JPH07330803A - セルロースとアミノ化合物との生物活性複合体 - Google Patents

セルロースとアミノ化合物との生物活性複合体

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JPH07330803A
JPH07330803A JP5436794A JP5436794A JPH07330803A JP H07330803 A JPH07330803 A JP H07330803A JP 5436794 A JP5436794 A JP 5436794A JP 5436794 A JP5436794 A JP 5436794A JP H07330803 A JPH07330803 A JP H07330803A
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trypsin
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Shlomo Margel
シュロモ・マーゲル
Sophia Sturchak
ソファア・ストゥーチャック
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Bar Ilan University
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】多数の遊離ヒドロキシ基を有するポリマーの活
性化法を提供する。 【構成】多数の遊離ヒドロキシ基を有するポリマー、例
えば、セルロース、アガロースまたはポリビニルアルコ
ールを、ヒドロキシ基に対する反応体と反応させる前の
前活性化工程において、ヒドロキシ基に関する反応体の
不在下で、少なくとも一つのＮ−複素環化合物、例え
ば、ピリジン、ピロール、ピリダジン、それらの完全ま
たは部分的ハロゲン化類似体およびあらゆるそれらの置
換体に接触させ、その反応体のポリマー結合性残基をそ
の後、未置換Ｎ−結合水素原子を少なくともひとつ含有
するアミノ化合物、例えば蛋白質と反応させることによ
り形成させたアミン−ポリマー複合体。さらに、この方
法により、多数のヒドロキシ基を含むポリマーから製造
する創傷に適用される粉末、バンデージ、パッチまたは
類似のカバー。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多数の遊離ヒドロキシ
基を含むポリマーの活性化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】官能基を有するポリマーとアミンの反応 生物活性化合物、例えば蛋白質のアミンの、官能基を有
するポリマー表面への共有カップリングは、一般には、
蛋白質のアミン基をポリマーの所望の官能基に相互作用
させることにより達成される。
【０００３】特に、例えば蛋白質のアミノリガンドのア
ルデヒド基含有ポリマー（ポリアルデヒドポリマー）へ
の結合は、図１に示される。シッフ塩基生成物は、相互
作用する試薬と平衡化されているから、水性溶液中では
不安定であるが、例えば、シッフ塩基結合を適切な還元
剤、例えばＮａＢＨ４で還元することにより安定化され
る。
【０００４】ジアルデヒドデキストランおよびジアルデ
ヒドセルロースは、シッフ塩基生成物の形成を通した蛋
白質の固定化に一般に用いられるポリアルデヒドポリマ
ーの例である。これらのポリマーは、親ポリマーである
デキストランおよびセルロースそれぞれの隣接ヒドロキ
シル基の過ヨウ素酸塩酸化により一般的に得られる（ツ
ルコバ（Ｊ．Ｔｕｒｋｏｖａ）ら、カナダ特許第１２１
７１３４号（１９８７）を参照されたい）。これらポリ
マーのアルデヒド含有量は酸化条件、即ち、過ヨウ素酸
塩濃度により制御されうる。これらジアルデヒドポリマ
ーの主鎖は、親ポリマーとは全く異なる構造を有する
（図２）。この違いは、親ポリマーと比較した場合に、
より開いた構造、高い孔性、水溶性の増加、高い生物分
解性および低い機械強度をジアルデヒドポリマーにもた
らす。例えば、セルロースは生物分解され得ないポリマ
ーであると考えられているが、ジアルデヒドセルロース
は生物分解性ポリマーであり、この特性は、制御された
放出の研究には必要であるが（シン（Ｍ．Ｓｉｎｇ
ｈ）、バスデヴァン（Ｐ．Ｖａｓｕｄｅｖａｎ）、シナ
（Ｔ．Ｊ．Ｍ．Ｓｉｎｈａ）、ライ（Ａ．Ｒ．Ｒａ
ｙ）、ミスロ（Ｍ．Ｍ．Ｍｉｓｒｏ）、およびグア
（Ｋ．Ｇｕｈａ）のＢｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１
５，６５５（１９８１）を参照されたい）、しかし、他
の医療の応用、例えば創傷の治療には不要である。
【０００５】ジアルデヒドポリマーと蛋白質の相互作用
により形成されたシッフ塩基結合は、水性溶液中では安
定でなく（図１および２）、その結果、結合した蛋白質
のもれ（ｌｅａｋａｇｅ）が生じる。さらに、蛋白質と
ポリアルデヒドポリマーの反応は通常、約０．５％−１
０％の遊離アルデヒド基が関与するとおり不完全である
（マーゲル（Ｓ．Ｍａｒｇｅｌ）およびビーゼル（Ｅ．
Ｗｉｅｓｅｌ）のＪ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｃｈｅ
ｍ．Ｅｄ．２２，１４５（１９８４））。したがって、
残りのアルデヒドは結合蛋白質のアミノ基と分子内相互
作用し、即ち、その活性が顕著に低下する（マーゲル
（Ｓ．Ｍａｒｇｅｌ）、Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ，４６２，１７７（１９８９）を参照された
い）。残りのアルデヒドのブロックおよびシッフ塩基の
安定化は、還元剤、例えばＮａＢＨ４を用いた還元によ
りもたらされる（図１および２）。しかしながら、還元
されたポリマーは顕著に低下した機械強度、高い水溶性
およびしばしば顕著に低下した蛋白質活性を有するが、
それは、天然の蛋白質活性に必要なジスルフィドのよう
な結合を還元するからである（ペン（Ｌ．Ｐｅｎｇ）、
カールトン（Ｇ．Ｊ．Ｃａｌｔｏｎ）およびブルネット
（Ｊ．Ｂ．Ｂｕｒｎｅｔｔ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１４，９１（１
９８７）を参照されたい）。
【０００６】図３は、遊離ヒドロキシ基含有ポリマー、
例えばセルロース、アガロース、デキストラン等への蛋
白質の化学結合を示す。この結合法は、さまざまな試
薬、例えば、臭化シアン、塩化トシル、塩化トレシル等
を用いた反応によりポリマーマトリックス上のヒドロキ
シル基を活性化することに基づく（グロマン（Ｅ．Ｖ．
Ｇｒｏｍａｎ）、およびビルチェック（Ｍ．Ｗｉｌｃｈ
ｅｋ），ＴＩＢＴＥＣＨ，５，２２０（１９８７）を参
照されたい）。活性化されたポリマーは、次に、図３に
従い、求核性置換反応によりアミノリガンド（およびチ
オールリガンド）、例えば蛋白質の共有結合に用いられ
る。
【０００７】このような誘導化法にしたがった、アミノ
（またはチオール）リガンドのヒドロキシル基含有ポリ
マーへの結合は、熱心に研究されている（ニルソン
（Ｋ．Ｎｉｌｓｓｏｎ）、モスバッハ（Ｋ．Ｍｏｓｂａ
ｃｈ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，３９
７（１９８０）を参照されたい）。通常、この反応は、
乾燥ポリマーを、所望の濃度の活性化剤（例えば、塩化
トシル、塩化トレシル等）を含有する有機溶媒（例え
ば、アセトンまたはジオキサン）に加えることにより達
成される。次に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチル
アミン等）を有機溶液に加えて、遊離したＨＣｌを中和
する。次に、ポリマーを適切な有機溶剤で未結合活性化
剤から洗い流す。次に、乾燥した活性化ポリマーを水性
溶液中で所望のアミノ（またはチオール）リガンドと反
応させる。次に、あらゆる未結合リガンドが除去され
る。必要であれば、残りのトシル基は公知の方法、例え
ば、塩基性条件または第２アミノ（またはチオール）リ
ガンドとの反応によりブロックされる。この活性化工程
における遊離ＨＣｌの中和に用いられる共通の有機塩基
はピリジンおよびトリエチルアミンである。コンフォー
ト（Ａ．Ｒ．Ｃｏｍｆｏｒｔ）、アルバート（Ｅ．Ｃ．
Ａｌｂｅｒｔ）およびランガー（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ）、
Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．３４，１３６
６（１９８９）は、トリピリジンの代わりにエチルアミ
ンを有機塩基として用いた場合、塩化トレシル活性化に
よりセルロースに結合したヘパリナーゼの残りの活性が
３倍増加したことを示した。
【０００８】塩化ｐ−トルエンスルホン酸（塩化トシ
ル）および／または塩化トリフルオロエタンスルホン酸
（塩化トレシル）と第１ヒドロキシル基の反応は、トシ
ル化エステルを形成するが、これは、図４に示されると
おり、アミノ（またはチオール）リガンドと極めて高い
反応性を有する。セルロース主鎖の構造は、この固定化
法の間変化しない（図５）ことにより、その塩基の化学
的および物理的特性、即ち、溶解性、機械特性、生物非
分解性等はほとんどそのまま変化しない。さらに、上記
活性化試薬、例えば塩化トシルおよび塩化トレシルによ
り形成された化学的結合は安定であり、即ち、溶媒への
結合蛋白質のあらゆる顕著なもれを阻止する（コロウイ
ック（Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）およびカプラン
（Ｎ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１３５−Ｂ，２９（１９８７）を
参照されたい）。
【０００９】創傷の治療 創傷は皮膚への損傷と定義してよい。創傷は皮膚をひっ
かくこと、熱、冷え、化学物質（放射性物質を含む）、
電気等により引き起こされる。単語「創傷」はやけどお
よび瘢痕をも含む。皮膚は、からだの中で最も重要で敏
感な器官のひとつであり、かつ、環境に対して防御的機
能を有する。皮膚の一部が損傷を受けたならば、水、
塩、蛋白質およびエネルギーは損傷を受けた皮膚を通し
て体から漏れ出す。体は顕著な量の熱を損失し、そし
て、微生物が、損傷を受けた皮膚から体に入り込む。カ
ビおよび微生物は創傷において局所的汚染を引き起こ
し、体中に深く侵入して、全身の炎症をもたらす。
【００１０】創傷を治療する目的は、皮膚に生じた損傷
を直すことである。損傷が小さく局所的であれば、通
常、治癒するまで数日または数週間である。しかしなが
ら、損傷を受けた場所が広くてひどければ、治療の進行
は遅くなり、通常は皮膚を移植したり他の治療、例えば
薬剤投与が必要である。しばしば、創傷の治療は、ひど
い痛み、瘢痕の跡をもたらし、生理学的治療および／ま
たは心理学的治療を必要とする。ひどい場合、治療は、
出血、汚染、痛み、毒、水の蓄積等の問題を処理せねば
ならない。
【００１１】創傷の治療の使用において、現在多数の方
法があるが、例えば、防腐および抗生物質製剤、レーザ
ー照射、寒冷治療、天然酵素製剤等を含む（例えば、ク
ランツ（Ｋｒａｎｔｚ）およびカール（Ｃａｒｒ）、Ｐ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、８版、１９
７２，ｐｐ１００１−１００３、「やけどおよび潰瘍の
治療のための試薬（Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｒｎｓ ａｎｄ Ｕｌｃｅｒ
ｓ）」；グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン
（Ｇｉｌｍａｎ）、Ｐａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂ
ａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、６版、Ｍ
ａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８
０，ｐｐ９６４−９８７を参照されたい）。各治療法
は、それぞれ利点と欠点を有する。
【００１２】これらの方法の間で、創傷の治療への天然
酵素の使用がまったく共通している。これらの酵素製剤
は、通常、蛋白質分解酵素のような酵素、例えば、トリ
プシンおよびキモトリプシン（化膿した壊死性の創傷を
きれいにし、そして病原体の量を減らす）、リゾチーム
（微生物の細胞壁を壊す）、および／またはコラーゲナ
ーゼ（コラーゲンを分解し、そしてラフな瘢痕を阻止す
る）を基にする。酵素製剤は通常ゲル、粉末、または流
体の形態をとり、創傷上に塗られる。創傷の治療への天
然蛋白質分解酵素の使用はまったく共通している。しか
しながら、この方法は、幾つかの大きな欠点を有する
が、例えば天然酵素は阻害剤により迅速に不活性化され
ず、水性溶液中で不安定であり、抗原特性および発熱特
性を示し、血流に侵入するかもしれず、そしてそれによ
りアレルギー反応を引き起こし、そしてさらにそれらは
高価である。
【００１３】これらの欠点に打ち勝つために、何人かの
研究者はポリマービーズへさまざまな蛋白質分解酵素を
共有結合させたが、該ビーズは約０．０５−０．５ｍｍ
の平均直径を有し、デキストランアルデヒドおよび／ま
たはジアルデヒドセルロースからなる（ツルコバ（Ｊ．
Ｔｕｒｋｏｖａ）ら、カナダ特許第１２１７３４号（１
９８７）；フレミング（Ｃ．Ｆｌｅｍｍｉｎｇ）、ガバ
ート（Ａ．Ｇａｂｅｒｔ）、ロス（Ｐ．Ｒｏｔｈ）およ
びワンド（Ｈ．Ｗａｎｄ）、Ａｃｔａ Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．Ｇｅｒ．３１，４４９（１９７３）を参照された
い）。しかしながら、創傷の治療のためのこれら複合ビ
ーズの使用は欠点が多いために限定されるが、その欠点
とは例えば、この方法は相対的に高価であり、かつ、流
体が創傷からしばしば流れ、そして複合体ビーズを洗い
流し、その結果何度もこの治療を繰り返す必要がある。
さらに、創傷の治療のためのこれらジアルデヒドポリマ
ーの主な欠点は、上記のとおりである。
【００１４】ソビエトの研究者により、創傷の治療のた
めの新規な方法が最近開発された。この方法は、生物活
性試薬、例えば蛋白質分解酵素の、ジアルデヒドセルロ
ース包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）および／またはアルデヒ
ドポリカプロアミド包帯への共有結合に基づく。ジアル
デヒドセルロース包帯は、セルロースの過ヨウ素酸塩の
酸化により形成され、そしてアルデヒドポリカプロアミ
ド包帯は、ポリカプロアミドの酸加水分解（３Ｍ ＨＣ
ｌ）により形成され、加水分解産物の末端アミノ基にグ
ルタルアルデヒドをカップリングさせる（図６を参照さ
れたい）。商品名「ＰＡＫＳＴＲＹＰＳＩＮ」（アルデ
ヒドポリカプロアミドへ結合したトリプシン）（ラキン
（Ｋ／Ｌａｋｉｎ）、プロニン（Ｖ．Ｐｒｏｎｉｎ）、
リルツセブ（Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ）、ストルチャック
（Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ）、フィラトフ（Ｖ．Ｆｉｌａ
ｔｏｖ）、ラーキン（Ｋ．Ｌａｋｉｎ）およびリルツセ
ブ（Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ）、ＵＳＳＲ特許Ｎ２１０９３
８号（１９８４）を参照されたい）という固定化酵素の
包帯が市販されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】これらの固定化包帯は
以前のポリアルデヒドビーズの問題を解決したが、創傷
からの流体の流れがしばしば複合ビーズを洗い流す。し
かしながら、ポリアルデヒドポリマーの他の主要な欠
点、即ち不安定な結合、体液への結合酵素のもれ、弱い
機械強度、水溶性、生物分解性等はいまだ存在する。
【００１６】なお、上記論文および特許文献の全開示
は、引用により本明細書の一部をなす。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ひとつの側面
において、多数の遊離ヒドロキシ基を含むポリマーを前
活性化する方法を提供する。現在好ましいポリマーはポ
リサッカロイドであるが、ポリサッカロイドは例示であ
り、したがって本発明は他のヒドロキシポリサッカロイ
ド、例えばポリビニルアルコールおよびそのコポリマ
ー、例えば、ポリオレフィン例えばポリエチレンとのコ
ポリマー、並びにポリオレフィン例えばポリエチレンを
基にし、かつ、表面ヒドロキシル基を含むグラフトポリ
マーもあてはまることは認識されるべきである。本発明
による方法は、ヒドロキシ基への反応体の不在下で少な
くともひとつのＮ−複素環化合物、例えばピリジン（置
換または非置換）；ピロール（置換または非置換）；ま
たはピリダジン（置換または非置換）とヒドロキシポリ
マーを接触させることからなる。このような化合物中の
複素環は完全にまたは部分的に飽和していてよく、例え
ばピロリノン、ピロリジンまたはピペリジンのような場
合であり、そして、これらの化合物は置換されていても
置換されていなくてもよい。Ｎ−複素環化合物が置換さ
れている場合、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキ
シ、フッ素、塩素、臭素およびトリフルオロメトルから
選択される少なくともひとつを含むことが好ましい。即
ち、前活性化されたポリマーは本発明の一部を形成す
る。
【００１８】他の側面において、本発明は、誘導化ポリ
サッカロイドポリマーの製造法を提供するが、この方法
は、上記の前活性化されたポリマーを製造し、次に、上
記ポリマー中の遊離ヒドロキシ基に対する一つの反応体
と該ポリマーを反応させるが、その際、上記反応体は、
未置換水素原子を含有するアミノ基と反応することがで
きる少なくともひとつの官能基を少なくとも潜在的に含
み、そして、ハロゲン化シアン、炭化水素エステル、ハ
ロゲン化ｓ−トリアジン、ハロホルメート、ハロゲン化
スルホン酸および核結合性活性水素原子を含有するＮ−
複素環化合物から選択されるのが好ましい。
【００１９】少なくともひとつの未置換Ｎ−結合水素原
子を含む少なくとも一つのアミノ化合物と、多数の遊離
ヒドロキシ基を含む少なくとも一つのポリサッカロイド
ポリマーの複合体を製造する方法であって、以下の工程
（ａ），（ｂ）および（ｃ）のうち少なくとも工程
（ａ）および（ｂ）からなる方法において、各工程は以
下のとおりである、即ち、（ａ）上記ポリマー中の遊離
ヒドロキシ基に対する少なくとも一つの反応体と反応さ
せることにより、少なくとも一つのポリサッカロイドポ
リマーを誘導するが、その際、このような反応体は、少
なくとも一つのアミノ化合物と反応することができる少
なくとも一つの官能基を少なくとも潜在的に含むという
事実により付加的に特徴付けされ、（ｂ）そうして誘導
化されたポリサッカロイドポリマーを少なくとも一つの
アミノ化合物と反応させ、必要であれば、（ｃ）そのよ
うな反応体とポリサッカロイドのヒドロキシ基との反応
産物であるあらゆるポリマー結合基を公知の方法により
ヒドロキシ基へ変換する。特に、本発明は、そのような
少なくとも一つの反応体との反応に関する少なくとも一
つのポリサッカロイドポリマーの容量を増加させるため
に、工程（ａ）の前に前活性化工程を含む改良法を提供
するが、その際、上記の前活性化工程は、ヒドロキシ基
に対する反応体の不在下で上記少なくとも一つのポリサ
ッカロイドポリマーを少なくとも一つのＮ−複素環化合
物に接触させる工程を含む。少なくとも一つのアミノ化
合物は、少なくとも一つの蛋白質、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、リゾチーム、コラーゲナーゼ、ア
ルブミンおよび／またはヒアルロニダーゼを含んでよ
い。
【００２０】上記工程前および上記工程後の、上記少な
くとも一つのポリサッカロイドポリマー（セルロースが
好ましいがこれに限定されない）は粉末の形態であって
も、あるいはバンデージ、パッチまたは類似の創傷カバ
ーとして用いられうる織物ウエブの形態であってもよ
い。
【００２１】本発明は、さらに、ポリマーに結合させた
アミン、例えば蛋白質を提供する工程を含む方法によ
り、多数のヒドロキシ基を含むポリマーから製造され
た、創傷に適用されるための粉末、バンデージ、パッチ
または類似のカバーに関する。ポリマーに結合したアミ
ンを含むそのような創傷カバーの一般性を損なうことな
く、そのような製造法は、ポリマーにアミンを結合する
ことに関して本明細書中で記載された方法を含む。アミ
ンが蛋白質の場合、これは、例えばトリプシン、キモト
リプシン、リゾチーム、コラーゲナーゼ、アルブミンお
よびヒアルロニダーゼから選択されるひとつでよい。ヒ
ドロキシ基に対する反応体の不在下で少なくともひとつ
のＮ−複素環化合物に接触させることによりヒドロキシ
基含有ポリマーを前処理した上記ポリマーに結合させた
アミン、特に蛋白質は、そのような処理をしなかった場
合に比べて顕著に高い活性を有するという重要な利点を
有することが見いだされた。本発明はさらに、未置換Ｎ
−結合水素原子を少なくとも一つ含む少なくとも一つの
アミン化合物と、多数のヒドロキシ基を含む少なくとも
一つのポリマーとの複合体を提供するが、該複合体は上
記方法にしたがって得られる。
【００２２】本発明の１つの態様によれば、蛋白質等の
生理活性化合物を、そのヒドロキシル酸基を通じてセル
ロースと複合させ、すなわち、セルロースに固定化する
ことができる。この新規な活性化方法を用いることによ
り、従来法と比較して、通常は、増大した活性化試薬結
合能力、同等のまたは増大した蛋白質結合能力、増大し
た吸湿性および結合した蛋白質のより高い活性が得られ
る。
【００２３】図７は、従来の活性化方法と本発明の１つ
の態様との主な相違点を示す。この新規な活性化方法と
従来法との主な相違点は、予備処理段階（例えば、ピリ
ジン等のＮ−複素環式塩基によるセルロースの予備処
理）のためである。この予備処理はセルロース鎖間の水
素結合を壊してピリジン分子をセルロース鎖の間に閉じ
込め（Ｌ．Ｓｅｇａｌ， Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， Ｐ
ａｒｔ Ｖ （１９７０）， Ｅｄ． Ｎ．Ｍ．Ｂｉｋ
ａｔｅｓ ａｎｄ Ｌ．Ｓｅｇａｌ， ｐｐ ７１９−
７２９ を参照のこと）、セルロースのより開放された
反応性の形をもたらすと信じられている（図８）。新規
方法と従来の誘導化法との他の相違点は、新規方法にお
いては水性ＮａＨＣＯ３および／またはＮａＯＨによる
セルロースの処理（シルケット加工）が必須ではなく、
固定化工程において初期の湿潤セルロース（Ｈ２Ｏ約６
％）を用いることもできるという事実のためである。
【００２４】予備活性化段階において他の塩基および／
または膨潤剤（例えば、アセトン、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、トリエチルアミン、プロピルアミン
等）で置換する試みは、本発明と比較して何ら異常な振
る舞いを示さなかった。
【００２５】本発明はまた、蛋白質（トリプシン、リゾ
チーム等）と結合した多糖類（セルロース等）からな
る、創傷の治療のための新規なポリマー表面の提供を可
能にする。これらの複合セルロース材料は、異なる製造
形（粉体および保護剤等）において、前述した理由（異
なる主鎖構造、非生物分解性、高い機械的強度および蛋
白質とポリマーとの安定な結合）のため、市販の材料
（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−Ｔ
ＲＹＰＳＩＮ）とは基本的に異なっている。新規活性化
方法により得られる複合材料は、従来法により得られる
材料よりも、創傷治療に著しく有効である。例えば、新
規活性化方法によりセルロース上に結合したトリプシン
の活性は、同様の量の酵素がポリマーに結合しているに
もかかわらず、従来法により得られる活性、およびＰＡ
ＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰ
ＳＩＮにより得られる活性の約５−１０倍高い。
【００２６】本研究においては以下の材料を用いた：ア
セトン、１，４−ジオキサン、トリエチルアミンおよび
プロピルアミンはＢＩＯ−ＬＡＢラボラトリーズ社製
（ＢＩＯ−ＬＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔ
ｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）；アガロース、アルブミン（ヒ
ト、分画Ｖ）、ビリルビン（ウシ胆石）、ピリダジン、
ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピペリジン、塩化ｐ
−トルエンスルホニル（塩化トシル）、および塩化２，
２，２−トリフルオロ−エタンスルホニル（塩化トレシ
ル）はシグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）；ピリジン、フォリン−シオカルト−フェノ
ール試薬、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＨ、ＫＨ２
ＰＯ４、ＮａＩＯ４、ＮａＢＨ４、トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン、エタノールアミン、メルカプト
エタノールおよび活性化モレキュラーシーブ４Ａはメル
ク社製（Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）；セルロース（木綿）−医療用ガーゼはセン
トラル・メディカル・サプライ社製（Ｃｅｎｔｒａｌ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ａ．Ｒ．Ｍ．， Ｉｓ
ｒａｅｌ）；セルロースパウダーＭＮ３００はデュレン
社製（Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ウシ膵臓トリ
プシン・タイプＩＩＩ、コラゲナーゼ・タイプＸＩ、卵
白リゾチーム、およびウシ精巣ヒアルロニダーゼ・タイ
プＩＶ−Ｓはシグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ， Ｍｏ．）；塩酸Ｎａ−ベンゾイル−ｌ−アルギ
ニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）、ウシアキレス腱コラ
ーゲン・タイプＩ、ミクロコッカス・リゾデイクチカス
（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕ
ｓ）の不溶凍結乾燥細胞およびヒト臍帯ヒアルロン酸ナ
トリウム塩は、シグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ， Ｍｏ．）。
【００２７】以下の実験動物を用いた：体重３００−３
３０ｇの雌モルモット（アニラブ社製、Ａｎｉｌａｂ．
Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ）を、実験前に２週
間条件づけた。動物に水および抗生物質を含まない基本
食を与え、制御された温度（２３−２５℃）および明暗
（１２時間／１２時間ＬＤ）下で飼育した。
【００２８】分析方法は以下のとおりである。
【００２９】Ａ．ポリマー結合トシルおよび／またはト
レシル基の量は、元素分析により決定されたイオウの
量、および結合トシル（および／またはトレシル）基を
加水分解した後に得られる水性溶液の吸収ピーク（例え
ば、トシルについては２６１ｎｍ、Ａ２６１）から求め
た。これらの基の加水分解は、トシル（および／または
トレシル）活性化セルロース（１ｇ）を室温において１
時間、ＮａＨＣＯ３水性溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ１１）
１０ｍｌに浸漬することにより行った。
【００３０】Ｂ．ポリマーに結合した蛋白質（酵素）の
量は、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ ｅｔａｌ．， Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９３， ２６５ （１９５
１））に従って測定した。
【００３１】Ｃ．結合したトリプシンの酵素活性は、Ｂ
ＡＥＥを酵素基質として用いて、ウォルシュおよびウィ
ルコックス（Ｋ．Ａ．Ｗａｌｓｈ， Ｐ．Ｅ．Ｗｉｌｃ
ｏｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１９， ３１−４１ （１９７０））に従って測定し
た。１ＢＡＥＥ単位の活性は、ｐＨ７．６、２５℃、反
応容量３．３ｍｌにおいて、１分間にＡ２５３を０．０
０１増加させる。
【００３２】Ｄ．結合したコラゲナーゼの酵素活性は、
ギャロップ、セイファーおよびメイルマン（Ｐ．Ｍ．Ｇ
ａｌｌｏｐ， Ｓ．Ｓｅｉｆｅｒ ａｎｄ Ｅ．Ｍｅｉ
ｌｍａｎ， ＪＢＣ ２２７， ８９１ （１９５
７））に従い、ウシアキレス腱の粉体「不溶」コラーゲ
ンの懸濁液を基質として用いて測定した。コラゲナーゼ
活性の１単位は、アッセイ条件下（３７℃、インキュベ
ーション２０分間、ｐＨ７．４）において１ｍｇの懸濁
コラーゲンの溶解をもたらす量として定義した。
【００３３】Ｅ．結合したリゾチームの酵素活性は、オ
リスおよびダッタ（Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ， Ｒ．Ｄａｔ
ｔａ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
４４， ４４４−４５０ （１９７６））に従い、ミ
クロコッカス・リゾデイクチカスの乾燥細胞を基質とし
て用いて測定した。リゾチーム活性の１単位は、実験条
件下（ｐＨ７．０、２５℃、細胞懸濁液０．３ｍｇ／ｍ
ｌ、反応容量３ｍｌ）において、対応する基質の溶解の
結果として、１分間にＡ４５０を０．００１減少させ
る。
【００３４】Ｆ．結合したヒアルロニダーゼの酵素活性
は、リンカー（Ａ．Ｌｉｎｋｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏ
ｆ Ｅｎｄｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏ
ｌ．４， ２５６−２６２ （１９８４））に従い、ヒ
アルロン酸を基質として用いて測定した。ヒアルロニダ
ーゼ活性の１単位は、アッセイ条件下（３７℃、ｐＨ
７．５、インキュベーション容量１ｍｌ）において１分
間に遊離したＮ−アセチルグルコサミンの量（ｆｍｏ
ｌ）として表される。
【００３５】Ｇ．結合したアルブミンの活性は、プロッ
ツら（Ｐｌｏｔｚ，Ｐ．Ｈ．， Ｂｅｒｋ，Ｐ．， Ｓ
ｃｈａｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｂ．Ｆ．， Ｇｏｒｄｏｎ，
Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｖｅｒｇａｌｌａ．Ｊ．， Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．５３， ７７８−７８５
（１９７４））に従い、ビリルビンを基質として用いて
測定した。アルブミンの活性は、２５℃、インキュベー
ション時間１５分間、２５ｍｇセルロース、反応容量３
ｍｌにおいて、モデル溶液（０．００５ｍｇ／ｍｌ炭酸
塩緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ８．５）からセルロースに吸
着したビリルビンの％として表される。
【００３６】Ｈ．生理活性高分子の吸湿性は、シュワー
タセックら（Ｋ．Ｓｃｈｗｅｒｔａｓｓｅｋ， Ｊ．
Ｄｏｕｂｅｃｋ ａｎｄ Ｕ．Ｆａｓｈｅｆｏｒｃｈ，
Ｔｅｘｔｉｌｔｅｃｈｎ．， ９， ３６１ （１９
５６））の方法に従って測定した。
【００３７】高分子の予備洗浄は以下のようにして行っ
た。
【００３８】Ａ．セルロースの予備洗浄およびシルケッ
ト加工 セルロース１ｇ（木綿ガーゼおよび／または粉体）を、
１％ＮａＨＣＯ３水性溶液および／または０．０５Ｎ
ＮａＯＨ水性溶液２５ｍｌ中において３０分間煮沸し、
この混合物を室温まで冷却した。セルロースを大量の蒸
留水で洗浄し、室温において乾燥させ、使用するまで保
存した。
【００３９】Ｂ．ポリカプロアミド（カプロン編み地）
の予備洗浄 ポリカプロアミド１ｇを、１％ＮａＨＣＯ３水性溶液１
５ｍｌ中において６０℃において３０分間インキュベー
トした。次に、この溶液を室温まで冷却し、ポリカプロ
アミドを大量の蒸留水で洗浄し、室温において乾燥さ
せ、使用するまで保存した。
【００４０】トリプシン結合ポリマーは以下のとおり合
成した。
【００４１】Ａ．トリプシンを結合させたジアルデヒド
セルロース（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮは、ソビエト連邦特許
第Ｎ２１０９３８号（Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ， Ｖ．Ｆ
ｉｌａｔｏｖ， Ｋ．Ｌａｋｉｎ ａｎｄ Ｖ．Ｒｙｌ
ｔｓｅｖ， １９８４）に従って調製した。簡単には、
セルロース１ｇを０．６Ｍ水性ＮａＩＯ４（ｐＨ５．
０）５ｍｌ中で室温において２４時間浸漬して、ジアル
デヒドセルロースを調製した。次に、このようにして酸
化したセルロースを２０５ｎｍにおける吸収が完全に消
失するまで大量の蒸留水で洗浄した。次に、形成された
ジアルデヒドセルロースを、室温において１８時間、
０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシンを含むＫ／Ｎａリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌ中に置いた。次に、ジ
アルデヒドセルロース−トリプシン複合体を同一の緩衝
液５０ｍｌにより、続いて生理食塩水（０．８５％水性
ＮａＣｌ溶液）５０ｍｌにより５回洗浄した。次に、洗
浄したジアルデヒドセルロース−トリプシン複合体（Ｄ
ＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）を室温において乾燥さ
せ、使用するまで保存した。これらの研究においては、
自家製ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮと市販の製品は
同様の結果を与えた。
【００４２】Ｂ．トリプシンを結合させたポリカプロア
ミド（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮは、ソビエト連邦特許第Ｎ１
１７３６５号（Ｋ．Ｌａｋｉｎ， Ｖ．Ｐｒｏｎｉｎ，
Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ， Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ ａｎ
ｄ Ｖ．Ｆｉｌａｔｏｖ １９８１）に従って調製し
た。簡単には、ポリカプロアミドを３Ｍ水性ＨＣｌ溶液
中（１：１５，ｗ／ｖ）で室温において１５時間加水分
解することにより活性化した。次に、活性化したポリカ
プロアミドを大量の蒸留水で洗浄した。次に、洗浄した
ポリマーを、室温において１５時間、５％（ｗ／ｖ）グ
ルタルアルデヒド水性溶液（１：１０， ｗ／ｖ）中に
置いた。次に、形成されたアルデヒド−ポリカプロアミ
ドを大量の蒸留水で洗浄した。活性化アルデヒド−ポリ
カプロアミドへのトリプシンの結合は、ジアルデヒドセ
ルロースへのトリプシンの結合について上述した方法に
従って行った。これらの研究においては、自家製ＰＡＫ
Ｓ−ＴＲＹＰＳＩＮと市販の製品は同様の結果を与え
た。
【００４３】滅菌は以下のとおり行った。それぞれの空
気乾燥高分子保護剤（１００ｍｇ）をナイロン中に密封
し、コバルト照射（２．５Ｍｒａｄ）により滅菌した。
【００４４】火傷の形成および治療は以下のとおり行っ
た。それぞれのモルモットの背中および両側について、
電気剃刀および除毛クリームにより毛を除去し、皮膚を
水で洗浄して、創傷のために準備した。石鹸および消毒
剤は、創傷治癒過程に影響を与えるかもしれないため、
使用しなかった。火傷はディビスら（Ｓ．Ｃ．Ｄａｖｉ
ｓ， Ｐ．Ｐ．Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｗ．Ｈ．Ｅａｇｌ
ｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ４８，
２４５ （１９９０））に従って形成した。火傷形成の
日に、パターソン（Ｊ．Ｓ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｔｈ
ｅ ＵＦＡＷ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｒｅ ａ
ｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｅｄ． ＵＦＡＷ， ２２３
−２４１（１９７２））に従って、モルモットをエーテ
ルで麻酔した。
【００４５】動物を、エーテルに浸漬したパッドととも
に換気されたガラス容器に置いた。エーテルが粘膜を火
傷させるため、パッドが動物に接触しないように注意し
た。このようにして動物を観察し、所望の段階に達した
ときに取り出した。
【００４６】それぞれ４５ｇの重量を有する、特別に設
計された真鍮棒２本を厳密に１２０℃に加熱した。真鍮
棒を垂直に保ち、モルモットの背中皮膚の両側に同時に
１５秒間、重力によってのみ圧力を加えて、直径１０×
２０ｍｍ、深さ０．７ｍｍの火傷を形成した。すなわ
ち、それぞれの動物につき２カ所の火傷を形成した（背
中の左側および右側）。１つは対照の包帯による治療用
であり、もう１つは生理活性複合包帯による治療用であ
る。
【００４７】
【実施例】以下の実施例により本発明を説明する。
【００４８】図７は、従来法と、本発明による生理活性
化合物（例えば、蛋白質）を水酸基を通して多糖類（例
えば、セルロース）に結合するための活性化方法との間
の主要な相違点を示す。ここでは、これらの活性化方法
の詳細な例を述べる。
【００４９】実施例１ 公知方法および新規方法による
活性化セルロースの製造 Ａ．塩化トシルを用いたセルロースの公知活性化方法 上記したように沸騰炭酸水素ナトリウムおよび／または
０．０５Ｎ水酸化ナトリウムによって処理した１ｇのセ
ルロース（医療用ガーゼ）を１０ｍｌの水で洗った。次
いで、１０５℃で乾燥するかまたは水／アセトン（３：
１，ｖ／ｖ）、水／アセトン（１：３，ｖ／ｖ）、アセ
トンおよび最後に乾燥アセトンによってこの水分を除去
した。次に、乾燥アセトン（１０ｍｌ）に溶解した塩化
