JPH11511355A - ヘパリン化生体材料の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血液接触表面上に固定されたヘパリンを有する医学的装置を製造する改良法であって、ヘパリンを、ヘパリン１分子につき２個以下の糖単位と反応するのに充分な過ヨウ素酸塩と一緒に、約４．５〜８の範囲のｐＨを有する緩衝溶液中で混合する上記改良法。この混合物を、遮光しながら少なくとも３時間反応させた後、固定されたアミン基に対して加えた。これは、天然の官能基数個だけのアルデヒドへの変換が、表面に対して結合したヘパリン分子の抗血栓生体有効性をよりよく保存するので、過剰の過ヨウ素酸塩を用いた後に、グリセロールの添加によって望ましい時点で反応を停止させることが含まれた先行技術方法にまさる改良である。本発明はまた、安定な液体として貯蔵できるし且つ数日後にアミノ化表面に対して直接的に適用できるヘパリンおよび過ヨウ素酸塩の反応した混合物を提供することにより、ヘパリンを乾燥し且つ還元する先行技術工程を回避する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリン化生体材料の製造法 発明の背景 本発明は、多糖基を有する生体分子をアミノ化表面に対して結合することによ る様々な表面の生体適合性の増強、そして特に、ヘパリンの共有結合によって生 体材料の向上した血液適合性を与えることに関する。 生体内または上で代用血管、合成および眼内レンズ、電極、カテーテル等とし てまたは外科手術若しくは透析を助けるように身体に連結するための体外装置と して役立つ医学的装置は周知である。しかしながら、このような生体材料の医学 的装置での使用は、急速なトロンボゲン作用を含めた不利な生体応答を刺激する ことがありうる。種々の血漿タンパク質は、プラスチック表面上で血小板および フィブリン沈着を開始する場合にある役割を果たしている。これらの作用は、血 流を妨げる血管収縮をもたらし、そして続いて起こる炎症性反応は、医学的装置 の機能の減損をもたらすことがありうる。 「生体材料」は、体液中へ実質的に不溶性であるおよび生体内または上に置か れるようにまたは体液に接触するように設計され且つ構築される材料として定義 することができる。理想的には、生体材料は、血液凝固、組織死、腫瘍形成、ア レルギー反応、異種生体反応（拒絶反応）または炎症性反応などの生体中での望 ましくない反応を引き起こさないであろうし；予定された目的の機能を果たすの に必要な強度、弾性、透過性および柔軟性などの物理的性質を有するであろうし ；容易に精製し、製造しそして滅菌することができるし；それが生体内にまたは 生体と接触して植込まれた状態にある間中、その物理的性質を実質的に維持し且 つ機能するであろう。 本明細書中で用いられる通り、生体材料の固体表面は、それが、生きた生物に 対する最終的に有益な作用を伴って、生きた生物の体液および／または組織と接 触して機能するまたは存在することができる場合に「生体適合性」として特徴付 けられる。宿主生物の障害を減少させるためには、長期生体適合性が望まれる。 生体材料の向上した生体適合性への一つのアプローチは、成長因子、抗微生物薬 、 抗トロンボゲン薬および細胞結合タンパク質などの種々の「生体分子」をその材 料の表面に対して結合することである。 ヘパリンなどの多糖類の生体材料に対する固定は、生体−および血液適合性を 向上させるのに広く研究されてきた。ヘパリン化材料の低下したトロンボゲン性 に関与する機序は、ＡＴ−IIIによるセリンプロテアーゼ（血液凝固酵素）の失 活を促進するヘパリンの能力にあると考えられる。その過程において、ＡＴ−II Iは、ヘパリン中の充分に定義された五糖類配列と複合体を形成し、コンホメー ション変化をするので、トロンビンなどのセリンプロテアーゼの活性部位と共有 結合を形成するＡＴ−IIIの能力が増強される。次に、形成されたＴＡＴ複合体 は、多糖から遊離し、２回目の失活の後にヘパリン分子を脱離する。 通常、生体材料に対するヘパリンの共有結合固定は、その生体材料とヘパリン 上の官能基（−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＮＨ₂）との間のカップリングを達成しう るように該材料を活性化させることから成る。トロンビン耐性表面は、必ずしも これらの過程を用いて得られない。