JPH07313178A - Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 マレイン酸とアンモニアからＬ−アスパラ
ギン酸を生産する際、多量のアンモニウム塩を排出しな
いＬ−アスパラギン酸の製造方法を提供する。 【構成】 マレイン酸とアンモニアおよびアルカリ金
属イオンを含む基質媒体に、マレイン酸イソメラーゼ活
性とアスパルターゼ活性の両方の活性を有する酵素含有
物、またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する酵素含
有物とアスパルターゼ活性を有する酵素含有物を作用せ
しめることによりＬ−アスパラギン酸を生成せしめ、次
にＬ−アスパラギン酸を含有する反応済媒体に鉱酸を加
え、Ｌ−アスパラギン酸の結晶を濾別・回収すると共
に、鉱酸のアルカリ金属塩を主成分とする廃液を排出す
るＬ−アスパラギン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はマレイン酸とアンモニア
からＬ−アスパラギン酸を生産する際、多量のアンモニ
ウムイオンを含んだ廃水を排出しないようにする方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、マレイン酸アンモニウムからＬ−
アスパラギン酸を製造する方法としては、シュードキナ
ス属、バチルス属、アエロバクター属、ブレビバクテリ
ウム属に属し、マレイン酸よりＬ−アスパラギン酸を生
成せしめる特徴を有する微生物を用いる方法（特公昭４
２−１１９９３号、特公昭４２−１１９９４号）が知ら
れている。

【０００３】しかしこれらの方法ではマレイン酸とアン
モニアまたはアンモニウム塩よりＬ−アスパラギン酸を
製造することを特徴としており反応液からＬ−アスパラ
ギン酸を回収するために硫酸などの鉱酸を用いて、Ｌ−
アスパラギン酸の結晶を析出させ、これを濾別する方法
がとられているが、高濃度の硫酸アンモニウム等のアン
モニウム塩を含有した廃水が大量に排出されるという問
題点を有していた。

【０００４】水溶液中のアンモニウムイオンの除去は廃
水処理の面でも非常に困難であり、湖沼や瀬戸内海など
の内湾ではアンモニウムイオンを含む窒素濃度が上昇す
ることによる水質汚染などの問題が生じてきている。ま
た最近、工場廃水中の窒素濃度の規制についても各省庁
で検討が行われているようである。従って、Ｌ−アスパ
ラギン酸の製造においても硫安などの副生成物が多量に
発生しない系の開発が望まれている。

【０００５】米国特許４５６０６５３ではＬ−アスパラ
ギン酸の生産の際にアスパルターゼもしくはアスパルタ
ーゼ生産菌をフマル酸とアンモニアに作用させて生成し
たアスパラギン酸アンモニウム水溶液にマレイン酸を添
加して酸性にすることによってＬ−アスパラギン酸を晶
析させ、濾液を異性化することによって反応液のリサイ
クルを行う方法が提案されている。この方法は、硫安な
どの副生成物が発生しない方法である。しかしこの方法
ではＬ−アスパラギン酸の晶析に用いたマレイン酸を、
臭素イオンを含んだ触媒を用いて、アスパルターゼが作
用できるフマル酸に異性化し、異性化後、触媒を除去す
る工程が含まれており、Ｌ−アスパラギン酸の製造工程
が煩雑になる欠点を有している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はマレイ
ン酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を生産する
際、多量のアンモニウム塩を排出しない、Ｌ−アスパラ
ギン酸の製造方法を提供しようとするものである。

【０００７】本発明者らはこのような高濃度のアンモニ
ウムイオンを含有した廃水が大量に排出されない、簡易
なＬ−アスパラギン酸の製造方法について鋭意検討を行
った結果、この反応の基質であるマレイン酸を中和する
のに、従来用いられていたアンモニアに加えてアルカリ
金属イオンをあわせて用いても、反応の転化率、選択率
共にアンモニア単独の場合と遜色ない結果が得られるこ
とを見いだし本発明を完成させるに至った。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明はマレイン酸とア
ンモニアおよびアルカリ金属イオンを含む基質媒体に、
マレイン酸イソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性の両
方の活性を有する酵素含有物、またはマレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する酵素含有物とアスパルターゼ活性を
有する酵素含有物を作用せしめることによりＬ−アスパ
ラギン酸を生成せしめ、次にＬ−アスパラギン酸を含有
する反応済媒体に鉱酸を加え、Ｌ−アスパラギン酸の結
晶を濾別・回収すると共に、鉱酸のアルカリ金属塩を主
成分とする廃液を排出することを特徴とするＬ−アスパ
ラギン酸の製造方法に関するものである。

【０００９】本発明に用いるマレイン酸はマレイン酸あ
るいはマレイン酸塩から選ばれるものであって、これら
の混合物でもよい。反応の際のマレイン酸濃度は通常５
〜３０重量％が好ましいがマレイン酸塩の溶解度と生産
性の面から特に１０〜２５重量％が好ましい。

【００１０】本発明に用いられるアンモニアは液体アン
モニア、アンモニア水溶液等が使用可能であるが、取扱
上、アンモニア水溶液が有利である。

【００１１】アンモニア水の濃度としては特に限定され
るものではないが、工業的には１０〜３５重量％が利用
するのに好ましい。

【００１２】本発明に使用するアルカリ金属イオンの量
はマレイン酸に対して０．５〜１．５倍モル、好ましく
は０．９〜１．３倍モル、より好ましくは１．１０〜
１．２５倍モル用いるのがよい。

【００１３】本発明に用いるアルカリ金属イオンとして
はナトリウムイオン、カリウムイオンのほか各種のアル
カリ金属イオンが使用できるが、経済的には水酸化ナト
リウムか水酸化カリウムをアルカリ金属イオンとして用
いるのが好ましい。またこれらのアルカリ金属水酸化物
は２種以上のものを混合して用いても差し支えない。さ
らにマレイン酸をアルカリ金属イオンで中和するかわり
にマレイン酸のアルカリ金属塩をそのまま用いても差し
支えない。

【００１４】反応液のｐＨは５から１０の範囲、好まし
くは７．０〜９．０の範囲、さらに好ましくはｐＨ７．
５〜８．５程度にアルカリ金属イオンおよびアンモニア
を添加して調整すればよい。

【００１５】本発明に使用するマレイン酸イソメラーゼ
活性とアスパルターゼ活性の両方の活性を有する微生物
としては、例えばアルカリゲネス（Alcaligenes ）属に
属する微生物（アルカリゲネス・フェカーリス（Alcali
genes faecalis）ＡＴＣＣ８７５０）などマレイン酸よ
りＬ−アスパラギン酸を収率よく生成する特徴を有する
微生物であれば特に限定されない。

【００１６】またマレイン酸イソメラーゼ活性を有する
微生物およびアスパルターゼ活性を有する微生物をくみ
あわせて使用することも可能である。マレイン酸イソメ
ラーゼ活性を有する微生物としては例えばシュードモナ
ス（Pseudomonas ）属に属する微生物（シュドモナス・
マルトフィリア（pseudomonas maltophilia ）ＡＴＣＣ
１３２７０）などマレイン酸よりフマル酸を収率よく生
成する特徴を有する微生物であれば特に限定されない。
また、アスパルターゼ活性を有する微生物としては例え
ばエッシェリシア（Escherichia ）属に属する微生物
（エッシェリシア・コリ（Escherichia coli）ＡＴＣＣ
１１３０３、ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ２７３２
５）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属す
る微生物などフマル酸よりＬ−アスパラギン酸を収率よ
く生成する特徴を有する微生物であれば特に限定されな
い。

【００１７】マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生
物とアスパルターゼ活性を有する微生物は混合して反応
に用いてもまた別々に反応に用いることも可能である。

【００１８】本発明の方法に使用される上記微生物菌体
の調製に使用する培地は特に限定されるものではなく、
一般の微生物に使用される培地でよい。培地の炭素源と
しては、例えば、グルコース、フラクトース、ショ糖な
どの糖類、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酢酸など
の有機酸、およびエタノールなどのアルコールが使用で
きる。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素な
どの無機塩類が使用できる。さらにペプトン、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カサミノ酸などの有機窒
素源も使用できる。無機塩としては、燐酸一水素カリウ
ム、燐酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一
鉄等が用いられる。また必要に応じてビタミン類も適宜
添加できる。

【００１９】培養は通気撹拌、振とうなどの好気的条件
下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２８〜
３７℃である。培養液のｐＨはｐＨ５〜１０、好ましく
はｐＨ７〜８で行い、ｐＨの調整は酸またはアルカリの
添加により行う。培養開始時の培地中の炭素源の濃度は
０．０５〜１０重量％、好ましくは０．５〜２重量％で
行う。培養期間は１０時間から４日間、好ましくは１５
時間から３日間で行う。上記のごとく培養して得られる
微生物菌体は遠心または濾過により集め、水または適当
な緩衝液を用いて洗浄し、本発明の反応に使用する。本
発明の反応は微生物菌体をそのまま用いることもできる
し、超音波、摩砕、凍結融解、酵素処理などにより物理
的または生化学的に処理して破砕した菌体破砕物、ある
いはこれから精製した酵素および菌体もしくは菌体破砕
物、酵素をポリアクリルアミド、アルギン酸、κ−カラ
ギーナンなどの適当な天然系高分子、あるいは合成高分
子を担体として固定化して用いることも可能である。

【００２０】また反応に用いる酵素含有物に含まれるフ
マラーゼ活性など該反応の妨げになりうる酵素を予め失
活させた後に反応に用いることも可能である。

【００２１】マレイン酸とアンモニアとの反応はそれら
を溶解した水性媒体、たとえば水または緩衝液中で行
う。反応の際の原料のマレイン酸の濃度は５〜２５重量
％好ましいが、マレイン酸塩の溶解性と生体触媒の反応
性を考えると特に１０〜２５重量％の範囲の水溶液で反
応させるのが効果的である。

【００２２】また反応液にはさらに塩化マンガン、硫酸
マンガンなどのマンガン塩、または塩化マグネシウム、
硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩を０．１〜５０
ｍＭ、特に１〜１０ｍＭの濃度に添加することがことが
好ましい。

【００２３】またメルカプトエタノールなどのチオ化合
物を０．１〜５０ｍＭ、特に１〜１０ｍＭの濃度に添加
することがことが好ましい。

【００２４】本発明における反応槽の態様は特に限定さ
れないが、例えば、バッチ型反応装置、カラム型反応装
置など従来から知られている反応槽で反応を行うことが
できる。反応槽は１つであってもよいし、複数あっても
差し支えない。またカラム型の反応装置の場合には、通
液速度をカラムに充填されている酵素の種類によって変
えて反応することも可能である。

【００２５】マレイン酸とアンモニアとの反応の際の温
度は低温では反応速度が低下するため通常２０℃程度を
下限とし、高温下ではマレイン酸イソメラーゼ活性とア
スパルターゼ活性の両方の活性を有する酵素含有物、ま
たはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する酵素含有物と
アスパルターゼ活性を有する酵素含有物の混合物の失活
を招くため５０℃程度を上限とするのが好ましく、より
好ましくは２５〜４０℃の範囲で行うのがよい。

【００２６】反応後の液中のＬ−アスパラギン酸は常法
通り等電点沈殿法等により容易に回収できる。例えば反
応液に硫酸等の鉱酸を添加しｐＨをＬ−アスパラギン酸
の等電点である２．７７程度に低下させ、冷却すること
によって結晶を析出させれば良い。

【００２７】本発明に用いる鉱酸としては硫酸、塩酸、
リン酸などが使用できる。

【００２８】析出したＬ−アスパラギン酸の結晶は通常
の方法、例えば濾過、遠心分離、デカンテーションなど
の方法で液から分離し、通常の方法にしたがって乾燥さ
れる。Ｌ−アスパラギン酸の結晶を分離した液中のアン
モニウムイオンの濃度はアンモニア単独で行なう方法に
比べて数分の一から数十分の一となっており、主成分は
鉱酸のアルカリ金属塩である。

【００２９】

【作用】本発明によれば、マレイン酸とアンモニアから
Ｌ−アスパラギン酸の製造に際して、廃水の主成分を従
来の鉱酸のアンモニウム塩から鉱酸のアルカリ金属塩に
かえることができ、近年の工業廃水に対する窒素規制に
対応することができる。

【００３０】

【実施例】次に本発明の方法を実施例をあげて説明する
が、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではな
い。

【００３１】実施例１ マレイン酸１重量％、マロン酸０．５重量％、硫酸アン
モニウム０．５重量％、燐酸１水素カリウム０．３重量
％、燐酸２水素カリウム０．１重量％、硫酸マグネシウ
ム７水塩０．０５重量％、酵母エキス２重量％からなる
組成の培地（ｐＨ６．５）６Ｌを全容１０Ｌのジャーフ
ァーメンターに仕込、アルカリゲネス・フェカーリス
（Alcaligenes faecalis）ＡＴＣＣ８７５０を接種し、
３０重量％のマレイン酸水溶液を用いて培地中のｐＨを
７．５に保ちながら培養を行った。培養２０時間後に培
養を終了し菌体を遠心分離によって集めた。この菌体を
４等分して、−８０℃で凍結して冷蔵した。

【００３２】２００ｇのマレイン酸、０．２５ｇの硫酸
マグネシウム７水塩、０．２ｇのメルカプトエタノール
および１ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をイオン交換水
に溶解し、水酸化ナトリウムを８２．８ｇ（対マレイン
酸１．２倍モル）添加後、２５重量％アンモニア水溶液
を添加して、ｐＨを８．３に調節し、水を追加して全量
を１Ｌとし、これを反応基質水溶液とした。

【００３３】この反応基質水溶液に先に４等分した凍結
菌体の一つを入れ、３０℃で緩やかに振盪しながら２４
時間反応させた。この反応液中のＬ−アスパラギン酸は
２１５．７ｇであった。この反応液を遠心分離して菌体
を除いた後、硫酸を添加し、ｐＨを２．８に調節した。
これを６０℃に加熱、その後冷却した。冷却後、吸引濾
過器で吸引濾過し、濾過器内の結晶を約１５０ｍｌの水
で吸引しながら洗浄し、この結晶を乾燥し重量、純度を
調べたところ、重量２１０．４ｇ、純度９９．０％であ
った。濾液１Ｌ中のアンモニア濃度を測定したところ、
ＮＨ₃ として約２．１ｇ／Ｌであった。

【００３４】実施例２ 実施例１において、反応基質に加える水酸化ナトリウム
の量を１００ｇ（対マレイン酸１．４５倍モル）にした
以外は実施例１と同様な操作を行った。反応後の反応液
中のＬ−アスパラギン酸は１７０ｇであった。実施例１
と同様な方法でＬ−アスパラギン酸の晶析を行い、重量
２１７ｇ、純度７７％のＬ−アスパラギン酸を得た。濾
液中のアンモニア濃度を測定したところ、ＮＨ₃ として
約０．８０ｇ／Ｌであった。

【００３５】実施例３ 実施例１において、反応基質に水酸化ナトリウムを水酸
化カリウムに変え、水酸化カリウムを９６．７ｇ（対マ
レイン酸１．０倍モル）添加する以外は、実施例１と同
様な反応を行った。反応後の反応液中のＬ−アスパラギ
ン酸は２２４ｇであった。実施例１と同様な方法でＬ−
アスパラギン酸の晶析を行い、重量２２１ｇ、純度９
８．９％のＬ−アスパラギン酸を得た。濾液中のアンモ
ニア濃度を測定したところ、ＮＨ₃ として約６．３ｇ／
Ｌであった。

【００３６】比較例１ 実施例１において、反応基質に水酸化ナトリウムを加え
ずに２５重量％アンモニア水のみを用いて、ｐＨを８．
３に調節した以外は、実施例１と同様の操作を行なっ
た。反応後の反応液中のＬ−アスパラギン酸は２２７．
０ｇであった。この反応液を実施例１と同様な方法で処
理し結晶と炉液を得た。結晶を乾燥し重量、純度を調べ
たところ、重量２２２．３ｇ、純度９９．１％であっ
た。濾液中のアンモニア濃度を測定したところ、ＮＨ₃
として約３５．９ｇ／Ｌであった。

【００３７】実施例４ マレイン酸１重量％、硫酸アンモニウム０．５重量％、
燐酸１水素カリウム０．３重量％、燐酸２水素カリウム
０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５重量
％、酵母エキス２重量％からなる組成の培地（ｐＨ６．
５）６Ｌを全容１０Ｌのジャーファーメンターに仕込、
シュードモナス・マルトフィリア（Pseudomonas maltop
hilia ）ＡＴＣＣ１３２７０を接種し、３０重量％のマ
レイン酸水溶液を用いて培地中のｐＨを７．５に保ちな
がら３０℃で通気撹拌培養を行った。培養２０時間目後
に培養を終了し菌体を遠心分離によって集めた。これを
４等分して、−８０℃で凍結して冷蔵した。

【００３８】また、フマル酸２重量％、コーンスティー
プ・リカー２重量％、酵母エキス２重量％、リン酸１カ
リウム０．１重量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５
重量％の組成からなる培地（アンモニアでｐＨを７．５
に調整）１Ｌを全容２Ｌのジャーファーメンターに仕
込、エッシェリシア・コリ（Escherichia coli）ＡＴＣ
Ｃ１１３０３を接種し、３７℃で通気攪拌培養を行っ
た。培養２０時間目後に培養を終了し菌体を遠心分離に
よって回収した。これを４等分して、−８０℃で凍結し
て冷蔵した。

【００３９】２００ｇのマレイン酸２０ｇ、０．２５ｇ
の硫酸マグネシウム７水塩、０．２ｇのメルカプトエタ
ノールおよび１ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をイオン
交換水に溶解し、水酸化ナトリウムを８２．８ｇ（対マ
レイン酸１．２倍モル）添加後、２５重量％アンモニア
水溶液を添加して、ｐＨを８．３に調節し、水を追加し
て全量を１Ｌとし、これを反応基質水溶液とした。

【００４０】この反応基質水溶液に先に４等分した２種
類の凍結菌体を混合して入れ、３０℃で緩やかに振盪し
ながら２４時間反応させた。この反応液中のＬ−アスパ
ラギン酸は２１９．２ｇであった。この反応液を遠心分
離して菌体を除いた後、硫酸を添加し、ｐＨを２．８に
調節した。これを６０℃に加熱、その後冷却した。冷却
後、吸引濾過器で吸引濾過し、濾過器内の結晶を約１５
０ｍｌの水で吸引しながら洗浄し、この結晶を乾燥し重
量、純度を調べたところ、重量２１４．４ｇ、純度９
９．０％であった。濾液１Ｌ中のアンモニア濃度を測定
したところ、ＮＨ₃ として約１．０ｇ／Ｌであった。

【００４１】実施例５ 実施例４において、反応基質に加える水酸化ナトリウム
の量を１００ｇ（対マレイン酸１．４５倍モル）にした
以外は実施例１と同様な操作を行った。反応後の反応液
中のＬ−アスパラギン酸は１７７．５ｇであった。実施
例１と同様な方法でＬ−アスパラギン酸の晶析を行い、
重量２１７．５ｇ、純度８０．２％のＬ−アスパラギン
酸を得た。濾液中のアンモニア濃度を測定したところ、
ＮＨ₃ として約０．８５ｇ／Ｌであった。

【００４２】実施例６ 実施例４において、反応基質に水酸化ナトリウムを水酸
化カリウムに変え、水酸化カリウムを９６．７ｇ（対マ
レイン酸１．０倍モル）添加する以外は、実施例１と同
様な反応を行った。反応後の反応液中のＬ−アスパラギ
ン酸は２２５．１ｇであった。実施例１と同様な方法で
Ｌ−アスパラギン酸の晶析を行い、重量２２１．５ｇ、
純度９９．２％のＬ−アスパラギン酸を得た。濾液中の
アンモニア濃度を測定したところ、ＮＨ₃ として約６．
１ｇ／Ｌであった。

【００４３】比較例２ 実施例４において、反応基質に水酸化ナトリウムを加え
ずに２５重量％アンモニア水のみを用いて、ｐＨを８．
３に調節した以外は、実施例１と同様の操作を行なっ
た。反応後の反応液中のＬ−アスパラギン酸は２２７．
２ｇであった。この反応液を実施例１と同様な方法で処
理し結晶と炉液を得た。結晶を乾燥し重量、純度を調べ
たところ、重量２２２．９ｇ、純度９９．２％であっ
た。濾液中のアンモニア濃度を測定したところ、ＮＨ₃
として約３５．５ｇ／Ｌであった。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、高濃度の硫酸アンモニ
ウム水溶液などの環境上好ましくない副生成物を伴わず
にＬ−アスパラギン酸を効率よくフマル酸を原料に製造
することができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレイン酸とアンモニアおよびアルカ
   リ金属イオンを含む基質媒体に、マレイン酸イソメラー
   ゼ活性とアスパルターゼ活性の両方の活性を有する酵素
   含有物、またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する酵
   素含有物とアスパルターゼ活性を有する酵素含有物を作
   用せしめることによりＬ−アスパラギン酸を生成せし
   め、次にＬ−アスパラギン酸を含有する反応済媒体に鉱
   酸を加え、Ｌ−アスパラギン酸の結晶を濾別・回収する
   と共に、鉱酸のアルカリ金属塩を主成分とする廃液を排
   出することを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製造方
   法。
2. 【請求項２】 マレイン酸イソメラーゼ活性とアスパ
   ルターゼ活性の両方の活性を有する酵素含有物、または
   マレイン酸イソメラーゼ活性を有する酵素含有物とアス
   パルターゼ活性を有する酵素含有物が、酵素活性を有す
   る微生物菌体、菌体破砕物、部分精製酵素、もしくは精
   製酵素またはこれらを含んでなる固定化酵素もしくは固
   定化微生物である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 マレイン酸に対して０．５〜１．５倍
   モルのアルカリ金属イオンを含む請求項１〜２のいずれ
   かに記載の方法。
4. 【請求項４】 アルカリ金属イオンがナトリウムイオ
   ンおよび／またはカリウムイオンである請求項１〜３の
   いずれかに記載の方法。