JPH0767639A

JPH0767639A - 新規な蛋白質分解酵素及びその製造法

Info

Publication number: JPH0767639A
Application number: JP24387393A
Authority: JP
Inventors: Ryoko Matsubara; 良子松原; Hirotaka Matsubara; 裕孝松原; Hisao Kojima; 尚夫小嶋; Okiteru Suzuki; 興輝鈴木
Original assignee: Nippi Inc
Current assignee: Nippi Inc
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 1995-03-14

Abstract

(57)【要約】【目的】新規な蛋白質分解酵素及びその製造法を提供
する。【構成】下記の理化学的性質を有する、バチルス属に
属する微生物由来の蛋白質分解酵素。（１）作用：ゼラチン、アゾコールの分解に著しい活性
を示し、カゼインに作用する。未変性のコラーゲンには
作用しないが、コラゲナーゼの合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ，Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｐｚ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）に作用す
る。インシュリンＢ鎖のＬｅｕ−Ｃｙｓ，Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ，Ｔｈｒ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏ−Ｌｙｓなど多くの部
位を切断する。（２）至適ｐＨ：７〜９（３）至適温度：４０℃〜５５℃ （４）分子量：約３０，０００

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な蛋白質分解酵素及
びその製造法に関する。更に詳細には、ゼラチン、アゾ
コールの分解に著しい活性を示し、カゼインに作用し、
未変性のコラーゲンには作用しないが、コラゲナーゼの
合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ，Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｐｚ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ）に作用し、インシュリンＢ鎖のＬｅｕ−
Ｃｙｓ，Ａｒｇ−Ｇｌｙ，Ｔｈｒ−Ｐｒｏ，Ｐｒ
ｏ−Ｌｙｓなど多くの部位を切断する新規な蛋白質分解
酵素及び当該蛋白質分解酵素生産菌を用いる当該蛋白質
分解酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】皮質性蛋白質の分解には、通常、広く用
いられている蛋白質分解酵素では満足できる効果が得ら
れない場合があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】皮質性蛋白質に対する
作用に特徴をもった蛋白質分解酵素が期待されている。
従来のコラゲナーゼもその一つであるが、これより更に
特異性に特徴をもった蛋白質分解酵素が期待されてい
る。

【０００４】従って、本発明者等は好気的条件下で培養
して新規な蛋白質分解酵素を産生しうる菌株を得るため
に多数の微生物を分離し、それらについて生産する皮質
性蛋白質に対する活性を検討した結果、魚皮から分離し
たバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌株が変性
コラーゲン（ゼラチン）の分解及びアゾコールに対して
強い活性を示すこと、並びにコラゲナーゼの合成基質に
作用し、他の蛋白質分解酵素よりもインシュリンＢ鎖に
おける多くの部位を切断することを見いだし、本発明を
完成した。

【０００５】よって、本発明の目的はこの新規な蛋白質
分解酵素及びその製造法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、新規な蛋白質
分解酵素及びその製造法に関するものであり、当該蛋白
質分解酵素は、バチルス属に属する生産菌を培養して得
られ、ゼラチンに強い活性を示し、基質特異性に特徴を
もっている。

【０００７】本発明の蛋白質分解酵素の製造に用いられ
る微生物は、バチルス属に属する蛋白質分解酵素生産菌
であり、特に効果の高かった菌株は、例えば、バチルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＷＦ−２株である。本
菌株は、平成５年８月１７日に通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所へ、受託番号ＦＥＲＭＰ−１３
８０２号として寄託された。

【０００８】本菌株は、魚皮から分離されたもので、そ
の菌学的特徴は次の通りである。１）形態長さ１．６μｍ、幅０．９μｍの桿菌である。周鞭毛を
有し、芽胞は楕円形で細胞の中央部に生成する。２）生育状態普通寒天培地上で増殖し、コロニーは灰白色、不正形で
ある。好気性菌で、嫌気的増殖はない。至適生育温度は
３７℃〜４０℃であり、生育可能温度は１８℃〜４７℃
である。３）グラム染色性：（−）４）生理学的性質ＯＦ試験：酸化的分解糖からの酸産生：グルコース、キシロース、アラビノー
ス、マンノース、マルトース、ラクトース、メリビオー
ス、ラフィノース、マンニトール、イノシトールから酸
を産生する。ズルシトールからは酸を産生しない。