ヘパリンは、ヘパリン上の極めて多量の官能 基のために、該表面に対してあまりに強く結合されうるし、またはカップリング は、ヘパリン上の活性な五糖類配列と生体材料との間の結合に起因することがあ り、ＡＴ−IIIの活性化を妨げ、したがってプロテアーゼの触媒的脱活を妨げる 。抗トロンボゲン表面を真に得るためには、生体分子の適切な固定が重要である 。ラーム（Larm）は、（米国特許第4,613,665号において）一部分に遊離末端ア ルデヒド基を有する分解したヘパリン分子を生じる制御された亜硝酸分解工程に よってヘパリンを活性化する方法を示した。この形のヘパリンは、アミノ化され た表面に対して還元的アミノ化法で共有結合することができる。その分子は分解 され、そしてその結果として溶液中で触媒活性をあまり示さないが、表面に対す るこの種類のヘパリンの終点結合は、該表面に対する生体材料の適切な提示によ って真の抗トロンボゲン性をもたらす。この様式で、該分子はＡＴ−IIIおよび 凝固酵素と自由に相互作用して、血栓および微小塞栓の生成を妨げる。 ヘパリンのその天然の官能基によるまたは末端アルデヒド基によるカップリン グの他に、過ヨウ素酸塩酸化によってヘパリンの鎖内に無作為に導入されたアル デヒドによるカップリングもまた記載された。ソロモン（Solomon）ら（米国特 許第4,600,652号および第4,642,242号において）およびフー（Hu）ら（米国特許 第4,720,512号；第4,786,556号；第5,032,666号；および第5,077,372号において ）は、過ヨウ素酸塩酸化後のヘパリンをアミノ化ポリウレタンに対してカップリ ングさせて、安定して結合したヘパリンの添加量が高い材料を得、発明者らはそ の材料の優れた抗トロンボゲン性を請求の範囲に記載した。しかしながら、それ ら請求の範囲を支持する実験データは示されなかった。ヘパリンの過ヨウ素酸塩 酸化は、過ヨウ素酸ナトリウムの緩衝水性溶液中で行われた。その酸化反応を、 グリセロールの添加によって停止させた後、その溶液を窒素下で蒸発乾固させた 。カップリングのために、乾燥ヘパリンを適当な緩衝液中で還元した。しかしな がら、ソロモンらおよびフーらによる酸化反応で用いられた過ヨウ素酸塩の量は 、ヘパリンを過度に酸化させることがあり、これが抗トロンボゲン性を低下させ るであろうということが注目された。更に、反応を停止させるグリセロールの使 用は、ホルムアルデヒドを生じることがあり、これがヘパリンのカップリングを 一層難しくしうることが注目された。更に、酸化したヘパリンを乾燥させること は不都合であり、しかもその工程に費用が加算されることが注目された。 したがって、本発明の目的は、活性な共有結合した生体分子をその表面上に有 する生体適合性表面を提供することである。 更に、本発明の目的は、アミノ化された支持体に対して生体分子を容易にカッ プリングさせることができる多糖基を有する生体分子を酸化する方法を提供する ことである。 更に、本発明の目的は、後の使用のために液体の形で貯蔵できる酸化生体材料 を提供することである。 発明の概要 これらのおよび他の目的は、本発明によって達成される。本発明者は、血液に 接触する表面上に固定されたヘパリンを有する医学的装置を製造する改良法を発 見したが、ここにおいて、ヘパリンは、ヘパリン１分子につき２個以下の糖単位 と反応するのに充分な過ヨウ素酸塩と一緒に、約４．５〜８の範囲のｐＨを有す る緩衝溶液中で混合される。特に、過ヨウ素酸ナトリウムが用いられる過ヨウ素 酸塩である場合、ヘパリンの過ヨウ素酸塩に対する重量比は約３０：１またはそ れ未満である。この混合物を、遮光しながら少なくとも３時間反応させた後、過 ヨウ素酸塩−ヘパリン反応をグリセロールで停止させることなく、固定されたア ミン基に対して加えた。固定アミンに対する適用は、ヘパリン上のアルデヒド基 と固定アミン基との間の反応を引き起こして、シッフ塩基を形成する。水素化シ アノホウ素のような穏やかな還元剤を用いて、そのシッフ塩基を安定化させて第 二アミンにする。 これは、天然の官能基数個だけのアルデヒドへの変換が、表面に対して結合し たヘパリン分子の抗血栓生体有効性をよりよく保存するので、過剰の過ヨウ素酸 塩を用いた後に、グリセロールの添加によって望ましい時点で反応を停止させる ことが含まれた上で論及された先行技術方法にまさる改良である。