JPH0731192B2 - ペニシロ酸抗体、その製法および用途 - Google Patents

ペニシロ酸抗体、その製法および用途

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JPH0731192B2
JPH0731192B2 JP59232249A JP23224984A JPH0731192B2 JP H0731192 B2 JPH0731192 B2 JP H0731192B2 JP 59232249 A JP59232249 A JP 59232249A JP 23224984 A JP23224984 A JP 23224984A JP H0731192 B2 JPH0731192 B2 JP H0731192B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ペニシロ酸に対する抗体、その製造法およ
び用途に関するものである。
〔従来の技術〕
ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、アンピシリン等
のような種々のペニシリン化合物が、今日、総合的に見
て最も広範に使用されている抗生物質である。ペニシリ
ン類は、種々の理由、特に安価で容易に入手できるとの
理由から、広範囲の細菌感染症に対する選りぬきの処置
剤である。
しかし、β−ラクタム環の加水分解によりペニシリンを
不活化するβ−ラクタマーゼを産生する多数の細菌株
が、ペニシリン処置に対して耐性をもつている。加水分
解で生成する化合物（一般にペニシロ酸類と称される）
は、抗菌性を全く示さない。
このようなβ−ラクタマーゼのひと血清中における存在
を測定するアツセイが提供されることが望まれている。
哺乳類の組織は通常β−ラクタマーゼを産生しないか
ら、このアツセイはβ−ラクタマーゼ産生有機体による
細菌感染症の検出に役立つ。ペニシリン耐性株は感受性
有機体より高濃度のβ−ラクタマーゼを作り出す（elab
orate）傾向をもつので、このようなアツセイはまた、
感染がペニシリン耐性株により起つているか否かの決定
に役立つ。
しかし、種々の細菌が免疫学的に交差反応性を有しない
β−ラクタマーゼを産生するので、β−ラクタマーゼの
直接の免疫学的測定は問題が多い。一般的なイムノアツ
セイ（免疫検定）の便のため、ひと血清中に存在するβ
−ラクタマーゼの濃度推定が可能なイムノアツセイを発
明することが望まれている。
ヨルケン等（1980年）、J.Pediatrics97巻715−720頁
は、ペニシリンからペニシロ酸への変換に基づいてβ−
ラクタマーゼの存在を測定する非免疫学的放射性同位元
素アツセイを記載している。ペニシリンに対する免疫原
は、ワル等（1975年）、FEBS Letters57巻９−13頁、ム
ンロ等（1978年）、J.Pharm.Sci.67巻1197−1204頁およ
び堀内・柴田（1965年）、Int.Arch.Allergy28巻306−3
20頁に記載されている。これら各文献は、ペニシリンの
β−ラクタム環を加水分解し蛋白担体中のリシンのε−
アミノ基に直接コンジユゲート（複合）させることによ
り免疫原を生成させ得ることを教示している。北川等
（1978年）、J.Biochem.84巻491−494頁は、酸の官能体
でアンピシリンのアミノ基をアシル化し、蛋白のシステ
イン基のジスルフイド結合の還元的開裂後に蛋白と結合
させることにより、アンピリンを蛋白質に縮合させてい
る。
〔発明の記載〕
この発明は、ペニシロ酸の蛋白質コンジユゲート（複合
体）であつて、蛋白質が抗原または酵素であるものを提
供する。抗原コンジユゲートはペニシロ酸に対する抗血
清の製造に用いられ、抗血清は酵素コンジユゲートと共
に生物学的液体中のペニシロ酸レベルの検出用高感度イ
ムノアツセイにおける試薬として用いられる。ペニシロ
酸に対する抗血清は、特異性が高く、元のペニシリン化
合物との交差反応性を僅かな水準でしか示さない。
この発明は、ペニシリン、その誘導体、およびβ−ラク
タマーゼの測定用新規イムノアツセイを提供するもので
ある。このイムノアツセイは、ペニシロ酸類の抗原およ
び酵素蛋白コンジユゲート、および上記抗原性コンジユ
ゲートから作られた抗血清を用いるものである。ペニシ
ロ酸類の語は、β−ラクタム環の加水分解という特性を
示すあらゆるペニシリン抗生物質誘導体を含む。最もあ
りふれたペニシロ酸類としては、ベンジルペニシロ酸
（ベンジルペニシリンから誘導）およびアンピシロ酸
