JPS61239896A - Ｌ−トリプトフアンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−トリプトフアンの製造方法に関し、さらに
詳しくは、トリプト７アンシンターゼの生ず　　　　　
合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とＦ因子プラスミド
由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と
を含有するプラスミドで形質転換されたエシェリヒア属
に属する微生物を利用してＬ−トリプト７アンを高収量
で効率よく製造する方法に関する。

従来、Ｌ−ト’）ブトファン生産性微生物を用いたＬ−
）！Ｊブト７アンの発酵生産においては、Ｌ−トリプト
７アンの生産性を高めるため、培地中にアント２ニル酸
やインドールを添加し培養する方法は知られている（特
公昭３５−１２３８４号公報参照）。さらに、Ｚ−）！
Ｊプトファスの生産性向上のための改良法として、アン
トラニル酸耐性微生物を用いる方法も提案されている（
特公昭５３−３３１５２号公報及び特開昭５９−１３０
１８１号公報参照）が、従来の発酵法にるるＬ−トリプ
トフアンの生産では、その生産性に限界がアシ、実用的
には問題があることが指摘されている。

また、遺伝子組換え技術を用いてＬ−ト１）ブトファン
の生産性の向上を図る方法も提案されている（特開昭５
９−１４０８９１号公報）が、一般に認められているよ
うに、遺伝子組換え技術で造成されるプラスミドは遺伝
的に不安定で、形質転換した微生物の培養中に該微生物
からプラスミドが徐々に脱落することが屡々ある。特に
、宿主微生物としてＺ−）！Ｊブト７アンの生産に好適
なトリットファンリプレッサー遺伝子欠損微生物の場合
やインドールアクリル酸が添加された培地を用いた場合
、組換えプラスミド脱落現象が激しく、組換えプラスミ
ドの宿主微生物内での安定化の方法が確立されない限シ
、上記遺伝子組換え技術によるＬ　−ト！Ｊグトファン
の製造法は実用化には問題がある（Ｔ、ＩＭＡＮＡＫＡ
、７．ＧｅｎｅｒａｌＭｔｃｒｏｂｔｏｌ、、　　１１
８．２５５−２６１（１９８０）参照〕。もつとも、プ
ラスミドの安定化法として、培地に抗生物質等の薬剤を
添加することも提案されているが、経済的な見地から有
効な方法とは言えみい。

本発明者らは、以上に述べた如き欠点のないＬ−トリプ
トフアンの製造法について鋭意研究を行なった結果、ト
リプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片と、Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を
司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを有するプラスミドで形
質転換したエシェリヒア属に属する微生物を、インドー
ルアクリル酸又はその塩を含む培地で培養する場合には
、プラスミドの脱落現象が殆んどなく、Ｌ−）リグトフ
ァンを効率よく高収量で生産することができることを見
い出し本発明を完成するに至った。

しかして、本発明によれば、トリプトファンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、Ｆ因子プラ
スミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ
断片とを有するプラスミドで形質転換したエシェリヒア
属に属する微生物を、インドールアクリル酸又はその塩
が添加された培地で培養し、培養物からｎ−トｖブト７
アンを回収することを特徴とするＬ−トリプトフアンの
製造方法が提供される。

本発明において微生物の形質転換のために使用されるプ
ラスミドを構成する「トリプトファンシンターゼの生合
成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下「Ｔ断片」と
略称することがある）とは、インドールとＬ−又はＤＬ
−セリンからＬ−）リグトファンの生合成を司る遺伝子
を含むＤＮＡ断片を意味し、しかして、Ｔ断片にはトリ
プトファンオペロン又はトリプトファンオペロンを含む
もつと大きなりＮＡ断片、或いは、トリプトファンｊ　
　　　　　オペロン中のトリプトファンシンターゼの生
合成を司る遺伝子であるＴｒｐ　ＡとＴｒｐ　Ｂにプロ
モータ及びオペレーターを結合したＤＮＡ断片、又はＴ
ｒｐ　ＡとＴｒｐ　ＢにＴｒｐ　Ｃ，Ｔｒｐ　Ｄ及びＴ
ｒｐ　Ｅの少なくとも１種とプロモーター及びオペレー
ターを結合したＤＮＡ断片（例えば、ＴｒｐＡ、Ｔｒｐ
　Ｂ、Ｔｒｐ　Ｃ及びＴｒｐ　Ｅにプロモーター及びオ
ペレーターが結合したＤＮＡ断片）等が包含される。こ
れらのＴ断片としては原核微生物、７アージ等に由来す
るものが包含され、実用的には大腸菌由来のものが好適
に使用され、中でも、トリプトファンオペロンそれ自体
及びファージφ８ｏｐｔの遺伝子を制限酵素Ｂａｍ　Ｈ
Ｉによシ切断して得られる約２２．６　ｋ　ｂの分子量
を有するトリプトファンオペロンを含むＤＮＡ断片が有
利に使用される。

本発明で使用するプラスミドは前述したように、上記の
Ｔ断片を、Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司
る遺伝子を含むＤＮＡ断片と組合わせる点に特徴を有す
る。Ｆ因子プラスミドは例え「蛋白質　核酸　酵素」第
２７巻第１号（１９８２）の９８頁の図１の遺伝子地図
及びＥｃθＲ１による物理的地図に示される如き構造を
もつ、分子量が９４．５ｋｂ　（６２Ｘ１０’　ｄｏｌ
ｔｏｎ）（Ｄ既知のプラスミドでアシ、大腸菌などの腸
内細菌中に通常細胞染色体当９１〜２個のコピー数で存
在する。このプラスミドは細胞分裂時にちょうど倍化し
てそれぞれの娘細胞に正確に伝達されるような機構を備
えている（このように、コピー数を低いレベルに保ちつ
つ、正確に宿主の増殖とペースを合わせて増やす仕組み
を５ｔｒｉｎ（Ｈｎｔな増殖の制御と呼んでいる）。Ｆ
因子プラスミドにおけるこのようなｓｔｒｉｎｇｅｎｔ
な増殖の制御機能が、ｍｉｎｉ−Ｆと呼ばれる分子量が
９．１　ｋ　ｂの自律増殖できる断片に担われているこ
とも既に究明されており、このｍ１ｔｉ−ＦがＦ因子プ
ラスミドより制限酵素Ｅｃｏ　　Ｒ１により切り出し可
能であることも知られている。

しかして「Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司
る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下Ｆ断片と略称するこ
とがらる）とは、上述したよりなＦ因子プラスミドを娘
細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子断片を意味し
、そのよりなＦ断片の代表例としては約９ｊ　ｋ　ｂの
分子量を有するｍ１ｔｔ−Ｆ断片が挙げられる。

本発明で使用するプラスミドは、以上に述べたＴ断片と
Ｆ断片に加えて、さらに他の遺伝子断片、例えば各種細
菌の薬剤耐性を司る、例えばカナマイシン耐性等の遺伝
子断片、例えばカナマイシン耐性を司る遺伝子断片等を
含有していてもよい。

そのようなプラスミドの代表例として、トリプトファン
オペロン断片及びＦ因子プラスミド由来のｍ１ｎｔ−Ｆ
断片を含有し、分子量が約３１．７ｋｂであシ且つ下記
の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （α）Ｅｃ、ｏ　　Ｒ１に対する認識部位が５ケ所であ
シ、（６）　　Ｂａｍ　Ｂ　Ｉに対する認識部位が２ケ
所でｓｂ、（ｃ）Ｈ４ｓｄ　■に対する認識部位が３ケ
所であることを特徴とするプラスミドｐＭＴＹ−１が挙
げられる。

このプラスミドｐＭＴＹ−１は上記のとおシ約３１．７
＆＆の分子量を有するが、この分子量はアガロース・ゲ
ル電気泳動法により測定したものである。

また、プラスミドｐＭＴＹ−１の各種制限酵素に対する
感受性は上記（α）〜（Ｃ）に示すとおシでｓｂ、よシ
詳細に各制限酵素による分解断片の分子量（ｋｂ）を示
せば次のとお如である。

