JPH073421B2 - 組織型およびウロキナ−ゼ型プラスミノ−ゲン活性化因子の阻害物質に対する診断検定 - Google Patents

組織型およびウロキナ−ゼ型プラスミノ−ゲン活性化因子の阻害物質に対する診断検定

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JPH073421B2 JP60503138A JP50313885A JPH073421B2 JP H073421 B2 JPH073421 B2 JP H073421B2 JP 60503138 A JP60503138 A JP 60503138A JP 50313885 A JP50313885 A JP 50313885A JP H073421 B2 JPH073421 B2 JP H073421B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を認識し
これに選択的に結合する受容体および標識手段を含む生
化学試薬に関し、より詳しくは血液および他の生物学試
料中のプラスミノーゲン活性化因子阻害物質の検出およ
び定量のための生化学試薬および診断装置に関する。
発明の背景 内皮細胞は脈管床の内腔面を内張りし、局所付着フイブ
リンの特異的タンパク質分解の分解作用に積極的役割を
演ずると思われている（トッド（Todd），ジヤーナル・
オブ・パソロジカル・バクテリオロジー（J.Pathol.Bac
teriol.），78,281（1959）；アストラップ（Astru
p），「化学的フイブリン溶解および血栓崩壊の進歩（P
rogress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysi
s）」，デビドゾン（Davidson）ほか編,vol.3,pp.1〜5
7,レーバン・プレス・ニユーヨーク（1978））。このプ
ロセスを開始し、制御する内皮の潜在能力は、組織型お
よびウロキナーゼ型両方の分子（レビン（Levin）ほ
か、ジヤーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell B
iol.），94,631（1982）；ロスクトフ（Loskutoff）ほ
か、ブラッド（Blood），62,62（1983））を含むプラス
ミノーゲン活性化因子（PAs）を合成し、放出するその
能力により強調される（ロスクトフ（Loskutoff）ほ
か、プロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ス
テート・オブ・アメリカ〔Proc.Natl.Acad.Sci.（US
A）〕，74,3903（1977）；シエプロ（Shepro）ほか、ト
ロンボシス・リサーチ（Thromb.Res.），18,609（198
0）；モスカテリ（Moscatelli）ほか、セル（Cell），2
0,343（1980）；ラウグ（Laug），トロンボシス・アン
ド・ヘモシタシス（Thromb,Haemostasis），45 ,219（1981）；ブーイス（Booyse）ほか、トロンボシ
ス・リサーチ（Thromb,Res.），24,495（1981））。内
皮細胞はまたフイブリン溶解の阻害物質を生ずることが
できる（ロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロシーデイ
ング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・ア
メリカ〔Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）〕，前掲；レビン
（Levin）ほか、トロンボシス・リサーチ（Thromb.Re
s.），15,869（1979）；ロスクトフ（Loskutoff）ほ
か、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.），256,4142（1981）；ドスネ（Dosn
e）ほか、トロンボシス・リサーチ（Thromb.Res.），1
2,377（1978）；エメイス（Emeis）ほか、バイオケミカ
ル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミユニケ
ーションズ（Biochem.Biophy.Res.Commun.），110,392
（1983）；ロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロシーデ
イング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・
アメリカ〔Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）〕，80,2956（1
983）；レビン（Levin），プロシーデイング・オブ・ザ
・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ〔Proc.N
atl.Acad.Sci.（USA）〕，80,6804（1983））。
これらの阻害物質は脈管壁のフイブリン溶解系の制御に
重要な調整役割をするけれども、それらの特異性、作用
方式、または生化学的性質についてはほとんど知られて
いない。これらの阻害物質が実際に内皮細胞により合成
されるとの結論は、培養細胞が血清含有培地からプロテ
アーゼ阻害物質に結合し、インターナリゼーションでき
るという最近の報告（コーエン（Cohen），ジヤーナル
・オブ・クリニカル・インベステイゲーシヨン（J.Cli
n.Invest.），52,2793（1973）；パスタン（Pastan）ほ
か、セル（Cell），12,609（1977）；ロールリッチ（Ro
hrlich）ほか、ジヤーナル・オブ・セル・フイジオロジ
ー（J.Cell Physiol.），109,1（1981）；マクフアーソ
ン（Mc Pherson）ほか、ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），256,11330（198
3））により多少不明瞭にされる。
組換えDNA手法による組織型プラスミノーゲン活性化因
子（ｔ−PA）を無制限量産生する可能性は臨床的および
商業的の両方で非常に高い関心を引いた。比較的不活性
な分子がフイブリン自体によって非常に有効な血栓崩壊
剤へと転化することから、ｔ−PAがフイブリン−血小板
血栓自体に局在化したときのみ活性酵素として存在でき
ることが示唆される。従って、ｔ−PAはウロキナーゼ型
プラスミノーゲン活性化因子およびストレプトキナーゼ
よりも非常に特異性の血栓崩壊剤であると思われる。
ｔ−PAとフイブリンとの間の相互作用はｔ−PAの天然阻
害物質がこの系の調整に必要でない、すなわち、調整
は、フイブリンの形成／溶解により達成されるので、存
在しないとの議論を提起した。ヒト血液中のそのような
阻害物質が存在することによって、遺伝子的に作られた
ｔ−PAを基にした特異的、有効かつ安全な血栓崩壊プロ
グラムを設計する試みが複雑化することは明らかであ
る。少くとも、用量、処置の時間および効力のような計
算は予測および（または）調節することが困難であろ
う。この問題は阻害物質の濃度が個人毎に異なれば殊に
重大であろう。
血漿中のｔ−PAの特異性阻害物質の存在は若干異議のあ
る問題である（コーレン（Collen），トロンボシス・ア
ンド・ヘモスタシス（Thromb.Haemostasis.），43,77
（1980））。事実、コルニンガー（Korninger）ほか、
トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.Haemost
as.），46,662（1981）に、血漿に加えたｔ−PAの活性
が２分のインビボ半減期（コルニンガー（Korninger）
ほか、トロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.H
aemostas.），46,658（1981））に比較して90分のイン
ビトロ半減期を有することが報告された。これらの観察
に基いてこれらの著者は血漿によるｔ−PAの阻害が生理
学的に重要でないと結論した。
その結論は最近クルイトフ（Kruithof）ほか、プログレ
ス・イン・フイブリノリシス（Prog.in Fibrinolysi
s），６,362（1983）に異議を提起された。シミロウス
カ（Chmielewska）ほか、トロンボシス・リサーチ（Thr
omb.Res.），31,427（1983）には血漿中のｔ−PAの急速
阻害物質の存在に対する直接的証拠が最近報告された。
すべての場合に、この抗−ｔ−PA活性が、血栓症問題を
有するかまたはその発現のおそれのある患者、すなわち
多分ｔ−PA療法を受ける人、の血漿中に検出された。こ
の発見は、コルニンガー（Korninger）ほか、トロンボ
シス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.Haemostas.），
前掲、が「正常」人の血漿のみを調べたので彼らがその
ような活性の検出に失敗したと説明することができる。
今日までｔ−PA阻害物質に対するこれらの報告は若干の
人の血液中に検出された「活性」の定性的記述にすぎな
い。
近年、培養内皮細胞中に抗フイブリン溶解剤が検出され
た（ロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロシーデイング
・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・ジ・ユナ
イテッド・ステート・オブ・アメリカ〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.（USA）〕，80,2956（1983））。この阻害物質は
主要内皮細胞産生物であり、それがフイブリン非依存性
（ウロキナーゼ型）およびフイブリン依存性（組織型）
の両プラスミノーゲン活性因子（PA）の活性を中和でき
るのでプラスミノーゲン活性化因子の阻害物質であると
思われる。ヒト血小板が免疫学的に類似の阻害物質を含
むこと（エリクソン（Erickson）ほか、ヘモスタシス
（Haemostasis.），14（１）,65（1984））および生理
学的関連刺激例えばトロンビンに対する反応において他
の血小板タンパク質、例えば血小板因子４とともに阻害
物質がそれらのヒト血小板により放出されることが観察
されたことはヒト生物学におけるこの阻害物質の潜在的
重要性を強調する。
ロスクトフ（Loskutoff）ほか、前掲、により見出され
た阻害物質はコンカナバリンＡアフイニテイークロマト
グラフイーと分取用ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）との組合せによる
ウシ大動脈内皮細胞ならし培地から精製され、4.5〜５
の等電点を有する50,000ダルトンの分子量の１本鎖タン
パク質であることが示された。
発明の概要 本発明は生化学試薬並びにそれを調製および使用する方
法、並びに該試薬を使用する診断装置を意図する。該生
化学試薬には（ａ）動物宿主中で産生したプラスミノー
ゲン活性化因子阻害物質に対する抗体のような受容体、
すなわち、抗−プラスミノーゲン活性化因子、および
（ｂ）標識手段が含まれる。
本発明の１観点において、生化学試薬は（ａ）標識手段
および（ｂ）動物宿主中で産生した多クローン性または
単クローン性抗体であることができる受容体からなる。
標識手段および受容体は単一分子であることができ、あ
るいは複数の個々の分子からなることができる。受容体
は、組織型またはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活
性化因子に結合して阻害する特定プラスミノーゲン活性
化因子阻害物質に結合する。標識手段は受容体を標識
し、そのようにして検定される試料例えば血栓症疾患を
有する患者の血清、中の阻害物質の存在を示す。本発明
の試薬の受容体は、組織型（ｔ−PA）およびウロキナー
ゼ型（ｕ−PA）のプラスミノーゲン活性化因子に結合す
る阻害物質に選択的に結合する。
本発明の他の観点において、生化学試薬に使用する多ク
ローン性受容体を形成する方法が意図される。該方法に
は、（ａ）阻害物質に対する抗体の産生を誘発する十分
な量でプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を動物宿主
に投与する段階、該抗体は前記阻害物質に対する受容体
である、（ｂ）前記抗体を含む抗血清を免疫宿主から採
取する段階、および（ｃ）抗血清から受容体を回収する
段階が含まれる。
本発明のなお他の観点は生化学試薬を形成する方法に関
する。該方法には段階（ａ）〜（ｃ）として記載した多
クローン性受容体を形成する段階が該受容体と標識手段
とを組合せる追加の段階（ｄ）とともに含まれる。
上記両方法はまた、段階（ａ）の十分な成長期間、例え
ば１〜２週間、後の、しかし段階（ｂ）の前に同一阻害
物質の第２注入を宿主に行なって抗体の産生を高める段
階を含むことができる。
本発明にはまた上記方法により生じた多クローン性受容
体が含まれる。
さらに本発明の観点において、検定すべき試料中のプラ
スミノーゲン活性化因子阻害物質の存在および量を検出
する固相検出法が意図される。該方法には、 （ａ）前記試料を分析する固体マトリックスを準備する
段階、 （ｂ）前記阻害物質に結合する第１結合試薬を前記マト
リックス上に添付して、固相支持体を形成する段階、前
記第１結合試薬は、前記阻害物質に対する多クローン
性または単クローン性受容体であるか、組織型プラス
ミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子からなる群から選択されるプラスミノ
ーゲン活性化因子であり、 （ｃ）分析すべき液体試料のアリコートを前記固相支持
体と混合して、第１固−液相混合物を形成する段階、 （ｄ）前記第１結合試薬が前記試料中に存在する阻害物
質と結合して、固相結合阻害物質−試薬複合体を形成す
るに十分な時間、前記第１固−液相混合物を保持する段
階、 （ｅ）前記第１固−液相混合物の固相と前記液相とを分
離する段階、 （ｆ）前記固相支持体上に結合した前記固相結合阻害物
質−試薬複合体の前記阻害物質部分と結合する第２結合
試薬の液体水溶液を混合して、第２固−液相混合物を形
成する段階、前記第２結合試薬は、前記工程（ｂ）で使
用しなかった前記第１結合試薬の他方であり、 （ｇ）前記第２結合試薬が前記複合体中に存在する前記
阻害物質と結合するに十分な時間（典型的には約２〜４
時間）前記第２固−液相混合物を保持する段階、 （ｈ）前記第２固−液相混合物の固相と液相とを分離す
る段階、及び （ｉ）前記阻害物質と結合した第２結合試薬の量を測定
することによって、阻害物質の量を決定する段階、が含
まれる。
さらに本発明には哺乳動物の診断装置、例えばキット、
が含まれる。該キットには活性成分として本発明の生化
学試薬およびｔ−PAまたはｕ−PAを含む少くとも１つの
パッケージが含まれる。生化学試薬には標識手段および
検定すべき試料と混合したときに試料中に存在するｔ−
PA阻害物質に選択的に結合し、阻害物質の存在および量
を示す多クローン性受容体が乾燥、溶液または分散形態
で含まれる。系中に含むことができる指標群には放射性
元素、生物活性酵素、またはNMR活性元素が含まれる。
診断装置はまたミクロタイターストリップ、例えば12ウ
エルを１列に含むもの、であることができる固体マトリ
ックスを含むことができる。存在するｔ−PAまたはｕ−
PAは好ましくは固体マトリックスに結合している。
診断装置はさらに検定結果を比較するための標準、並び
に、殊にウエルの洗浄、試料の希釈または標識試薬の希
釈のための種々の緩衝剤を乾燥または液体形態で含むこ
とができる。
本発明の生化学試薬の使用にはプラスミノーゲン活性化
因子例えば組織型またはウロキナーゼ型のプラスミノー
ゲン活性化因子と結合（錯化）する特定プラスミノーゲ
ン活性化因子阻害物質の検出および定量が含まれる。そ
のような試薬の殊に好ましい使用はインビトロプロトコ
ルにおけるプラスミノーゲン活性化因子阻害物質の検出
に関する。
本発明は若干の利益および利点を提供する。
本発明の１利点は本発明の生化学試薬および診断装置が
非常に特異性であることである。生物試料はしばしば多
数のフイブリン溶解阻害物質を含有する。既存の検定は
一般に、試料のプラスミノーゲン活性化因子またはプラ
スミンの活性を低下する能力を測定するので、それらを
これらの検定により識別することが困難である。対照的
に、本発明の殊に好ましい診断装置は特定プラスミノー
ゲン活性化因子に結合する阻害物質のみを検出する。
本発明の他の利点は、本発明の試薬が定量的であって、
PAに結合する機能的に活性な阻害物質の量の測定を与
え、阻害物質の活性でないことである。従って、試薬は
例えば酵素検定のように塩またはpHにおける変動により
影響されないであろう。
本発明の利点の１つは本発明の診断装置がミクロタイタ
ープレートのウエルに結合した組織型プラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−PA）またはウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｕ−PA）を用いることができ、従っ
て迅速かつ再現可能な方法で容易に多数の試料をスクリ
ーニングするのに適する。
本発明の他の利点は本発明の生化学試薬および診断装置
が機能的に活性な阻害物質、すなわちｔ−PAまたはｕ−
PAに結合する阻害物質、のみを測定することがである。
種々の疾患において変動しやすいのはこの形態である。
内皮細胞および血小板により放出された阻害物質は１つ
は活性、１つは不活性の２形態で存在する。不活性形態
は変性剤、例えばSDSおよびグアニジンで処理すること
により活性化することができる。従って、本発明の試薬
および診断装置の追加利点はそれらを種々の試料中の活
性および不活性両阻害物質の相対量の測定に使用できる
ことである。
本発明の他の利点および利益は以下の本発明の説明、図
面および請求の範囲から当業者に容易に明らかになろ
う。
図面の簡単な説明 本発明の開示の一部を形成する図面において、 第１図はコンカナバリンＡ−セフアロース（Sepharos
e）上のアフイニテイークロマトグラフイーによるなら
し培地（CM）の分画を例示するグラフである。融合ウシ
大動脈内皮細胞（BAE）からCM1リットルを後記のように
10ミリリットル（ml）のコンカナバリンＡ−セフアロー
スカラムに通した。カラムは順次（ａ）１モル（Ｍ）Na
Cl、（ｂ）0.001Mリン酸ナトリウム、（ｃ）0.5Mα−メ
チル−Ｄ−マンノシドを含有する0.01Mリン酸ナトリウ
ム、および（ｄ）0.5Mα−メチル−Ｄ−マンノシドおよ
び1M-NaClを含む0.01Mリン酸ナトリウムで洗浄した。挿
入図はすべてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）およびクーマシーブリリ
アントブルー〔バイオラッド（Bio Rad,Richmond,CA）
製〕による染色後示された出発物質（CM）、並びにプー
ルした貫通（Ｉ）、α−メチルマンノシド低塩（II）お
よび高塩（III）画分のタンパク質プロフイルを示す。
第２図はSDS-PAGE後のコンカナバリンＡ画分II（上記）
の阻害物質活性の検出を例示するグラフである。コンカ
ナバリンＡピークII物質（第１図）をプールし、後に詳
記するようにチューブゲル中SDS-PAGEにより分画した。
ゲルをスライスし、各切片を緩衝液中へ溶離し、次いで
溶離液を125I−フイブリンプレート法（後記）により測
定してそのｕ−PA媒介フイブリン溶解活性の阻害能力に
ついて試験した。挿入図はスラブゲル上のSDS-PAGEによ
り分画し、クーマシーブリリアントブルーで染色するこ
とにより、およびリバースフイブリンオートグラフイー
によりそれぞれ分析した類似の試料のタンパク質プロフ
イル（レーン１）および阻害物質活性（レーン２）を示
す。
第３図はSDS-PAGEによる精製した阻害物質の分析を示す
リバースフイブリンオートグラムのフオトコピーであ
る。阻害物質活性の大部分を含むゲル抽出物（第２図に
示した画分49〜52）をプールし、後に詳記するように、
7.5〜20パーセント勾配スラブゲル上で分析した。電気
泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（レーン
１）、過ヨウ素酸−シッフ（Sciff）試薬（レーン２）
で染色し、またはリバースフイブリンオートグラフイー
により阻害物質活性について試験した（レーン３）。
第４図はBAE阻害物質によるPA活性の阻害を例示するグ
ラフである。精製した阻害物質の増加量を、2.5単位/ml
のヒトｕ−PA（０）またはｔ−PA（●）とともに37℃で
５分間保温した。125 I−プラスミノーゲンを加えてさらに60分間保温を続
けた。反応は試料を３％のSDSおよび５％の２−メルカ
プトエタノールの存在下に100℃に３分間加熱すること
により停止させた。種々の試料の125I−プラスミノーゲ
ンをその特有の重鎖および軽鎖に分裂する能力を、ムッ
ソニ（Mussoni）ほか、トロンボシス・リサーチ（Throm
b.Res.），34,241（1984）のようにSDS-PAGEおよびオー
トラジオグラフイーにより評価した。定量は乾燥ゲルか
ら125I−標識プラスミノーゲンおよひプラスミン鎖を切
り取り、それをガンマカウンター中で計数することによ
り行なった。データは阻害物質が存在しないときに観察
されたプラスミノーゲン開裂に関するパーセントとして
示される。
第５図は125I−標識ｔ−PAのBAE阻害物質に対する結合
を示すオートラジオグラムのフオトコピーである。125I
−標識ｔ−PAを精製阻害物質（１ミクログラム/ml）の
不在下（レーン１）または存在下（レーン２）に37℃で
30分間保温した。反応は試料緩衝液の添加により停止
し、次いで試料をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフイ
ーにより分析した。
第６図はBAE阻害物質およびプロテアーゼネキシン（pro
teasenexin）の相対安定性を例示するグラフである。精
製阻害物質（20ミクログラム/ml）および精製プロテア
ーゼネキシン（160ミクログラム/ml）を、後に詳記する
ようにpH2.7で（Ａ）または0.025パーセントのSDSの存
在下に（Ｂ）37℃で60分間保温した。試料は検定緩衝液
３容量の添加により中和し、検定緩衝液中へ希釈し、残
存阻害物質活性について125I−フイブリンプレート検定
（後記）により試験した。対照試験において、PBSをそ
れぞれグリシンおよびSDSの代りに用いた。データは阻
害物質を欠くｕ−PA対照に関する百分率として示され
る。試験した試料には非処理（０）および処理（●）プ
ロテアーゼネキシン、並びに非処理（△）および処理
（▲）BAE阻害物質が含まれる。
第７図はＬ〔3,4,5−3H〕ロイシン標識コンカナバリン
Ａ画分IIのSDS-PAGEを例示するグラフである。コンカナ
バリンA10ピークII試料のアリコート（225ミクロリット
ル）をチューブゲル中のSDS-PAGEにかけた。電気泳動後
ゲルをスライスし、各切片を、後に詳記するように緩衝
液中へ抽出した。生じたゲル抽出物を後記のように125I
−フイブリンプレート法による阻害物質活性（●）およ
びシンチレーション計数による放射能（○）について15
試験した。
第８図はSDSゲルから抽出したＬ〔3,4,5−3H〕ロイシン
標識阻害物質のアルカリ性PAGEを例示するグラフであ
る。SDS-PAGE後の阻害物質画分（第７図に示したスライ
ス抽出物51〜54）をプールし、アルブミンと組合せて10
0ミクログラム/mlの最終濃度になし、0.5％のトライト
ン（Triton）Ｘ−100を含むPBSに対して透析した。次い
で試料をチューブゲル中アルカリ性PAGEにより分画し、
前記第７図のように放射能（○）および阻害性物質活性
（●）の測定を行なった。
第９図はCMからの阻害物質の免疫沈降を示すオートラジ
オグラムのフオトコピーである。クローン化BAEからの
Ｌ〔3,4,5−3H〕ロイシン標識CMを、後に詳記するよう
に、精製阻害物質に対する抗血清を含むタンパク質Ａ−
セフアロースビーズとともに保温した。固定化した錯体
を0.25Mのトリス（Tris）、2.2パーセントのSDS、2.5％
（v/v）の２−メルカプトエタノール、および20％のグ
リセリン（pH6.5）とともに37℃で１時間保温すること
によりビーズから抽出した。抽出物をスラブゲル上のSD
S-PAGEにより分画し、オートラジオグラフイーにより試
験した。レーン１は出発物質（CM）を示し、レーン２は
免疫上澄みを示し、レーン３は免疫沈降物を示す。矢印
はリバースフイブリンオートグラフイーにより示された
（図示しない）阻害物質活性の位置を示す。
第10図は種々の濃度のｔ−PAで被覆したミクロタイター
ウエルに対する精製阻害物質の結合を例示するグラフで
ある。ポリ塩化ビニル（PVC）プラスチックウエルを、
ミクログラム／ミリリットル（μg/ml）の単位で示した
濃度でリン酸塩緩衝塩水（PBS）中のｔ−PA（50ミクロ
リットル／ウエル）とともに４℃で約18時間保温した。
ウエルを洗浄し、ウシ血清アルブミン（BSA）でブロッ
クし、希釈緩衝液中の精製阻害物質とともに２時間保温
した:20ナノグラム（ng）/ml,●……●;50ng/ml,○……
○;100ng/ml,△……△。ウエルの洗浄後、結合した阻害
物質をウサギ抗−阻害物質受容体（1:100希釈）ととも
に37℃で２時間保温し、次いで125I−ヤギ抗−ウサギIg
G（1.5×105cpm/ウエル）とともに37℃で２時間保温し
た。個々のウエルそれぞれ中の結合した放射能をガンマ
カウンター中で測定し、結合のために提供されたものに
関する百分率として示した。
第11図はｔ−PAで被覆したウエルに結合する阻害物質の
速度論を例示するグラフである。PVCプラスチックウエ
ルをｔ−PA（PBS中1ng/ml,●……●）またはBSA（PBS中
1ng/ml,○……○）の50ミクロリットルとともに４℃で
一夜保温した。ウエルを洗浄し、BSAでブロックし、希
釈緩衝液中の精製阻害物質（100ng/ml）とともに示した
時間37℃で保温した。ウエルを洗浄した後、結合した阻
害物質を第10図について示したように検出した。
第12図は精製阻害物質の検出に対する第１または第２抗
体の保温時間の影響を示すグラフである。PVCプラスチ
ックウエルを、第10図について記載したようにｔ−PA
（閉図形）またはBSA（開図形）で被覆し、洗浄し、ブ
ロックし、精製阻害物質（50ng/ml）とともに１時間保
温した。ウエルをウサギ抗−阻害物質受容体（Rb∝In）
（1:100希釈、○，●）とともに示した時間保温し、次
いで125I−ヤギ抗−ウサギIgG（125Gt∝RbIgG）（1.5×
105cpm/ウエル）とともに２時間保温した。あるいはウ
エルをウサギ抗−阻害物質受容体とともに２時間保温
し、125I−ヤギ抗−ウサギIgGの保温時間を変化させた
（△，▲）。
第13図は精製阻害物質の検出に対するウサギ抗−阻害物
質受容体の量を変化させる影響を例示するグラフであ
る。PVCプラスチックウエルを、第10図について記載し
たように、ｔ−PAで被覆し、洗浄し、ブロックし、示し
た量の阻害物質（50ng/ml）とともに保温した。次いで
ウエルを種々の希釈（1:50,●;1:75,△;1:100,■;1:20
0,□;1:500,○）のウサギ抗−阻害物質受容体とともに3
7℃で２時間保温した。結合した抗体−阻害物質−ｔ−P
A錯体を第10図について記載したように検出した。
第14図は精製阻害物質の検出に対する125I−ヤギ抗−ウ
サギIgGの量を変化させる影響を例示するグラフであ
る。PVCプラスチックウエルは、第10図について記載し
たようにｔ−PAで被覆し、洗浄し、ブロックし、阻害物
質（50ng/ml）とともに保温した。ウエルはウサギ抗−
阻害物質受容体（1:75）とともに37℃で２時間保温し
た。洗浄後、ウエルを125I−ヤギ抗−ウサギIgG2.5×10
4（△）、５×104（○）、１×105（□）、1.5×10
5（■）、２×105（▲）、３×105（●）cpm、とともに
37℃で２時間保温した。
第15図は精製阻害物質およびBAEならし培地中に存在す