（アンピシリンから誘導）がある。この発明の蛋白質・
ペニシロ酸コンジユゲートは、下式で示されるように、
α−アミノ基における連結によつて特徴づけられる。
この発明の化合物は、大部分下記式を有するものであ
る。
〔式中、Ｘはアルカリ金属または水素、Ｙは天然または
合成ペニシリン抗生物質の置換基で通常フエニル基、Ｒ
は炭素原子３ないし９個およびカルコゲン（Ｏまたは
Ｓ）および窒素（Ｎ）（特にアミドとして）であるヘテ
ロ原子０ないし５個を有する連結基で、通常Ｒは鎖中に
５ないし12個の原子、さらに普通には鎖中に７ないし10
個の原子を有する直鎖基であり、好ましくはＲは式 で示される基であり、Ｚは抗原性ポリアミノ酸または酵
素、ｎは１ないしＺの分子量の500分の１、さらに普通
には1000分の１、好ましくは1500分の１である〕 Ｚが抗原の場合、ｎは通常１ないし500であり、代表的
には10ないし100である。Ｚが酵素の場合、ｎは１ない
し30であり、さらに普通には２ないし20、通常約２ない
し16である。
ポリアミノ酸の分子量は、一般に少なくとも約5000であ
り、上限はないが、通常10000000未満であり、普通約60
00000以下である。関与するのが抗原か酵素かにより、
普通異なる範囲があり得る。抗原では、範囲は約5000な
いし10000000、通常約20000ないし600000、さらに普通
には約25000ないし250000（分子量）である。酵素で
は、範囲は約10000ないし600000、さらに普通には約100
00ないし300000（分子量）である。抗原および酵素の両
者とも、分子量200000当り約１個のペニシロ酸類縁体
基、さらに普通には分子量500000当り少なくとも１個が
存在する。中間分子量の抗原（35000ないし600000）の
場合、ペニシロ酸類縁体基の数は一般に約２ないし25
0、さらに普通には10ないし100である。低分子量の抗原
（35000未満）では、ペニシロ酸縁体基の数は一般に約
２ないし10、普通２ないし５の範囲である。
種々の型の蛋白質が抗原性物質として使用できる。この
ような型には、アルブミン、血清蛋白質例えばグロブリ
ン、眼レンズ蛋白質、リポ蛋白質等が含まれる。蛋白質
の例示としては、うし血清アルブミン、キーホールリン
ペツトのヘモシアニン、卵オボアルブミン、うしガンマ
グロブリン等が挙げられる。別のものとして、充分な利
用できるアミノ基（例えばリジン）を有する合成ポリア
ミノ酸を製造することもできる。
酵素は、コンジユゲーシヨンの容易性、回転速度、およ
びペニシロ酸（または関連化合物）を測定する生理学的
液体に応じて広範囲に変り得る。
主として、選りぬきの酵素は、I.U.B.分類によると、ク
ラス１のオキシドレダクターゼおよびクラス３のヒドロ
ラーゼである。特にクラス１中で興味のある酵素は、ク
ラス1.1のデヒドロゲナーゼ、さらに詳しくは、サブク
ラス1.1.1および1.1.99並びにクラス1.11のペルオキシ
ダーゼである。ヒドロラーゼ中では、特にクラス3.1、
さらに詳しくは3.1.3およびクラス3.2、さらに詳しくは
3.2.1である。
デヒドロゲナーゼの例としては、マレエートデヒドロゲ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナー
ゼ、およびラクテートデヒドロゲナーゼが挙げられる。
ペルオキシダーゼの例には、西洋わさび（horseradis
h）ペルオキシダーゼが含まれ、ヒドロラーゼの例には
アルカリホスフアターゼおよびグリコシダーゼ、例えば
β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびリソ
チームが含まれる。
この発明の蛋白質コンジユゲートは、元のペニシリン化
合物をアシル化し、この化合物を蛋白質にコンジユゲー
トし、次いでβ−ラクタム環を加水分解してペニシロ酸
コンジユゲートとすることにより製造し得る。例えば、
メチルジチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルは、アンピシリンのＮ−アセチルアミノ基を介して結
合し得る。ジスルフイド結合を開裂すると、ハプテンが
ブロモアセチルグリシンＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルで標識した蛋白質と縮合可能にする。生成する
ペニシリン・蛋白質コンジユゲートは、アルカリ性条件
下でβ−ラクタム環を加水分解することにより対応する