１　　　　　（α）　　ＥＣａ　Ｒ１：　９．１．７．
０、＆４．６．１、五１（６）　　Ｂａｍ　ＨＩ　：　
２２．６．９．１（Ｃ）１イｓｄｍ：　１ａＯ１１（Ｌ
８，２．９以上に述べた如き特性をもつプラスミドｐＭ
ＴＹ−１は例えば次のようにして製造することができる
。

まず、トリブトファンオペロン断片の調製は、例えば、
染色体遺伝子中にトリグロファンオペロンをもつ大腸菌
、例えば、ＥａｃｈａｒｉａｈｔαｃｏＨＫ−１２（Ｉ
ＦＯ５５Ｑ１、ＡＴＣＣ１０７９８、ＡＴＣＣｅ２５５
６２）などに、７アージ、例えばファージφ８０　（Ａ
ＴＣＣ１１４５６α−Ｂ１）などを感染させ、溶原化及
び誘発現象を利用して、ファージＤＮＡ中にトリプトフ
ァンオペロンを取り込んだファージを大量に調製し〔Ｒ
，Ｍ、Ｄａｓｎａｙ　、Ｃ，ＹａｘｏｆｓｋｙＨ７、Ｂ
ａｅｔｅｒｔｏｌ、、１１８．５０５　（１９７４）参
照〕、それから常法（Ａ？、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ａｌｏｎ
ｔ％ｇ１（１９８２）７．１６４〜１６５、Ｃｏ１ｄＳ
ｐ−ｉｎ　Ｅａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照
〕に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素、例えば
Ｂα常Ｈ１，Ｅｃｏ　Ｒ１等を用いてトリプト７アンオ
ペロンを含むＤＮＡ断片を切シ出すことにより行なうこ
とができる。

他方、ｍ１ｎｔ　Ｆ断片の調製は、例えば、Ｆ因子プラ
スミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｅａ
ｒｓ　）ｆ−１２株（ＡＴＣＣ１３１５３、ＡＴＣＣｇ
２３５８９、ＡＴＣＣｇ２３５９０）等からそれ自体公
知の方法で、例えばＰ。

Ｇｗｔｔｒｒｙ　、Ｄ、Ｌ、ＬｅＢＬａｎｃ　、　　Ｓ
。

Ｆａｌｋｏｗ　ＨＪ、Ｅａｃｔ、、１１６．１０６４（
１９７３）等の文献に記載の方法でＦ因子プラスミドを
取シ出し、それから制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて分子量
が約９１　ｋ　ｂのｍｔｙｓｔＦ断片を切り出すことに
より調製することができる。

このようにして調製されたｍｉｎｉ　　Ｆ断片は、上記
トリプトファンオペロンを含むＤＮＡ断片の切シ出しに
用いたと同じ制限酵素で処理した後、上記で調製したト
リプトファンオペロンを含む遺伝子画分と一緒にし、リ
ガーゼ、例えばＴ４７アージ由来のりガーゼ等を作用さ
せて結合させることによシ、目的とするプラスミドｐＭ
ＴＹ−１が得られる。

なお、プラスミドｐＭＴＹ−１の具体的調製法について
は特開昭６０−２１８９号公報の実施例１に詳細に説明
されている。

このようにして調製されるプラスミドｐＭＴＹ−１は、
コピー数は少ないが、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に
正確に受は継がれ、脱落することが少ないという優れた
特性を有する。

本発明によれば、このようにして製造されたプラスミド
によってエシェリヒア属に属する微生物が形質転換され
る。形質転換されるエシエリヒア属に属する微生物（宿
主）としては、例えばエシェリヒア−コリ（Ｅｓａｈｔ
ｒｉｃｈｉα　ｃｏｎ）Ｋ−１２系微生物が挙げられ、
中でも、Ｌ−トリブトファンの分解活性を有していない
菌株（すなわちトリプトファナーゼ欠損変異株）が好適
である。

とれら宿主微生物に対する上記のプラスミドの導入はそ
れ自体公知の方法、例えばＪｉ、　Ｍａｙｓｄｅｌ　。

Ａ、Ｈｔｇａ　ＨＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５３．１５９
（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうことができ
る。

形質転換された微生物は、インドール−アクリル酸又は
その塩を含む培地で通常好気的に培養される。培養はそ
れ自体既知の方法で行なうことができ、例えば、培地と
しては通常の微生物の培養１　　　　　　　に用いられ
ると同様の炭素源、窒素源、無機塩等を含む天然又は合
成培地を使用することができる。

しかして炭素源としては、例えばグルコース、グリセロ
ール、フラクトース、シュクロ・−ス、糖蜜等の種々の
炭水化物が使用でき、また、窒素源としては、例えばト
リプトン、酵母エキス、コーン・ステープ・リカー、カ
ゼイン加水分解物等の天然有機窒素源が使用できる。天
然有機窒素源の多くは窒素源と共に炭素源にもなシ得る
。無機塩としては、例えばリン酸第−水素カリウム、リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化マンガン等が
使用できる。さらに、培地には必要に応じてその他の微
生物の生育に必要な栄養素を添加することができる。

本発明の方法によれば、上記の如き炭素源、窒素源、無
機塩等を含む培地に、インドールアクリル酸又はその塩
が添加される。インドールアクリル酸又はその塩は培養
の当初に添加してもよく、或いは培養の途中で添加して
もよい。途中で添加する場合には、遅くとも微生物の対
数増殖期の末期までに添加することが望ましい。添加は
一回に行なってもよく、或いは複数回に分けて又は連続
的に行なうこともできる。

インドールアクリル酸又はその塩の添加量は厳密には制
限されるものではないが、一般には、培地に対し少なく
とも２５μｍ１７ｄの最終濃度になるように添加するこ
とができ、好ましくは８０〜４００μｙ／−の範囲、さ
らに好ましくは１００〜２００Ａｇ／−の範囲の最終濃
度となるように添加するのが有利である。

なお、インドールアクリル酸の塩としては、例えばイン
ドールアクリル酸ナトリウムのようなインドールアク１
ノル酸のアルカリ金属塩が包含される。

ここで「最終濃度」とは、培養終了時までに培地に添加
されるインドールアクリル酸又はその塩の合計濃度をい
う。

また、培地には、Ｌ−トリブトファンの前駆物質として
インドール又はアントラニル酸もしくはその塩（塩とし
てはインドールアクリル酸の塩について上記したと同様
のものが使用できる）を適宜添加することができる。イ
ンドール又はアントラニル酸もしくはその塩の添加は、
インドールアクリル酸又はその塩におけると同様、培養
の当初に行なってもよく、或いは培養の途中で行なって
もよい。培養の途中で行なう場合には、遅くとも微生物
の対数増殖期の末期までに添加するととが望ましく、添
加は一回に行なってもよく、或いは複数回に分けて又は
連続的に行なってもよい。

インドール又はアントラニル酸もしくはその塩の添加量
も厳密に制限されるものではないが、例えば炭素源とし
てグをコースを用いる場合、グルコースに対して、０．
０５〜１倍モル、好ましくはＱ、０１〜０．５倍モルの
範囲の量で添加するのが有利である。

さらに、本発明の方法では、炭素源の少なくとも一部と
してグルコースを使用することが望ましく、その使用量
は一般に、インドールアクリル酸又はその塩に対して、
１０〜６００倍モル、好ましくは５０〜４００倍モル、
さらに好ましくは１００〜３００倍モルの範囲が適当で
ある。

培養時間は微生物の種類、他の培養条件等によシ異なる
が、インドールアクリル酸又はその塩を培養の当初に添
加して培養を行なう場合には、通常、約２４〜約１２０
時間程度とすることができ、また、インドールアクリル
酸又はその塩を培養の途中で添加して培養する場合には
、通常、約１〜ｊ　　　　　約４８時間程度とすること
ができる。

また、培養温度は通常約２０〜約５０℃の範囲とするこ
とができ、培地のｐＨは一般に５〜９の範囲、好ましく
は約６〜約８の範囲に調節するのが好適である。

さらに、培養は振盪又は通気攪拌等の好気的条件下に行
なうのが好ましい。

以上に述べた培養条件下に培養することによって得られ
る培養物からのＬ−ト１）ブトファンの回収は、それ自
体既知の方法によシ行なうことができ、例えば、イオン
交換樹脂、活性炭等を用いて吸着−脱着処理によシ行な
うことができる。

