるばかりでなく、医薬としての利用も大いに期待
することはできる。またこのインヒビターを利用すれ
ば、微生物利用工業において、分泌生産された目的とす
る蛋白質がプロテアーゼによって破壊変成することがな
くなるので、従来得られなかったりあるいは充分量得る
ことができなかった蛋白質も自由に得ることも可能とな
る。
第１図、第２図、第３図は、それぞれ、プロテアーゼイ
ンヒビターBbrPI、BbrPIb、BbrPIdのアミノ酸配列を示
し、第４図はBbrPIのSDS−PAGEのパターンを示したもの
であり、第５図はBbrPIのウェスタン・ブロッティング
の結果を図示したものである。
ンヒビターBbrPI、BbrPIb、BbrPIdのアミノ酸配列を示
し、第４図はBbrPIのSDS−PAGEのパターンを示したもの
であり、第５図はBbrPIのウェスタン・ブロッティング
の結果を図示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:08）
Claims (6)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で示されるプロテアー
ゼインヒビターBbrPI。 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列で示されるプロテアー
ゼインヒビターBbrPIb。 - 【請求項３】下記のアミノ酸配列で示されるプロテアー
ゼインヒビターBbrPId。 - 【請求項４】バチルス属に属するプロテアーゼインヒビ
ターBbrPI生産菌を培養することを特徴とする請求項１
のプロテアーゼインヒビターBbrPIの製造法。 - 【請求項５】バチルス属に属するプロテアーゼインヒビ
ターBbrPIb生産菌を培養することを特徴とする請求項２
のプロテアーゼインヒビターBbrPIbの製造法。 - 【請求項６】バチルス属に属するプロテアーゼインヒビ
ターBbrPId生産菌を培養することを特徴とする請求項３
のプロテアーゼインヒビターBbrPIdの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2238976A JPH0730118B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2238976A JPH0730118B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04120096A JPH04120096A (ja) | 1992-04-21 |
| JPH0730118B2 true JPH0730118B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=17038089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2238976A Expired - Fee Related JPH0730118B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0730118B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5433167A (en) * | 1992-02-04 | 1995-07-18 | Sharp Kabushiki Kaisha | Method of producing silicon-carbide single crystals by sublimation recrystallization process using a seed crystal |
-
1990
- 1990-09-11 JP JP2238976A patent/JPH0730118B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04120096A (ja) | 1992-04-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |