JPH0731473A - Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、誘導物質の不存在下にＮ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異さ
れたエシェリヒア・コリーの変異株に、エシェリヒア属
に属するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由
来のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む
染色体ＤＮＡ断片が組込まれた組換えプラスミドを導入
し、得られる形質転換株を培養し、培養物からＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼを採取するＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼの製造方法を提供する。 【効果】本発明方法によれば、シアル酸無添加培地での
培養により著量の目的酵素を容易に製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エシェリヒア属に属
し、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む
組換えプラスミドを導入して形質転換した微生物より、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを製造する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
（Ｎ−acylneuraminate aldolase）は、別名シアル酸ア
ルドラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員会の酵
素番号Ｅ．Ｃ．４．１．３．３．に分類され、系統名で
はＮ−アシルノイラミン酸：ピルビン酸リアーゼ（Ｎ−
acylneuraminate ：pyruvate lyase）と呼ばれている酵
素である。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル酸
（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒
する酵素である。

【０００３】

【化１】

【０００４】本発明者らは、先にエシェリヒア属、その
他の数種の属に属する公知菌を、シアル酸の存在下に培
養する時には、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼが、工業的規模で容易に製造できることを見出し、該
酵素の製造技術を確立した（特公昭５６−５４１５３
号、特許第１１１１３４６号）。

【０００５】しかるに上記確立された方法では、培地へ
のシアル酸の添加が必須であり、このシアル酸自体その
調製に繁雑な操作等を要し且つ高価なものである不利が
あった。しかもこのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼは生産されないかあ
るいは極微量生産されるのみで、到底工業的実施はでき
ないものであった。即ち上記方法に利用される微生物
は、それ自体シアル酸の不存在下ではＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産能を実質的に発現できないもの
であった。

【０００６】本発明者らは、上記方法の最大の欠点とな
るシアル酸利用を必須とする点を解消し、該シアル酸を
利用せずとも工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼを製造できる技術を開発するべく鋭意研
究を重ねた。その結果、上記確立された方法に利用され
る微生物のうちエシェリヒア属に属する特定の変異株
が、シアル酸、その類縁体等の誘導物質の無添加培地で
も著量の目的酵素を生産するという事実を見出し、この
知見に基づく発明を完成した（特開昭６０−１８４３８
４号公報）。

【０００７】引き続く研究において、本発明者らはま
た、前記確立された方法に利用される微生物のうちエシ
ェリヒア属に属するものからＮ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽出し、こ
れをエシェリヒア・コリー系ベクターに組み込んで組換
えプラスミドを作成することに成功すると共に、該プラ
スミドで形質転換させたエシェリヒア属に属するＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌又は該酵素の欠損
株が、上記変異株と同様にシアル酸等の誘導物質の無添
加培地で、目的とする酵素を著量生産できるという事実
をも発見し、この知見に係る発明をも完成した（特願昭
５９−１８１２５０号）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
従来技術は勿論のこと、本発明者等が新たに開発した技
術にみられる目的酵素の生産性をも凌ぐ非常に優れた酵
素生産能を有する、より改良された形質転換微生物及び
該微生物による目的酵素の製造技術を確立することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、誘導物
質の不存在下にＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生
産能を発現するように変異されたエシェリヒア・コリー
の変異株に、エシェリヒア属に属するＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片が組込ま
れた組換えプラスミドを導入し、得られる形質転換株を
培養し、培養物からＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの製造方法が提供される。

【００１０】本発明は、本発明者らが先に開発した上記
変異株を宿主として、これに先に開発した特定のプラス
ミドを導入して形質転換させる時には、該形質転換株
が、実に驚くべきことに、宿主とする変異株及び先の形
質転換株のいすれからも全く予期できない非常に優れた
目的酵素生産能を発現するという事実、即ち本発明に係
わる形質転換株は、その目的酵素生産能が、飛躍的に向
上されたものとなるという事実の発見に基づいて完成さ
れたものである。従って、本発明の上記形質転換株を利
用する方法によれば、調製が面倒なシアル酸、その類縁
体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの誘導物質
を培地に添加せずとも、通常の微生物の培養用培地を用
いて、従来不可能であった非常に著量の目的酵素を容易
に工業的規模で大量に製造採取することができる。

【００１１】以下、本発明方法に利用する上記形質転換
株の製造法につき詳述する。

【００１２】本発明においては、宿主としてエシェリヒ
ア属に属する変異株を用いることが重要である。該変異
株については、先の特開昭６０−１８４３８４号に詳述
されている通り、公知の各種エシェリヒア属微生物に、
公知の各種変異処理手段を適用することにより得られ
る。本発明に特に好適に用いられる上記変異株の一例と
しては、エシェリヒア・コリー（Ｅ．coli）ＩＦ０３３
０１を親株とし、これをニトロソグアニジンを用いて変
異処理して得られるエシェリヒア・コリーＭ８３２８
（微工研条寄第８３２号、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２）を
例示できる。

【００１３】本発明の形質転換微生物は、上記変異株を
始めとして、シアル酸添加培地でＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ生産能を有する各種微生物を同様に変異
処理して得られる変異株に、Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ遺伝子を含む特定のプラスミドを導入するこ
とにより得られる。

【００１４】上記プラスミドは、エシェリヒア属に属す
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリー系ベクターに組込
むことにより製造される。ここで染色体ＤＮＡ供与菌と
して用いられるエシェリヒア属細菌は、例えばエシェリ
ヒア・コリー（Ｅ．coli）のようなＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ高生産能のものであるのが好ましい
が、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有す
る限り特に制限はなく、公知の各種細菌をいずれも使用
可能である。

【００１５】上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
生産菌からの染色体ＤＮＡの調製は、通常の方法、例え
ばフエノールを用いる方法〔Saito-Miura 法、Biochim.
Biophys. Acta.,７２，６１９（１９６３）〕等により
行なわれる。

【００１６】調製された染色体ＤＮＡは、次いでベクタ
ーと連結するために切断される。この染色体ＤＮＡの切
断は、通常の制限エンドヌクレアーゼを用いる方法によ
り行なわれるが、特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を切断しない限り、
例えば物理的に剪断力を加えて切断する方法によること
もできる。制限エンドヌクレアーゼを用いて染色体ＤＮ
Ａを切断する方法の実施に当り、完全切断を起こす反応
条件を採用する場合には、目的とするＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の
制限エンドヌクレアーゼを用いることができ、また部分
的にしか切断を起こさない反応条件を採用する場合に
は、全ての種類の制限エンドヌクレアーゼを用いること
ができる。特にベクターとの連結の容易さから該制限エ
ンドヌクレアーゼとしては、用いられるベクターに唯一
の切断部位を有するものが好ましい。

【００１７】かくして切断された染色体ＤＮＡ断片を挿
入結合されるベクターＤＮＡとしては、通常用いられる
いずれも利用することができるが、特にエシェリヒア・
コリー系ベクターが好適である。上記ベクターの例とし
ては、例えばCol Ｅ１の系統、ｐＳＣ１０１の系統、ｐ
ＢＲ３２２の系統、ｐＡＣＹＣ１７７の系統、ｐＣＲ１
の系統、Ｒ６Ｋの系統、ラムダファージの系統等を例示
できる。

【００１８】上記染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの結
合は、一般的に行なわれている方法、例えば供与染色体
とベクターとを同一の制限エンドヌクレアーゼで切断
し、しかる後に之等をＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
る方法により行なわれるが、この方法に限定されること
なく、他の如何なる方法によってもよい。

【００１９】かくして得られる組換えプラスミド（供与
染色体ＤＮＡ断片とベクターとの結合体）は、次に宿主
（組換えプラスミド受容菌）である前記エシェリヒア属
に属する変異株に導入される。該宿主菌に上記プラスミ
ドを導入して形質転換を行なわせる方法は、代表的には
コンピテント細胞を用いる形質転換法〔Mol. Gen. Gene
t., １６７，２５１（１９７９）〕等に従うことができ
る。本発明では特にこの方法に限定されることなく他の
公知の各種の方法をいずれも採用することができる。

【００２０】上記方法により得られる形質転換株から目
的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を
含む供与染色体ＤＮＡ断片を保有し、該酵素をシアル酸
等の誘導物質の不存在下に著量生産する能力を有する目
的の微生物の選択分離は、何ら特殊な方法によらずと
も、通常の方法により、例えば所望の染色体上の遺伝形
質もしくはベクターの持つ形質又はこれらの両者を合せ
持つ菌のクローンを選択的に生育させ得る培地を利用す
る方法により実施できる。

【００２１】かくしてシアル酸無添加培地で著量のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼを生産する能力を有す
る目的の形質転換株を取得できる。

【００２２】本発明は、上記のごとくして得られる形質
転換株を培養してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
を採取する方法を提供するものである。

【００２３】上記形質転換株の培養のための培地として
は炭素源、窒素源、無機化合物その他の栄養素を含み、
細菌の培養に一般に用いられている合成培地、半合成培
地或いは天然培地のいずれをも使用することができる。
上記各培地に利用される炭素源としては、例えばブドウ
糖、果糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセ
ロール等の糖質液、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等
の有機酸類等を例示できる。窒素源としては、例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等を例示でき
る。炭素源としても窒素源としても利用できるものとし
ては、例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー等を例示できる。無機化合物としては、例えばリン
酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等を例示できる。その他の栄養素とし
ては、例えば酵母エキス、ビタミン等を例示できる。

【００２４】培養は、液体培地又は固体培地のいずれで
も行なうことができるが、通常液体培地の方が有利であ
って、特に振盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産
上有利である。培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２
８〜３７℃とするのが好適である。培養中は適当な中和
剤を用いてｐＨを６〜９に調整するのが好ましい。上記
培養を通常１０〜５０時間行なうことにより、目的とす
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性は最高に
達する。本酵素は一般に菌体内酵素であるので、培養物
からの本酵素の採取、精製は菌体内酵素を採取精製する
通常の方法に従うことができる。特に好ましいひとつの
代表例としては、例えば、上記培養液から遠心分離等の
方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガラス
ビーズを用いる磨砕処理、或いはフレンチプレス処理等
によって破砕し、酵素を抽出する方法を例示できる。ま
た上記で得られる抽出液はこれを硫安塩析法、イオン交
換クロマトグラフイー、ゲル濾過法等の常法により処理
することができ、かくして精製Ｎ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼを取得することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明
する。尚、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性
は、バーネットらの方法〔J. E. G. Barnett, D.L.Cori
na, and G.Rasool, Biochemical Journal, 125, 275 (1
971)〕に従い求めたものであり、該酵素活性の１単位と
は、反応温度３７℃において１分間に１マイクロモルの
Ｎ−アセチルマンノサミンを生成する酵素量をいう。

【００２６】

【実施例１】 （１）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産株Ｅ．
coli Ｋ１２Ｃ６００株からの染色体ＤＮＡの調製 下記組成のＬ培地１ｌ中でエシェリヒア・コリー（Ｅ．
coli）Ｋ１２Ｃ６００株を３７℃で約３時間振盪培養
し、対数増殖期の菌体を集めた。

【００２７】〈Ｌ培地組成〉 ペプトン １ｇ／ｄｌ 酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ グルコース ０．１ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｄｌ ｐＨ ７．２に調整 上記菌体につきフェノール法によるＤＮＡ抽出操作を行
なって、最終３．８ｍｇの染色体ＤＮＡを抽出精製し
た。

【００２８】（２）ベクターＤＮＡの調製と制限酵素に
よる切断 ベクターとしてのプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを以
下の通り調製した。即ち、まずｐＢＲ３２２をプラスミ
ドとして保有するエシェリヒア・コリーＫ１２株の一種
を下記組成のＧＰＭ培地に接種し、３７℃で対数増殖期
まで培養した後、最終濃度１００μｇ／ｍｌのクロラム
フェニコールを添加し、更に一夜培養した。

【００２９】〈ＧＰＭ組成〉 グルコース １０ｇ ペプトン １０ｇ ＮＨ₄ Ｃｌ １ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ １５．２ｇ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ３ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ₂ ＳＯ₄ ０．１１５ｇ ＭｇＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．０８３ｇ 酵母エキス １ｇ 脱塩水 全体を１ｌとする量 上記操作により、細胞内にプラスミドＤＮＡを多量に生
産させた。クロラムフエニコール添加の１６時間目に菌
体を集め、リゾチーム・ＳＤＳ処理して溶菌させ、３０
０００×ｇ、１時間の超遠心により上清を得た。これよ
りプラスミドＤＮＡを濃縮し、セシウムクロライド−エ
チジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法によって最終７
００μｇのｐＢＲ３２２のプラスミドＤＮＡを分画採取
した。

【００３０】（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの導
入 上記（１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇを取り、制限エ
ンドヌクレアーゼHindIIIを３７℃で３０分間、６０分
間又は１２０分間それぞれ反応させ、ＤＮＡの部分的切
断を行なった後、６５℃で１０分間熱処理して反応を停
止させた。

【００３１】他方、ベクターｐＢＲ３２２につき、制限
エンドヌクレアーゼHind IIIを用いて完全に切断後、ア
ルカリフォスフアターゼで処理してｐＢＲ３２２のＤＮ
Ａ断片を調製した。

【００３２】上記染色体ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ールの存在下に、Ｔ₄ ファージ由来のＤＮＡリガーゼを
用いて、１０℃で１６時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行なっ
た。６５℃で１０分間の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈殿させ、
採取し、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム）１ｍＭを含むトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．
０）０．５ｍｌに溶解した。

【００３３】（４）組換えプラスミドＤＮＡによる形質
転換 エシェリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株から、ニトロソ
グアニジン変異処理によって誘導したＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ欠損株を、Ｌ培地１０ｍｌにて対数
増殖中期まで生育させた後、塩化カルシウム５０ｍＭを
含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で２回洗浄
することにより、コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を
有する）細胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁液
０．４ｍｌに上記（３）で得たＤＮＡ溶液０．１ｍｌを
加えて、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２℃、２
分間の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ませた。

【００３４】次にこの細胞懸濁液をＬ培地に接種し、３
７℃で２時間静置培養を行なって形質転換反応を完了さ
せた後、集菌し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレート
に塗沫し、３７℃で２日間培養した。

【００３５】尚、上記最小培地プレートは、シアル酸２
ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ １ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ７ｇ、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ２ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ０．１ｇ、ロイシ
ン２０ｍｇ、スレオニン２０ｍｇ及びチアミン１ｍｇを
１ｌの純水に溶解し、ｐＨを７．０に調整したものに寒
天２０ｇを加えて殺菌した固形培地にアンピシリンを１
０μｇ／ｍｌとなるように加えることにより調製したも
のである。

【００３６】上記により生じたコロニーを釣菌し、アン
ピシリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性とを検討し、形質転換株ＲＣ−Ｈ１／ｐＭＫ
２（約１４．２ｋｂ）を取得した。

【００３７】（５）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼの遺伝情報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をＬ培地１００ｍｌ中で培
養し、上記（２）と同様にしてクロラムフェニコール処
理を行なった。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及び
ドリー（Birnboim and Doly ）の方法〔Nucleie Acids
Research, ７，１５１３〜１５２３（１９７９）〕によ
り、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの遺伝情報を
担うｐＢＲ３２２プラスミド（以下「ｐＭＫ２」と称す
る）を含む液を調製した。

【００３８】この溶液をアガロースゲル電気泳動（アガ
ロース０．７％、９０Ｖ）にかけ、ｐＭＫ２のバンドを
紫外線照射下で切り出し、これを透析チューブに入れ、
再度電気泳動を行ない、ゲルよりＤＮＡを抽出した。エ
チジウムブロマイドの除去を行なった後、２倍容のエタ
ノールを加えて沈殿させ、得られたｐＭＫ２の９０μｇ
を５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌに溶解
した。

【００３９】次いで上記（４）と同様にして、エシェリ
ヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持
たせた後、上記ｐＭＫ２を取り込ませた。かくして得ら
れる菌株をアンピシリン１０μｇ／ｍｌを含む最小培地
プレートに培養し、生じてくるコロニーを分離し、アン
ピシリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性を検討して、形質転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６０
０／ｐＭＫ２を収得した。

【００４０】（６）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ遺伝子のサブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドｐＭＫ２の１０μｇを取り、これに
２種の制限エンドヌクレアーゼEco RI及びHindIIIを同
時に作用させて３７℃で１時間部分的に切断反応を行な
った後、６５℃で１０分間熱処理して反応を停止させ
た。

【００４１】他方、ベクターｐＢＲ３２２につき、制限
エンドヌクレアーゼEco RI及びHindIIIを同時に用いて
完全に切断後、アルカリフォスターゼで処理してｐＢＲ
３２２のＤＮＡ断片を調製した。

【００４２】上記ｐＭＫ２のＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２
のＤＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトールの存在下に、Ｔ₄ ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼを用いて、１０℃で１６時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行
なって組換えプラスミドを調製した。

【００４３】次いで上記（４）と同様にしてエシェリヒ
ア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持た
せた後、上記で調製した組換えプラスミドを取り込ませ
た。

【００４４】かくして得られる菌体をアンピシリン１０
μｇ／ｍｌを含む最小培地プレートに培養し、生じてく
るコロニーを分離し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形
質転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６を得た。

【００４５】この形質転換株は、Ｎ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を組込ん
だ組換えプラスミドを保有するものであり、該プラスミ
ドを以下「ｐＭＫ６」と称する。

【００４６】ｐＭＫ６の制限酵素切断地図は図１に示す
通りである。これはｐＢＲ３２２に由来しPst I 、Pvu
II、Sal I 及びBam HIで各々切断される切断部位を有す
るＤＮＡ断片（Hind III−Eco RI断片、４３２１ｂｐ）
と、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来の
染色体ＤＮＡ断片（Hind III−Eco RI断片、約１．２ｋ
ｂ）とが、Eco RI及びHind IIIの切断部位で連結されて
なり、約５．５ｋｂの大きさを有するものである。