かかる本発明の方法によれば、トリブトファンシンター
ゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とＦ因子７″
２スミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片とを有するプラスミド、例えばプラスミドｐＭＴ
Ｙ−１で形質転換されたエシェリヒア属に属する微生物
を培養してＬ−トリプトフアンを製造するに際し、トリ
プトファンの生産速度を著しく高めることができ式１業
上極めて有利である。

以下、実施例を掲げて本発明の方法をさらに具体的に説
明する。

形質転換 （イ）宿主菌の準備 エシエリヒア・コリ（Ｅ、ｃｏｇイ）ｆ−１２株（ｒｐ
Ｏｓ５ｏ１）から常法に従い、ＮＴＧにトロソグアニジ
ン）処理によってトリプトファン要求性変異株を調製し
た（Ｅ、Ａ、Ａｄｔｌ−ｂｅｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、
Ｂゼｏｃｈｅｔｎ、Ｅｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅａ、　Ｃｏｍｍ、　、　１８．７８８（１９６５）
参照〕。

すなわち、上記Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株をＬ培地にて
対数増殖中期まで培養し、遠心分離によυ集菌して菌株
をＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に懸濁し
た後、１００μＩ／−〜２００μｇ／ｍｌのＮＴＧ（Ｎ
−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジン）を
添加し、１５〜３０分間処理する。該処理物を同じ緩衝
液にて洗浄後、Ｌ培地（Ｂαｅｔａ　トリプトン１０１
１酵母エキス５ＩＳ　ＮａＣ１５ＪＦ、グルコースＩＩ
Ｉ、水１１；ｐＨ７，２）に添加し、３７℃にて振盪培
養を行ない、該培養物は常法に従い、ペニシリン濃縮法
およびレプリカ法を併用してトリプトファン要求性変異
株を単離した。

（ト）形質転換 上記（イ）で得た大腸菌に一１２系株（トリプトファン
要求性変異株）を、上記と同じＬ培地１０ｔｎｔに接種
し、３７℃にて振盪培養を行ない、対数増殖中期もしく
は、後期まで生育させた後遠心分離にて集菌し、これを
０℃の氷冷下に０．１Ｍ　ＭＱＣＩ。

及びＯ−１Ｍｃａｃｌ、の水溶液に寺褐卓荘懸濁させて
ＤＮＡ受容状態菌（コンビ−テント菌）を調製した。こ
れに特開昭６０−２１８９号公報の実施例１に記載の方
法に従って得たプラスミドｐＭＴＹ−１を加え、０℃の
水冷下に４０分間反応させ、次いで４０℃にて３分間加
温処理した後、再度０℃の水冷下にて２時間反応させた
。

次にＬ培地に上記処理菌体を接種し、３７℃にて１時間
３０分振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗浄後
、最少培地（Ｄａｖｔａ培地”、に、ＨＰＯ４７１１、
ＫＥ、Ｐｏ、２９、ＭＱＳＯ，・７Ｈ。

ＯｃＬｌｇ、（ＮＨ，）、Ｓｏ、１１１、ｆｈフコース
１１純粋１７）にて調製した平板培地に塗抹し、３７℃
にて培養し、生育したコロニーを再び同培地上で純化し
た後、形質転換株（Ｔｒｐ要求性の１　　　　　　　消
失、すなわちプラスミド上のトリプトファンオペロンに
よシ生合成可能となシ、最少培地上にて生育可能となっ
た菌株）を得た。この形質転換株は、エシエリヒア・コ
リ（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｔａＣｏｌ＜３に１２Ｉ’ｆ２
００１として、茨木県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号
の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和５８年７月
６日付で受託番号：微工研菌寄第７１３９号（ＦＥＢＮ
　　Ｐ−７１３９）にて寄託されている。

実施例　１ ＬＬ培地（トリプトン１０１１酵母エキスｓｙ。

ＮαＣ１３１，グルコースＩＦ！、水１１．ｐＨ７，２
ＨＣ１ｄを大聖試験管（２００Ｘ２４φ）に分注し、１
２０℃で１５分間滅菌処理したものに、エシエリヒア・
コリｒ−１２１’ｆ２００１（ＦＥＢＮ　　Ｐ−７１５
９）を植菌し、３７℃で１ｇ時間振盪培養したものを前
培養物とした。かくして得られた前培養物の２ｍを、イ
ンドールアクリル酸１００メ１及びインドール０．５η
／１−を含む下記組成の培地、（（５００ｄ容三角プラ
スコに１００−分注）に植菌し、３７℃で４８時間振盪
培養を行った。

培養終了後、遠心分離によシ菌体を除去し、上澄液中の
Ｌ　−１−１ｊグトフアンを高速液体クロマトグラフィ
ー（島津Ｌｃ　−ｓＡ　）によシ定量したところ、１０
岬／ノの生成が認められた。

培地Ａの組成 ＭＥ、Ｃ１４１ｉ ＫＢ、Ｐｏ、　　　　　　　　　　　　　　　５ｇＮα
ｔ　ＨＰ　Ｏａ・１２Ｈ，０１℃Ｍｘｇｓｏ、・７Ｈ，
Ｏｎ、５ｇ ＣａＣ１，−２Ｂ、０　　　　　　　　　　１５Ｗｌｉ
カザミノ酸　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ酵母エ
キス　　　　　　　　　　　　　　　２ｇグルコース　
　　　　　　　　　　　　　　３０．９ＣａＣＯ，（別
殺菌）　　　　　　　　　　　２ＯＮ水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１１７）Ｈ７，０ 実施例　２ エシエリビ７−：ｙ１７ｆ−１２）’ｆ２００１（ＦＥ
ＲＮ　　Ｐ−７１３９）を実施例１と同様の操作によシ
前培養した。かくして得られた前培養物２ｄをインドー
ルアクリル酸１００ａｌ／ｗｌ及びアントラニル酸１１
ｑ／−を含む培地Ａ（５００ゴ容三角フラスコに１００
ｄ分注）に植菌し、３７℃で４８時間振盪培養を行った
。

培養終了後、遠心分離にて得られた上澄液中のＬ−トリ
ブトファンを定量したところ、Ａ１１１Ｐ／禮の生成が
認められた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含むＤＮＡ断片とＦ因子プラスミド由来の増殖制御分配
   系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とを含有するプラスミ
   ドで形質転換したエシエリヒア属に属する微生物を、イ
   ンドールアクリル酸又はその塩が添加された培地で培養
   し、培養物からＬ−トリプトフアンを回収することを特
   徴とすすＬ−トリプトフアンの製造方法。 ２、培地にさらにインドールまたはアントラニル酸もし
   くはその塩を添加することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３、遅くとも微生物の対数増殖期の末期までに培地にイ
   ンドールアクリル酸またはその塩を少なくとも２５μｇ
   ／ｍｌの最終濃度で添加する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子が
   トリプトフアンオペロンである特許請求の範囲第１〜３
   項のいずれかに記載の方法。 ５、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を
   含むＤＮＡ断片がエシエリヒア・コリ由来のものである
   特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。 ６、Ｆ因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺伝
   子を含むＤＮＡ断片がｍｉｎｉ−Ｆ断片である特許請求
   の範囲第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７、プラスミドが、トリプトフアンオペロンを含むＤＮ
   Ａ断片及びＦ因子プラスミド由来のｍｉｎｉ−Ｆ断片を
   含有し、分子量が約３１．７ｋｂであり且つ制御酵素Ｅ
   ＿ｃ＿ｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIに対する認
   識部位がそれぞれ５ケ所、２ケ所及び３ケ所であるプラ
   スミドｐＭＴＹ−１である特許請求の範囲第１〜６項の
   いずれかに記載の方法。 ８、エシエリヒア属に属する微生物がプラスミドｐＭＴ
   Ｙ−１で形質転換されたエシエリヒア・コリＫ−１２系
   微生物である特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、エシエリヒア属に属する微生物がＬ−トリプトフア
   ンの分解活性を有しない菌株である特許請求の範囲第１
   〜８項のいずれかに記載の方法。