本発明はまた 、安定な液体として貯蔵できるし且つ数日後にアミノ化表面に対して直接的に適 用できるヘパリンおよび過ヨウ素酸塩の反応した混合物を提供することにより、 ヘパリンを乾燥し且つ還元する先行技術工程を回避する。 この方法は、結合する表面が高アミン密度を有する場合に特に有用である。例 えば、固定アミン基が表面上のポリアルキレンイミンの固定コーティングによっ て与えられる場合、そのポリアルキレンイミン上には、結合されるヘパリン分子 上に２個以上の反応性ジアルデヒド基を有する必要がない（そして表面の生物活 性に不都合である）ように多数の潜在的結合部位が存在する。 発明の詳細な説明 本方法において、医学的装置は、向上した生体適合性を有する血液適合性表面 を提供することができる。医学的装置により、それらの作業中に血液に接触する 表面を有し、その血液が引続き患者の循環系で用いられる装置を意味する。これ には、例えば、血液に接触した後にそれを患者に戻す血液酸素化装置、血液ポン プ、血液センサー、血液を運ぶのに用いられるチューブ材料等のような外科手術 で用いるための体外装置を挙げることができる。これにはまた、血管または心臓 中に植込まれる血管移植片、ステント、ペースメーカーリード線、心臓弁等のよ うなヒトまたは動物体内で血液に接触して植込まれたエンドプロテーゼを挙げる ことができる。これには、更に、監視または修復のために血管または心臓中に入 れられるカテーテル、ガイドワイヤ等のような一時的血管内使用のための装置を 挙げることができる。 改良された抗血栓性表面は、装置の表面に対する共有結合によるヘパリンの固 定によって与えられる。ヘパリンにより、本発明者は、抗凝固性を有する直鎖陰 イオンムコ多糖類の異種の群であるグリコサミノグリカンを意味する。本明細書 中で用いられるヘパリンは、抗凝固薬としてヘパリンの製造に慣用的な方法で組 織から得られた標品でありうる。ヘパリン標品は、所望ならば、ヒト組織を含め た様々な哺乳動物組織から得ることができる。概して、ブタまたはウシ起源が用 いられ、ヘパリン出発物質に好ましい組織はブタ腸粘膜である。この組織源から 製造されたヘパリン標品は商業的に入手可能である。 本発明の本質的態様は、ヘパリン分子上のアルデヒド基に対して結合できる固 定アミン基を有する装置の血液接触表面を提供することである。このようなアミ ン基は、当業者に知られている方法によって与えられることができる。例えば、 アミン官能性スペーサー分子は、１個および／または複数の生体分子を固定する のに用いられてきた。スペーサーは、生体分子の活性部位を、効率よく体液に接 触するように支持体から離れて外面に保持されることを確実にする。スペーサー は、概して、分子の対向する末端に位置した少なくとも２個またはそれ以上の反 応性官能基を有する有機分子から誘導される。このような基は、スペーサーを固 体表面に対しておよび生体分子に対してカップリングできる結合ビヒクルとして 役立つ。例えば、ナラヤナン（Narayanan）らの米国特許第5,132,108号において 、コポリマー表面は、水蒸気プラズマ媒質の存在下において高周波電界をそれに 施すことによって高周波プラズマ処理を施された。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ ）および１−（３−ジメチルプロピル）−３−カルボジイミド（ＥＤＣ）カップ リング剤の水性溶液を、高周波プラズマ放電で改質されたポリウレタン表面に対 して適用した。次に、その表面に確保された抗トロンボゲン薬を有するポリマー 表面を提供するために、ヘパリンおよびＥＤＣの水性溶液をＰＥＩ処理表面に対 して適用した。しかしながら、ポリウレタン表面の不均一性を考慮すると、多官 能性スペーサー分子でのコーティングでも確実ではない。 更に別の適用範囲は、例えば、ゴランダー（Golander）らの米国特許第4,565, 740号またはラームらの米国特許第5,049,403号にしたがって与えられることがで きる。これら特許の最初のものでは、ポリマー陽イオン界面活性剤（例えば、ポ リアルキレンイミン）およびジアルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）の複 合体を支持体材料上に吸着させる。これら特許の第二のものでは、ポリアミンを 支持体表面上に吸着させ、そしてクロトンアルデヒドと架橋させる。