トシル（１０ｇ）を含むフラスコにこのセルロースを移
した。撹拌しながら、約１分かけてピリジン（２ｍｌ）
を滴下した。室温で１時間反応後、セルロースを多量の
乾燥アセトンで洗い、次いで空気乾燥するか、または前
記の洗浄方法の順序を逆にして水に移した。
【００５０】Ｂ．塩化トシルを用いたセルロースの本発
明による活性化方法 １ｇの乾燥セルロース（医療用ガーゼ）（および／また
は約６％の水分を含有する天然セルロース）を室温で約
３０分間ピリジン（２ｍｌ）中に浸漬した。この予備処
理によりピリジンで膨潤したセルロースを、乾燥アセト
ン（１０ｍｌ）中に溶解した塩化トシル（１０ｇ）を含
有するフラスコに移した。室温で１時間反応後、セルロ
ースを多量の乾燥アセトンで洗い、次いで空気乾燥する
か、または前記のようにして水溶液に移した。結合した
トシル基の量は、公知方法により活性化されたセルロー
スに関しては、０．１２５ミリモル／ｇセルロースであ
り、モノサッカライド単位（Ｍｎ−１６２）当たり０．
０２０トシル基に相当し、本願の新規方法に関しては、
２５倍増加して３．１２ミリモル／ｇセルロース（すな
わち、モノサッカライド単位当たり０．５０トシル基）
まで上昇した。
【００５１】公知方法若しくは新規方法のいずれかによ
り生成したトシル化セルロース（１ｇ）を、０．５％ト
リプシン（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍ水性炭酸水素塩
緩衝液（２．５ｍｌ，ｐＨ８．５）中に室温で１８時間
浸漬した。次いで、各サンプルの未結合トリプシンを５
０ｍｌの炭酸水素塩緩衝液で洗い、続いて５０ｍｌの食
塩水（０．８５％の塩化ナトリウム水溶液）で５回洗っ
た。次に、得られたサンプルを０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液
（ｐＨ１１）中に室温で１時間浸漬することによって、
残留トシル基を除去した。誘導化されたセルロースサン
プルを更に５０ｍｌの炭酸塩緩衝液、５０ｍｌの食塩水
（５回）、５０ｍｌの蒸留水で洗い、次いで室温にて風
乾した。結合トリプシンの量は、公知方法および新規方
法のいずれによって活性化されたセルロースについても
同じであったが、新規方法により活性化されたセルロー
スの酵素活性は公知方法の場合に比べて約９倍高かった
（図９）。
【００５２】実施例２ ２ｍｌのピリジンに１ｇのセルロースを浸漬する代わり
に量を多くした、すなわち、２ｍｌより多い量のピリジ
ン中にセルロースを浸漬して、実施例１−Ｂ（新規活性
化方法）を繰り返した。同様の結果が得られた。（１ｇ
のセルロースは２ｍｌ未満のピリジンでは完全に湿らな
いということにも留意されたい。）セルロースをピリジ
ン中で３０分より長く前処理したときも、やはり同様の
結果が得られた。他方、前処理時間が３０分未満の場合
は、セルロース結合トシル基およびトリプシンの量がや
や低いという結果が得られた。
【００５３】実施例３ セルロース粉末の活性化 セルロース織物（医療用ガーゼ）の代わりにセルロース
粉末を用いて実施例１および２を繰り返した。公知方法
および新規方法によって活性化された粉末セルロースに
結合したトリプシンの量並びにその酵素活性は、実施例
１においてセルロース織物について得られた結果と同様
であった。
【００５４】実施例４ 塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ）
によるセルロースの活性化 活性化剤として塩化トシルの代わりに塩化トレシル（セ
ルロース１ｇにつき５０ｍｌ）用いて実施例１−３を繰
り返した。セルロースに結合したトレシル基とトリプシ
ン分子の量および結合トリプシンの活性に関する公知活
性化方法と新規活性化方法との比較は図１１に示されて
いる。公知方法に比べて新規活性化方法によって活性化
されたセルロースについては、トレシル基の量と結合ト
リプシンの量並びに当該セルロース活性のいずれも有意
に高いという結果が得られた。
【００５５】実施例５ 溶媒の種類の変更 Ａ．セルロース活性化用の溶媒 アセトンの代わりに１，４−ジオキサンを用いて実施例
１−４を繰り返した。同様の結果が得られた。Ｂ．セルロース前処理用の溶媒 １ｇのセルロースを含有するサンプルをアセトンおよび
／または１，４−ジオキサン中で室温で１時間浸漬する
ことにより前処理した。次いで、セルロースサンプル
を、膨潤状態または乾燥状態のいずれかの状態で、実施
例１−４に記載されたように処理した。同様の結果が得
られた。
【００５６】実施例６ セルロースの予備洗浄処理の変
更 前述のようにして、１ｇのセルロースを沸騰炭酸水素ナ
トリウムおよび／または０．０５Ｎ水酸化ナトリウム
（マーセリゼーション：ｍｅｒｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ）
中に浸漬することにより処理した。続いて、実施例１−
Ｂおよび実施例３（新規活性化方法）を繰り返した。同
様の結果が得られた。
【００５７】実施例７ ピリジン濃度の変更 セルロースを１０ｍｌのアセトンと２ｍｌのピリジン
（ピリジンの１７％アセトン溶液）中に浸漬する代わり
に、Ａ．ピリジンの５０％アセトン溶液（アセトン６ｍ
ｌ＋ピリジン６ｍｌ）およびＢ．１００％の乾燥ピリジ
ンを用いて実施例１−Ａ（公知活性化方法）を繰り返し
た。セルロースに結合したトシル基の量は、１００％ピ
リジンの場合が５０％ピリジンの場合よりも高かった
（それぞれ、前者が０．０７５ミリモル／ｇ、後者が
０．０５９ミリモル／ｇ）。しかし、実施例１−Ａに記
載された公知活性化方法により得られた量（０．１２５
ミリモル／ｇ）よりも低かった（図１２）。
【００５８】実施例８ ピリジン前処理がトリプシンと
セルロースの相互作用に及ぼす影響 生物活性試薬（例えば、蛋白質類）のセルロースへの結
合に及ぼすピリジンの影響を、次の実験によって調べ
た。 （ａ）アセトンにピリジンを加えないで実施例１−Ａ
（公知活性化方法）を繰り返した。 （ｂ）１ｇのセルロースを２ｍｌのピリジン中で室温で
３０分間浸漬した。次いで、セルロースを多量のアセト
ンで洗ってから風乾した。次に（ａ）を繰り返した。 （ｃ）実施例１−Ａを繰り返した。 （ｄ）１ｇのセルロースを２ｍｌのピリジン中で室温で
３０分間浸漬した。次いで、セルロースを多量のアセト
ンで洗ってから風乾した。次に実施例１−Ａを繰り返し
た。 （ｅ）実施例１−Ｂ（新規活性化方法）を繰り返した。
次に、種々の方法で生成された活性化セルロースを実施
例１に記載された処理方法によってトリプシンと反応さ
せた。図１３−１４は結合トシル基の量と結合トリプシ
ンの活性が次の順序と一致していることを裏付けてい
る：ｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａ。これらの図は、セルロースを
ピリジン中で前処理することにより結合トリプシンの量
が相対的に増加するとともに結合酵素の活性が増大する
ことを明確に示している。また、これらの図は、結合ト
シル基の最多量と結合トリプシンの最大酵素活性は実施
例１−Ｂに記載された新規活性化方法によって得られた
ことを示している。
【００５９】実施例９ 最初の塩化トシル濃度が結合ト
シル基の量に及ぼす影響 塩化トシルのアセトンに対する種々の濃度（０．２５、
１、４、８、１０、１２ｇ／１０ｍｌアセトン）につい
て、実施例１−Ｂを繰り返した。図１５は、結合トシル
基の最多量は最初の塩化トシル濃度が４ｇ／１０ｍｌア
セトンの場合に得られることを裏付けている。
【００６０】実施例１０ ［塩化トシル」／［ピリジ
ン］の最初のモル比が結合トシル基に及ぼす影響 ［塩化トシル］／［ピリジン］の種々のモル比（１：７
０、１：５０、１：５、１：１、２：１ 塩化トシル／
ピリジン、モル／モル）について、実施例１（公知活性
化方法および新規活性化方法）および実施例８−ｄ（セ
ルロースをピリジンで前処理し、次いで過剰のピリジン
をアセトンで洗い、更に公知の活性化方法によって活性
化）を繰り返した。図１６は、結合トシル基の最少量は
常に公知の活性化方法によって得られていることを示し
ている。しかしながら、［塩化トシル］／［ピリジン］
の最初のモル比が約０．２５までに関しては、新規活性
化方法の場合も実施例８−ｄの場合も同様の結合トシル
基量が得られた。他方、［塩化トシル］／［ピリジン］
の最初のモル比が０．２５を越える場合は、実施例８−
ｄに記載された方法に比べて新規活性化方法において結
合トシル量は有意に高かった。
【００６１】実施例１１ ピリジン以外の有機塩基がト
リプシンとセルロースの相互作用に及ぼす影響 ピリジンの代わりにトリエチルアミンおよび／またはプ
ロピルアミンを用いて実施例１を繰り返した。表１は、
新規活性化方法においてトリエチルアミンおよびプロピ
ルアミンを用いるよりもピリジンを用いることの優位性
を示している。すなわち、結合トリプシンの得られた活
性は、ピリジンの場合は６７２０Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、
トリエチルアミンの場合は８７４Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、
そしてプロピルアミンの場合は０Ｕ活性／ｍｇ蛋白質で
あった。他方、公知の活性化方法においては、有機塩基
を変えたことによる結合トリプシンの活性の相違は存在
しないか、または有意に減少しなかった。すなわち、得
られた結合トリプシンの活性は、ピリジンの場合は７４
３Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、トリエチルアミンの場合は７６
５Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、そしてプロピルアミンの場合は
１６７Ｕａｃｔ／ｍｇ蛋白質であった。
【００６２】
【表１】
【００６３】実施例１２ 種々のＮ−複素環化合物がト
リプシンとセルロースの相互作用に及ぼす影響 ピリジンの代わりに次の化合物を用いて実施例１を繰り
返した：ピペリジン、ピリダジン、ピロリジン、ピロリ
ンおよびピロール。表２は、新規活性化方法は公知活性
化方法に比べて、同等のまたはより大きな結合トシル基
量を示しているとともに、より大きな結合トリプシン量
および結合トリプシン活性を示しており、新規活性化方
法が公知の活性化方法方法よりも有意に優れていること
を裏付けている。
【００６４】
【表２】
【００６５】実施例１３ トリプシンをアルブミンに代えて実施例１をおよび実施
例１２（一部）を繰り返した。表３は、新規活性化方法
は公知活性化方法に比べて、結合アルブミンの量も活性
もともに大きいことを示しており、前者が後者よりも有
意に優れていることを裏付けている。
【００６６】
【表３】
【００６７】実施例１４ セルロースをアガロースに代えて実施例１及び１２（部
分的に）を繰り返した。表４には、アガロースの場合に
おいて、より多量な結合トシル基、より多量及びより高
活性の結合トリプシンとして示されるように、公知の方
法に比較して新規な活性化方法の著しい優位性が示され
ている。
【００６８】
【００６９】実施例１５ トリプシンとセルロースとの相互作用に及ぼすピリジン
後処理の影響：実施例１−Ｂに記載の新規な活性化方法
を繰り返した。生成した乾燥トシル活性化セルロース
を、ピリジン中に１ｈｒ、再浸漬することによりピリジ
ン処理した。ピリジンによるこの後−再処理の目的は、
トシル化セルロースのトシル基の一部を、結合されたピ
リジンに置換することである。次いで、誘導されたセル
ロースをアセトンで十分に洗浄し、室温で乾燥した。結
合トシル基の量はこの処理で半分に減少した（３．１２
から１．４７ｍｍｏｌ／ｇ・セルロース）。
【００７０】ピリジンによる後処理の後にさらに残存ト
シル基を除去するために、誘導されたセルロースを、ｐ
Ｈ１１の０．０５Ｍ重炭酸緩衝水溶液１０ｍｌ中に、室
温で１ｈｒ浸漬した。次いで、誘導されたセルロースを
十分水洗し、さらに風乾した。誘導されたピリジン後処
理セルロースに対するトリプシンの結合は、実施例１記
載の方法によって行った。
【００７１】結合したトリプシンの量はピリジン後処理
により、著しく減少した（３．８ｍｇ／ｇ・セルロース
に代わって、０．５ｍｇ／ｇ・セルロース）が、結合し
た酵素（トリプシン）の活性は著しく増加した（６７４
４から１０２４２Ｕａｃｔ／ｍｇ・蛋白）。ピリジン後
処理を２５℃以上の高温で行った場合も同様な結果をえ
た。
【００７２】実施例１６ トシル化セルロースへのトリプシンの結合に及ぼすｐＨ
の影響 実施例１−Ｂの新規活性化方法によって製造された３ｇ
のトシル化セルロースを各１ｇの３つの塊に分割した。
各塊を下記の水性緩衝液中のトリプシン水溶液（０．５
％、ｗ／ｖ）２．５ｍｌに、室温で１８ｈｒ振盪した。 Ａ． Ｋ／Ｎａリン酸緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ７．５ Ｂ． ＮａＨＣＯ３緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ８．５ Ｃ． ＮａＨＣＯ３緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ９．７
【００７３】表５によれば、結合トリプシンの量はいず
れの緩衝液でも同様であったが、酵素活性はｐＨ８．５
の重炭酸緩衝液が最も高いことが示されている。
【００７４】
【００７５】実施例１７ トシル化セルロースへのトリプシン結合に及ぼす温度の
影響：次の温度で実施例１６−Ｂを繰り返した。 Ａ． ４℃ Ｂ． ２５℃ Ｃ． ４０℃ 表６は、４℃及び２５℃において同様の結合能及び酵素
活性を示している。一方、４０℃では同様の結合能が得
られたが、結合酵素は変成によりその活性を完全に失っ
た。
【００７６】
【００７７】実施例１８ トシル化セルロースへのトリプシン結合の動力学 トリプシン溶液と共にトシル化セルロースを異なった間
隔でインキュベーションすることにより、実施例１７−
Ｂを繰り返した。図１７に示した結果によれば、この実
験条件下で、約６時間またはそれ以上の時間で最高のト
リプシン結合に達した。
【００７８】実施例１９ トシル化セルロースへのトリプシン結合に及ぼすトリプ
シン濃度の影響 次のトリプシン濃度において実施例１８を繰り返した。 Ａ． １ｍｇ／ｍｌ Ｂ． ５ｍｇ／ｍｌ Ｃ． ２０ｍｇ／ｍｌ Ｄ． ４０ｍｇ／ｍｌ Ｅ． ８０ｍｇ／ｍｌ 図１８は、４０ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上、即ち、４ｍｇ
／ｇ・セルロースの初期トリプシン濃度について、結合
トリプシンが最高濃度に達したことを示している。しか
しながら、このような実験条件下、例えば、４０ｍｇ／
ｍｌの初期トリプシン濃度において、セルロースに結合
したトリプシンの比率（％）は比較的高く、例えば５ｍ
ｇ／ｍｌの初期トリプシン濃度において、セルロースに
結合したトリプシンの比率は２７％であった。
【００７９】実施例２０ トシル化セルロースへのトリプシンの結合における種々
の加水分解試薬の影響セルロースに結合した残存トシル
基を加水分解することを目的とする下記の試薬の存在下
に、実施例１−Ｂ（新規な活性化方法及びトリプシン結
合）を繰り返した。 Ａ． ０．２Ｍトリス緩衝液、ｐＨ１１ Ｂ． ０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８ Ｃ． ０．０５Ｍ ＮａＮＯ３ 緩衝液、ｐＨ１１ Ｄ． ０．１％ エタノールアミン＋ＨＣｌ、ｐＨ８ Ｅ． ０．８Ｍ メルカプトエタノール＋ＮａＯＨ、ｐ
Ｈ８ 表７は、０．０５Ｍ ＮａＮＯ３ 緩衝水溶液、ｐＨ１
１の存在において、最高のトリプシン結合量及び酵素活
性が得られたことを示している。
【００８０】
【００８１】実施例２１ 新規の及び公知の活性化方法によるセルロースへのトリ
プシン以外の酵素の結合 蛋白分解酵素トリプシンを下記の酵素に置換することに
より、実施例１を繰り返した。 Ａ． コラゲナーゼ Ｂ． リゾチーム Ｃ． ヒアルロニダーゼ 図１９は、新規及び公知の２つの活性化方法において、
セルロースに結合した酵素（コラゲナーゼ、リゾチー
ム、ヒアルロニダーゼ）の量は同じであったことを示
す。しかしながら、結合酵素の活性は、新規な活性化方
法でセルロースに結合された酵素について、著しく高か
った。
【００８２】実施例２２ 新規及び公知の活性化方法によりセルロースへの酵素の
逐次結合 実施例１に記載したように、公知及び新規な活性化方法
によって生成されたトシル化セルロース１ｇを、０．５
％のトリプシン（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍ重炭酸緩
衝水溶液（ｐＨ，８．５）２．５ｍｌに、室温で０．５
ｈｒ浸漬した。次いで、２．５ｍｌのコラゲナーゼ溶液
（０．１Ｍ ＮａＮＯ３ 緩衝液中に５ｍｇ／ｍｌ濃
度、ｐＨ８．５）を添加し、さらに反応を１７．５ｈｒ
継続した。次いで、実施例１の方法により、未結合の酵
素を洗浄した。
【００８３】別々に（実施例１及び２１−Ａにより）及
び逐次的に結合した酵素の量と活性とについての比較を
表８に示す。
【００８４】
【００８５】実施例２３ 織物セルロース（医薬用ガーゼ）をセルロースパウダー
に代えた以外は、実施例２１と同様に行った，同様の結
果が得られた。
【００８６】実施例２４ コラゲナーゼ溶液を３種類の酵素：コラゲナーゼ、リゾ
チームおよびヒアルロニターゼを含む溶液（０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．５）中各酵素５ｍｇ／ｍ
ｌ）に代えた以外は実施例２２と同様に行った。
【００８７】図２０は、新規な活性化法によって調製さ
れた、トシル化セルロースとカップリングした酵素は、
既知の活性化法によって調製された酵素と比較して有意
に高い活性を有することを示す。
【００８８】実施例２５ ジアルデヒドセルロースを有機溶剤で前処理することに
よる、トリプシン結合へのおよび結合した酵素の活性へ
の影響
【００８９】１ｇのジアルデヒドセルロースを室温で３
０分間、２ｍｌピリジンに浸した。続いて、ジアルデヒ
ドセルロースを６×５０ｍｌのアセトンで洗浄し、風乾
させた、続いて、”材料と方法”の記載に従って、トリ
プシンをピリジン前処理したジアルデヒトセルロースに
カップリングさせた。
【００９０】ジアルデヒドセルロースをピリジンの変わ
りにアセトンまたはジオキサンに浸したものについて
も、同様の実験を行った。
【００９１】表９は、トリプシンの結合および結合した
トリプシンの活性は、ジアルデヒドセルロースの上述し
た溶剤での前処理によっては有意に変化しなかった。
【００９２】
【表９】
【００９３】実施例２６ 乾燥セルロース−トリプシン結合体の最大酵素活性へ到
達するまでに要する時間
【００９４】実施例１に従って調製されたトリプシン−
セルロース結合体の乾燥サンプルを室温で０．１Ｍ Ｋ
Ｎａ リン酸緩衝液ｐＨ７．５、１：１０（ｗ：ｖ）
に浸すことによって湿らせた。図２１は、水性溶液中約
１時間後に酵素がその最大活性に到達することを示す。
【００９５】実施例２７ 創傷治療のために調製された、神々の活性ポリマーの湿
度の比較
【００９６】表１０は、創傷治療のために調製された、
下記の活性ポリマーの相対湿度を示す。 Ａ．”材料と方法”の記載に従って調製されたジヒドロ
セルロース Ｂ．実施例２５に従って異なる溶剤（アセトン、ジオキ
サンおよびピリジン）で前処理されたジヒドロセルロー
ス Ｃ．”材料と方法”の記載に従って調製されたポリカプ