【００４７】また上記プラスミドｐＭＫ６を保有するエ
シェリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株は、工業技術院微
生物工業技術研究所に「エシェリヒア・コリーＫ１２Ｃ
６００／ｐＭＫ６」なる名称にて寄託されており、その
寄託番号は微工研条寄第８３３号である。

【００４８】（７）本発明形質転換株の調製 上記（６）で得た形質転換株から上記（５）と同様にし
てｐＭＫ６を取り出し、これを、上記（４）と同様にし
て、エシェリヒア・コリーＭ８３２８株に取込ませた。

【００４９】即ち、エシェリヒア・コリーＭ８３２８株
を、Ｌ培地で対数増殖中期まで生育させた後、塩化カル
シウム５０ｍＭを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
７．０）で２回洗浄することにより、コンピテントな
（ＤＮＡ取り込み能を有する）細胞を調製した。このコ
ンピテント細胞懸濁液に上記で得たｐＭＫ６の１μｇを
加えて、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２℃、２
分間の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ませた。

【００５０】次にこの細胞懸濁液をＬ培地に接種し、３
７℃で２時間静置培養を行なって形質転換反応を完了さ
せた後、集菌し、洗浄し、再懸濁液をアンピシリン４０
μｇ／ｍｌを含むＬ培地プレートに塗沫し、３７℃で１
日間培養した。

【００５１】上記により生じたコロニーを釣菌し、アン
ピシリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性とを検討し、形質転換株．coliＭ８３２８／
ｐＭＫ６を取得した。

【００５２】上記形質転換株は、工業技術院微生物工業
技術研究所に「エシェリヒア・コリーＭ８３２８／ｐＭ
Ｋ６」なる名称にて寄託されており、その寄託番号は微
工研菌寄第８５１９号（ＦＥＲＭ ｐ−８５１９）であ
る。

【００５３】（８）本発明形質転換株によるＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼの生産 上記（７）で得た形質転換株につき、Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ供与菌で
あるエシェリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株及びこれに
ｐＭＫ６を導入して形質転換させた形質転換株エシェリ
ヒア・コリーＫ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６並びに本発明形
質転換株の親株（変異株）であるエシェリヒア・コリー
Ｍ８３２８株及び該Ｍ８３２８株の親株であるエシェリ
ヒア・コリーＩＦＯ３３０１株の各々と対比して、それ
らのシアル酸無添加培地（酵母エキス培地）におけるＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産性を検討した。

【００５４】各微生物の培養培地としては、以下の組成
の培地を利用した。

【００５５】〈酵母エキス培地組成〉 酵母エキス ２０ｇ コハク酸 １０ｇ 純水 全体を１ｌとする量（ｐＨ６．０） 上記各培地に各微生物を接種し、３０℃で２４時間振盪
培養を行なった。その後、培養液から遠心分離法により
菌体を集め、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０
０ｍｌに懸濁させて超音波処理を行ない細胞を破砕し、
菌体内の酵素を抽出し、遠心分離により沈渣と上澄とを
分離した後、抽出液（上澄）として粗酵素液を得た。

【００５６】得られた酵素液の活性を測定した結果を下
記表１に示す。

【００５７】

【表１】

【００５８】上記表１より、本発明の形質転換株の利用
によれば、シアル酸無添加培地において著量のＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼを取得できることが明らか
である。またこの本発明形質転換株に見られる目的酵素
生産能は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ供与菌にｐＭＫ６を導入して形質転
換させた形質転換株エシェリヒア・コリーＫ１２Ｃ６０
０／ｐＭＫ６及び本発明形質転換株の親株であるエシェ
リヒア・コリーＭ８３２８株の各々における同酵素の生
産能からは、全く予期できない非常に顕著なものである
ことが判る。

【００５９】なお、上記粗酵素液は、これを常法に従い
硫安で塩析し、遠心分離し、透析後、凍結乾燥すること
により粗酵素粉末とすることができる。また該酵素粉末
は、これをイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過等の
手段により精製して更に純化された酵素標品とすること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えプラスミドｐＭＫ６の制限酵素切断地図
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】誘導物質の不存在下にＮ−アシルノイラミ
   ン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異されたエ
   シェリヒア・コリーの変異株に、エシェリヒア属に属す
   るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ
   −アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体
   ＤＮＡ断片が組込まれた組換えプラスミドを導入し、得
   られる形質転換株を培養し、培養物からＮ−アシルノイ
   ラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−
   アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造方法。