次に、陰イ オン材料の中間層を含めた多重コーティングを適用して、有効なコーティングを 得る。しかしながら、これら架橋コーティングは、表面上への吸着および表面に 対するイオン結合に頼り、表面に対してコーティングを充分に結合させていない かもしれない。本発明の発明者は、本明細書中に援用される発明者の米国特許第 5,229,172号；第5,308,641号；および第5,350,800号における多層コーティング の使用によって生体材料の生体適合性の向上に寄与した。例えば、米国特許第5, 229,172号において、本発明者は、種々のスペーサーおよび生体分子を結合する のに用いることができるポリマー表面上のグラフトしたアクリルアミドの基層を 提供することによってポリマー材料の表面特性を改質する方法を発見した。また は、米国特許第5,308,641号において、本発明者は、アミノ化支持体に対して共 有結合した且つアルデヒド基中で二官能性である架橋剤と架橋したポリアルキレ ンイミンを含む改良されたスペーサー材料を発見した。または、米国特許第5,35 0,800号において、本発明者は、カルボキシル基を有する生体材料をアミノ化固 体表面に対してカルボジイミドによって結合した後、そのカルボキシル基の二官 能性を選択的に回復する方法を発見した。 金属またはガラス表面上では、金属またはガラス支持体とグラフトされた基層 との間を共有結合させる有機構造が存在しないので、このような多層コーティン グの基層の結合が課題でありうる。他には、アミノシランを表面に付着するよう に適用した後、そのアミノシランに対して該アミノシランのアミン官能性によっ て生体分子を結合することによって金属およびガラスに対する結合の問題が取り 組まれてきた。これは、ローランド（Rowland）ら発行の米国特許第5,355,433号 で見ることができ、ここでは、アミノシランを用いてヘパリン分子を酸化タンタ ル表面に対して付着させている。アミノシランはまた、エリクソン（Eriksson） ら発行の米国特許第4,118,485号において、ガラスまたは金属表面に対するヘパ リン分子の結合に関して開示されている。 好ましくは、固定されたアミン官能基は、ポリアルキレンイミンを支持体に対 して共有結合させている本発明者の米国特許第5,308,641号で開示されたのと同 様に与えられる。ポリアルキレンイミンにより、本発明者は、１−非置換イミン 、１−置換塩基性イミン、活性イミン（１−アシル置換イミン）、異性体オキサ ゾリン／オキサジン等のようなアジリジンおよびアゼチジンモノマーから発生し た 水溶性親水性ポリアミンを含むことを意味する。本発明で用いられるポリアルキ レンイミンは、好ましくは、高度に分岐状であり、したがって、第一、第二およ び第三アミン基を有する。例えば、古典的陽イオン鎖成長重合によって単独でか またはエチレンイミンとの共重合に適した他のモノマーと一緒に重合したエチレ ンイミンは、本発明で用いられるであろう。このようなポリエチレンイミンの好 ましい分子量は、約６０，０００〜約１，０００，０００でありうる。 本発明の臨界的態様は、平均的なヘパリン分子上にある限られた数の反応性ア ルデヒド基を与えるように制御されたヘパリン分子の酸化である。これは、ヘパ リンの緩衝水性溶液に対して過ヨウ素酸塩を加え、そしてそれをヘパリンと反応 させることによって行われる。いずれの水溶性過ヨウ素酸塩も用いることができ るが、好ましくは、過ヨウ素酸塩は過ヨウ素酸ナトリウムなどのアルカリ金属過 ヨウ素酸塩である。必要な過ヨウ素酸塩の量は、ヘパリン分子中の２個以下の糖 単位と反応するのに充分な量である。糖によって、本発明者は、グリコサミノグ リカンの構造を構成する塩基性二糖類残基を意味する。用いられる過ヨウ素酸塩 が過ヨウ素酸ナトリウムであり且つ用いられるヘパリンが商業的に入手可能な注 射用の形のヘパリン（すなわち、１６０ｕ／ｍｇの活性を有するそのナトリウム 塩）である場合、ヘパリンの過ヨウ素酸塩に対する重量比は、ヘパリン分子中の ２個以下の糖単位と反応するように約３０：１またはそれ未満であるべきである 。その他の過ヨウ素酸塩化合物および他の形のヘパリンに必要な過ヨウ素酸塩の 量を慣用的な計算および実験によって決定できることは当業者に理解されるであ ろう。 ヘパリンと過ヨウ素酸塩との間の反応は、水性緩衝溶液中で起こる。概して、 ｐＨが約４．