る阻害物質の、第10〜14図により確立された殊に好まし
い条件下に阻害物質結合検定を用いた検出に対する用量
−反応曲線を例示するグラフである。ｔ−PA被覆ウエル
を、示した濃度の精製阻害物質（●）または連続希釈ウ
シ大動脈内皮細胞（BAE）ならし培地（○）とともに37
℃で１時間保温した。結合した阻害物質を、第10図につ
いて記載したようにウサギ抗−阻害物質受容体（1:7
5）、次いで125I−ヤギ抗−ウサギIgG（2.5×104cpm）
で定量した。
第16図は両対数プロットで示した第15図の精製阻害物質
に対する標準用量−反応曲線を例示するグラフである。
第15図に示した精製阻害物質に対する結合データを用い
た。
第17図はリバースフイブリンオートグラフイーにより検
出した阻害物質の用量−反応曲線を示すオートグラムの
コピーである。種々の濃度の精製阻害物質を、後に詳記
するようにSDS-PAGEおよびリバースフイブリンオートグ
ラフイーにより分析した。レーン1,0.5ng;レーン2,1ng;
レーン3,2.5ng;レーン4,5ng;レーン5,10ng。分子量標識
が示されている。
第18図は固定したｔ−PAに対する阻害物質の結合に対す
る外因PAの影響を例示するグラフである。精製阻害物質
（50ng/ml）を示した濃度のｔ−PA（●）、ｕ−PA（uk,
▲）またはストレプトキナーゼ（SK,■）とともに37℃
で１時間保温した。阻害物質のｔ−PAに対する結合を、
後に詳記する阻害物質結合検定で定量した。
第19図は正常なヒト血漿および血清の阻害物質活性をng
/mlで例示するグラフである。健康な供血者から静脈穿
刺により採取した血液試料を酸−クエン酸添加デキスト
ロース（ACD）中へ置いた。血漿および血清は各血液試
料から調製し、阻害物質活性を、後に詳記する阻害剤結
合検定で測定した。
発明の詳細な説明 本発明は生化学試薬並びにそれを調製および使用する方
法、並びに該試薬を使用する診断法に関する。該試薬に
は（ａ）動物宿主中で産生されたプラスミノーゲン活性
化因子阻害物質に対する受容体、および（ｂ）標識手段
が含まれる。
I.一般的説明 用いた「プラスミノーゲン活性化因子阻害物質」という
用語はプラスミノーゲン活性化因子の作用を阻害または
阻止するタンパク質を示すことを意味する。「プラスミ
ノーゲン活性化因子」は血液、殊に血漿中に存在するプ
ラスミノーゲンを活性化し、それを血液凝固のフイブリ
ン溶解系におけるプラスミンに転化するタンパク質であ
る。本発明に有用なプラスミノーゲン活性化物質には組
織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）およびウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−PA）が含
まれる。用いた「ウロキナーゼ型」はヒト以外の哺乳動
物中に見出されたウロキナーゼおよびその同族タンパク
質を示すことを意味する。
用いた「受容体」という用語は抗原リガンドに結合する
生物学的活性分子を示すことを意味する。本発明の受容
体分子は、抗体、免疫動物の腹水液または血清中に見出
されるような事実上精製された形態において事実上完全
な抗体、であり、または後記するように、FabおよびＦ
（ab′）2抗体部分のような抗体のイデイオタイプ含有
ポリペプチド部分である。
受容体分子の生物学的活性はそれらの水性媒体中の混合
物で、少くとも生理学的pH値およびイオン強度における
その抗原リガンドに対する受容体の結合により証明され
る。好ましくは受容体はまた約５〜約９のpH値範囲内
で、蒸留水ないし約１モル塩化ナトリウムのようなイオ
ン強度で抗原リガンドに結合する。
抗体のイデイオタイプ含有ポリペプチド部分（抗体結合
部位）はイデイオタイプを含み、リガンドに結合する抗
体分子の部分であり、抗体のFab、Fab′、およびＦ（a
b′）2部分が含まれる。抗体のFabおよびＦ（ab′）2部
分は当該技術によく知られ、周知の方法によりパパイン
およびペプシンのそれぞれ事実上完全な抗体に対する反
応により調製される。例えば、テオフイロポラウスほか
（Theofilopolous and Dixon）に対する米国特許第4,34
2,566号参照。抗体のFab′部分もまたよく知られ、Ｆ
（ab′）2ジスルフイト結合を、例えばメルカプトエタ
ノールにより還元し、次に還元されたシステイン残基を
ヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化すること
により調製される。完全な抗体は好ましい受容体であ
り、本発明の受容体分子の例として使用される。
本発明に有用な受容体は多クローン性受容体である。
「多クローン性受容体」（Pab）は抗体を産生する種々
の抗体産生細胞を免疫分子の複数のエピトープにクロー
ン化することにより生じた受容体である。
多クローン性受容体を産生する宿主として本発明におい
て有用な非ヒト温血動物には家禽（例えばニワトリまた
はハト）、多くの平胸類鳥群（例えばエミュー、ダチョ
ウ、ヒクイドリまたはモア）あるいは哺乳動物（例えば
犬、猫、サル、ヤギ、豚、牛、馬、ウサギ、モルモッ
ト、ラット、ハムスター、またはマウス）を含むことが
できる。好ましい宿主動物はウサギである。
受容体は指標標識手段または「標識基」あるいは「ラベ
ル」とともに使用される。標識基またはラベルは特定阻
害物質が受容体に結合したことを測定する手段として受
容体とともに使用される。
「指標標識手段」、「標識基」または「ラベル」という
用語は受容体に結合され、または別個に使用される単一
の原子および分子で、単独にまたは追加の試薬とともに
使用されても、これらの原子または分子を含めるために
使用される。そのような標識群またはラベルはそれ自体
免疫化学によく知られ、単にそれらが異なった新規な受
容体、方法および（または）系とともに使用される限り
本発明の一部を構成する。
指標標識手段は抗体または抗原に、それらを変性するこ
となく化学的に結合し、有用な免疫けい光トレーサーで
あるけい光色素（染料）を形成するけい光標識剤である
ことができる。適当なけい光標識剤はイソシアン酸フル
オレセイン（FIC）、イソチオシアン酸フルオレセイン
（FITC）、ジメチルアミノナフタレン−Ｓ−スルホニル
クロリド（DANSC）、イソチオシアン酸テトラメチルロ
ーダミン（TRITC）、リッサミンローダミンB200スルホ
ニルクロリド（RB200SC）などのようなけい光色素であ
る。免疫けい光分析手法の記載はマルカロニス（Marcha
lonis）ほか、「免疫けい光分析（Immunofluorescence
Analysis）」189〜231、に見出され、それは参照により
ここに加入される。
指標標識手段は本発明の受容体、ｔ−PAまたはｕ−PAの
ような有用な抗原に直接結合させることができ、あるい
は別の分子を含むことができる。標識手段が本発明の受
容体に結合する抗体のような別の分子であることが殊に
好ましい。スタフイロコッカス・アウレウス（Staphylo
coccus aureus）タンパク質Ａ、ときにはタンパク質Ａ
として示される、もまた本発明の完全または事実上完全
な抗体受容体が使用される別の分子標識または標識手段
として使用することができる。そのような使用において
タンパク質Ａ自体が、後記するように放射性元素または
けい光色素染料のようなラベルを含有する。
標識群はまた、生物学的活性酵素、例えばホースラデイ
ッシュペルオキシダーゼ（HRP）またはグルコースオキ
シダーゼなど、であることができる。主標識群がHRPま
たはグルコースオキシダーゼである場合には受容体−配
位子鎖体が形成された事実を可視化するために追加の試
薬が必要である。HRPに対するそのような追加試薬には
過酸化水素および酸化染料前駆物質例えばジアミノベン
ジジンが含まれる。グルコースオキシダーゼとともに使
用できる追加試薬は2,2′−アジノ−ジ−（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ABTS）である。
放射性元素は他種のラベルを与え、こゝに典型的な有用
なラベルとして使用される。本発明に使用できる典型的
な放射性標識剤はガンマ線放射を生ずる放射性元素であ
る。それ自身ガンマ線を放出する元素、例えば124I、125
I、128I、131I、132Iおよび51Crはガンマ線放射を生ずる放
射性元素標識群の１つの種類を示す。125Iが殊に好まし
い。他種の有用な標識群は、それ自身が陽電子を放出す
る11C、18F、15Oおよび13Nのような元素である。そのよう
に放出された陽電子は分析媒質中に存在する電子に遭遇
するとガンマ線を生ずる。ベータ線放射体、例えば111
インジウムもまた有用である。
放射性多クローン性受容体は周知のように放射性アミノ
酸を含有する培地中の培養により、並びに多クローン性
受容体を分離し、次いで多クローン性受容体を上記放射
性元素の１つで標識することにより作ることができる。
タンパク質の放射性標識は当該技術によく知られ、こゝ
にさらに論議しない。
本発明はまた本発明の多クローン性受容体および生化学
試薬を形成する方法を意図する。
本発明の生化学試薬に使用する多クローン性受容体を形
成する方法には動物宿主、好ましくは哺乳動物（例えば
ウサギ、ヤギまたは馬）にプラスミノーゲン活性化因子
阻害物質を、阻害物質に対する抗体の産生を誘発する十
分な量投与することが含まれる。生じた抗体は阻害物質
に対する受容体である。次いで抗体を含有する抗血清を
免疫宿主から採取し、生じた受容体を回収する。
本発明の生化学試薬系は上記のように形成した受容体を
標識手段と組合せることにより形成される。適当な標識
手段は前に記載したものである。標識手段が別の分子で
あることが殊に好ましい。
さらに本発明の態様は検定すべき試料中のプラスミノー
ゲン活性化因子阻害物質の存在および量を検出する固相
検定法である。該方法には、（ａ）試料を検定する固体
マトリックスを準備する段階、（ｂ）阻害物質と結合
（錯化）する結合試薬を固体マトリックス上に添付して
固相支持体を形成する段階、（ｃ）検定すべき液体試料
のアリコートを固相支持体に混合して固−液相混合物を
形成する段階、（ｄ）結合試薬が試料中に存在する阻害
物質と結合（錯化）する十分な予定時間（典型的には約
２〜４時間）混合物を保持する段階、（ｅ）固相と液相
とを分離する段階、および（ｆ）結合試薬と結合（錯
化）した阻害物質の存在を測定する段階が含まれる。
結合試薬と錯化した阻害物質の存在は多くの方法で測定
することができる。好ましい１態様において、その測定
は（ｉ）固体支持体上に結合した阻害物質に結合する第
２の結合試薬の液体水溶液を上記段階（ｅ）後に得られ
た固相と混合して第２の固−液相混合物を形成する段
階、第２結合試薬は阻害物質と錯化する、（ii）第２結
合試薬が阻害物質と結合（錯化）する十分な予定時間
（典型的には約２〜約４時間）第２固−液混合物を保持
する段階、（iii）第２固−液混合物の固相と液相とを
分離する段階、および（iv）阻害物質に結合した第２結
合試薬の量を測定しそれにより阻害物質の量を決定する
段階により行なわれる。
阻害物質と結合または錯化する第２結合剤の量は、典型
的には前記のように標識手段により測定される。標識手
段は第２結合試薬と結合し第２結合剤と標識手段とが１
つの分子であることができる。より好ましくは第２結合
試薬および標識手段は別々の分子である。
従って、標識手段が第２結合試薬と結合している場合に
は、初めに挙げた結合試薬と錯化した阻害物質の存在を
決定する上記方法は、（ｉ）結合した標識手段を含む第
２結合試薬の液体水溶液を上記段階（ｅ）後に得られた
固相と混合して第２固−液相混合物を形成する段階、第
２結合試薬は阻害物質と結合（錯化）し、標識手段は阻
害物質に結合した第２結合試薬の量を測定する手段を与
える、（ii）第２結合試薬が阻害物質と結合（錯化）す
る十分な予定時間混合物を保持する段階、（iii）第２
固−液相混合物の固相と液相とを分離する段階、および
（iv）阻害物質に結合した第２結合試薬の量を測定する
段階を用いて行なうことができる。
標識手段は、殊に好ましい実施において別の分子であ
る。そのような状態では、結合（錯化）した阻害物質
は、（ｉ）第２結合試薬の液体溶液を前記段階（ｅ）後
に得られた固相と混合して第２固−液相混合物を形成す
る段階、第２結合試薬は阻害物質と結合（錯化）する、
（ii）第２結合試薬が阻害物質と結合（錯化）する十分
な予定時間、形成された混合物を保持する段階、（ii
i）第２固−液相混合物の固相と液相とを分離する段
階、（iv）別分子指標標識手段（前記した）を混合して
第３固−液相混合物を形成する段階、（ｖ）第２結合試
薬と指標標識手段とが結合する十分な予定時間（典型的
には約２〜約４時間）第３固−液相混合物を保持する段
階、（vi）第３固−液相混合物の固相と液相とを分離す
る段階、および（vii）第２結合試薬に結合した別分子
指標標識手段の量を測定する段階により測定することが
できる。
第１結合試薬がｔ−PAまたはｕ−PAであり、第２結合試
薬がウサギ抗−阻害物質受容体であり、別分子標識手段
がヤギ抗−ウサギIgG抗体である上記態様の詳細が後に
示される。
なお他の方法において、第１結合試薬と反応または錯化
した阻害物質の量を第２結合試薬の使用なく測定するこ
とができる。この態様において、指標標識手段を阻害物
質に直接結合させ、阻害物質の量がそのラベルにより測
定される。
例えば、検定される試料中に存在するタンパク質を後記
手順の１つにより125ヨウ素で放射性標識することがで
きる。前記段階（ｅ）の固相と液相とを分離した後、放
射性標識した、しかし結合していないタンパク質を混合
物から除去し、それにより放射性標識した結合阻害物質
を固体支持体上に残す。次いで結合した放射性標識阻害
物質の存在および量をガンマカウンターを用いて測定す
ることができる。同様の結果は、放射性元素の代りに検
定試料の成分と反応させるために指標標識手段として反
応性けい光分子、例えばイソシアン酸フルオレセインを
用いて得ることができる。
好ましい第１および第２結合試薬には組織型およびウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子または本発明の
前記受容体が含まれる。用いる第１結合試薬が組織型ま
たはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子であれ
ば、第２結合試薬は受容体である。あるいは、用いる第
１結合試薬が受容体であれば第２結合試薬は上記プラス
ミノーゲン活性化因子の１つである。従って、第１結合
試薬が（ａ）ｔ−PAおよびｕ−PAからなる群から選ばれ
たプラスミノーゲン活性化因子、または（ｂ）阻害物質
に結合する本発明の受容体であり、第２結合試薬は
（ａ）ｔ−PAおよびｕ−PAからなる群から選ばれるプラ
スミノーゲン活性化因子、または（ｂ）本発明の受容体
である。しかし、第１および第２結合試薬は異なる。
別分子指標標識手段は、好ましくは第２結合試薬が、阻
害物質に結合する本発明の完全または事実上完全な抗体
受容体である場合に使用される。従って、別分子指標標
識手段は、好ましくは結合した標識群、例えば放射性同
位体、酵素またはけい光色素染料、を有する抗体例えば
ヤギ抗−ウサギIgGまたはタンパク質Ａである。
本発明はさらに試料中のプラスミノーゲン活性化因子阻
害物質の存在および量を検出するための、キットの形態
であることができる診断装置を意図する。該キットには
（１）活性成分として、乾燥、溶液または分散形態で本
発明の生化学試薬の有効量、および（２）ｔ−PAまたは
ｕ−PAを含む少くとも１つの容器が含まれる。
診断装置はまた複数のウエルを有するミクロタイタース
トリップまたはプレートであることができる固体マトリ
ックスを含むことができる。存在するｔ−PAまたはウロ
キナーゼは好ましくは固体マトリックスに結合される。
前記診断装置および方法に有用な適当なマトリックスに
は、フアルコン・ミクロテストIIIフレキシブル・アッ
セイ・プレート（Falcon Microtest III Flexible Assa
y Plates）〔フアルコン・プラスチックス（Falcon Pla
stics,Oxnard,CA）製〕の名称で販売される96ウエルミ
クロタイタープレートおよびイムロン（Immulon）Ｉお
よびII〔ダイナテク（Dynatech,Alexandria,VA）製〕の
名称で販売されるミクロタイターストリップが含まれ
る。ミクロタイターストリップまたはプレートは透明プ
ラスチック材料、好ましくはポリ塩化ビニルまたはポリ
スチレンで作られる。あるいは診断装置に使用する固体
マトリックスにはアボット・ラボラトリーズ（Abbott L
aboratories,North Chicago,IL）から入手できる直径約
１ミクロン〜約５ミリメートルのポリスチレンビーズ；
便宜な多きさのポリスチレン管、棒または板；およびポ
リスチレン粒子が約１ミクロンの大きさであり、ラテッ
クスから遠心分離で分離できるポリスチレンラテックス
が含まれる。
固体マトリックスはまた、フアルマシア・フアイン・ケ
ミカルズ・オブ・ピスカタウエイ（Pharmacia Fine Che
micals of Piscataway,New Jersey）から入手できる交
叉重合デキストラン、例えばセフアデックス（Sephade
x）Ｇ−25,−50,−100,−200など、フアルマシア・フア
イン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から入
手できるアガロースおよび交叉結合アガロース、例えば
セフアロース（Sepharose）6B、CL6B、4B、CL4Bなどの
ような種々の物質から作ることができる。
アガロースまたはセフアロースマトリックスは典型的に
はブロモシアンを用い、結合させるために活性化する。
次いで活性化したマトリックスを１モルグリシンで洗浄
し、活性化マトリックス（固体支持体）の乾燥なく本発
明の生化学試薬、ｔ−PAまたはｕ−PAに結合させる。次
いでマトリックス結合試薬、ｔ−PAまたはｕ−PAを洗浄
し、使用することができる。これらの固体マトリックス
の使用のさらに詳細はIII、Ｂに示される。
診断装置はさらに検定結果を比較する標準および乾燥ま
たは液体形態で種々の緩衝剤を含むことができる。
前記のような標識手段は、好ましくは本発明の生化学試
薬中に受容体とともに供給され、受容体に結合したとき
にはそれらとともに包装することができ、またはより好
ましくは、別分子標識手段が使用されるときに別個に包
装される。過酸化水素およびジアミノベンジジンのよう
な追加試薬もまたHRPのような標識群が使用されるとき
に系中に含ませることができる。そのような物質は多く
の標識群のように商業的に容易に入手でき、診断装置と
ともに供給されなくてもよい。さらに、若干の試薬例え
ば過酸化水素は放置すると分解し、または若干の放射性
元素のように短命であり、最終使用者による供給がより
良好である。
以下に論議する若干の研究データはプラスミノーゲン活
性化因子阻害物質の性質および本発明の生化学試薬診断
装置の、ヒト血清中のプラスミノーゲン活性化因子に結
合したプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を検定およ
び定量する能力を評価するために行なった。
本発明の診断装置は阻害物質のプラスチックミクロタイ
ターウエル上に固定化したｔ−PAまたはｕ−PAに対して
結合する能力を基にしている。洗浄後結合の程度は、錯
体をまず阻害物質に対するウサギ抗血清と、次に125I−
ヤギ抗−ウサギIgGと混合し、保持（保温）することに
より定量した。本発明の診断装置および検定法を使用し
てｔ−PAと阻害物質との間に反応が速く（78％以上が１
時間以内に結合する）、時間および濃度依存性で、広範
囲の阻害物質濃度（１〜100ng/ml）にわたって鋭敏であ
ることが認められた。外因添加ｔ−PAおよびｕ−PAは阻
害物質に対し固定化ｔ−PAと競合することが認められ、
ｔ−PA12ng/mlおよびｕ−PA6ng/mlで結合に50％の低下
が得られた。
以下に論議する結果は本発明の生化学試薬および診断装
置を用いる態様の例示であり、本発明はそのように限定
されるものでないことを理解すべきである。
II 結果 A.ウシ内皮細胞（BAE）阻害物質の精製 BAEからのCM（後にIII、A,Bおよび次の論文に記載され
るように）が組織型（ｔ−PA）およびウロキナーゼ型
（ｕ−PA）プラスミノーゲン活性化因子（レビン（Levi
n）ほか、ジヤーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.o
f Cell Biol.），94,631（1982））並びにフイブリン溶
解の阻害物質（ロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オ
ブ・アメリカ〔Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）〕，80,295
6（1983））を含むことが前に示された。このCMのコン
カナバリンＡ−セフアロース上のアフイニテイークロマ
トグラフイーによる分画はｕ−PAおよびｔ−PAを互いに
分離できることを示し（ロスクトフ（Loskutoff）ほ
か、ブラッド（Blood），62,62（1983））この方法がま
た阻害物質の精製に有用であることを示唆した。
CM1リットルをコンカナバリンＡ−セフアロースカラム
に適用し、カラムを、後にIIIに記載するように処理し
た。ピーク画分をプールし、SDS-PAGEにより分画し、ク
ーマシーブリリアントブルーで染色することによりタン
パク質について、またリバースフイブリンオートグラフ
イーによりフイブリン溶解活性化因子および阻害物質の
存在について分析した。第１図に示すように、カラムに
適用したタンパク質の85％以上が貫通流出液中に回収さ
れた。（プールＩ）。この画分はアルブミンとｕ−PAの
両方を含有したが阻害物質を含有しなかった（示されて
いない）。若干の阻害物質はプールIII中に検出され、
その画分は回収ｔ−PA活性の大部分を含有した（ロスク
トフ（Loskutoff）ほか、ブラッド（Blood），前掲）。
しかし、溶解耐性帯域の相対大きさより判断して全阻害
物質の20％以下を示した（エリクソン（Erickson）ほ
か、アナリテイカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.），137,454（1984））。検出可能な阻害物質活性の
大部分は第２図に示されるように、コンカナバリンＡ、
プールII画分、全タンパク質の僅かに５％を含む画分、
中に回収された。それは主染色タンパク質の１つと共移
動すると思われた。
コンカナバリンＡプールIIはまたチューブゲル中SDS-PA
GEにより分析し、結果は第２図に示される。電気泳動後
ゲルをスライスし、切片の抽出物をその125I−フイブリ
ンのｕ−PA−媒介溶解を阻害する能力について試験し
た。再び阻害物質活性をゲルの単領域中で検出し、第２
図の挿入図に示される溶解耐性帯域のものと識別できな
かった相対移動度(Rf)で移動した（すなわち、Rf＝0.
6）。ゲルのこの領域中に検出された他のタンパク質は
少なく、阻害物質をそのようなゲルから抽出することに
より精製を終えることができることが示唆された。
最高阻害物質活性を有する抽出物（第２図、切片49〜5
2）をプールし、7.5〜20パーセント勾配ゲル上で再分析
し、結果は第３図に示される。ゲルをクーマシーブリリ
アントブルー（第３図、レーン１）で、または過ヨウ素
酸−シツフ試薬（第３図、レーン２）で染色したときに
単−タンパク質が検出され、それはリバースフイブリン
オートグラフイー（第３図、レーン３）により示された
阻害物質と共移動した。出発CM中および種々のプールし
た画分中に存在する阻害物質抗原の量をローレル（Laur
ell），スカンジナビアン・ジヤーナル・オブ・クリニ
カル・アンド・ラボラトリー・インベステイゲーション
（Scand.J.Clin.Lab.Invest），29,21（1977）のロケッ
ト法により精製阻害物質に対し発達した抗血清を用いて
測定した（図示なし）。
これらのスクリーニングは、CMが阻害物質0.6ミクログ
ラム/mlを含有すること、阻害物質の600ミクログラムが
コンカナバリンＡに適用されたこと（第１図）、および
90ミクログラムが最終ゲル抽出物から回収されること
（第２図および第３図）を示した。従って、この精製プ
ロトコルが出発抗原の約15％の回収を生じた。精製阻害
物質は、Mr標準に直接比較したとき還元および非還元の
両条件で50,000±2,500ダルトンの見掛け分子量（Mr）
を有した（データは示さない）。
B.精製阻害物質の予備確認 PAは１本鎖プラスミノーゲンを１アルギニン−バリン結
合の開裂により２本鎖プラスミンに転化する（サマリア
（Summaria）ほか、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.），242,4279（196
7））。このプロセスは還元剤の存在下にSDS-PAGEによ
りモニターすることができる（ムツソニ（Mussoni）ほ
か、トロンボシス・リサーチ（Thromb.Res.），34,241
（1984）；サマリア（Summaria）ほか、ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），
前掲；デイノ（Dano）ほか、ビオシミカ・エ・ビオフイ
ジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta），566,138（197
9））。阻害物質が抗活性化因子であるかどうかを決定
するために、この開裂を阻害するその能力を評価し、結
果を第４図に示した。精製阻害物質はｕ−PAおよびｔ−
PAの両方の125I−プラスミノーゲンをその特有重鎖およ
び軽鎖に開裂する能力をブロックし、これを用量依存的
に行なった。ｔ−PAの阻害は第５図に示されるようにSD
S-PAGE後なお明らかであった酵素−阻害物質媒体の形成
と関連があった。
融合BAEから採取したCM中に検出されたように（ロスク
トフ（Loskutoff）ほか、プロシーデイング・オブ・ザ
・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ〔Proc.N
atl.Acad.Sci.（USA）〕，前掲）精製分子の阻害物質活
性は第６図に示されるように、pH2.7において37℃で60
分の保温、またはSDSにさらしたときに破壊されなかっ
た。対照的に阻害物質活性または精製プロテアーゼネキ
シンはこれらの同−処理により消滅した。これらのタン
パク質の阻害物質活性は２−メルカプトエタノール５％
の存在下に37℃で30分間保温することにより影響されな
かった（図示されない）。
C.L〔3,4,5−3H〕ロイシンの存在下に培養したBAEから
の阻害物質の精製 血漿および血清はともにフイブリン溶解の阻害物質を含
有する（ロスクトフ（Loskutoff），ジヤーナル・オブ
・セルラー・フイジオロジー（J.Cell Physiol.），96,
361（1978）；マラールツ（Mullertz），「化学的フイ
ブリン溶解および血栓崩壊の進歩（Progress in Chemic
al Fibrinolysis and Thombolysis）」，デビッドソン
（Davidson）ほか編、vol.3,pp213〜237,レーバン・プ
レス，ニユーヨーク（1978）；コーレン（Collen），ト
ロンボシス・アンド・ヘモスタシス（Thromb.Haemosta
s.），43,77（1980））。培養した内皮細胞はCMの調製
中にこれらの血清タンパク質をインターナリゼーション
または結合し、次にそれらを血清を含まない培地に逆に
放出することができる（コーエン（Cohen），ジヤーナ
ル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J.Cl
in.Invest.），52,2793（1973）；パスタン（Pastan）
ほか、セル（Cell），12,609（1977）；ロールリッチ
（Rohrlich）ほか、ジヤーナル・オブ・セルラー・フイ
ジオロジー（J.Cell.Physiol.），109,1（1981）；マク
フアーソン（Mc Pherson）ほか、ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），256,11
330（1981））。阻害物質が実際にBAEにより合成された
かまたは単に汚染血清阻害物質であったかを測定するた
めに阻害物質を、非標識CMからの阻害物質の精製に開発
したと同じプロトコルを用いてＬ〔3,4,5−3H〕ロイシ
ンの存在下に培養した細胞のCMから精製した。コンカナ
バリンＡ−セフアロースカラムを低塩および高塩の存在
下にα−メチルマンノシドで溶出したときに２ピークの
放射性標識タンパク質が回収された（データは示されな
い）。阻害物質を含有するピークII画分をプールし、さ
らにSDS-PAGEによる分析にかけ、結果は第７図に示され
る。阻害物質活性および放射能の大部分がともに同一画
分中に回収された。これらの２つの活性はまたピーク阻
害物質画分（第７図中の画分52、53）をプールし、透析
し、次にアルカリ性PAGEによる分析にかけたときに共移
動した（第８図）。一緒にして、これらのデータから阻
害物質が細胞の生合成産生物で、汚染血清タンパク質で
ないことが示された。
免疫沈降スクリーニングは上記結果の確認およびクロー
ン化BAEによる阻害物質合成の定量の両方を達成した。
結果は第９図および表Ｉに示される。
これらのスクリーニングにおいて、クローン化BAEから
採取した放射性標識CMを精製阻害物質に対する抗体とと
もに保温した。結合した物質を抗体タンパク質Ａ−セフ
アロースビーズから抽出し、SDS-PAGEにより分画し、オ
ートラジオグラフイーにより分析した（第９図）。50,0
00ダルトンの近似Mrの単一放射性標識ポリペプチドが示
され、リバースフイブリンオートグラフイーにより分析
したときそれは阻害物質活性を有した（図示しない）。
このタンパク質は前免疫血清で調整したタンパク質Ａ−
セフアロースビーズに吸着されなかった（図示しな
い）。これらの免疫沈降スクリーニングにおいて分析し
た種々のCMから回収された全放射能および精製の各段階
における放射性標識タンパク質の回収（第７〜８図、表
Ｉ）は24時間中に細胞により合成され、分泌された全タ
ンパク質の2.5〜12％を占めることを示す（表Ｉ）。
D.阻害物質に対する機能検定の開発および評価（阻害物
質結合検定） ポリ塩化ビニル（PVC）プラスチックウエルを一夜４℃
で種々の濃度のｔ−PAで被覆し、第10図に示すように本
発明の検定のためにｔ−PAの最適濃度を決定した。ウエ
ルを洗浄し、BSAでブロックし、37℃で２時間、３つの
異なる濃度の精製阻害物質（20、50および100ng/ml）と
ともに保温した。洗浄後、錯体をまずウサギ抗−阻害物
質受容体（1:100希釈）、次いで125II−ヤギ抗−ウサギ
IgG（1.5×105cpm/ウエル）とともに保温することによ
り結合の程度を定量した。PVCウエルの被覆に用いたｔ
−PA濃度が0.1から1.0マイクログラム/mlに上るにつれ
て結合阻害物質の検出が３濃度のすべてで増加した（第
10図）。１ミクログラム/ml以上にｔ−PA被覆濃度が上
昇すると結合阻害物質の検出は増加しなかった。従っ
て、後のスクリーニングには１ミクログラム/mlのｔ−P
A濃度をPVCウエルの被覆に用いた。
阻害物質含有溶液に対する保温時間を最適化するために
阻害物質と固定化ｔ−PAとの相互反応の速度論を決定し
た。精製阻害物質（100ng/ml）をｔ−PAまたはBSA被覆
ウエル上37℃で種々の時間保温した。結合した阻害物質
を次いでウサギ抗−阻害物質受容体（1:100）、次いで
125I−ヤギ抗−ウサギIgG（1.5×105cpm/ウエル）で定
量した。阻害物質と固定化ｔ−PAとの間の反応は早い反
応であり、75％以上の結合が30分以内に生じた（第11
図）。この時間中に阻害物質は対照BSA被覆ウエルに結
合しなかった。便宜上、阻害物質含有溶液に対する１時
間の保温時間を後のスクリーニングに用いた。
多クローン性受容体および標識手段に対する保温時間を
同様に最適化した。ｔ−PAまたはBSA−被覆ウエルを37
℃で１時間阻害物質（50ng/ml）とともに保温し、次い
でウサギ抗−阻害物質受容体とともに種々の時間保温し
た。結合した受容体を標識（125I−ヤギ抗−ウサギIg
G）とともに２時間保温することにより検出した。ある
いはウエルを受容体とともに２時間保温し、標識に対す
る保温時間を変動させた。受容体および標識はともに速
やかに検定中のそれぞれの抗原と結合し、80％以上の結
合が1.5〜２時間後に生じた（第12図）。従って、爾後
のスクリーニングには受容体および標識の両方に対し２
時間の保温時間を用いた。
阻害物質の検出に対するウサギ抗−阻害物質受容体の希
釈を変化させる影響を測定して検定の感度を最適化し
た。ｔ−PA被覆ウエルを37℃で１時間、種々の濃度の阻
害物質（１〜100ng/ml）とともに保温した。洗浄後、ウ
エルを種々の希釈のウサギ抗−阻害物質受容体（1:50〜
1:500）とともに保温し、結合した抗体を125I−ヤギ抗
−ウサギIgG（1.5×105cpm/ml）で検出した。阻害物質
の最適検出は抗血清の1:50〜1:75希釈で生じた（第13
図）。爾後のスクリーニングは抗血清の1:75希釈を用い
た。125I−ヤギ抗−ウサギIgG（2.5×104〜３×105cpm/
ウエル）の濃度を変化させる影響を同様にスクリーニン
グして検定感度を最適化した。阻害物質の最適検出は
125I−ヤギ抗−ウサギIgGの2.5〜５×104cpm/ウエルで
生じた（第14図）。
この検定で検出した精製阻害物質の典型的な標準用量−
反応曲線が第15図に示される。検定は1ng/mlまで感受性
であり、10〜100ng/mlの間阻害物質に対し線形反応を示
し、250ng/ml以上の阻害物質濃度で飽和した。ウシ大動
脈内皮細胞ならし培地（CM）を用いた用量−反応もまた
第15図に示される。この曲線を標準曲線と比較するとこ
のCM試料が機能的に活性な阻害物質約100ng/mlを含有し
たことが示される。便宜上、標準曲線は未知試料中の阻
害物質濃度を計算するために通常両対数プロットにプロ
ットした（第16図）。このようにプロットすると直線を
示すことをみることができる。
E.阻害物質結合検定とリバースフイブリンオートグラフ
イーとの比較 本発明の機能検定（阻害物質結合検定）の感度を、PA阻
害物質の検出および定量に通常使用される他の検定、リ
バースフイブリンオートグラフイー、の感度と比較し
た。種々の濃度の阻害物質（0.5〜10ng/レーン）をSDS-
PAGEにより分画し、次いでリバースフイブリンオートグ
ラフイーにより分析した。結果は第17図に示される。こ
の方法において、洗浄したポリアクリルアミドゲルをフ
イブリン、プラスミノーゲンおよびPAを含むインジケー
ターゲル上に置いた。プラスミンが徐々に形成され、阻
害物質が相当するポリアクリルアミドゲル中に存在した
領域を除いてゲルの一般的溶解を生じた。リバースフイ
ブリンオートグラフイーの感度は2.5ng/レーンであり
（第17図）、0.1mlが各レーンに適用されたのでその感
度は25ng/ml、すなわち阻害物質結合検定より25倍低い
感受性であった。
F.阻害物質結合検定の適用 本発明の阻害物質結合検定を用いて精製酵素と阻害物質
との相互作用を調べた。３種の精製PA（ｔ−PA、ｕ−PA
およびストレプトキナーゼ）を37℃で１時間、精製阻害
物質（50ng/ml）とともにに保温し、次にｔ−PAに結合
する阻害物質の能力を阻害物質結合検定で定量した。外
因添加ｔ−PAおよびｕ−PAは阻害物質に対する固定化ｔ
−PAと競合し、第18図に示されるように、ｔ−PA12ng/m
lおよびｕ−PA6ng/mlで結合に50％の低下が得られた。
ストレプトキサーゼも、DFP−不活性化ｔ−PA（データ
は示されない）も固定化ｔ−PAに対する阻害物質の結合
に影響を与えなかった。
本発明の阻害物質結合検定はまたヒト血漿および血清中
の阻害物質の検出に用いた。血漿および血清は16健康人
供血者から採集し、各試料中の阻害物質活性を阻害物質
結合検定で測定した。正常人血漿は第19図に示されるよ
うに低水準または非検出水準の阻害物質を含有した。対
照的にこれらの供血者からの血清は、また第19図に示さ
れるように、高水準の阻害物質活性を含有した。
最後にこの検定を用いて正常供血者および止血系におい
て異常と思われた供血者からの血漿中の阻害物質濃度を
測定して比較した。結果は表IIに示される。
これらの試料はDr.ビー．ウイマン（Dr.B.Wiman）の好
意により提供された。このスクリーニングから阻害物質
は正常血漿中に検出されないが、患者は約25ng/mlを有
したことをみることができる。この同一患者はウイマン
（Wiman），トロンボシス・リサーチ（Thrombosis Rese
arch），31,427（1983）において異なる検定で調べたと
きに高阻害物質を有することが示された。
III.物質および方法 A.プラスミノーゲン活性化因子 組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−PA）を、レイ
ケン（Rijken）ほか、ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），256,7035（1981）
に記載されたようにヒト黒色腫細胞ならし培地から分離
した。要約すると、ヒト黒色腫細胞をプラスチック組織
培養フラスコ〔フアルコン（Falcon,Oxnard,CA）製〕中
CO2６％を捕足した大気空気中37℃で融合（confluent）
単層に成長させた。増殖培地は炭酸水素ナトリウム（7.