【０００９】ガス産生試験：（−）フォーゲス・プロスカウェル試験：（＋）カタラーゼ：（＋）以上の性質から本菌はバチルス属に属することが認めら
れた。

【００１０】この新規蛋白質分解酵素は上記の生産菌株
を適切な好気的培養条件下、例えば、振盪培養法や通気
撹拌培養させることにより生産される。

【００１１】培地としては、生産菌株が摂取しうる窒素
及び無機塩などを含有させる。生産菌は通常２５℃〜３
７℃で培養するのが望ましい。本発明の酵素を生産する
ためには細菌の発育のために使われる窒素源はすべて利
用できる。例えば、ペプトン、肉エキス、酵母、酵母エ
キス、豆類粉末、コーン・スチープ・リカー、米ぬか、
麩、ゼラチン、魚粉、ミートミール及び無機窒素等を用
いることができる。とりわけ、本発明の酵素の生産に
は、０．１〜０．４％のゼラチンを含ませた培地が好適
である。培養は本蛋白質分解酵素の生産量が多くなる適
切な培地に接種して実施するが、培地のｐＨは中性付近
がよい。

【００１２】本発明の蛋白質分解酵素の精製分離には微
生物の生産物を精製分離するのに通常用いられる手段を
適当に組み合わせることによって行うことができる。例
えば、硫安等による塩析法、アセトン、メタノール、イ
ソプロパノール等の有機溶媒による沈殿法、各種吸着体
による吸着と溶離法、イオン交換体による吸着、溶離及
びクロマトグラフィー、種々の担体によるゲル濾過法、
種々の電気泳動法、限外濾過法、凍結乾燥法、凍結法、
透析法、クロマトフォーカシング、疎水性クロマトグラ
フィー等である。これらの手段を組み合わせ、また繰り
返すことによって、本発明の蛋白質分解酵素を単離する
ことができる。

【００１３】更に具体的には、培養上澄みを限外濾過
し、硫酸アンモニウム（硫安）を加えて３０〜７０％飽
和で沈殿する画分を集める。この沈殿物をリン酸塩緩衝
液で透析し、ＣＭセファロースＦＦのカラムにかけて吸
着させる。このカラムを、上記透析に用いたと同じリン
酸塩緩衝液と同緩衝液に０．５ＭＮａＣｌを加えた溶液
とによるＮａＣｌ濃度勾配系で溶出し、０．１５ＭＮａ
Ｃｌ濃度付近から溶出される成分が本発明の目的の酵素
である。次いで、得られた当該酵素をスーパーローズ６
ＨＲカラムによるゲル濾過法によって精製する。

【００１４】以下に本発明の新規蛋白質分解酵素の理化
学的性質及び酵素化学的性質を示す。１）作用：変性コ
ラーゲンであるゼラチン及びアゾコール（変性コラーゲ
ン標品、シグマ社製）に対して著しい分解活性を示す。
又、カゼインに対しても高い活性を示す。コラゲナーゼ
の合成基質［Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ（Ｚ−ＧＰＬＧＰと略すことがある），Ｃｂ
ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
（Ｚ−ＧＰＧＧＰＡと略すことがある），Ｐｚ−Ｐｒ
ｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＺ−ＰＬＧＰ
Ｒと略すことがある）］に対して作用する。しかし、未
変性のコラーゲンには作用しない。但し、上式中、Ｃｂ
ｚはカルボキシベンゾイル基を示し、Ｐｚはフェニラゾ
ベンゾキシカルボニル基を意味する。