５〜８の中性〜僅かに酸性範囲の緩衝液を用いることができ、急速 な反応が望まれる場合、より低いｐＨ（例えば、ｐＨ＝４．５の酢酸緩衝液）が 好ましいが、より長い貯蔵寿命を有するより遅い反応には、より中性のｐＨ（例 えば、ｐＨ＝６．８８のリン酸緩衝液）が好ましい。ｐＨ４．５の酢酸緩衝液で は、その反応は約３時間進行するはずであるが、ｐＨ６．８８のリン酸緩衝液で は、反応は約１６時間進行するはずである。所望ならば、反応した溶液を、引続 き使用前に約５℃で貯蔵してよい。反応した混合物の中性ｐＨでの貯蔵安定性は 、２〜１４日間延長されうる。 グリセロールまたはグリコールを用いて反応を停止させて混合物中の過剰の過 ヨウ素酸塩を除去した後にヘパリンを乾燥させることを必要とした先行技術組成 物とは異なり、本発明の反応性混合物は、グリセロールまたはグリコール組成物 を添加することなく且つ乾燥させることなく、コーティングされる表面上の固定 アミン基に対して加えることができる。好ましくは、反応混合物を最初に希釈し 、そしてそのｐＨを、混合物のｐＨがカップリング反応に好ましいｐＨまで上昇 するように調整する。例えば、反応混合物は、酢酸緩衝溶液（ｐＨ＝４．５）中 で希釈できる。水素化シアノホウ素ナトリウムなどの穏やかな還元剤をその希釈 混合物に対して加えて、酸化ヘパリン上の反応性アルデヒド基と処理される表面 上に固定されたアミン官能基との間に形成された結合を減少させる。次に、処理 される表面を希釈混合物中に浸漬し且つ反応を完了させるのに充分な温度および 時間でインキュベートする。例えば、その反応は、５０℃で約１〜３時間以内に 完了しうる。 任意の改良として、固定されたヘパリンをその上に有する表面を、フィブリノ ーゲンの凝固を更に妨げるようにトロンビンの作用を阻害しうる吸着タンパク質 分子と一緒に提供することができる。例えば、ヘパリンによって活性化されるこ とが知られている抗トロンビンIIIは、トロンビンを失活させる。そのタンパク 質は、装置を患者血液と接触させる直前に（例えば、医学的装置を植込む直前に 外科医によって）固定されたヘパリンを含む表面上に吸着させることができるし 、または吸着されたタンパク質を含む固定ヘパリンを、固定ヘパリンおよび吸着 タンパク質をその上に含む装置を乾燥させた後、慣用的な手段によってその装置 を包装し且つ滅菌することによって滅菌装置中で提供することができる。 次の実施例は、このようなヘパリンコーティングをどのように金属表面上に与 えることができるかを示す。 実施例１ コイルタンタルワイヤ片を、２％マイクロクリーン（Microclean）中で３０分 間超音波洗浄した後、脱イオン水中で３０分間超音波処理した。この最後の工程 を繰返した後、そのコイルをイソプロパノール中で洗浄し且つ５０℃で２０分間 乾燥させた。 清浄なコイルを、トリクロロビニルシラン（メルク（Merck）ダルムシュタッ ト、ＦＲＧ）のキシレン中２％溶液中で６０秒間旋回させた後、キシレン中で６ ０秒間、イソプロパノール中で６０秒間、水中で、そして最後にアセトン中で６ ０秒間洗浄した。次に、そのコイルを一晩中自然乾燥させた。 次に、乾燥したコイルを、３５重量％の新鮮な蒸留アクリル酸および５重量％ アクリルアミドの水性溶液１５ｍｌで満たされたガラス管中に入れた。モノマー 溶液１５ｍｌに対して、硝酸セリウムアンモニウム（０．１Ｍ）の硝酸（０．１ Ｍ）中溶液０．９ｍｌを加えた。脱気を約１８ｍｍＨｇで３〜５分間行った後、 超音波処理１０分間および追加のインキュベーション３５〜４０分間を全て室温 で行った。次に、グラフトされた試料を脱イオン水によって５０℃で１０回洗浄 した後、５０℃で一晩中インキュベーションした。得られた試料は、トルイジン ブルー溶液中に浸漬した場合に濃い染色を示した。 クロトンアルデヒド３７５ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナトリウム中溶液（ｐＨ＝９ ．１）を製造し、そして１０分間撹拌後、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、６０， ０００のＭ_wを有するＢＡＳＦからのPolymin SN）を加えた。更に５分間混合し た後、コイルを架橋ＰＥＩ溶液中で振とうしながら１時間インキュベートした。 脱イオン水で洗浄した後、そのコイルを、０．５重量％ＰＥＩ（Polymin SN）の ０．