ペニシロ酸コンジユゲートに変換することができる。こ
の方法は後記実施例に詳述する。
上記コンジユゲーシヨン法を用いることにより、加水分
解されたβ−ラクタム環はペニシロ酸とその母体ペニシ
リンの弁別を可能にし、その結果両者間の交差反応性が
比較的低くなる。ペニシロ酸とそれに対応するペニシリ
ンの弁別は、大量の対応ペニシリンの存在下で極めて低
濃度の加水分解物（ペニシロ酸）の存在の測定を行なう
後記β−ラクタマーゼアツセイに不可欠である。
免疫原コンジユゲートは、抗体製造の常法にしたがい、
広範囲の脊椎動物に注射し得る。通常、動物は定期的に
採血し、プラトー（値）に達するまでタイター（力価）
および特異性が向上した血液が継続して得られ、その後
特異性とタイターは低下する。免疫原コンジユゲート
は、筋肉内、腹腔内、皮下等に注射し得る。通常、フロ
イント完全または不完全アジユバントのような媒質を用
いる。
前述のように、この発明にしたがつて製造した抗体およ
び酵素試薬は、ペニシリン、ペニシロ酸類およびβ−ラ
クタマーゼ類の定量用イムノアツセイに用いるに特に適
する。ペニシリンの測定は、ペニシリンの加水分解およ
び生成するペニシロ酸の測定によるものであり、ペニシ
ロ酸の測定は、生理学的試料について行なうペニシロ酸
の直接測定によるものである。好適には、アツセイは米
国特許第3817837号記載のホモジニアス酵素イムノアツ
セイを用いることができる。この方法は、酵素コンジユ
ゲート、ペニシロ酸類含有試料およびペニシロ酸に対す
る抗体を、水性緩衝媒質中、約10−50℃の範囲の温度、
通常約20−40℃の温度で、合わせる工程を含んでいる。
別の方法として、米国特許第4299916号記載の「デイツ
プステイツクアツセイ」によつても実施することができ
る。デイツプステイツクアツセイでは、表面上に、第１
の酵素例えばグルコースオキシダーゼと共に抗ペニシロ
酸抗血清を共有結合した、固体支持体（「デイツプステ
ツク」（計量棒）〕を用いる。デイツプステイツクおよ
びペニシロ酸とコンジユゲートした第２の酵素（例えば
西洋わさびペルオキシダーゼ）を試験すべき試料中でイ
ンキユベートする。酵素コンジユゲートと固定化抗体間
の結合度は試料中遊離ペニシロ酸量と反比例する。グル
コースと適当な染料先駆体を加えると、デイツプステイ
ツク上のグルコースオキシダーゼは過酸化水素を生じ、
それが西洋わさびペルオキシダーゼにより染料先駆体か
ら不溶性染料への変換に使用される。不溶性染料はデイ
ツプステイツク上に残り、色素生成度は試料中のペニシ
ロ酸存在量に反比例する。
β−ラクタマーゼのアツセイは、一定時間内におけるペ
ニシリンからのペニシロ酸の産生を測定するものであ
る。患者試料を適当な緩衝液と混合し、ペニシリンを最
終濃度が約５−20μg/mlになるように加える。混合物を
通常１時間37℃でインキユベートし、その後試料を直ち
に室温にもどして酵素活動の続行を防ぐ。次いで、混合
物中のペニシロ酸濃度を上記方法の何れかにより測定
し、標準曲線によりβ−ラクタマーゼ量を定量する。種
々の細菌株が産生する種々のβ−ラクタマーゼの酵素活
性は、一般に約103ないし105（秒−１）である。上記ア
ツセイ法によると、約10-3ないし10-5IU/mlのβ−ラク
タマーゼを検知できることが判明した。
〔実施例〕
以上に示す実施例はこの発明を説明するものであつて、
これを限定するものではない。
特にことわらない限り、％と部は重量で示すが、例外と
して液体混合物は容量で示す。溶媒を明示しない場合は
水である。温度は、ことわらない限りセ氏で示す。使用
する略語は次の通りである。
BGG:うしガンマグロブリン BSA:うし血清アルブミン DMF:N,N−ジメチルホルムアミド DTE:ジチオエリスリトール ECDI:N,N′−（３′−ジメチルアミノプロピル）エチル
カルボジイミド EDTA:エチレンジアミン四酢酸 G6P:グルコース−６−ホスフエート G6PDH:グルコース−６−ホスフエート・デヒドロゲナー
ゼ HSA:ひと血清アルブミン GO:グルコースオキシダーゼ HRP:西洋わさびペルオキシダーゼ Ig:免疫グロブリン NHS:N−ヒドロキシスクシンイミド NMR:核磁気共鳴 PBS:燐酸緩衝液（0.1MNa2HPO4、0.2M NaCl、pH7.0） PEG6000:ポリエチレングリコール6000 THF:テトラヒドロフラン BAG:ブロモアセチルグリシン AA−PEN:蛋白質に結合した非損傷ペニシリン CLA−PeN:ペニシロ酸の開裂ラクタム環 1.メチルジチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルおよびブロモアセチルグリシンＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルの製造。
メチルジチオ酢酸（0.22ミリモル、30mg）、NHS（0.22
ミリモル、25mg）、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（0.22ミリモル、46mg）および乾燥DMF3mlを０℃で混合
し、アルゴン中４℃で一夜放置した。得られる溶液を後
の使用のために冷蔵庫中に保存した。
ブロモアセチルグリシン（0.1ミリモル、38mg）、NHS
（0.2ミリモル、22mg）およびECDI（0.2ミリモル、38m
g）を無水DMF1mlにアルゴン気流下氷浴中で溶かした。
混合物を密栓し冷所で一夜攪拌した。黄褐色の溶液を使
用に備えて冷蔵庫中に保存した。
2.メチルジチオ酢酸NHSエステルを用いたアンピシリン
のアシル化によるＮ−メチルジチオアセチルアンピシリ
ンの製造。
アンピシリン（5.24g、13ミリモル）のアセトン（75m
l）スラリーを氷浴で冷却し、４％KHSO390mlを徐々に加
えた。アンピシリンは数分後に溶解した。メチルジチオ
酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（3g、13.1
ミリモル）のDMF（15ml）溶液を20分間に上記アンピシ
リン溶液に滴下した。反応混合物を氷浴中で２時間攪拌
し、次いでアセトンの大部分を水流ポンプの減圧下にロ
ータリー蒸発器で留去した。水溶液を石油エーテル50ml
で抽出し、有機層を捨てた。水層を氷浴で冷却し、10％
H3PO4でpH2の酸性にした。分離した固体をアセトン（3m
l）に溶かし、エーテル350mlに加え、水層をエーテルで
抽出した。エーテ層を水（50ml）で１回、食塩水（50m
l）で２回洗浄し、乾燥（MgSO4）し、濃縮すると油状物
が分離した。エーテル溶液を油状物から分離した。エー
テル溶液を濃縮し、粗製物3.75gを得た。油状物をポン
プ乾燥して純品700mg（mp100℃）を得た。
3.N−メチルジチオアセチルアンピシリンの活性化。
上記２で得たＮ−メチルジチオアンピシリン（0.3ミリ
モルおよびDTE（0.3ミリモル）を、予じめアルゴンを飽
和したメタノール5mlとトリエチルアミン0.5mlに氷浴中
で溶かした。混合物を密栓し冷所で一夜攪拌した。反応
混合物をロータリー蒸発器で濃縮乾固し、新らしいメタ
ノール（３倍）を加えた。活性化ハプテンをアルゴン飽
和DMF3.5mlにとり、直ちに使用した。
4.BSAおよびBGGのブロモアセチルグリシンNHSエステル
による活性化 BSA（644mg）をpH8.5の0.1Mアルゴン飽和ほう酸緩衝液
（32ml）に氷浴中に溶かした。ブロモアセチルグリシン
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BAG−NHS、29
3mg）のDMF溶液を45分間に加え、混合物をさらに15分間
反応させた。添加中、pHを0.1N.NaOHで８に保つが、最
終pHは通常約7.2になつた。標識蛋白質溶液をpH6.8に調
節し、セフアデツクスＧ−50のカラムで精製した。最終
容量は150mlとなつた。活性化BSAはBAG−NHS−BSAとし
て示す。
BGG（600mg）の0.1Mほう酸緩衝液（30ml）溶液をBAG−N
HS（145mg）と同様に反応させて、BAG−NHS−BGGを得
た。
5.AA−Pen−BSAコンジユゲートの製造。
上記４で製造したBAG−NHS−BSAをpH7.5に調節し、氷浴
で冷却した。上記３で製造した活性化ペニシリン（282m
g、pH7）をBAG−NHS−BSA溶液に加えた。最終コンジユ
ゲーシヨン混合物のpHを7.5に調節し、混合物を冷所で
２日間攪拌した。得られるコンジユゲートをセフアデツ
クスＧ−50カラムで濃縮した。蛋白質フラクシヨンを集
めて凍結乾燥し、BSAコンジユゲート600mgを得た。ハプ
テン数は12と推計された。
6.AA−Pen−BSAに対する抗血清の製造。
ひつじに毎月注射を行なつた。最初の注射には上記５の
AA−Pen−BSAコンジユゲート1mgを0.15M・NaCl（1ml）
と完全フロイントアジユバント（1ml）で乳化したもの
を含ませた。以後の全注射にはコンジユゲート1mgを0.1
5MNaCl（1ml）と不完全フロイントアジユバント（1ml）
で乳化したものを含ませた。ひつじから毎月各補助注射
の１週間後に採血した。
7.CLA−Pen−BSAコンジユゲート精製用抗AA−Pen−BSA
アフイニテイ担体の製造。
上記６で得たAA−Pen−BSA抗血清を、下記８のCLA−Pen
−BSAコンジユゲート精製用アフイニテイ担体の製造に
用いた。まず、AA−Pen−BSA抗血清を抗BSA活性除去処
理に付した。BSA−セフアロース4Bを、CNBrセフアロー
ス（フアルマシア社）およびBSAからフアルマシア社の
書物「アフイニテイクロマトグラフイー：原理と方法」
記載の方法により製造した。AA−Pen−BSA抗血清（8m
l）を飽和(NH4)2SO4(PH6)8mlで処理して免疫グロブリン
（Ig）フラクシヨンを沈殿させた。沈殿を遠心分離（４
℃、104rpmで30分間）して集め、0.1M・NaHCO3−0.5M・
NaCl（pH8.3）に再けんだくした。次いで、同じ緩衝液
で透析した。
BSA−セフアロース4Bを用いて1.5×6.7cmのカラムを作
つた。透析したIgフランクシヨンをBSA−セフアロース4
Bのカラムに通し、ウフタロニー２重免疫拡散法により
クロマトグラフイー前にIgに存在した抗BSA活性がクロ
マトグラフイー後には存在しないことを確認した。
吸収したIgフラクシヨンを同様にしてCNBrセフアローズ
と結合させ、非開裂β−ラクタム環を有するコンジユゲ
ートの吸収に用いる抗AA−Pen−BSAアフイニテイ担体を
製造した。
8.AA−Pen−BSAのアルカリ性加水分解によるCLA−Pen−
BSAの製造。
上記５で得たAA−Pen−BSAコンジユゲート（100mg）を
0.1Mほう酸緩衝液（pH10）に溶かし、室温で一夜放置し
た。次いでこれを上記７で作つた抗AA−Pen−BSAアフイ
ニテイ担体に通した。通過ピークを集め、合わせて脱イ
オン水で透析した。非加水分解物が存在しないことをウ
フタロニー免疫散法で確認した。コンジユゲートを凍結
乾燥した。収量89.7mg。
9.CLA−Pen−BSAに対する抗血清の製造と試験。
ひつじに毎月注射を行なつた。最初の注射には上記８の
精製CLA−Pen−BSAコンジユゲート2mgを0.15MNaCl（1m
l）と完全フロイントアジユバント（1ml）で乳化したも
のを含ませた。以後の全注射にはコンジユゲート1mgを
0.15MNaCl（1ml）と不完全フロイントアジユバント（1m
l）で乳化したものを含ませた。ひつじから毎月各補助
注射の１週間後に採血した。抗血清の力価を測り、種々
のペニシリン誘導体との交差反応性をRIAにより測定し
た。
RIAは次のように実施した。抗血清（または非免疫性ひ
つじ血清で希釈した抗血清）100μｌを14C−ペニシロ酸
酸25μｌと40℃で一夜インキユベートした。トレーサー
抗原濃度はPBS（pH7.2）中2.5μg/mlであつた。PBS（pH
7.2）中20％PEG6000の375μｌを加えて結合抗原を沈殿
させ、次いで４℃で30分間インキユベートした。溶液を
４℃で遠心分離（3000rpmで30分間）し、上清350μｌを
除き、シンチレーシヨンカウンターで計数した。１頭の
ひつじから得た抗血清で、抗血清２μｌがトレーサー50
％の沈殿に必要なことがわかつた。
交差反応の検討のために、抗血清を、非免疫血清75μｌ
で希釈したときトレーサー抗原約50％を沈殿する量の14
C−ペニシロ酸と反応させた。希釈抗血清を４℃で５時
間、PBS25μｌ中の非標識抗原の濃度を次第に増してイ
ンキユベートした。結合した標識抗原量を上記RIAで測
定した。結合した標識抗原量を上記RIAで測定した。１
頭のひつじから得た血清につき、約0.45μg/mlのペニシ
ロ酸がトレーサーの50％置換をもたらし、同じ置換をも
たらすのにベンジルペニシリン31.6μg/mlが必要なこと
がわかつた。
10.固体担体の製造。
ワツトマンNo.2紙デイスク（直径15cm）を0.1Mカルボ
ニルジイミダゾール中室温で５時間活性化した。次い
で、デイスクを水で充分洗いTHFで乾燥した。
上記９で得たCLA−Pen−BSA抗血清を(NH4)2SO4で沈殿さ
せ、透析した。透析した抗血清（250mg/μｌ）とGO（10
0μl/ml）をPBS（pH7.0）に加えた。得られる溶液を活
性化デイスク（20ml/デイスク）４時間反応させた。PBS
で充分洗浄後、デイスクを安定剤（BSA2mg/mlおよび15
％しよ糖PBS溶液）で飽和させ、次いで凍結乾燥した。
デイスクを〜0.25インチのパツドに切断し、後記アツセ
イに使用するプラスチツクストリツプ（「デイツプステ
イツク」と称する）上にマウントした。
11.アンピシロ酸に対するHRPのコンジユゲーシヨン。
アンピシロ酸は次のようにして製造した。アンピシリン
３水化物（10g、シグマ社）を水50mlにけんだくし、10N
−NaOHを加えて溶かした。10N−NaOHを加えてpHを12に
保つた。１時間後、6N−HClでpHを7.0に調節した。次い
で２−プロパノール（140ml）を加え、溶液を４℃で４
時間放置し、その後に結晶が生成した。結晶を過し、
冷却した２−プロパノール：水（3:1）で数回洗い、室
温で乾燥した。薄層クロマトグラフイーにより、この物
質がほぼアンピシロ酸からなることがわかつた。収量1.
97g。
アンピシロ酸は次のようにしてHRPとコンジユゲートし
た。HRP粉末（60mg）を水5mlに溶かした。実蛋白質濃度
を測定したところ、8.8mg/mlであつたが、これは粉末の
73％のみが実際にHRPであつたことを示す。HRP溶液を一
夜透析し、その間蒸留水を数回変えた。透析溶液（4.2m
l、8.3mg/ml）を0.1M−NaIO40.8mlと室温で60分間反応
させた。次いで反応混合物を5mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH4.6）で平衡化したセフアデツクスＧ−25カラムに
通し、視覚検査によりピークを集めた。精製HRP（3.9mg
/ml）4.5mlに製造したアンピシロ酸32mgの2M−Na3PO
4（pH7.5ml）溶液を加えた。混合物を４℃で30分間攪拌
し、次いでNaBH3CNの10mg/ml溶液0.6mlを加えた。４℃
で一夜インキユベートした後、コンジユゲートを水で平
衡したセフアデツクスＧ−25カラムで精製した。コンジ
ユゲートをPBSで透析した。
12.アツセイ ベンジルペニシリン、アンピシリン、ペニシロ酸および
アンピシロ酸の交差反応性を、次のようにして測定し
た。上記10で製造したデイツプステイツクを、PBS（pH
7.2）に溶かした各ハプテンの連続希釈液中でインキユ
ベートした。デイツプステイツクをブロツトし、BSA0.2
％、0.05Mβ−Ｄ−グルコースおよび４−Cl−１−ナフ
トール（300ng/ml）PBS溶液に移す。この溶液中で15分
インキユベート後、デイツプステイツクを除き、ブロツ
トし、マクベス・レフレクタンス・スペクトロメータ
（マクベス・インストルメント・デイビジヨン・オブ・
コロモルガン・コーポレイシヨン、ニユーバーフ、ニユ
ーヨーク、12550）で色素単位（color difference uni
t,CDU）反応値（reflectance value）（発色剤中でイン
キユベートした空パツドCDU0に対する値）を測定した。
結果を第１表に示す。
これらの結果は、抗CLA−Pen−BSAが、開裂β−ラクタ
ム環化合物（すなわちベンジルペニシロ酸およびアンピ
シロ酸）に対して、対応する閉鎖β−ラクタム環化合物
（すなわちベンジルペニシリンおよびアンピシリン）よ
りも、約10ないし10000ng/mlの範囲のハプテン濃度でよ
く反応することを示している。
β−ラクタマーゼのアツセイ用標準曲線は次のようにし
て作成した。β−ラクタマーゼの正常ひと血清による連
続希釈液を作つた。種々の濃度の試料（100μｌ）を、
ベンジルペニシリン11.1μg/mlとPBS（pH7.2）からなる
基質溶液900μｌと37℃で１時間インキユベートした。
インキユベーシヨン終了後、試料を急いで室温にもど
し、最初のインキユベーシヨンがデイツプステイツクを
酵素反応混合物に入れる上記デイツプステイツクアツセ
イを実施した。結果を第２表に示す。
精密実験を、β−ラクタマーゼを種々のレベルで加えた
単一のひと血清試料について各レベルで15回アツセイす
ることにより行なつた。各試料（100μｌ）を上記基質
溶液と37℃で１時間インキユベートした。試料を室温に
もどした後、デイツプステイツク法でアツセイした。結
果を標準曲線から読み取り第３表に示す。
ａ）15回反復の平均値。
20種の血清試料を用いて変動実験を行なつた。これら
は、細菌感染症をもつことが知られない個人からのもの
であるが、物理的状態が異なつており、あるものは透明
で、あるものは溶血し、さらにあるものは極めて高脂質
で濁つていた。血清は種々の濃度のβ−ラクタマーゼで
スパイクした。アツセイは前記のように行なつた。結果
を第４表に示す。
ａ）20血清試料の平均値。
３種のアツセイプロトコルを比較した。各プロトコルで
は次の試薬を用いた。
酵素コンジユゲート試薬:PBS中HRP−アンピシロ酸（上
記11による）200ng/ml、およびBSA2mg/ml GO−HRP基質溶液:PBS中グルコース9mg/ml、４−Cl−１
−ナフトール300μg/mlおよびBSAmg/ml ペニシリン溶液:PBS中ベンジルペニシリン11.1μｇおよ
びEDTA10-3M プロトコル（Ａ）では、試料（100μｌ）をペニシリン
溶液（900μｌ）と37℃で１時間インキユベートする。
デイツプステイツクを溶液に室温で30分間浸漬し、その
後洗浄し酵素コンジユゲート試薬に移して15分間おく。
洗浄後、デイツプステイツクをGO−HRP基質溶液に15分
間浸漬し、ブロツトした後、適当な反射計で読みとる。
プロトコル（Ｂ）では、試料（100μｌ）とペニシリン
溶液（900μｌ）を合わせ、直ちにデイツプステイツク
を37℃で１時間浸漬する。デイツプステイツクを洗浄
し、酵素コンジユゲート試薬に移して15分間おき、その
後洗浄し、GO−HRP基質溶液に移して15分間おく。ブロ
ツトした後、デイツプステイツクを適当な反射計で読み
とる。
プロトコル（Ｃ）では、試料（100ml）を、メタノール
溶液から真空乾燥したベンジルペニシリン（10μｇ）で
被覆されている試験管中、室温で30分間インキユベート
する。次いで酵素コンジユゲート試薬（900μｌ）を試
験管に加え、デイツプステイツクを15分間浸漬する。洗
浄後、デイツプステイツクをGO−HRP基質溶液に移して1
5分間おき、ブロツトした後、適当な反射計で読み取
る。
β−ラクタマーゼの正常ひと血清中連続希釈液を作つ
た。上記各アツセイを実施した結果を第５表に示す。
プロトコルＢおよびＣの両アツセイは、約10-1ないし10
4IU/mlの範囲のβ−ラクタマーゼレベルの測定に適する
標準曲線をもたらした。
この発明の組成物は、患者血清試料中のペニシロ酸に対
する高感度・正確な測定法を提供する。抗原コンジユゲ
ートは、ペニシロ酸に対する高親和性・高力価の抗体の
効率的な産生をもたらす。これら抗体と酵素コンジユゲ
ートの組合わせは、ペニシロ酸の正確・迅速な測定法を
提供する。血清試料に予じめ定めた量のペニシリンを加
えることにより、β−ラクタマーゼのアツセイを実施す
ることができるが、そのβ−ラクタマーゼレベルは一定
時間内に産生されるペニシロ酸量から推計されるもので
ある。
上述したこの発明の説明は、明確化と理解のために例示
と実施例に基づいて細部を記載しているが、特許請求の
範囲に記載した発明の範囲内において変更および修正を
加え得ることはいうまでもない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リチヤード・ロジヤース アメリカ合衆国カリフオルニア94306、パ ーロ・アルト・アーベン・コート 557番 (56)参考文献 Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，57（１）, Ｐ．９−13（1975) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，84，Ｐ．491−494, （1978)

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）アッセイ媒質中で、ペニシロ酸を含
    む可能性のある試料、ペニシロ酸に対する抗体、および
    ペニシロ酸／酵素コンジュゲートを、混合する工程と、 （ii）上記試料中のペニシロ酸量に関連して上記ペニシ
    ロ酸／酵素コンジュゲートに上記抗体が結合したものの
    量または／および上記抗体が結合していないものの量を
    測定する工程 とを含む、上記試料中のペニシロ酸を測定する方法にお
    いて、 上記ペニシロ酸／酵素コンジュゲートが、式 ［式中、Ｘはアルカリ金属または水素、Ｙは天然または
    合成ペニシリン抗生物質の有機基、Ｒは炭素原子３ない
    し９個およびヘテロ原子０ないし５個を有する連結基、
    Ｚは酵素であるポリアミノ酸、ｎは１ないしＺの分子量
    の500分の１を意味する］ で示される化合物であり、および／または上記ペニシロ
    酸に対する抗体が、式 ［式中、Ｚは抗原性であるポリアミノ酸を意味し、Ｘ、