【００１５】本発明の蛋白質分解酵素はインシュリンＢ
鎖の多くの部位を切断するが、とりわけ、Ｌｅｕ−Ｃｙ
ｓ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
の間を切断する。２）至適温度：４０℃〜５５℃ ３）至適ｐＨ：７．０〜９．０４）熱安定性：４０℃以下で安定５）ｐＨ安定性：６．０〜９．０６）阻害剤：ＥＤＴＡで阻害されず、ｐ−ＡＰＭＳＦで
部分的に阻害される（残存活性は６０％）。ここでｐ−
ＡＰＭＳＦはパラ−アミノフェニルメタンスルフォニル
フルオライドである。７）精製方法：本発明の蛋白質分解酵素は、培養上澄み
の硫安分画、ＣＭセファロースカラムクロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法により、ポリアクリルアミド電気泳動に
よって均一な程度まで精製できる。８）分子量：３０，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法）。９）力価測定法：５０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．５、４ｍＭＣａＣｌ₂含有）０．４５ｍｌ中で酵素
溶液（０．０５ｍｌ）とアゾコール（シグマ社製：５ｍ
ｇ）とを３０℃で１０分間反応後、０．５ｍｌの純水を
加えて遠心し、上澄みをとって５３０ｎｍで吸光度を測
定する。力価は１分間にＡ₅₃₀を１．００変化させる酵
素量を１単位とする。１０）等電点：ｐＩ８．３１１）紫外部吸収：吸収極大（λｍａｘ）：２８０ｎｍＡ₂₈₀／Ａ₂₆₀：１．５

【００１６】

【数１】１２）アミノ酸組成（残基数モル）：アスパラギン酸３７メチオニン２スレオニン１９イソロイシン１３セリン３９ロイシン１９グルタミン酸１７チロシン１０プロリン１４フェニルアラニン８グリシン３９リジン１４アラニン４１ヒスチジン１０シスチンＮ．Ｄ．トリプトファン６バリン３３アルギニン４総数３２５注）上記中、Ｎ．Ｄ．は検出されないことを示す。

【００１７】

【実施例】次に、本発明の実施例を示すが、上述の如く
本明細書により明らかにされた諸性質に基づいた培養液
から、本発明の新規な蛋白質分解酵素の採取に種々の手
段を採用することができるので、これに限定されるもの
ではない。（実施例１）表１に示す培地で、バチルス属に属する生
産菌株、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＷＦ
−２株（ＦＥＲＭＰ−１３８０２）を２５℃で２４時
間振盪培養（１１０ｒｐｍ）した。

【００１８】

【表１】培養後、菌体を除き、濾液に硫安を加えて３０〜７０％
飽和で沈殿となる画分を集めた。得られた沈殿を溶解し
て、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透
析し、ＣＭセファロース・ファースト・フローのカラム
にかけて吸着させた。次いで、前述と同じ緩衝液と同緩
衝液に０．５ＭＮａＣｌを加えたものとにより、リニア
グラジエント系による溶出を行った。０．１５ＭＮａＣ
ｌ付近から溶出される活性画分（本発明の蛋白質分解酵
素の画分に相当）を採取した。更に、この画分につい
て、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に０．１Ｍ
ＮａＣｌを加えた系で、スーパーローズ６ＨＲカラムに
よるゲル濾過クロマトグラフィーを行って精製画分を得
た。本画分はポリアクリルアミドゲルの電気泳動法によ
って単一のバンドを与えた。この結果を添付の図１に図
面代替写真により示す。このようにして精製して得られ
た酵素のアゾコールに対する比活性は８．０３単位／ｍ
ｇであり、培養後の濾液の酵素の比活性は０．１６単位
／ｍｇであり、精製により比活性が５０倍上昇した。

【００１９】（実施例２）実施例１で得られた本発明の
蛋白質分解酵素と、ズブチリシン・ＢＰＮ’（シグマ
社）、ズブチリシン・カールスベルグ（シグマ社）及び
ズブチリシン・ノボ（ノボ社）、並びにサーモライシン
（シグマ社）、トリプシン（シグマ社）及びクロストリ
ジウムのコラゲナーゼ（シグマ社）とについて種々の蛋
白質、即ち、ゼラチン（ニッピ社）、アゾコール（シグ
マ社）、カゼイン（メルク社）、コラーゲン（シグマ
社）、並びにコラゲナーゼの合成基質であるＺ−ＧＰＬ
ＧＰ（シグマ社）、Ｚ−ＧＰＧＧＰＡ（シグマ社）及び
ＰＺ−ＰＬＧＰＲ（シグマ社）に対する作用を比較し
た。比較は、各酵素の至適条件下で反応させ、終濃度１
０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）可溶性の生成ペプチドを
ニンヒドリン法により定量することにより行った。結果
を表２に示す。