１Ｍホウ酸ナトリウム中溶液（ｐＨ＝９．１）と１０分間接触させた。水溶 性カルボジイミド（１−（３−ジエチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ イミド．ＨＣｌ）を０．０５Ｍの濃度で加えた。カップリングを、振とうしなが ら１時間進行させた後、脱イオン水で１０分間洗浄した。 酸化ヘパリンは、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．８８；０．０２５ＭＫ₂ ＨＰＯ₄＋ＮａＨ₂ＰＯ₄ ^*２Ｈ₂Ｏ）中、０．１６５ｍｇ／ｍｌのＮａＩＯ₄を５ ｍｇ／ｍｌの天然ヘパリン（アクゾー（Akzo））に対して加えることによって製 造された。遮光下で一晩中酸化後、得られたヘパリン溶液を、０．４Ｍアセテー トｐＨ＝４．６中において１：２０の比率で希釈した。０．１ｍｇ／ｍｌのＮａ ＣＮＢＨ₃を希釈ヘパリンに対して加え、そしてコイルをこの溶液中において５ ０℃で２時間インキュベートした。脱イオン水、１Ｍ ＮａＣｌおよび再度水で 洗浄して、ゆるく結合したヘパリンを除去した後、コイルをトルイジンブルーと 一緒にインキュベートしたが、これはまさにライラック色の染色を与え、成功し たヘパリン化が示された。更に別の生物活性試験もまたうまく行われて、予め 吸着された抗トロンビンIIIの活性化によってトロンビンを脱活させるヘパリン 化表面の能力を確認した。生物活性はまた、１％ドデシル硫酸ナトリウムを用い て５０℃で一晩中刺激後にうまく試験されて、金属支持体上のコーティングの優 れた安定性が示された。 本発明を具体的な実施態様および実施例に関して上に記載してきたが、発明が 必ずしもそのように制限されないということ、並びに本発明の概念から逸脱する ことなく多数の他の実施態様、実施例、用途、その実施態様、実施例および用途 からの変更および逸脱を行うことができるといことは当業者に理解されるであろ う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘンドリクス，マルク オランダ王国エヌエル−6432 エールルヴ ェー ゲレーン，ラームボウストラート 118 (72)発明者 フーアシュ，ベネディクテ オランダ王国エヌエル−6211 イェーセー ホーンスブローク，アシュター・ド・モ ーレン ７ (72)発明者 キャハラン，パトリック・ティー オランダ王国エヌエル−6166 カーエー ゲレーン，エレガストストラート 10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 血液接触表面上に固定されたヘパリンを有する医学的装置を、該血液接 触表面上に固定された遊離アミン基を与え；ヘパリンを過ヨウ素酸塩と反応させ てヘパリン上にアルデヒド基を与え、そしてその反応をグリセロールの添加によ って停止させ；反応したヘパリンを乾燥させ；該乾燥ヘパリンを緩衝溶液中で還 元し、そして該還元ヘパリンを、ヘパリン上のアルデヒド基が該遊離アミン基と 反応し且つヘパリンを該血液接触表面上に固定するように該固定アミン基に対し て加える工程によって製造する方法において、その改良は、 （ａ）ヘパリンを、ヘパリン１分子につき２個以下の糖単位と反応するのに充 分な過ヨウ素酸塩と一緒に、約４．５〜８の範囲のｐＨを有する緩衝溶液中で混 合し； （ｂ）その混合物を遮光しながら少なくとも３時間反応させ； （ｃ）反応した混合物を、過ヨウ素酸塩−ヘパリン反応をグリセロールで停止 させることなくおよび混合物を乾燥させることなく、固定されたアミン基に対し て加えることを含む。 ２． 固定アミン基を、ポリアルキレンイミンの固定されたコーティングによ って与える請求項１に記載の方法。 ３． 反応した混合物を、固定アミン基を加える前の２〜１４日間貯蔵する請 求項１に記載の方法。 ４． 過ヨウ素酸塩が過ヨウ素酸ナトリウムである請求項１に記載の方法。 ５． ヘパリンの過ヨウ素酸塩に対する重量比が約３０：１またはそれ未満で ある請求項４に記載の方法。 ６． 反応した混合物を固定アミン基に対して加える前に、それを穏やかな還 元剤と混合する工程を更に含む請求項１に記載の方法。 ７． 還元剤が水素化シアノホウ素ナトリウムである請求項６に記載の方法。 ８． 還元剤および反応した混合物の混合物のｐＨを約４．６に調整する請求 項７に記載の方法。