ロアミド−グルタルアルデヒド Ｄ．公知の活性化法（実施例１−Ａ）に従って調製され
たトシル化セルロース Ｅ．新規な活性化法（実施例１−Ｂ）に従って調製され
た、ピリジンで前処理されたトシル化セルロース Ｆ．実施例１５に従って調製された、ピリジンで前処理
および後処理されたトシル化セルロース
【００９７】表１０は、新規な活性化法に従ってピリジ
ンで前処理されたトシル化セルロース、およびピリジン
で前処理および後処理されたトシル化セルロースに関し
て最も高い湿度が得られたことを示す。
【００９８】
【表１０】
【００９９】実施例２８ 酵素とカップリングしたポリマーの安定性と活性
【０１００】下記の結合体ポリマーのそれぞれ２５ｍｇ
を、室温で０．２５ｍｌの０．１ＭＫ／Ｎａ リン酸緩
衝液ｐＨ７．５に浸した。 Ａ．実施例１に記載された、新規なおよび／または公知
の活性化法に従って調整されたセルロースにカップリン
グしたトリプシン Ｂ．”材料と方法”の記載に従って調製されたジアルデ
ヒドセルロース（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）に
カップリングしたトリプシン Ｃ．”材料と方法”の記載に従って調製されたポリカプ
ロアミド（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）にカップリング
したトリプシン
【０１０１】図２２は、新規なおよび／または公知の活
性化法に従ったセルロースにカップリングしたトリプシ
ンの活性は実験時間中変化しなかったことを示す。一
方、ジアルデヒドセルロースおよび／またはポリカプロ
アミドにカップリングしたトリプシンの活性は実験時間
中有意に減少することが観察された。さらに、ポリマー
から、新規なおよび／または公知の活性化法に従って調
製された結合体セルロースの水性溶液に浸出した結合ト
リプシンは検出されなかった。その一方、ＰＡＫＳ−Ｔ
ＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＳＩＮにつ
いて、有意な量の遊離トリプシンおよび／または水溶性
ポリマーに結合したトリプシンが観察された。
【０１０２】実施例２９ 生物活性複合ポリマーの滅菌 ナイロン袋中に密封して入れられた各１００ｍｇの生物
活性複合ポリマーを含有する、風乾した下記のバンデー
ジを２．５メガラドγ線により滅菌した。 Ａ．セルロース（対照） Ｂ．材料および方法中の記述に従って調製したジアルデ
ヒドセルロースに結合したトリプシン（ＤＡＬＣＥＫＳ
−ＴＲＹＰＳＩＮ） Ｃ．材料および方法中の記述に従って調製したポリカプ
ロアミドに結合したトリプシン（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳ
ＩＮ） Ｄ．実施例１で記載した新規な活性法および／または公
知の活性法に従って調製したセルロースに結合したトリ
プシン Ｅ．実施例１５に従って調製した、ピリジンで前処理お
よび後処理したセルロースに結合したトリプシン Ｆ．実施例２２に従って調製した、セルロースに結合し
たトリプシンおよびコラゲナーゼ
【０１０３】図２３は、ジアルデヒドセルロースに結合
したトリプシン（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）お
よび／またはポリカプロアミドに結合したトリプシン
（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）の活性が滅菌処理により
顕著に減少したことを示す。一方、新規な活性法および
／または公知の活性法によりおよび／またはピリジンで
の前処理および後処理によりセルロースに結合した酵素
の活性はγ線滅菌法により顕著には変化しなかった。
【０１０４】実施例３０ 生物活性複合ポリマーの滅菌 各１００ｍｇの生物活性複合ポリマーを含有し、且つ積
層したポリエステル／アルミニウム／ポリエチレン袋に
密封して入れられた実施例２４に記載した通りに調製し
た風乾バンデージを、液体窒素もしくは固体ＣＯ２を含
有するデュワー瓶中または窒素もしくはＣＯ２の不活性
雰囲気中に各々保持しながら、３．０メガラドγ線によ
り滅菌した。
【０１０５】表１１に提示したデータは、本発明の実施
態様に従った多種酵素包帯中のセルロースに結合した酵
素の活性が低温における放射線照射後保持されたことを
示す。一方、公知の方法に従ったセルロースに結合した
酵素の活性は放射線照射により顕著に減少した。例え
ば、公知の方法によるセルロースに結合したリゾチーム
の活性は照射後その最初の活性の３１％のみしか保持し
なかったのに対し、本発明の方法を使用すると照射後の
リゾチーム活性の損失はなかった。
【０１０６】
【０１０７】実施例３１ 生物活性複合体バンデージを用いる創傷の治療 材料および方法中の記述に従って２５匹のモルモットに
おわせた火傷を火傷後直ちに実施例２９に記載したバン
デージにより処置した。
【０１０８】各包帯を食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）に
最初浸した。次いで、湿ったバンデージを火傷傷口上に
配置しナイロンにより覆い、それにより水の蒸発を防い
だ。それから、２４時間毎に包帯を取り換えた。
【０１０９】火傷治療の間、下記の検討を行った。 Ａ．各２４時間後の顕微鏡写真を撮ることを含めて、火
傷の治癒状況の目視管理 Ｂ．各２４時間後の壊死組織から治癒した火傷傷口の領
域の測定 Ｃ．３日目、５日目および７日目に採取したバイオプシ
ーによる組織学的検討 Ｄ．火傷治療前後の結合酵素の活性。 Ｅ．火傷傷口からバンデージにより吸収された蛋白質の
量
【０１１０】図２４および表１２は、公知活性法により
調製したバンデージならびに／またはＤＡＬＣＥＫＳ−
ＴＲＹＰＳＩＮおよび／もしくはＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳ
ＩＮから構成されるバンデージにより治療した壊死組織
と比較して新規な活性法により調製したバンデージによ
り治療した壊死組織からの火傷の治癒速度が顕著に速か
ったことを示す。
【０１１１】
【０１１２】バイオプシー検討の結果は、表１１に示し
たのと同様であった。さらに、これらの検討は新規な活
性法により調製したバンデージを用いて７日間治療した
火傷の肉芽組織も示した。これらの肉芽組織は図２４に
確認もされている。
【０１１３】図２５は、ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩ
Ｎおよび／またはＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮから構成さ
れるバンデージの酵素活性が各々６５％および５４％ま
で治療により減少したことを示す。一方、新規な活性法
および／または公知の活性法により調製したバンデージ
の酵素活性は、火傷治療の間、顕著に変化しなかった。
【０１１４】火傷傷口からバンデージ内に吸収された蛋
白質の量は、火傷治療後各バンデージを５ｍｌの食塩水
中で振盪することにより検討した。次いで、水溶液中の
蛋白質の量を２８０ｎｍにおける紫外線吸収スペクトル
により決定した。火傷傷口から吸収した最も多量の蛋白
質は新規な活性法により調製した生物活性複合体バンデ
ージについて見いだされた（表１３）。
【０１１５】
【０１１６】実施例３２ 多種酵素バンデージを用いる創傷の治療 非処理セルロースおよび、実施例２４に記載した通り
に、本発明の実施態様に従って調製した多酵素セルロー
ス包帯を用いて実施例３１を繰り返した。図２６は、本
発明のこれらの多酵素セルロース包帯を使用したとき
に、壊死組織が非処理セルロース包帯と比較して顕著に
より速い治癒速度を発揮することを示す。
【０１１７】本発明を特定的に記載したが、当業界の熟
達者は多くの変更と修正をなし得ることを了解するであ
ろう。従って、本発明は、特定的に記載した実施態様に
制限されると解釈されるべきでなく、本発明の範囲、精
神および概念は特許請求の範囲を参照することにより一
層容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アルデヒド基含有ポリマーへのアミノ
リガンド、例えば蛋白質のカップリングを示す。
【図２】図２は、セルロースの過ヨウ素酸塩酸化、およ
びその結果得られるジアルデヒドセルロースへのアミノ
リガンド、例えば蛋白質のカップリングを示す。
【図３】図３は、アミノリガンド、例えば蛋白質の共有
カップリングに関するヒドロキシル含有ポリマーの活性
化を示す。
【図４】図４は、塩化トシルおよび塩化トレシル手段に
よる、アミノリガンド、例えば蛋白質の、ヒドロキシル
基含有ポリマーへの結合を示す。
【図５】図５は、塩化トシルおよび塩化トレシル手段に
よる、アミノリガンド、例えば蛋白質とセルロースの相
互作用を示す。
【図６】図６は、ポリサッカロイドの加水分解および該
加水分解産物へのグルタルアルデヒドの結合を示す。
【図７】図７は、アミノリガンド、例えば蛋白質のヒド
ロキシル基によるセルロースへのカップリングに関す
る、公知の方法および本発明の一つの態様にしたがった
方法を示す。
【図８】図８は、セルロース中のピリジンの含有を示
す。
【図９】図９は、公知の方法および本発明の一つの態様
にしたがった方法により形成された、トシル化セルロー
スにカップリングさせたトリプシンの量と活性を比較す
る。
【図１０】図１０は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化セル
ロース粉末にカップリングさせたトリプシンの量と活性
を比較する。
【図１１】図１１は、トレシル基の量、および、公知の
方法および本発明の一つの態様にしたがった方法により
形成された、トレシル化セルロースにカップリングさせ
たトリプシンの量と活性を比較する。
【図１２】図１２は、公知の方法におけるピリジン濃度
の変化により形成された、セルロースにカップリングさ
せたトシル基の量を比較する。
【図１３】図１３は、ピリジンで予め処理されたセルロ
ースの、結合トシル基量に対する影響、およびトシル化
セルロースにカップリングさせたトリプシンの量および
活性に対する影響を比較する。
【図１４】図１４は、本発明の一つの態様にしたがった
活性化方法の、カップリングされたトシル基の量に対す
る影響、およびカップリングされたトリプシンの量およ
び活性に対する影響を示す。
【図１５】図１５は、塩化トシル濃度の、セルロースに
結合したトシル基の量に対する影響を示す。
【図１６】図１６は、塩化トシル／ピリジンのモル比
の、セルロースに結合したトシル基の量に対する影響を
示す。
【図１７】図１７は、トシル化されたセルロースに結合
したトリプシンの動力学を示す。
【図１８】図１８は、トリプシン濃度の、トシル化され
たセルロースへの結合に対する影響を示す。
【図１９】図１９は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化され
たセルロースにカップリングしたさまざまな酵素の量お
よび活性を示す。
【図２０】図２０は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化され
たセルロースに連続してカップリングした酵素の活性を
示す。
【図２１】図２１は、乾燥したセルロース−トリプシン
複合体の完全な酵素活性を得るのに必要な時間を示す。
【図２２】図２２は、異なるポリマーに結合したトリプ
シンの活性を時間の函数として示す。
【図２３】図２３は、ガンマ放射線により滅菌した後の
トリプシン複合ポリマーの酵素活性を示す。
【図２４】図２４は、やけどの創傷において、本発明の
一つの態様にしたがって、セルロースにカップリングし
たトリプシンのＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ法を比
較する。
【図２５】図２５は、創傷の治療後の、トリプシン結合
ポリマーの酵素活性を示す。
【図２６】図２６は、非処理セルロース包帯と、本発明
の一つの態様にしたがって製造された多種酵素セルロー
ス包帯との比較をする。 やけどの創傷の治療：新規な方法により製造された、非
処理セルロース包帯と多種酵素（トリプシン、リゾチー
ム、コラーゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ）セルロース包
帯との比較を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 セルロースとアミノ化合物との生物活
性複合体
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、多数の遊離ヒドロキシ
基を含むポリマーの活性化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】官能基を有するポリマーとアミンの反応 生物活性化合物、例えば蛋白質のアミンの、官能基を有
するポリマー表面への共有カップリングは、一般には、
蛋白質のアミン基をポリマーの所望の官能基に相互作用
させることにより達成される。
【０００３】特に、例えば蛋白質のアミノリガンドのア
ルデヒド基含有ポリマー（ポリアルデヒドポリマー）へ
の結合は、図１に示される。シッフ塩基生成物は、相互
作用する試薬と平衡化されているから、水性溶液中では
不安定であるが、例えば、シッフ塩基結合を適切な還元
剤、例えばＮａＢＨ4で還元することにより安定化され
る。
【０００４】ジアルデヒドデキストランおよびジアルデ
ヒドセルロースは、シッフ塩基生成物の形成を通した蛋
白質の固定化に一般に用いられるポリアルデヒドポリマ
ーの例である。これらのポリマーは、親ポリマーである
デキストランおよびセルロースそれぞれの隣接ヒドロキ
シル基の過ヨウ素酸塩酸化により一般的に得られる（ツ
ルコバ（Ｊ．Ｔｕｒｋｏｖａ）ら、カナダ特許第１２１
７１３４号（１９８７）を参照されたい）。これらポリ
マーのアルデヒド含有量は酸化条件、即ち、過ヨウ素酸
塩濃度により制御されうる。これらジアルデヒドポリマ
ーの主鎖は、親ポリマーとは全く異なる構造を有する
（図２）。この違いは、親ポリマーと比較した場合に、
より開いた構造、高い孔性、水溶性の増加、高い生物分
解性および低い機械強度をジアルデヒドポリマーにもた
らす。例えば、セルロースは生物分解され得ないポリマ
ーであると考えられているが、ジアルデヒドセルロース
は生物分解性ポリマーであり、この特性は、制御された
放出の研究には必要であるが（シン（Ｍ．Ｓｉｎｇ
ｈ）、バスデヴァン（Ｐ．Ｖａｓｕｄｅｖａｎ）、シナ
（Ｔ．Ｊ．Ｍ．Ｓｉｎｈａ）、ライ（Ａ．Ｒ．Ｒａ
ｙ）、ミスロ（Ｍ．Ｍ．Ｍｉｓｒｏ）、およびグア
（Ｋ．Ｇｕｈａ）のＢｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１
５，６５５（１９８１）を参照されたい）、しかし、他
の医療の応用、例えば創傷の治療には不要である。
【０００５】ジアルデヒドポリマーと蛋白質の相互作用
により形成されたシッフ塩基結合は、水性溶液中では安
定でなく（図１および２）、その結果、結合した蛋白質
のもれ（ｌｅａｋａｇｅ）が生じる。さらに、蛋白質と
ポリアルデヒドポリマーの反応は通常、約０．５％−１
０％の遊離アルデヒド基が関与するとおり不完全である
（マーゲル（Ｓ．Ｍａｒｇｅｌ）およびビーゼル（Ｅ．
Ｗｉｅｓｅｌ）のＪ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｃｈｅ
ｍ．Ｅｄ．２２，１４５（１９８４））。したがって、
残りのアルデヒドは結合蛋白質のアミノ基と分子内相互
作用し、即ち、その活性が顕著に低下する（マーゲル
（Ｓ．Ｍａｒｇｅｌ）、Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ，４６２，１７７（１９８９）を参照された
い）。残りのアルデヒドのブロックおよびシッフ塩基の
安定化は、還元剤、例えばＮａＢＨ4を用いた還元によ
りもたらされる（図１および２）。しかしながら、還元
されたポリマーは顕著に低下した機械強度、高い水溶性
およびしばしば顕著に低下した蛋白質活性を有するが、
それは、天然の蛋白質活性に必要なジスルフィドのよう
な結合を還元するからである（ペン（Ｌ．Ｐｅｎｇ）、
カールトン（Ｇ．Ｊ．Ｃａｌｔｏｎ）およびブルネット
（Ｊ．Ｂ．Ｂｕｒｎｅｔｔ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１４，９１（１
９８７）を参照されたい）。
【０００６】図３は、遊離ヒドロキシ基含有ポリマー、
例えばセルロース、アガロース、デキストラン等への蛋
白質の化学結合を示す。この結合法は、さまざまな試
薬、例えば、臭化シアン、塩化トシル、塩化トレシル等
を用いた反応によりポリマーマトリックス上のヒドロキ
シル基を活性化することに基づく（グロマン（Ｅ．Ｖ．
Ｇｒｏｍａｎ）、およびビルチェック（Ｍ．Ｗｉｌｃｈ
ｅｋ），ＴＩＢＴＥＣＨ，５，２２０（１９８７）を参
照されたい）。活性化されたポリマーは、次に、図３に
従い、求核性置換反応によりアミノリガンド（およびチ
オールリガンド）、例えば蛋白質の共有結合に用いられ
る。
【０００７】このような誘導化法にしたがった、アミノ
（またはチオール）リガンドのヒドロキシル基含有ポリ
マーへの結合は、熱心に研究されている（ニルソン
（Ｋ．Ｎｉｌｓｓｏｎ）、モスバッハ（Ｋ．Ｍｏｓｂａ
ｃｈ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，３９
７（１９８０）を参照されたい）。通常、この反応は、
乾燥ポリマーを、所望の濃度の活性化剤（例えば、塩化
トシル、塩化トレシル等）を含有する有機溶媒（例え
ば、アセトンまたはジオキサン）に加えることにより達
成される。次に、塩基（例えば、ピリジン、トリエチル
アミン等）を有機溶液に加えて、遊離したＨＣｌを中和
する。次に、ポリマーを適切な有機溶剤で未結合活性化
剤から洗い流す。次に、乾燥した活性化ポリマーを水性
溶液中で所望のアミノ（またはチオール）リガンドと反
応させる。次に、あらゆる未結合リガンドが除去され
る。必要であれば、残りのトシル基は公知の方法、例え
ば、塩基性条件または第２アミノ（またはチオール）リ
ガンドとの反応によりブロックされる。この活性化工程
における遊離ＨＣｌの中和に用いられる共通の有機塩基
はピリジンおよびトリエチルアミンである。コンフォー
ト（Ａ．Ｒ．Ｃｏｍｆｏｒｔ）、アルバート（Ｅ．Ｃ．
Ａｌｂｅｒｔ）およびランガー（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ）、
Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．３４，１３６
６（１９８９）は、トリピリジンの代わりにエチルアミ
ンを有機塩基として用いた場合、塩化トレシル活性化に
よりセルロースに結合したヘパリナーゼの残りの活性が
３倍増加したことを示した。
【０００８】塩化ｐ−トルエンスルホン酸（塩化トシ
ル）および／または塩化トリフルオロエタンスルホン酸
（塩化トレシル）と第１ヒドロキシル基の反応は、トシ
ル化エステルを形成するが、これは、図４に示されると
おり、アミノ（またはチオール）リガンドと極めて高い
反応性を有する。セルロース主鎖の構造は、この固定化
法の間変化しない（図５）ことにより、その塩基の化学
的および物理的特性、即ち、溶解性、機械特性、生物非
分解性等はほとんどそのまま変化しない。さらに、上記
活性化試薬、例えば塩化トシルおよび塩化トレシルによ
り形成された化学的結合は安定であり、即ち、溶媒への
結合蛋白質のあらゆる顕著なもれを阻止する（コロウイ
ック（Ｓ．Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）およびカプラン
（Ｎ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１３５−Ｂ，２９（１９８７）を
参照されたい）。
【０００９】創傷の治療 創傷は皮膚への損傷と定義してよい。創傷は皮膚をひっ
かくこと、熱、冷え、化学物質（放射性物質を含む）、
電気等により引き起こされる。単語「創傷」はやけどお
よび瘢痕をも含む。皮膚は、からだの中で最も重要で敏
感な器官のひとつであり、かつ、環境に対して防御的機
能を有する。皮膚の一部が損傷を受けたならば、水、
塩、蛋白質およびエネルギーは損傷を受けた皮膚を通し
て体から漏れ出す。体は顕著な量の熱を損失し、そし
て、微生物が、損傷を受けた皮膚から体に入り込む。カ
ビおよび微生物は創傷において局所的汚染を引き起こ
し、体中に深く侵入して、全身の炎症をもたらす。
【００１０】創傷を治療する目的は、皮膚に生じた損傷
を直すことである。損傷が小さく局所的であれば、通
常、治癒するまで数日または数週間である。しかしなが
ら、損傷を受けた場所が広くてひどければ、治療の進行
は遅くなり、通常は皮膚を移植したり他の治療、例えば
薬剤投与が必要である。しばしば、創傷の治療は、ひど
い痛み、瘢痕の跡をもたらし、生理学的治療および／ま
たは心理学的治療を必要とする。ひどい場合、治療は、
出血、汚染、痛み、毒、水の蓄積等の問題を処理せねば
ならない。
【００１１】創傷の治療の使用において、現在多数の方
法があるが、例えば、防腐および抗生物質製剤、レーザ
ー照射、寒冷治療、天然酵素製剤等を含む（例えば、ク
ランツ（Ｋｒａｎｔｚ）およびカール（Ｃａｒｒ）、Ｐ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、８版、１９
７２，ｐｐ１００１−１００３、「やけどおよび潰瘍の
治療のための試薬（Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｕｒｎｓ ａｎｄ Ｕｌｃｅｒ
ｓ）」；グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびギルマン
（Ｇｉｌｍａｎ）、Ｐａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂ
ａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、６版、Ｍ
ａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８
０，ｐｐ９６４−９８７を参照されたい）。各治療法
は、それぞれ利点と欠点を有する。
【００１２】これらの方法の間で、創傷の治療への天然
酵素の使用がまったく共通している。これらの酵素製剤
は、通常、蛋白質分解酵素のような酵素、例えば、トリ
プシンおよびキモトリプシン（化膿した壊死性の創傷を
きれいにし、そして病原体の量を減らす）、リゾチーム
（微生物の細胞壁を壊す）、および／またはコラーゲナ
ーゼ（コラーゲンを分解し、そしてラフな瘢痕を阻止す
る）を基にする。酵素製剤は通常ゲル、粉末、または流
体の形態をとり、創傷上に塗られる。創傷の治療への天
然蛋白質分解酵素の使用はまったく共通している。しか
しながら、この方法は、幾つかの大きな欠点を有する
が、例えば天然酵素は阻害剤により迅速に不活性化され
ず、水性溶液中で不安定であり、抗原特性および発熱特
性を示し、血流に侵入するかもしれず、そしてそれによ
りアレルギー反応を引き起こし、そしてさらにそれらは
高価である。
【００１３】これらの欠点に打ち勝つために、何人かの
研究者はポリマービーズへさまざまな蛋白質分解酵素を
共有結合させたが、該ビーズは約０．０５−０．５ｍｍ
の平均直径を有し、デキストランアルデヒドおよび／ま
たはジアルデヒドセルロースからなる（ツルコバ（Ｊ．
Ｔｕｒｋｏｖａ）ら、カナダ特許第１２１７３４号（１
９８７）；フレミング（Ｃ．Ｆｌｅｍｍｉｎｇ）、ガバ
ート（Ａ．Ｇａｂｅｒｔ）、ロス（Ｐ．Ｒｏｔｈ）およ
びワンド（Ｈ．Ｗａｎｄ）、Ａｃｔａ Ｂｉｏｌ．Ｍｅ
ｄ．Ｇｅｒ．３１，４４９（１９７３）を参照された
い）。しかしながら、創傷の治療のためのこれら複合ビ
ーズの使用は欠点が多いために限定されるが、その欠点
とは例えば、この方法は相対的に高価であり、かつ、流
体が創傷からしばしば流れ、そして複合体ビーズを洗い
流し、その結果何度もこの治療を繰り返す必要がある。
さらに、創傷の治療のためのこれらジアルデヒドポリマ
ーの主な欠点は、上記のとおりである。
【００１４】ソビエトの研究者により、創傷の治療のた
めの新規な方法が最近開発された。この方法は、生物活
性試薬、例えば蛋白質分解酵素の、ジアルデヒドセルロ
ース包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）および／またはアルデヒ
ドポリカプロアミド包帯への共有結合に基づく。ジアル
デヒドセルロース包帯は、セルロースの過ヨウ素酸塩の
酸化により形成され、そしてアルデヒドポリカプロアミ
ド包帯は、ポリカプロアミドの酸加水分解（３Ｍ ＨＣ
ｌ）により形成され、加水分解産物の末端アミノ基にグ
ルタルアルデヒドをカップリングさせる（図６を参照さ
れたい）。商品名「ＰＡＫＳＴＲＹＰＳＩＮ」（アルデ
ヒドポリカプロアミドへ結合したトリプシン）（ラキン
（Ｋ／Ｌａｋｉｎ）、プロニン（Ｖ．Ｐｒｏｎｉｎ）、
リルツセブ（Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ）、ストルチャック
（Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ）、フィラトフ（Ｖ．Ｆｉｌａ
ｔｏｖ）、ラーキン（Ｋ．Ｌａｋｉｎ）およびリルツセ
ブ（Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ）、ＵＳＳＲ特許Ｎ２１０９３
８号（１９８４）を参照されたい）という固定化酵素の
包帯が市販されている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】これらの固定化包帯は
以前のポリアルデヒドビーズの問題を解決したが、創傷
からの流体の流れがしばしば複合ビーズを洗い流す。し
かしながら、ポリアルデヒドポリマーの他の主要な欠
点、即ち不安定な結合、体液への結合酵素のもれ、弱い
機械強度、水溶性、生物分解性等はいまだ存在する。
【００１６】なお、上記論文および特許文献の全開示
は、引用により本明細書の一部をなす。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ひとつの側面
において、多数の遊離ヒドロキシ基を含むポリマーを前
活性化する方法を提供する。現在好ましいポリマーはポ
リサッカロイドであるが、ポリサッカロイドは例示であ
り、したがって本発明は他のヒドロキシポリサッカロイ
ド、例えばポリビニルアルコールおよびそのコポリマ
ー、例えば、ポリオレフィン例えばポリエチレンとのコ
ポリマー、並びにポリオレフィン例えばポリエチレンを
基にし、かつ、表面ヒドロキシル基を含むグラフトポリ
マーもあてはまることは認識されるべきである。本発明
による方法は、ヒドロキシ基への反応体の不在下で少な
くともひとつのＮ−複素環化合物、例えばピリジン（置
換または非置換）；ピロール（置換または非置換）；ま
たはピリダジン（置換または非置換）とヒドロキシポリ
マーを接触させることからなる。このような化合物中の
複素環は完全にまたは部分的に飽和していてよく、例え
ばピロリノン、ピロリジンまたはピペリジンのような場
合であり、そして、これらの化合物は置換されていても
置換されていなくてもよい。Ｎ−複素環化合物が置換さ
れている場合、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フッ
素、塩素、臭素およびトリフルオロメトルから選択され
る少なくともひとつを含むことが好ましい。即ち、前活
性化されたポリマーは本発明の一部を形成する。
【００１８】他の側面において、本発明は、誘導化ポリ
サッカロイドポリマーの製造法を提供するが、この方法
は、上記の前活性化されたポリマーを製造し、次に、上
記ポリマー中の遊離ヒドロキシ基に対する一つの反応体
と該ポリマーを反応させるが、その際、上記反応体は、
未置換水素原子を含有するアミノ基と反応することがで
きる少なくともひとつの官能基を少なくとも潜在的に含
み、そして、ハロゲン化シアン、炭化水素エステル、ハ
ロゲン化ｓ−トリアジン、ハロホルメート、ハロゲン化
スルホン酸および核結合性活性水素原子を含有するＮ−
複素環化合物から選択されるのが好ましい。
【００１９】少なくともひとつの未置換Ｎ−結合水素原
子を含む少なくとも一つのアミノ化合物と、多数の遊離
ヒドロキシ基を含む少なくとも一つのポリサッカロイド
ポリマーの複合体を製造する方法であって、以下の工程
（ａ），（ｂ）および（ｃ）のうち少なくとも工程
（ａ）および（ｂ）からなる方法において、各工程は以
下のとおりである、即ち、（ａ）上記ポリマー中の遊離
ヒドロキシ基に対する少なくとも一つの反応体と反応さ
せることにより、少なくとも一つのポリサッカロイドポ
リマーを誘導するが、その際、このような反応体は、少
なくとも一つのアミノ化合物と反応することができる少
なくとも一つの官能基を少なくとも潜在的に含むという
事実により付加的に特徴付けされ、（ｂ）そうして誘導
化されたポリサッカロイドポリマーを少なくとも一つの
アミノ化合物と反応させ、必要であれば、（ｃ）そのよ
うな反応体とポリサッカロイドのヒドロキシ基との反応
産物であるあらゆるポリマー結合基を公知の方法により
ヒドロキシ基へ変換する。特に、本発明は、そのような
少なくとも一つの反応体との反応に関する少なくとも一
つのポリサッカロイドポリマーの容量を増加させるため
に、工程（ａ）の前に前活性化工程を含む改良法を提供
するが、その際、上記の前活性化工程は、ヒドロキシ基
に対する反応体の不在下で上記少なくとも一つのポリサ
ッカロイドポリマーを少なくとも一つのＮ−複素環化合
物に接触させる工程を含む。少なくとも一つのアミノ化
合物は、少なくとも一つの蛋白質、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、リゾチーム、コラーゲナーゼ、ア
ルブミンおよび／またはヒアルロニダーゼを含んでよ
い。
【００２０】上記工程前および上記工程後の、上記少な
くとも一つのポリサッカロイドポリマー（セルロースが
好ましいがこれに限定されない）は粉末の形態であって
も、あるいはバンデージ、パッチまたは類似の創傷カバ
ーとして用いられうる織物ウエブの形態であってもよ
い。
【００２１】本発明は、さらに、ポリマーに結合させた
アミン、例えば蛋白質を提供する工程を含む方法によ
り、多数のヒドロキシ基を含むポリマーから製造され
た、創傷に適用されるための粉末、バンデージ、パッチ
または類似のカバーに関する。ポリマーに結合したアミ
ンを含むそのような創傷カバーの一般性を損なうことな
く、そのような製造法は、ポリマーにアミンを結合する
ことに関して本明細書中で記載された方法を含む。アミ
ンが蛋白質の場合、これは、例えばトリプシン、キモト
リプシン、リゾチーム、コラーゲナーゼ、アルブミンお
よびヒアルロニダーゼから選択されるひとつでよい。ヒ
ドロキシ基に対する反応体の不在下で少なくともひとつ
のＮ−複素環化合物に接触させることによりヒドロキシ
基含有ポリマーを前処理した上記ポリマーに結合させた
アミン、特に蛋白質は、そのような処理をしなかった場
合に比べて顕著に高い活性を有するという重要な利点を
有することが見いだされた。本発明はさらに、未置換Ｎ
−結合水素原子を少なくとも一つ含む少なくとも一つの
アミン化合物と、多数のヒドロキシ基を含む少なくとも
一つのポリマーとの複合体を提供するが、該複合体は上
記方法にしたがって得られる。
【００２２】本発明の１つの態様によれば、蛋白質等の
生理活性化合物を、そのヒドロキシル基を通じてセルロ
ースと複合させ、すなわち、セルロースに固定化するこ
とができる。この新規な活性化方法を用いることによ
り、従来法と比較して、通常は、増大した活性化試薬結
合能力、同等のまたは増大した蛋白質結合能力、増大し
た吸湿性および結合した蛋白質のより高い活性が得られ
る。
【００２３】図７は、従来の活性化方法と本発明の１つ
の態様との主な相違点を示す。この新規な活性化方法と
従来法との主な相違点は、予備処理段階（例えば、ピリ
ジン等のＮ−複素環式塩基によるセルロースの予備処
理）のためである。この予備処理はセルロース鎖間の水
素結合を壊してピリジン分子をセルロース鎖の間に閉じ
込め（Ｌ．Ｓｅｇａｌ， Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， Ｐ
ａｒｔ Ｖ （１９７０）， Ｅｄ． Ｎ．Ｍ．Ｂｉｋ
ａｔｅｓ ａｎｄ Ｌ．Ｓｅｇａｌ， ｐｐ ７１９−
７２９ を参照のこと）、セルロースのより開放された
反応性の形をもたらすと信じられている（図８）。新規
方法と従来の誘導化法との他の相違点は、新規方法にお
いては水性ＮａＨＣＯ3および／またはＮａＯＨによる
セルロースの処理（シルケット加工）が必須ではなく、
固定化工程において初期の湿潤セルロース（Ｈ2Ｏ約６
％）を用いることもできるという事実のためである。
【００２４】予備活性化段階において他の塩基および／
または膨潤剤（例えば、アセトン、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、トリエチルアミン、プロピルアミン
等）で置換する試みは、本発明と比較して何ら異常な振
る舞いを示さなかった。
【００２５】本発明はまた、蛋白質（トリプシン、リゾ
チ−ム等）と結合した多糖類（セルロース等）からな
る、創傷の治療のための新規なポリマー表面の提供を可
能にする。これらの複合セルロース材料は、異なる製造
形（粉体および保護剤等）において、前述した理由（異
なる主鎖構造、非生物分解性、高い機械的強度および蛋
白質とポリマーとの安定な結合）のため、市販の材料
（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−Ｔ
ＲＹＰＳＩＮ）とは基本的に異なっている。新規活性化
方法により得られる複合材料は、従来法により得られる
材料よりも、創傷治療に著しく有効である。例えば、新
規活性化方法によりセルロース上に結合したトリプシン
の活性は、同様の量の酵素がポリマーに結合しているに
もかかわらず、従来法により得られる活性、およびＰＡ
ＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰ
ＳＩＮにより得られる活性の約５−１０倍高い。
【００２６】本研究においては以下の材料を用いた：ア
セトン、１，４−ジオキサン、トリエチルアミンおよび
プロピルアミンはＢＩＯ−ＬＡＢラボラトリーズ社製
（ＢＩＯ−ＬＡＢ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔ
ｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）；アガロース、アルブミン（ヒ
ト、分画Ｖ）、ビリルビン（ウシ胆石）、ピリダジン、
ピロール、ピロリジン、ピロリン、ピペリジン、塩化ｐ
−トルエンスルホニル（塩化トシル）、および塩化２，
２，２−トリフルオロ−エタンスルホニル（塩化トレシ
ル）はシグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
Ｍｏ．）；ピリジン、フォリン−シオカルト−フェノ
ール試薬、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、ＮａＯＨ、ＫＨ2Ｐ
Ｏ4、ＮａＩＯ4、ＮａＢＨ4、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、エタノールアミン、メルカプトエタ
ノールおよび活性化モレキュラーシーブ４Ａはメルク社
製（Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）；セルロース（木綿）−医療用ガーゼはセントラ
ル・メディカル・サプライ社製（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ａ．Ｒ．Ｍ．， Ｉｓｒａ
ｅｌ）；セルロースパウダーＭＮ３００はデュレン社製
（Ｄｕｒｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）；ウシ膵臓トリプシ
ン・タイプＩＩＩ、コラゲナーゼ・タイプＸＩ、卵白リ
ゾチ−ム、およびウシ精巣ヒアルロニダーゼ・タイプＩ
Ｖ−Ｓはシグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ， Ｍｏ．）；塩酸Ｎａ−ベンゾイル−ｌ−アルギニ
ンエチルエステル（ＢＡＥＥ）、ウシアキレス腱コラー
ゲン・タイプＩ、ミクロコッカス・リゾデイクチカス
（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕ
ｓ）の不溶凍結乾燥細胞およびヒト臍帯ヒアルロン酸ナ
トリウム塩は、シグマ社製（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ， Ｍｏ．）。
【００２７】以下の実験動物を用いた：体重３００−３
３０ｇの雌モルモット（アニラブ社製、Ａｎｉｌａｂ．
Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ）を、実験前に２週
間条件づけた。動物に水および抗生物質を含まない基本
食を与え、制御された温度（２３−２５℃）および明暗
（１２時間／１２時間ＬＤ）下で飼育した。
【００２８】分析方法は以下のとおりである。
【００２９】Ａ．ポリマー結合トシルおよび／またはト
レシル基の量は、元素分析により決定されたイオウの
量、および結合トシル（および／またはトレシル）基を
加水分解した後に得られる水性溶液の吸収ピーク（例え
ば、トシルについては２６１ｎｍ、Ａ２６１）から求め
た。これらの基の加水分解は、トシル（および／または
トレシル）活性化セルロース（１ｇ）を室温において１
時間、ＮａＨＣＯ3水性溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ１１）
１０ｍｌに浸漬することにより行った。
【００３０】Ｂ．ポリマーに結合した蛋白質（酵素）の
量は、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ ｅｔａｌ．， Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９３， ２６５ （１９５
１））に従って測定した。
【００３１】Ｃ．結合したトリプシンの酵素活性は、Ｂ
ＡＥＥを酵素基質として用いて、ウォルシュおよびウィ
ルコックス（Ｋ．Ａ．Ｗａｌｓｈ， Ｐ．Ｅ．Ｗｉｌｃ
ｏｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１９， ３１−４１ （１９７０））に従って測定し
た。１ＢＡＥＥ単位の活性は、ｐＨ７．６、２５℃、反
応容量３．３ｍｌにおいて、１分間にＡ２５３を０．０
０１増加させる。
【００３２】Ｄ．結合したコラゲナーゼの酵素活性は、
ギャロップ、セイファーおよびメイルマン（Ｐ．Ｍ．Ｇ
ａｌｌｏｐ， Ｓ．Ｓｅｉｆｅｒ ａｎｄ Ｅ．Ｍｅｉ
ｌｍａｎ， ＪＢＣ ２２７， ８９１ （１９５
７））に従い、ウシアキレス腱の粉体「不溶」コラーゲ
ンの懸濁液を基質として用いて測定した。コラゲナーゼ
活性の１単位は、アッセイ条件下（３７℃、インキュベ
ーション２０分間、ｐＨ７．４）において１ｍｇの懸濁
コラーゲンの溶解をもたらす量として定義した。
【００３３】Ｅ．結合したリゾチ−ムの酵素活性は、オ
リスおよびダッタ（Ｄ．Ｆ．Ｏｌｌｉｓ， Ｒ．Ｄａｔ
ｔａ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
４４， ４４４−４５０ （１９７６））に従い、ミ
クロコッカス・リゾデイクチカスの乾燥細胞を基質とし
て用いて測定した。リゾチ−ム活性の１単位は、実験条
件下（ｐＨ７．０、２５℃、細胞懸濁液０．３ｍｇ／ｍ
ｌ、反応容量３ｍｌ）において、対応する基質の溶解の
結果として、１分間にＡ４５０を０．００１減少させ
る。
【００３４】Ｆ．結合したヒアルロニダーゼの酵素活性
は、リンカー（Ａ．Ｌｉｎｋｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏ
ｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏ
ｌ．４， ２５６−２６２ （１９８４））に従い、ヒ
アルロン酸を基質として用いて測定した。ヒアルロニダ
ーゼ活性の１単位は、アッセイ条件下（３７℃、ｐＨ
７．５、インキュベーション容量１ｍｌ）において１分
間に遊離したＮ−アセチルグルコサミンの量（ｆｍｏ
ｌ）として表される。
【００３５】Ｇ．結合したアルブミンの活性は、プロッ
ツら（Ｐｌｏｔｚ，Ｐ．Ｈ．， Ｂｅｒｋ，Ｐ．， Ｓ
ｃｈａｒｓｃｈｍｉｄｔ，Ｂ．Ｆ．， Ｇｏｒｄｏｎ，
Ｊ．Ｋ． ａｎｄ Ｖｅｒｇａｌｌａ，Ｊ．， Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．５３， ７７８−７８５
（１９７４））に従い、ビリルビンを基質として用いて
測定した。アルブミンの活性は、２５℃、インキュベー
ション時間１５分間、２５ｍｇセルロース、反応容量３
ｍｌにおいて、モデル溶液（０．００５ｍｇ／ｍｌ炭酸
塩緩衝液、０．１Ｍ、ｐＨ８．５）からセルロースに吸
着したビリルビンの％として表される。
【００３６】Ｈ．生理活性高分子の吸湿性は、シュワー
タセックら（Ｋ．Ｓｃｈｗｅｒｔａｓｓｅｋ， Ｊ．
Ｄｏｕｂｅｃｋ ａｎｄ Ｕ．Ｆａｓｈｅｆｏｒｃｈ，
Ｔｅｘｔｉｌｔｅｃｈｎ．， ９， ３６１ （１９
５６））の方法に従って測定した。
【００３７】高分子の予備洗浄は以下のようにして行っ
た。
【００３８】Ａ．セルロースの予備洗浄およびシルケッ
ト加工 セルロース１ｇ（木綿ガーゼおよび／または粉体）を、
１％ＮａＨＣＯ3水性溶液および／または０．０５Ｎ
ＮａＯＨ水性溶液２５ｍｌ中において３０分間煮沸し、
この混合物を室温まで冷却した。セルロースを大量の蒸
留水で洗浄し、室温において乾燥させ、使用するまで保
存した。
【００３９】Ｂ．ポリカプロアミド（カプロン編み地）
の予備洗浄 ポリカプロアミド１ｇを、１％ＮａＨＣＯ3水性溶液１
５ｍｌ中において６０℃において３０分間インキュベー
トした。次に、この溶液を室温まで冷却し、ポリカプロ
アミドを大量の蒸留水で洗浄し、室温において乾燥さ
せ、使用するまで保存した。
【００４０】トリプシン結合ポリマーは以下のとおり合
成した。
【００４１】Ａ．トリプシンを結合させたジアルデヒド
セルロース（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮは、ソビエト連邦特許
第Ｎ２１０９３８号（Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ， Ｖ．Ｆ
ｉｌａｔｏｖ， Ｋ．Ｌａｋｉｎ ａｎｄ Ｖ．Ｒｙｌ
ｔｓｅｖ， １９８４）に従って調製した。簡単には、
セルロース１ｇを０．６Ｍ水性ＮａＩＯ4（ｐＨ５．
０）５ｍｌ中で室温において２４時間浸漬して、ジアル
デヒドセルロースを調製した。次に、このようにして酸
化したセルロースを２０５ｎｍにおける吸収が完全に消
失するまで大量の蒸留水で洗浄した。次に、形成された
ジアルデヒドセルロースを、室温において１８時間、
０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシンを含むＫ／Ｎａリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）２．５ｍｌ中に置いた。次に、ジ
アルデヒドセルロース−トリプシン複合体を同一の緩衝
液５０ｍｌにより、続いて生理食塩水（０．８５％水性
ＮａＣｌ溶液）５０ｍｌにより５回洗浄した。次に、洗
浄したジアルデヒドセルロース−トリプシン複合体（Ｄ
ＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）を室温において乾燥さ
せ、使用するまで保存した。これらの研究においては、
自家製ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮと市販の製品は
同様の結果を与えた。
【００４２】Ｂ．トリプシンを結合させたポリカプロア
ミド（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮは、ソビエト連邦特許第Ｎ１
１７３６５号（Ｋ．Ｌａｋｉｎ， Ｖ．Ｐｒｏｎｉｎ，
Ｖ．Ｒｙｌｔｓｅｖ， Ｓ．Ｓｔｕｒｃｈａｋ ａｎ
ｄ Ｖ．Ｆｉｌａｔｏｖ １９８１）に従って調製し
た。簡単には、ポリカプロアミドを３Ｍ水性ＨＣｌ溶液
中（１：１５，ｗ／ｖ）で室温において１５時間加水分
解することにより活性化した。次に、活性化したポリカ
プロアミドを大量の蒸留水で洗浄した。次に、洗浄した
ポリマーを、室温において１５時間、５％（ｗ／ｖ）グ
ルタルアルデヒド水性溶液（１：１０， ｗ／ｖ）中に
置いた。次に、形成されたアルデヒド−ポリカプロアミ
ドを大量の蒸留水で洗浄した。活性化アルデヒド−ポリ
カプロアミドへのトリプシンの結合は、ジアルデヒドセ
ルロースへのトリプシンの結合について上述した方法に
従って行った。これらの研究においては、自家製ＰＡＫ
Ｓ−ＴＲＹＰＳＩＮと市販の製品は同様の結果を与え
た。
【００４３】滅菌は以下のとおり行った。それぞれの空
気乾燥高分子保護剤（１００ｍｇ）をナイロン中に密封
し、コバルト照射（２．５Ｍｒａｄ）により滅菌した。
【００４４】火傷の形成および治療は以下のとおり行っ
た。それぞれのモルモットの背中および両側について、
電気剃刀および除毛クリームにより毛を除去し、皮膚を
水で洗浄して、創傷のために準備した。石鹸および消毒
剤は、創傷治癒過程に影響を与えるかもしれないため、
使用しなかった。火傷はディビスら（Ｓ．Ｃ．Ｄａｖｉ
ｓ， Ｐ．Ｐ．Ｍｅｒｔｚ ａｎｄ Ｗ．Ｈ．Ｅａｇｌ
ｓｔｅｉｎ， Ｊ．Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ４８，
２４５ （１９９０））に従って形成した。火傷形成の
日に、パターソン（Ｊ．Ｓ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｔｈ
ｅ ＵＦＡＷ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃａｒｅ ａ
ｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｅｄ． ＵＦＡＷ， ２２３
−２４１（１９７２））に従って、モルモットをエーテ
ルで麻酔した。
【００４５】動物を、エーテルに浸漬したパッドととも
に換気されたガラス容器に置いた。エーテルが粘膜を火
傷させるため、パッドが動物に接触しないように注意し
た。このようにして動物を観察し、所望の段階に達した
ときに取り出した。
【００４６】それぞれ４５ｇの重量を有する、特別に設
計された真鍮棒２本を厳密に１２０℃に加熱した。真鍮
棒を垂直に保ち、モルモットの背中皮膚の両側に同時に
１５秒間、重力によってのみ圧力を加えて、直径１０×
２０ｍｍ、深さ０．７ｍｍの火傷を形成した。すなわ
ち、それぞれの動物につき２カ所の火傷を形成した（背
中の左側および右側）。１つは対照の包帯による治療用
であり、もう１つは生理活性複合包帯による治療用であ
る。
【００４７】
【実施例】以下の実施例により本発明を説明する。
【００４８】図７は、従来法と、本発明による生理活性
化合物（例えば、蛋白質）を水酸基を通して多糖類（例
えば、セルロース）に結合するための活性化方法との間
の主要な相違点を示す。ここでは、これらの活性化方法
の詳細な例を述べる。
【００４９】実施例１ 公知方法および新規方法による
活性化セルロースの製造 Ａ．塩化トシルを用いたセルロースの公知活性化方法 上記したように沸騰炭酸水素ナトリウムおよび／または
０．０５Ｎ水酸化ナトリウムによって処理した１ｇのセ
ルロース（医療用ガーゼ）を１０ｍｌの水で洗った。次
いで、１０５℃で乾燥するかまたは水／アセトン（３：
１，ｖ／ｖ）、水／アセトン（１：３，ｖ／ｖ）、アセ
トンおよび最後に乾燥アセトンによってこの水分を除去
した。次に、乾燥アセトン（１０ｍｌ）に溶解した塩化
トシル（１０ｇ）を含むフラスコにこのセルロースを移
した。撹拌しながら、約１分かけてピリジン（２ｍｌ）
を滴下した。室温で１時間反応後、セルロースを多量の
乾燥アセトンで洗い、次いで空気乾燥するか、または前
記の洗浄方法の順序を逆にして水に移した。
【００５０】Ｂ．塩化トシルを用いたセルロースの本発
明による活性化方法 １ｇの乾燥セルロース（医療用ガーゼ）（および／また
は約６％の水分を含有する天然セルロース）を室温で約
３０分間ピリジン（２ｍｌ）中に浸漬した。この予備処
理によりピリジンで膨潤したセルロースを、乾燥アセト
ン（１０ｍｌ）中に溶解した塩化トシル（１０ｇ）を含
有するフラスコに移した。室温で１時間反応後、セルロ
ースを多量の乾燥アセトンで洗い、次いで空気乾燥する
か、または前記のようにして水溶液に移した。結合した
トシル基の量は、公知方法により活性化されたセルロー
スに関しては、０．１２５ミリモル／ｇセルロースであ
り、モノサッカライド単位（Ｍｎ−１６２）当たり０．
０２０トシル基に相当し、本願の新規方法に関しては、
２５倍増加して３．１２ミリモル／ｇセルロース（すな
わち、モノサッカライド単位当たり０．５０トシル基）
まで上昇した。
【００５１】公知方法若しくは新規方法のいずれかによ
り生成したトシル化セルロース（１ｇ）を、０．５％ト
リプシン（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍ水性炭酸水素塩
緩衝液（２．５ｍｌ，ｐＨ８．５）中に室温で１８時間
浸漬した。次いで、各サンプルの未結合トリプシンを５
０ｍｌの炭酸水素塩緩衝液で洗い、続いて５０ｍｌの食
塩水（０．８５％の塩化ナトリウム水溶液）で５回洗っ
た。次に、得られたサンプルを０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液
（ｐＨ１１）中に室温で１時間浸漬することによって、
残留トシル基を除去した。誘導化されたセルロースサン
プルを更に５０ｍｌの炭酸塩緩衝液、５０ｍｌの食塩水
（５回）、５０ｍｌの蒸留水で洗い、次いで室温にて風
乾した。結合トリプシンの量は、公知方法および新規方
法のいずれによって活性化されたセルロースについても
同じであったが、新規方法により活性化されたセルロー
スの酵素活性は公知方法の場合に比べて約９倍高かった
（図９）。
【００５２】実施例２ ２ｍｌのピリジンに１ｇのセルロースを浸漬する代わり
に量を多くした、すなわち、２ｍｌより多い量のピリジ
ン中にセルロースを浸漬して、実施例１−Ｂ（新規活性
化方法）を繰り返した。同様の結果が得られた。（１ｇ
のセルロースは２ｍｌ未満のピリジンでは完全に湿らな
いということにも留意されたい。）セルロースをピリジ
ン中で３０分より長く前処理したときも、やはり同様の
結果が得られた。他方、前処理時間が３０分未満の場合
は、セルロース結合トシル基およびトリプシンの量がや
や低いという結果が得られた。
【００５３】実施例３ セルロース粉末の活性化 セルロース織物（医療用ガーゼ）の代わりにセルロース
粉末を用いて実施例１および２を繰り返した。公知方法
および新規方法によって活性化された粉末セルロースに
結合したトリプシンの量並びにその酵素活性は、実施例
１においてセルロース織物について得られた結果と同様
であった。
【００５４】実施例４ 塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ）
によるセルロースの活性化 活性化剤として塩化トシルの代わりに塩化トレシル（セ
ルロース１ｇにつき５０ｍｌ）用いて実施例１−３を繰
り返した。セルロースに結合したトレシル基とトリプシ
ン分子の量および結合トリプシンの活性に関する公知活
性化方法と新規活性化方法との比較は図１１に示されて
いる。公知方法に比べて新規活性化方法によって活性化
されたセルロースについては、トレシル基の量と結合ト
リプシンの量並びに当該セルロース活性のいずれも有意
に高いという結果が得られた。
【００５５】実施例５ 溶媒の種類の変更 Ａ．セルロース活性化用の溶媒 アセトンの代わりに１，４−ジオキサンを用いて実施例
１−４を繰り返した。同様の結果が得られた。Ｂ．セルロース前処理用の溶媒 １ｇのセルロースを含有するサンプルをアセトンおよび
／または１，４−ジオキサン中で室温で１時間浸漬する
ことにより前処理した。次いで、セルロースサンプル
を、膨潤状態または乾燥状態のいずれかの状態で、実施
例１−４に記載されたように処理した。同様の結果が得
られた。
【００５６】実施例６ セルロースの予備洗浄処理の変
更 前述のようにして、１ｇのセルロースを沸騰炭酸水素ナ
トリウムおよび／または０．０５Ｎ水酸化ナトリウム
（マーセリゼーション：ｍｅｒｃｅｒｉｚａｔｉｏｎ）
中に浸漬することにより処理した。続いて、実施例１−
Ｂおよび実施例３（新規活性化方法）を繰り返した。同
様の結果が得られた。
【００５７】実施例７ ピリジン濃度の変更 セルロースを１０ｍｌのアセトンと２ｍｌのピリジン
（ピリジンの１７％アセトン溶液）中に浸漬する代わり
に、Ａ．ピリジンの５０％アセトン溶液（アセトン６ｍ
ｌ＋ピリジン６ｍｌ）およびＢ．１００％の乾燥ピリジ
ンを用いて実施例１−Ａ（公知活性化方法）を繰り返し
た。セルロースに結合したトシル基の量は、１００％ピ
リジンの場合が５０％ピリジンの場合よりも高かった
（それぞれ、前者が０．０７５ミリモル／ｇ、後者が
０．０５９ミリモル／ｇ）。しかし、実施例１−Ａに記
載された公知活性化方法により得られた量（０．１２５
ミリモル／ｇ）よりも低かった（図１２）。
【００５８】実施例８ ピリジン前処理がトリプシンと
セルロースの相互作用に及ぼす影響 生物活性試薬（例えば、蛋白質類）のセルロースへの結
合に及ぼすピリジンの影響を、次の実験によって調べ
た。 （ａ）アセトンにピリジンを加えないで実施例１−Ａ
（公知活性化方法）を繰り返した。 （ｂ）１ｇのセルロースを２ｍｌのピリジン中で室温で
３０分間浸漬した。次いで、セルロースを多量のアセト
ンで洗ってから風乾した。次に（ａ）を繰り返した。 （ｃ）実施例１−Ａを繰り返した。 （ｄ）１ｇのセルロースを２ｍｌのピリジン中で室温で
３０分間浸漬した。次いで、セルロースを多量のアセト
ンで洗ってから風乾した。次に実施例１−Ａを繰り返し
た。 （ｅ）実施例１−Ｂ（新規活性化方法）を繰り返した。 次に、種々の方法で生成された活性化セルロースを実施
例１に記載された処理方法によってトリプシンと反応さ
せた。図１３−１４は結合トシル基の量と結合トリプシ
ンの活性が次の順序と一致していることを裏付けてい
る：ｅ＞ｄ＞ｃ＞ｂ＞ａ。これらの図は、セルロースを
ピリジン中で前処理することにより結合トリプシンの量
が相対的に増加するとともに結合酵素の活性が増大する
ことを明確に示している。また、これらの図は、結合ト
シル基の最多量と結合トリプシンの最大酵素活性は実施
例１−Ｂに記載された新規活性化方法によって得られた
ことを示している。
【００５９】実施例９ 最初の塩化トシル濃度が結合ト
シル基の量に及ぼす影響 塩化トシルのアセトンに対する種々の濃度（０．２５、
１、４、８、１０、１２ｇ／１０ｍｌアセトン）につい
て、実施例１−Ｂを繰り返した。図１５は、結合トシル
基の最多量は最初の塩化トシル濃度が４ｇ／１０ｍｌア
セトンの場合に得られることを裏付けている。
【００６０】実施例１０ ［塩化トシル」／［ピリジ
ン］の最初のモル比が結合トシル基に及ぼす影響 ［塩化トシル］／［ピリジン］の種々のモル比（１：７
０、１：５０、１：５、１：１、２：１ 塩化トシル／
ピリジン、モル／モル）について、実施例１（公知活性
化方法および新規活性化方法）および実施例８−ｄ（セ
ルロースをピリジンで前処理し、次いで過剰のピリジン
をアセトンで洗い、更に公知の活性化方法によって活性
化）を繰り返した。図１６は、結合トシル基の最少量は
常に公知の活性化方法によって得られていることを示し
ている。しかしながら、［塩化トシル］／［ピリジン］
の最初のモル比が約０．２５までに関しては、新規活性
化方法の場合も実施例８−ｄの場合も同様の結合トシル
基量が得られた。他方、［塩化トシル］／［ピリジン］
の最初のモル比が０．２５を越える場合は、実施例８−
ｄに記載された方法に比べて新規活性化方法において結
合トシル量は有意に高かった。
【００６１】実施例１１ ピリジン以外の有機塩基がト
リプシンとセルロースの相互作用に及ぼす影響 ピリジンの代わりにトリエチルアミンおよび／またはプ
ロピルアミンを用いて実施例１を繰り返した。表１は、
新規活性化方法においてトリエチルアミンおよびプロピ
ルアミンを用いるよりもピリジンを用いることの優位性
を示している。すなわち、結合トリプシンの得られた活
性は、ピリジンの場合は６７２０Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、
トリエチルアミンの場合は８７４Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、
そしてプロピルアミンの場合は０Ｕ活性／ｍｇ蛋白質で
あった。他方、公知の活性化方法においては、有機塩基
を変えたことによる結合トリプシンの活性の相違は存在
しないか、または有意に減少しなかった。すなわち、得
られた結合トリプシンの活性は、ピリジンの場合は７４
３Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、トリエチルアミンの場合は７６
５Ｕ活性／ｍｇ蛋白質、そしてプロピルアミンの場合は
１６７Ｕ活性／ｍｇ蛋白質であった。
【００６２】
【表１】 トリプシンのセルロースへの結合に対する有機塩基の影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トシル基の量 トシル化セルロースの蛋白質結合容量 (mmol/gセルロース) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トリプシンの量 結合トリプシンの酵素活性 (mg/gセルロース) (Ｕ活性／ｍｇ蛋白質) 活性化： 公知の 本発明の 公知の 本発明の 公知の 本発明の 方法 方法 方法 方法 方法 方法 有機塩基 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ピリジン 0.120 3.120 3.0 3.8 743 6720 トリエチル アミン 0.019 0.058 1.7 5.2 765 874 プロピル アミン 0.011 0.056 0.5 0.2 167 0 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００６３】実施例１２ 種々のＮ−複素環化合物がト
リプシンとセルロースの相互作用に及ぼす影響 ピリジンの代わりに次の化合物を用いて実施例１を繰り
返した：ピペリジン、ピリダジン、ピロリジン、ピロリ
ンおよびピロール。表２は、新規活性化方法は公知活性
化方法に比べて、同等のまたはより大きな結合トシル基
量を示しているとともに、より大きな結合トリプシン量
および結合トリプシン活性を示しており、新規活性化方
法が公知の活性化方法方法よりも有意に優れていること
を裏付けている。
【００６４】
【表２】 トリプシンのセルロースへの結合に対するＮ−複素環塩基の影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トシル基の量 トシル化セルロースの蛋白質結合容量 (mmol/gセルロース)−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トリプシンの量 結合トリプシンの酵素活性 (mg/gセルロース) (Ｕ活性／ｍｇ蛋白質) 活性化： 公知の 本発明の 公知の 本発明の 公知の 本発明の 方法 方法 方法 方法 方法 方法 有機塩基 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ピペリジン 0.06 0.1 1.28 1.38 1260 2660 ピリダジン 0.25 1.67 2.65 47.70 4380* 45390* ピロリジン 0.15 0.54 0.78 1.20 740 2400 ピロリン 0.09 0.2 2.17 2.19 1940 2460 ピロール 0.11 0.11 2.18 2.58 440 2380 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− * U活性/gセルロース
【００６５】実施例１３ トリプシンをアルブミンに代えて実施例１をおよび実施
例１２（一部）を繰り返した。表３は、新規活性化方法
は公知活性化方法に比べて、結合アルブミンの量も活性
もともに大きいことを示しており、前者が後者よりも有
意に優れていることを裏付けている。
【００６６】
【表３】 アルブミンのセルロースへの結合に対するＮ−複素環塩基の影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合アルブミンの量 結合アルブミンの活性 (mmol/gセルロース) (溶液から吸着されたビリルビンの％) 活性化： 公知の 本発明の 公知の 本発明の 方法 方法 方法 方法 有機塩基 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ピリジン １．８１ ２．６３ １１．９ ５４．１ ピリダジン ２．３１ ５．６２ ２９．５ ５１．８ ピロール ０．２５ ０．３９ ５．７ １４．７ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００６７】実施例１４ セルロースをアガロースに代えて実施例１及び１２（部
分的に）を繰り返した。表４には、アガロースの場合に
おいて、より多量な結合トシル基、より多量及びより高
活性の結合トリプシンとして示されるように、公知の方
法に比較して新規な活性化方法の著しい優位性が示され
ている。
【００６８】
【表４】 アガロースへのトリプシンの結合に及ぼすＮ−複素環塩基の影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トシル基の量 トシル化アガロースの蛋白質結合容量 (mmol/gアガロース)−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合トリプシン量 結合トリプシン酵素活性 (mg/gアガロース) (Ｕ活性/mg蛋白質) 活性化 公知 本発明 公知 本発明 公知 本発明 有機塩基 方法 方法 方法 方法 方法 方法 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ピリジン 0.10 0.90 1.06 2.13 648 1003 ピリダジン 0.37 2.06 3.41 4.30 1050 3241 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００６９】実施例１５ トリプシンとセルロースとの相互作用に及ぼすピリジン
後処理の影響：実施例１−Ｂに記載の新規な活性化方法
を繰り返した。生成した乾燥トシル活性化セルロース
を、ピリジン中に１ｈｒ、再浸漬することによりピリジ
ン処理した。ピリジンによるこの後ー再処理の目的は、
トシル化セルロースのトシル基の一部を、結合されたピ
リジンに置換することである。次いで、誘導されたセル
ロースをアセトンで十分に洗浄し、室温で乾燥した。結
合トシル基の量はこの処理で半分に減少した（３．１２
から１．４７ｍｍｏｌ／ｇ・セルロース）。
【００７０】ピリジンによる後処理の後にさらに残存ト
シル基を除去するために、誘導されたセルロースを、ｐ
Ｈ１１の０．０５Ｍ重炭酸緩衝水溶液１０ｍｌ中に、室
温で１ｈｒ浸漬した。次いで、誘導されたセルロースを
十分水洗し、さらに風乾した。誘導されたピリジン後処
理セルロースに対するトリプシンの結合は、実施例１記
載の方法によって行った。
【００７１】結合したトリプシンの量はピリジン後処理
により、著しく減少した（３．８ｍｇ／ｇ・セルロース
に代わって、０．５ｍｇ／ｇ・セルロース）が、結合し
た酵素（トリプシン）の活性は著しく増加した（６７４
４から１０２４２Ｕａｃｔ／ｍｇ・蛋白）。ピリジン後
処理を２５℃以上の高温で行った場合も同様な結果をえ
た。
【００７２】実施例１６ トシル化セルロースへのトリプシンの結合に及ぼすｐＨ
の影響 実施例１−Ｂの新規活性化方法によって製造された３ｇ
のトシル化セルロースを各１ｇの３つの塊に分割した。
各塊を下記の水性緩衝液中のトリプシン水溶液（０．５
％、ｗ／ｖ）２．５ｍｌに、室温で１８ｈｒ振盪した。 Ａ． Ｋ／Ｎａリン酸緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ７．５ Ｂ． ＮａＨＣＯ3緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ８．５ Ｃ． ＮａＨＣＯ3緩衝液、０．１Ｍ，ｐＨ９．７
【００７３】表５によれば、結合トリプシンの量はいず
れの緩衝液でも同様であったが、酵素活性はｐＨ８．５
の重炭酸緩衝液が最も高いことが示されている。
【００７４】
【表５】 トシル化セルロースへのトリプシンの結合に及ぼすｐＨの影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 緩衝液 結合トリプシン量 結合トリプシン酵素活性 (mg/gセルロース) (Ｕ活性/mg蛋白質) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− リン酸塩 ０．１Ｍ ｐＨ７．５ ４．６ ３４３５ 重炭酸塩 ０．１Ｍ ｐＨ８．５ ３．８ ６７００ ｐＨ９．７ ４．１ ４１８９ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００７５】実施例１７ トシル化セルロースへのトリプシン結合に及ぼす温度の
影響：次の温度で実施例１６−Ｂを繰り返した。 Ａ． ４℃ Ｂ． ２５℃ Ｃ． ４０℃ 表６は、４℃及び２５℃において同様の結合能及び酵素
活性を示している。一方、４０℃では同様の結合能が得
られたが、結合酵素は変成によりその活性を完全に失っ
た。
【００７６】
【表６】 トシル化セルロースへのトリプシン結合に及ぼす温度の影響 温度 結合トリプシン量 結合トリプシンの酵素活性 （℃） （ｍｇ／ｇ・セルロース） （Ｕ活性／ｍｇ・蛋白質） ４ ３．３ ６７４７ ２５ ３．８ ６７６０ ４０ ２．７ ０
【００７７】実施例１８ トシル化セルロースへのトリプシン結合の動力学 トリプシン溶液と共にトシル化セルロースを異なった間
隔でインキュベーションすることにより、実施例１７−
Ｂを繰り返した。図１７に示した結果によれば、この実
験条件下で、約６時間またはそれ以上の時間で最高のト
リプシン結合に達した。
【００７８】実施例１９ トシル化セルロースへのトリプシン結合に及ぼすトリプ
シン濃度の影響 次のトリプシン濃度において実施例１８を繰り返した。 Ａ． １ｍｇ／ｍｌ Ｂ． ５ｍｇ／ｍｌ Ｃ． ２０ｍｇ／ｍｌ Ｄ． ４０ｍｇ／ｍｌ Ｅ． ８０ｍｇ／ｍｌ 図１８は、４０ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上、即ち、４ｍｇ
／ｇ・セルロースの初期トリプシン濃度について、結合
トリプシンが最高濃度に達したことを示している。しか
しながら、このような実験条件下、例えば、４０ｍｇ／
ｍｌの初期トリプシン濃度において、セルロースに結合
したトリプシンの比率（％）は比較的高く、例えば５ｍ
ｇ／ｍｌの初期トリプシン濃度において、セルロースに
結合したトリプシンの比率は２７％であった。
【００７９】実施例２０ トシル化セルロースへのトリプシンの結合における種々
の加水分解試薬の影響セルロースに結合した残存トシル
基を加水分解することを目的とする下記の試薬の存在下
に、実施例１−Ｂ（新規な活性化方法及びトリプシン結
合）を繰り返した。 Ａ． ０．２Ｍトリス緩衝液、ｐＨ１１ Ｂ． ０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８ Ｃ． ０．０５Ｍ ＮａＮＯ3 緩衝液、ｐＨ１１ Ｄ． ０．１％ エタノールアミン＋ＨＣｌ、ｐＨ８ Ｅ． ０．８Ｍ メルカプトエタノール＋ＮａＯＨ、ｐ
Ｈ８ 表７は、０．０５Ｍ ＮａＮＯ3 緩衝水溶液、ｐＨ１
１の存在において、最高のトリプシン結合量及び酵素活
性が得られたことを示している。
【００８０】
【表７】 トシル化セルロースへのトリプシンの結合における 種々の加水分解試薬の影響 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 加水分解条件 結合トリプシン量 結合トリプシンの酵素活性 (mg/g・セルロース) （Ｕ活性/mg・蛋白質） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− トリス 0.2M，pH11 ２．５ ２６３６ トリス 0.1M，pH8 ３．３ ５０５３ NaHCO3 0.05M，pH11 ３．８ ６７４４ エタノールアミン 0.15M，pH8 ３．４ ２１０８ メルカプトエタノール 0.8M，pH8 １．８ ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００８１】実施例２１ 新規の及び公知の活性化方法によるセルロースへのトリ
プシン以外の酵素の結合 蛋白分解酵素トリプシンを下記の酵素に置換することに
より、実施例１を繰り返した。 Ａ． コラゲナーゼ Ｂ． リゾチーム Ｃ． ヒアルロニダーゼ 図１９は、新規及び公知の２つの活性化方法において、
セルロースに結合した酵素（コラゲナーゼ、リゾチー
ム、ヒアルロニダーゼ）の量は同じであったことを示
す。しかしながら、結合酵素の活性は、新規な活性化方
法でセルロースに結合された酵素について、著しく高か
った。
【００８２】実施例２２ 新規及び公知の活性化方法によりセルロースへの酵素の
逐次結合 実施例１に記載したように、公知及び新規な活性化方法
によって生成されたトシル化セルロース１ｇを、０．５
％のトリプシン（ｗ／ｖ）を含有する０．１Ｍ重炭酸緩
衝水溶液（ｐＨ，８．５）２．５ｍｌに、室温で０．５
ｈｒ浸漬した。次いで、２．５ｍｌのコラゲナーゼ溶液
（０．１Ｍ ＮａＮＯ3 緩衝液中に５ｍｇ／ｍｌ濃
度、ｐＨ８．５）を添加し、さらに反応を１７．５ｈｒ
継続した。次いで、実施例１の方法により、未結合の酵
素を洗浄した。
【００８３】別々に（実施例１及び２１−Ａにより）及
び逐次的に結合した酵素の量と活性とについての比較を
表８に示す。
【００８４】
【表８】 新規及び公知の活性化方法によって生成されたトシル化セルロース に対する別々に又は逐次的に結合された酵素の量及び活性 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 酵素 量 酵素活性 （ｍｇ／ｇ・セルロース） （Ｕ活性／ｍｇ・蛋白質） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 結合 逐次的結合 結合 逐次的結合 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− トリプシン ３．８ ３．２ ６７００ ６８６５ コラゲナーゼ ５．２ ４．３ １１７６ １３６５ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
【００８５】実施例２３ 織物セルロース（医薬用ガーゼ）をセルロースパウダー
に代えた以外は、実施例２１と同様に行った。同様の結
果が得られた。
【００８６】実施例２４ コラゲナーゼ溶液を３種類の酵素：コラゲナーゼ、リゾ
チームおよびヒアルロニダーゼを含む溶液（０.１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ3緩衝液(ｐＨ８.５)中 各酵素 ５ｍｇ／ｍｌ）
に代えた以外は実施例２２と同様に行った。
【００８７】図２０は、新規な活性化法によって調製さ
れた、トシル化セルロースとカップリングした酵素は、
既知の活性化法によって調製された酵素と比較して有意
に高い活性を有することを示す。
【００８８】実施例２５ ジアルデヒドセルロースを有機溶剤で前処理することに
よる、トリプシン結合へのおよび結合した酵素の活性へ
の影響
【００８９】１ｇのジアルデヒドセルロースを室温で３
０分間、２ｍｌピリジンに浸した。続いて、ジアルデヒ
ドセルロースを６×５０ｍｌのアセトンで洗浄し、風乾
させた。続いて、”材料と方法”の記載に従って、トリ
プシンをピリジン前処理したジアルデヒドセルロースに
カップリングさせた。
【００９０】ジアルデヒドセルロースをピリジンの変わ
りにアセトンまたはジオキサンに浸したものについて
も、同様の実験を行った。
【００９１】表９は、トリプシンの結合および結合した
トリプシンの活性は、ジアルデヒドセルロースの上述し
た溶剤での前処理によっては有意に変化しなかった。
【００９２】
【表９】 ジアルデヒドセルロース(ＤＡＣ)の有機溶剤による前処理のトリプシン結合へのおよび結合した酵素の活性への影響 前処理 トリプシンの結合量 結合トリプシンの酵素活性 （ｍｇ／ｇ ＤＡＣ） （Ｕ活性／ｍｇ 蛋白質） − ３.４ ６１６ アセトン ４.２ ６５２ ジオキサン ３.２ ６６５ ピリジン ４.８ ７１４
【００９３】実施例２６ 乾燥セルロース−トリプシン結合体の最大酵素活性へ到
達するまでに要する時間
【００９４】実施例１に従って調製されたトリプシン−
セルロース結合体の乾燥サンプルを室温で０.１Ｍ Ｋ/
Ｎａ リン酸緩衝液 ｐＨ７.５、１:１０（ｗ:ｖ）に浸
すことによって湿らせた。図２１は、水性溶液中約１時
間後に酵素がその最大活性に到達することを示す。
【００９５】実施例２７ 創傷治療のために調製された、種々の活性ポリマーの湿
度の比較
【００９６】表１０は、創傷治療のために調製された、
下記の活性ポリマーの相対湿度を示す。 Ａ．”材料と方法”の記載に従って調製されたジヒドロ
セルロース Ｂ．実施例２５に従って異なる溶剤（アセトン、ジオキ
サンおよびピリジン）で前処理されたジヒドロセルロー
ス Ｃ．”材料と方法”の記載に従って調製されたポリカプ
ロアミド−グルタルアルデヒド Ｄ．公知の活性化法（実施例１-Ａ）に従って調製され
たトシル化セルロース Ｅ．新規な活性化法（実施例１-Ｂ）に従って調製され
た、ピリジンで前処理されたトシル化セルロース Ｆ．実施例１５に従って調製された、ピリジンで前処理
および後処理されたトシル化セルロース
【００９７】表１０は、新規な活性化法に従ってピリジ
ンで前処理されたトシル化セルロース、およびピリジン
で前処理および後処理されたトシル化セルロースに関し
て最も高い湿度が得られたことを示す。
【００９８】
【表１０】 種々の活性ポリマーの相対湿度 活性化ポリマー 前処理 湿度 (セルロースからの％) ジアルデヒドセルロース − ９４ アセトン １０６ ジオキサン １１７ ピリジン １２６ ポリカプロアミド − ８１ グルタルアルデヒド トシル化セルロース − ２１８ （公知の活性化法） ピリジン ３７６ （新規の活性化法） ピリジン ４０５ （前処理および後処理）
【００９９】実施例２８ 酵素とカップリングしたポリマーの安定性と活性
【０１００】下記の結合体ポリマーのそれぞれ２５ｍｇ
を、室温で０.２５ｍｌの０.１ＭＫ/Ｎａ リン酸緩衝液
ｐＨ７.５に浸した。 Ａ．実施例１に記載された、新規なおよび／または公知
の活性化法に従って調製されたセルロースにカップリン
グしたトリプシン Ｂ．”材料と方法”の記載に従って調製されたジアルデ
ヒドセルロース（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）に
カップリングしたトリプシン Ｃ．”材料と方法”の記載に従って調製されたポリカプ
ロアミド（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）にカップリング
したトリプシン
【０１０１】図２２は、新規なおよび／または公知の活
性化法に従ったセルロースにカップリングしたトリプシ
ンの活性は実験時間中変化しなかったことを示す。一
方、ジアルデヒドセルロースおよび／またはポリカプロ
アミドにカップリングしたトリプシンの活性は実験時間
中有意に減少することが観察された。さらに、ポリマー
から、新規なおよび／または公知の活性化法に従って調
製された結合体セルロースの水性溶液に浸出した結合ト
リプシンは検出されなかった。その一方、ＰＡＫＳ−Ｔ
ＲＹＰＳＩＮおよびＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＳＩＮにつ
いて、有意な量の遊離トリプシンおよび／または水溶性
ポリマーに結合したトリプシンが観察された。
【０１０２】実施例２９ 生物活性複合ポリマーの滅菌 ナイロン袋中に密封して入れられた各１００ｍｇの生物
活性複合ポリマーを含有する、風乾した下記のバンデー
ジを２．５メガラドγ線により滅菌した。 Ａ．セルロース（対照） Ｂ．材料および方法中の記述に従って調製したジアルデ
ヒドセルロースに結合したトリプシン（ＤＡＬＣＥＫＳ
−ＴＲＹＰＳＩＮ） Ｃ．材料および方法中の記述に従って調製したポリカプ
ロアミドに結合したトリプシン（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳ
ＩＮ） Ｄ．実施例１で記載した新規な活性法および／または公
知の活性法に従って調製したセルロースに結合したトリ
プシン Ｅ．実施例１５に従って調製した、ピリジンで前処理お
よび後処理したセルロースに結合したトリプシン Ｆ．実施例２２に従って調製した、セルロースに結合し
たトリプシンおよびコラゲナーゼ
【０１０３】図２３は、ジアルデヒドセルロースに結合
したトリプシン（ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）お