    Ｙ、Ｒおよびｎはそれぞれ上記定義を意味する］ で示される化合物を抗原として得られたものであること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】工程（ｉ）の混合が、ペニシロ酸／酵素コ
    ンジュゲートの抗体に結合したものと抗体に結合してい
    ないものとを弁別することができ、結合したものの量が
    試料中のペニシロ酸量に関係しているような条件下で行
    われる、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】工程（ｉ）において、抗体が固体支持物に
    結合しており、混合後、アッセイ媒質から上記支持物を
    分離する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】工程（ii）において、試料中のペニシロ酸
    量に関連して、上記支持物または／およびアッセイ媒質
    中の酵素活性を測定する、特許請求の範囲第３項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】試料が、β−ラクタマーゼを有する可能性
    のある試料とペニシロ酸に対するペニシリン前駆体とを
    合わせることにより調製されたものである、特許請求の
    範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】酵素が、西洋わさびペルオキシダーゼであ
    る、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の
    方法。
  7. 【請求項７】式 ［式中、Ｘはアルカリ金属または水素、Ｙは天然または
    合成ペニシリン抗生物質の有機基、Ｒは炭素原子３ない
    し９個およびヘテロ原子０ないし５個を有する連結基、
    Ｚは酵素であるポリアミノ酸、ｎは１ないしＺの分子量
    の500分の１を意味する］ で示される化合物を必須成分とする、下記の測定方法で
    使用するペニシロ酸測定用試薬： （ｉ）アッセイ媒質中で、ペニシロ酸を含む可能性のあ
    る試料、ペニシロ酸に対する抗体、およびペニシロ酸／
    酵素コンジュゲートを、混合する工程と、（ii）上記試
    料中のペニシロ酸量に関連して、上記ペニシロ酸／酵素
    コンジュゲートに上記抗体が結合したものの量または／
    および上記抗体が結合していないものの量を測定する工
    程とを含む、試料中のペニシロ酸を測定する方法。
  8. 【請求項８】Ｒが鎖中に５ないし12個の原子を有する直
    鎖である、特許請求の範囲第７項記載の試薬。
  9. 【請求項９】Ｒが、 である、特許請求の範囲第８項記載の試薬。
  10. 【請求項１０】Ｙがフェニルである、特許請求項７項記
    載の試薬。
  11. 【請求項１１】Ｚが西洋わさびペルオキシダーゼであ
    る、特許請求の範囲第７項記載の試薬。
  12. 【請求項１２】式 ［式中、Ｘはアルカリ金属または水素、Ｙは天然または
    合成ペニシリン抗生物質の有機基、Ｒは炭素原子３ない
    し９個およびヘテロ原子０ないし５個を有する連結基、
    Ｚは抗原性であるポリアミノ酸、ｎは１ないしＺの分子
    量の500分の１を意味する］ で示される化合物を抗原として得られた抗体を必須成分
    とする、下記の測定方法で使用するペニシロ酸測定用試
    薬： （ｉ）アッセイ媒質中で、ペニシロ酸を含む可能性のあ
    る試料、ペニシロ酸に対する抗体、およびペニシロ酸／
    酵素コンジュゲートを、混合する工程と、（ii）上記試
    料中のペニシロ酸量に関連して上記ペニシロ酸／酵素コ
    ンジュゲートに上記抗体が結合したものの量または／お
    よび上記抗体が結合していないものの量を測定する工程
    とを含む、試料中のペニシロ酸を測定する方法。
  13. 【請求項１３】Ｒが鎖中に５ないし12個の原子を有する
    直鎖である、特許請求の範囲第12項記載の試薬。
  14. 【請求項１４】Ｒが、 である、特許請求の範囲第13項記載の試薬。
  15. 【請求項１５】Ｙがフェニルである、特許請求項12項記
    載の試薬。
  16. 【請求項１６】Ｚがうし血清アルブミンまたはうしガン
    マグロブリンである、特許請求の範囲第12項記載の試
    薬。
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