【００２０】

【表２】表２の結果からわかるように、本発明の蛋白質分解酵素
は、他の蛋白質分解酵素と比べて変性コラーゲンである
ゼラチンに対して著しい分解活性を示した。又、アゾコ
ール（変性コラーゲン）やカゼインにも高い活性を示し
た。しかし、未変性のコラーゲンに対しては作用を示さ
なかった。本発明の蛋白質分解酵素は前述のコラゲナー
ゼの合成基質に対しても作用を示したが、他の蛋白質分
解酵素のそれらに対する作用は弱いか認められなかっ
た。

【００２１】（実施例３）実施例１で得られた本発明の
蛋白質分解酵素のインシュリンＢ鎖における切断部位
を、微生物由来の他の蛋白質分解酵素、即ち、ズブチリ
シン・ＢＰＮ’、ズブチリシン・カールスベルグ及びズ
ブチリシン・ノボ並びにサーモライシンと比較した。比
較は、各酵素とインシュリンＢ鎖とを反応させ、生成し
たペプチドを高速液体クロマトグラフィーによって分取
し、それらのアミノ酸組成を分析して、切断部位を決定
した（Ｅ．Ｉｃｈｉｓｈｉｍａ等のＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．５５，２１９１−２１９３頁，１９９１
年に記載の方法を参照）。結果を表３に示す。

【００２２】

【表３】表３の結果からわかるように、本発明の蛋白質分解酵素
は、他の蛋白質分解酵素よりも多くの部位を切断するこ
とが認められた。とりわけ、Ｌｅｕ−Ｃｙｓ、Ａｒｇ−
Ｇｌｙ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｌｙｓの結合を切断
するなど、バチルス属由来の他の蛋白質分解酵素とは異
なる挙動を示した。（実施例４）実施例１で得られた本発明の蛋白質分解酵
素とバチリス属由来の他の蛋白質分解酵素であるズブチ
リシン・ＢＰＮ’、サーモライシン及びトリプシンとの
アミノ酸組成を測定し、比較した。各々の酵素のアミノ
酸組成を表４に示す。

【００２３】

【表４】表４からわかるように、本発明の酵素は、バチリス属由
来の他の酵素と異なるアミノ酸組成を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の蛋白質分解酵素の精製段階
（培養濾液、硫安沈殿、ＣＭセファロース、ゲル濾過）
におけるＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真
である。

フロントページの続き (72)発明者鈴木興輝東京都足立区千住緑町１丁目１番地１株式会社ニッピ内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する、バチルス
属に属する微生物由来の蛋白質分解酵素。（１）作用：ゼラチン、アゾコールの分解に著しい活性
を示し、カゼインに作用する。未変性のコラーゲンには
作用しないが、コラゲナーゼの合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ，Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｐｚ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）に作用す
る。インシュリンＢ鎖のＬｅｕ−Ｃｙｓ，Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ，Ｔｈｒ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏ−Ｌｙｓなど多くの部
位を切断する。（２）至適ｐＨ：７〜９（３）至適温度：４０℃〜５５℃ （４）分子量：約３０，０００
【請求項２】バチルス属に属する蛋白質分解酵素生産
菌を培養し、培養物から下記の理化学的性質を有する蛋
白質分解酵素を採取することを特徴とする蛋白質分解酵
素の製造法。（１）作用：ゼラチン、アゾコールの分解に著しい活性
を示し、カゼインに作用する。未変性のコラーゲンには
作用しないが、コラゲナーゼの合成基質（Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ，Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，Ｐｚ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）に作用す
る。インシュリンＢ鎖のＬｅｕ−Ｃｙｓ，Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ，Ｔｈｒ−Ｐｒｏ，Ｐｒｏ−Ｌｙｓなど多くの部
位を切断する。（２）至適ｐＨ：７〜９（３）至適温度：４０℃〜５５℃ （４）分子量：約３０，０００