よび／またはポリカプロアミドに結合したトリプシン
（ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ）の活性が滅菌処理により
顕著に減少したことを示す。一方、新規な活性法および
／または公知の活性法によりおよび／またはピリジンで
の前処理および後処理によりセルロースに結合した酵素
の活性はγ線滅菌法により顕著には変化しなかった。
【０１０４】実施例３０ 生物活性複合ポリマーの滅菌 各１００ｍｇの生物活性複合ポリマーを含有し、且つ積
層したポリエステル／アルミニウム／ポリエチレン袋に
密封して入れられた実施例２４に記載した通りに調製し
た風乾バンデージを、液体窒素もしくは固体ＣＯ2を含
有するデュワー瓶中または窒素もしくはＣＯ2の不活性
雰囲気中に各々保持しながら、３．０メガラドγ線によ
り滅菌した。
【０１０５】表１１に提示したデータは、本発明の実施
態様に従った多種酵素包帯中のセルロースに結合した酵
素の活性が低温における放射線照射後保持されたことを
示す。一方、公知の方法に従ったセルロースに結合した
酵素の活性は放射線照射により顕著に減少した。例え
ば、公知の方法によるセルロースに結合したリゾチーム
の活性は照射後その最初の活性の３１％のみしか保持し
なかったのに対し、本発明の方法を使用すると照射後の
リゾチーム活性の損失はなかった。
【０１０６】
【表１１】照射後の多種酵素包帯中の結合酵素の相対活性 結合酵素 結合酵素活性（最初の活性＝１００） 公知方法 本発明の方法 トリプシン ８０ １０５ リゾチーム ３１ １０５ コラゲナーゼ −− １００ヒアルロニダーゼ −− １００
【０１０７】実施例３１ 生物活性複合体バンデージを用いる創傷の治療 材料および方法中の記述に従って２５匹のモルモットに
おわせた火傷を火傷後直ちに実施例２９に記載したバン
デージにより処置した。
【０１０８】各包帯を食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）に
最初浸した。次いで、湿ったバンデージを火傷傷口上に
配置しナイロンにより覆い、それにより水の蒸発を防い
だ。それから、２４時間毎に包帯を取り換えた。
【０１０９】火傷治療の間、下記の検討を行った。 Ａ．各２４時間後の顕微鏡写真を撮ることを含めて、火
傷の治癒状況の目視管理 Ｂ．各２４時間後の壊死組織から治癒した火傷傷口の領
域の測定 Ｃ．３日目、５日目および７日目に採取したバイオプシ
ーによる組織学的検討 Ｄ．火傷治療前後の結合酵素の活性。 Ｅ．火傷傷口からバンデージにより吸収された蛋白質の
量
【０１１０】図２４および表１２は、公知活性法により
調製したバンデージならびに／またはＤＡＬＣＥＫＳ−
ＴＲＹＰＳＩＮおよび／もしくはＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳ
ＩＮから構成されるバンデージにより治療した壊死組織
と比較して新規な活性法により調製したバンデージによ
り治療した壊死組織からの火傷の治癒速度が顕著に速か
ったことを示す。
【０１１１】
【表１２】生物活性複合体包帯による壊死組織からの火傷の治癒の動態＊ 治療の 壊死組織から治癒した傷口の領域 日数 （全傷口領域からの％） ジアルデヒド ポリカプロア セルロース−トリプシン セルロース− アミド− トリプシン トリプシン 公知方法 本発明の方法 (DALCEKS- (PAKS- TRYPSIN) TRYPSIN) １ ０ ０〜 ５ ０〜 ５ ５〜 １５ ２ ５〜 １０ ５〜 １０ ５〜 １０ ２５〜 ３５ ３ １０〜 １５ １０〜 ２０ １０〜 １５ ４５〜 ６０ ４ １０〜 ２０ １５〜 ２５ １５〜 ２０ ６０〜 ８０ ５ ２０〜 ３０ ２５〜 ３５ ２５〜 ３０ ８０〜１００ ６ ３０〜 ５０ ３５〜 ５０ ３０〜 ４５ ９０〜１００ ７ ４０〜 ５５ ４０〜 ６０ ４０〜 ５０ １００ １０ ６０〜 ７０ ６０〜 ８０ ５５〜 ７０ １００１５ ８０〜１００ ９０〜１００ ８０〜１００ １００ ＊値は２５匹のモルモットで行った実験の平均値であ
る。
【０１１２】バイオプシー検討の結果は、表１１に示し
たのと同様であった。さらに、これらの検討は新規な活
性法により調製したバンデージを用いて７日間治療した
火傷の肉芽組織も示した。これらの肉芽組織は図２４に
確認もされている。
【０１１３】図２５は、ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩ
Ｎおよび／またはＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮから構成さ
れるバンデージの酵素活性が各々６５％および５４％ま
で治療により減少したことを示す。一方、新規な活性法
および／または公知の活性法により調製したバンデージ
の酵素活性は、火傷治療の間、顕著に変化しなかった。
【０１１４】火傷傷口からバンデージ内に吸収された蛋
白質の量は、火傷治療後各バンデージを５ｍｌの食塩水
中で振盪することにより検討した。次いで、水溶液中の
蛋白質の量を２８０ｎｍにおける紫外線吸収スペクトル
により決定した。火傷傷口から吸収した最も多量の蛋白
質は新規な活性法により調製した生物活性複合体バンデ
ージについて見いだされた（表１３）。
【０１１５】
【表１３】火傷治療中にバンデージ内に吸収された蛋白質の量 バンデージ 火傷傷口から吸収された 蛋白質の量（ｍｇ／包帯） ジアルデヒドセルロース−トリプシン １５．０ （ＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） ポリカプロアミド−トリプシン ２２．６ （ＰＡＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ） セルロース−トリプシン １８．３ （公知方法） セルロース−トリプシン◆ ４２．３ セルロース−ピリジン−トリプシン＊ ３４．５セルロース−トリプシン−コラゲナーゼ◆ ６５．４ ＊ピリジンで前処理及び後処理したセルロース ◆本発明の方法
【０１１６】実施例３２ 多種酵素バンデージを用いる創傷の治療 非処理セルロースおよび、実施例２４に記載した通り
に、本発明の実施態様に従って調製した多酵素セルロー
ス包帯を用いて実施例３１を繰り返した。図２６は、本
発明のこれらの多酵素セルロース包帯を使用したとき
に、壊死組織が非処理セルロース包帯と比較して顕著に
より速い治癒速度を発揮することを示す。
【０１１７】本発明を特定的に記載したが、当業界の熟
達者は多くの変更と修正をなし得ることを了解するであ
ろう。従って、本発明は、特定的に記載した実施態様に
制限されると解釈されるべきでなく、本発明の範囲、精
神および概念は特許請求の範囲を参照することにより一
層容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アルデヒド基含有ポリマーへのアミノ
リガンド、例えば蛋白質のカップリングを示す。
【図２】図２は、セルロースの過ヨウ素酸塩酸化、およ
びその結果得られるジアルデヒドセルロースへのアミノ
リガンド、例えば蛋白質のカップリングを示す。
【図３】図３は、アミノリガンド、例えば蛋白質の共有
カップリングに関するヒドロキシル含有ポリマーの活性
化を示す。
【図４】図４は、塩化トシルおよび塩化トレシル手段に
よる、アミノリガンド、例えば蛋白質の、ヒドロキシル
基含有ポリマーへの結合を示す。
【図５】図５は、塩化トシルおよび塩化トレシル手段に
よる、アミノリガンド、例えば蛋白質とセルロースの相
互作用を示す。
【図６】図６は、ポリサッカロイドの加水分解および該
加水分解産物へのグルタルアルデヒドの結合を示す。
【図７】図７は、アミノリガンド、例えば蛋白質のヒド
ロキシル基によるセルロースへのカップリングに関す
る、公知の方法および本発明の一つの態様にしたがった
方法を示す。
【図８】図８は、セルロース中のピリジンの含有を示
す。
【図９】図９は、公知の方法および本発明の一つの態様
にしたがった方法により形成された、トシル化セルロー
スにカップリングさせたトリプシンの量と活性を比較す
る。
【図１０】図１０は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化セル
ロース粉末にカップリングさせたトリプシンの量と活性
を比較する。
【図１１】図１１は、トレシル基の量、および、公知の
方法および本発明の一つの態様にしたがった方法により
形成された、トレシル化セルロースにカップリングさせ
たトリプシンの量と活性を比較する。
【図１２】図１２は、公知の方法におけるピリジン濃度
の変化により形成された、セルロースにカップリングさ
せたトシル基の量を比較する。
【図１３】図１３は、ピリジンで予め処理されたセルロ
ースの、結合トシル基量に対する影響、およびトシル化
セルロースにカップリングさせたトリプシンの量および
活性に対する影響を比較する。
【図１４】図１４は、本発明の一つの態様にしたがった
活性化方法の、カップリングされたトシル基の量に対す
る影響、およびカップリングされたトリプシンの量およ
び活性に対する影響を示す。
【図１５】図１５は、塩化トシル濃度の、セルロースに
結合したトシル基の量に対する影響を示す。
【図１６】図１６は、塩化トシル／ピリジンのモル比
の、セルロースに結合したトシル基の量に対する影響を
示す。
【図１７】図１７は、トシル化されたセルロースに結合
したトリプシンの動力学を示す。
【図１８】図１８は、トリプシン濃度の、トシル化され
たセルロースへの結合に対する影響を示す。
【図１９】図１９は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化され
たセルロースにカップリングしたさまざまな酵素の量お
よび活性を示す。
【図２０】図２０は、公知の方法および本発明の一つの
態様にしたがった方法により形成された、トシル化され
たセルロースに連続してカップリングした酵素の活性を
示す。
【図２１】図２１は、乾燥したセルロース−トリプシン
複合体の完全な酵素活性を得るのに必要な時間を示す。
【図２２】図２２は、異なるポリマーに結合したトリプ
シンの活性を時間の函数として示す。
【図２３】図２３は、ガンマ放射線により滅菌した後の
トリプシン複合ポリマーの酵素活性を示す。
【図２４】図２４は、やけどの創傷において、本発明の
一つの態様にしたがって、セルロースにカップリングし
たトリプシンのＤＡＬＣＥＫＳ−ＴＲＹＰＳＩＮ法を比
較する。
【図２５】図２５は、創傷の治療後の、トリプシン結合
ポリマーの酵素活性を示す。
【図２６】図２６は、非処理セルロース包帯と、本発明
の一つの態様にしたがって製造された多種酵素セルロー
ス包帯との比較をする。 やけどの創傷の治療：新規な方法により製造された、非
処理セルロース包帯と多種酵素（トリプシン、リゾチー
ム、コラーゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ）セルロース包
帯との比較を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図８】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１０】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１１】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１２】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１３】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１８】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１９】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２０】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２１】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２２】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２３】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/00 47/48 Ｚ Ａ６１Ｌ 15/44 Ｃ０８Ｂ 15/06 7433−4Ｃ Ａ６１Ｌ 15/03

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 セルロース、セルロース以外の多糖、お
    よび複数の遊離ヒドロキシ基を含む多糖以外のポリマー
    から選択される少なくとも１つのポリマーを前活性化す
    る方法であって、該ポリマーをヒドロキシ基に対する反
    応体の不在下に、ピリジン、ピロールおよびピリダジ
    ン、その部分的に水素化された類似体、その完全に水素
    化された類似体、ならびにＣ１−６アルキル、Ｃ１−６
    アルコキシ、フッ素、塩素、臭素およびトリフルオロメ
    チルから選択される少なくとも１つの置換基を含む前記
    のいずれかより好ましくは選択される少なくとも１つの
    Ｎ−複素環化合物と接触させることからなる上記方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に定義する少なくとも１つのポ
    リマー中のヒドロキシ基の誘導体を製造する方法であっ
    て、まず請求項１の方法によって該ポリマーを前活性化
    し、次いで該前活性化されたポリマーを該ポリマー中の
    遊離ヒドロキシ基に対する少なくとも１つの反応体と反
    応させることからなり、ここで、該反応体は非置換水素
    原子を含むアミノ基と反応できる少なくとも１つの官能
    基を少なくとも潜在的に含むという事実によりさらに特
    徴付けられている上記方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも１つの反応体がハロゲン化シ
    アン、炭酸エステル、ハロゲン化ｓ−トリアジン、ハロ
    ホルム化物、スルホン酸ハロゲン化物および核結合活性
    ハロゲン原子を含むＮ−複素環化合物から選択される請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 少なくとも１つの非置換Ｎ−結合水素原
    子を含む少なくとも１つのアミノ化合物の、請求項１に
    定義する少なくとも１つのポリマーとの複合体を製造す
    る方法であって、以下の工程（ａ）、（ｂ）および
    （ｃ）のうちの少なくとも工程（ａ）および（ｂ）、す
    なわち： （ａ）該ポリマー中の遊離ヒドロキシ基に対する少なく
    とも１つの反応体との反応によって少なくとも１つのポ
    リマーを誘導体化し、ここでこのような反応体は該少な
    くとも１つのアミノ化合物と反応できる少なくとも１つ
    の官能基を少なくとも潜在的に含むという事実によりさ
    らに特徴付けられており、（ｂ）このようにして誘導体
    化されたポリマーを少なくとも１つのアミノ化合物と反
    応させ、そして所望するならば、（ｃ）ポリマー結合ヒ
    ドロキシ基をこのような反応体と反応させた産物である
    いかなるポリマー結合基をも既知の方法によってヒドロ
    キシ基に再変換する、からなる上記方法において、 このような少なくとも１つの反応体と反応するための少
    なくとも１つのポリマーの容量を増加するために、工程
    （ａ）に先立ち請求項１の方法によって前活性化工程を
    実施する改良を特徴とする方法。
  5. 【請求項５】 少なくとも１つの反応体がハロゲン化シ
    アン、炭酸エステル、ハロゲン化ｓ−トリアジン、ハロ
    ホルム化物、スルホン酸ハロゲン化物および核結合活性
    ハロゲン原子を含むＮ−複素環化合物から選択される請
    求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 蛋白質中の少なくとも１つのアミノ基
    と、請求項１に定義する少なくとも１つのポリマーとの
    複合体を製造する方法であって、ここで該ポリマーは粉
    末状および織物ウエブ状から選択され、以下の工程
    （ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの少なくとも工程
    （ａ）および（ｂ）、すなわち： （ａ）該ポリマー中の遊離ヒドロキシ基に対する少なく
    とも１つの反応体との反応によって少なくとも１つのポ
    リマーを誘導体化し、ここでこのような反応体は該少な
    くとも１つのアミノ基と反応できる少なくとも１つの官
    能基を少なくとも潜在的に含むという事実によりさらに
    特徴付けられており、（ｂ）このようにして誘導体化さ
    れたポリマーを少なくとも１つのアミノ基と反応させ、
    そして所望するならば、（ｃ）ポリマー結合ヒドロキシ
    基をこのような反応体と反応させた産物であるいかなる
    ポリマー結合基をも既知の方法によってヒドロキシ基に
    再変換する、からなる上記方法において、 このような少なくとも１つの反応体と反応するための少
    なくとも１つのポリマーの容量を増加するために、工程
    （ａ）に先立ち請求項１の方法によって前活性化工程を
    実施する改良を特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 少なくとも１つの反応体が、ハロゲン化
    シアン、炭酸エステル、ハロゲン化ｓ−トリアジン、ハ
    ロホルム化物、スルホン酸ハロゲン化物および核結合活
    性ハロゲン原子を含むＮ−複素環化合物から選択され；
    および／または少なくとも１つの蛋白質がトリプシン、
    キモトリプシン、リゾチーム、コラゲナーゼ、アルブミ
    ンおよびヒアルロニダーゼから選択され；および／また
    は少なくとも１つのポリマーがバンデージ、パッチまた
    は類似の創傷カバーへの使用に適した織物ウエブ状であ
    る、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 例えば、少なくとも１つのポリマーに結
    合したトリプシン、キモトリプシン、リゾチーム、コラ
    ゲナーゼ、アルブミンおよび／またはヒアルロニダーゼ
    などの蛋白質の形で少なくとも１つのアミンを提供する
    工程を含む方法によって、請求項１に定義する少なくと
    も１つのポリマーから製造された創傷に適用するための
    粉末、バンデージ、パッチまたは類似のカバー。
  9. 【請求項９】 少なくとも１つのポリマーがセルロース
    およびポリビニルアルコールから選択される、請求項８
    に記載の創傷に適用するためのカバー。
  10. 【請求項１０】 Ｎ−複素環化合物との処理による前活
    性化に付され、かつこのように前活性化されたポリマー
    と、少なくとも１つの非置換Ｎ−結合水素原子を含む少
    なくとも１つのアミノ化合物との複合体である、請求項
    １に定義するポリマー。
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