5％溶液16ml毎リットル−培地）、Ｌ−グルタミン（200
M溶液10ml毎リットル−培地）および熱不活性化新生児
子牛血清（最終濃度10％）を捕足した変性イーグル必須
培地100mlであった。細胞を子牛血清のない培地で洗浄
し、血清を含まない培地25mlとともに保温した。生じた
ならし培地（CM）を３連続日採取して置換し、30分間7,
000×ｇで遠心分離し、使用するまで−20℃で貯蔵し
た。示したときにアプロチニン〔カルバイオケム−ベー
リング（Calbiochem-Behring,La Jolla,CA）製〕を血清
を含むおよび血清を含まない培地の両方に加えた（最終
濃度20KIU/ml）。
市販ウロキナーゼ〔ウインキナーゼ（WINKINASE），ス
ターリング−ウインスロプ（Sterling-Winthrop,Ressel
aer,NY）製、５×105CTA単位〕はさらにホルムベルグ
（Holmberg）ほか、ビオシミカ・エ・ビオフイジカ・ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta），445,215（1976）に記
載のようにアフイニテイークロマトグラフイーにより精
製した。
B.プラスミノーゲン活性化因子阻害物質 阻害物質の精製に用いたウシ大動脈内皮細胞（BAE）は
ブーイス（Booyse）ほか、トロンボシス・エ・ダイアセ
シス・ヘモラージカ（Thromb.Diathes.Haemorrh.），3
4,825（1975）の方法（その教示は参照によりこゝに加
入される）により牛の大動脈から分離し、150cm3フラス
コ〔フアルコン・プラスチックス（Falcon Plastics,Ox
nard,CA）製〕中、レビン（Levin）ほか、トロンボシス
・リサーチ（Thromb.Res.），15,869（1979）に記載さ
れるように10％胎児子牛血清を捕足した変性イーグル培
地15ml中で培養した。スクリーニングのため細胞は16〜
22回1:5比で、一般に下記のようにならし培地（CM）の
調製前に少くとも１週間融合させた。
クローン化BAEを若干の代謝標識スクリーニングに用い
た。これらのクローンは１次細胞調製から成長した単細
胞から発達させた。要約すると、新に分離した細胞を60
mm皿に接種し、一夜付着させた。細胞を前加温培地で洗
浄し、トリプシン〔ギブコ（GIBCO,Long Island,NY）
製〕で培養皿から離し、ピペットで穏やかに分散させ、
増殖培地中に約20細胞毎mlに希釈した。次いで希釈細胞
の４〜５アリコート（各50ミクロリットル）をクーパ
（Cooper）皿ふた（lid）〔フアルコン・プラスチック
ス（Falcon Plastics,Oxnard,CA）製〕の反転無菌裏面
上に置き、60分間室温で保温して細胞を付着させた。
各細胞小滴の位置をペンでマークした後、増殖培地6.7m
l中に融合BAEを含むクーパ皿上にふたを反転して置い
た。融合BAEをこの培地中に24時間保持し、仮定的に成
長因子を生成させた（ガダスク（Gajdusk）ほか、ジヤ
ーナル・オブ・セル・バイオロジー（J.Cell.Biol.）8
5,467（1980））。マーク領域を顕微鏡で調べ、単細胞
を含む領域を連日細胞についてモニターした。これらの
クローンが数千細胞に成長したとき、細胞をトリプシン
の存在下に環クローニングにより取出し、増殖培地100
ミクロリットルを含む0.5cmミクロタイターウエル〔フ
アルコン（Falcon）製〕中に分配し、融合するまで成長
させた。空ふたもまた融合BAEsを含むクーパ皿底上に反
転し、この方法の対照として扱った。これらのふたは培
養期間中細胞を含まなく保たれ、細胞が底から脱離して
ふた上に再付着しなかったことが示された。この手順に
より発達したクローンは因子III関連抗原に対し陽性で
あり、それらが内皮細胞からなることが示された（ヤツ
フエ（Jaffe）ほか、ジヤーナル・オブ・クリニカル・
インベステイゲーション（J.Clin Invest.），52,2757
（1973））。
次いで融合単層をPBS15mlで２回洗浄し、次に血清を含
まない培地15mlとともに保温した。24時間後、生じたCM
を採取し、プールし、400×ｇで５分間遠心し、NaN3お
よびツイン80〔シグマ・ケミカルズ（Sigma Chemicals,
St.Louis,MO）製〕をそれぞれ0.02％および0.01％の濃
度に加えた後、−30℃で、さらに使用するまで貯蔵し
た。10mlのコナカナバリンＡ−セフアロース〔シグマ・
ケミカルズ（Sigma Chemicals,St.Louis,MO）製〕カラ
ム（1.5×5cm）に、前もって0.02％NaNO3および0.01％
ツイン80〔ポリオキシエチレン（80）ソルビタンモノオ
レアート〕を含むリン酸塩緩衝塩水（PBS）で平衡さ
せ、CM約１リットルを４℃で10ml/hの速さで通した。
貫通物質を採取した後、カラムを1M-NaCl、0.01％ツイ
ン80および0.02％NaN3を含むPBS（pH7.4）少くとも10カ
ラム容量で洗浄し、非特異性吸着タンパク質を除去し
た。カラムを約等容量の、しかし添加NaClのないこの緩
衝液で洗浄し、次いで２段階で溶離した。最初に0.5M−
α−メチル−Ｄ−マンノシド〔シグマ・ケミカルズ（Si
gma Chemicals,St.Louis,MO）製〕、0.02％NaNO3および
0.01％ツイン80を含有する0.01Mリン酸ナトリウム、pH
7.2、で2.5ml/hの速さでタンパク質を溶離した。次回に
同一の、しかし1M-NaClを含む緩衝液でカラムを溶離し
た。
精製における第２段階には分取用SDS-PAGEが含まれた。
阻害物質含有画分（スラブゲル電気泳動およびリバース
フイブリンオートグラフイーにより確認した）をプール
し、アリコート（225ミクロリットル）をチューブゲル
中のSDS-PAGEにかけた。追跡染料がゲルの底に達したと
き、ゲルを凍結し、1mm切片に切った。各２切片を合わ
せ、４℃で24時間、0.01％ツインを含むPBS0.2mlで抽出
した。次いで各抽出物を125I−フイブリンプレート検定
（後記）により阻害物質活性について試験した。阻害物
質活性のピークを含む画分をプールし、−70℃で、さら
に使用するまで貯蔵した。
阻害物質はまたＬ−〔3,4,5−3H〕ロイシンの存在下に
培養した細胞から採取したCMから精製した。この場合に
培養株をロイシンを含まないMEM〔ギブコ（GIBCO,Long
Island,NY）製〕15mlで２回洗浄し、次いでＬ−〔3,4,5
−3H〕ロイシン〔158Ci/ミリモル，ニユー・イングラン
ド・ニユークリア（New England Nuclear,Boston,MA）
製〕20マイクロCi/mlを含むロイシン不含MEM15mlの存在
下に保温した。24時間後、培地を前記のように採取し、
非標識CM55mlと合わせ、1mlのコンカナバリンＡ−セフ
アロースカラム（0.6×3.5cm）に4ml/hの速さで通し
た。カラムを洗浄し、1ml/hで溶離した。再び阻害物質
含有画分をプールし、分取用チューブゲル電気泳動にか
けた。生じた阻害物質含有ゲル抽出物はさらに使用する
まで−70℃で貯蔵した。
精製阻害物質に対する多クローン性受容体を、後に詳記
するようにウサギ中で産生した。タンパク質Ａ−セフア
ロース（Ｌ−4B〔フアルマシア・フアイン・ケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,NJ）製〕を0.
02％NaN3、0.05％ツイン20〔ポリオキシエチレン（20）
ソルビタンモノラウラート〕および0.1％ウシ血清アル
ブミンを含むPBS中で再び水和し、この緩衝液10倍過剰
で３回洗浄した。抗血清のIgG画分を、製造業者により
指定されたように抗阻害物質試薬または前免疫血清の40
ミクロリットル当り約80ミクログラムのタンパク質Ａ−
セフアロースの割合で、洗浄したビーズに結合させた。
IgG被覆ビーズを、〔3,4,5−3H〕ロイシンの存在下に培
養したクローン化BAEから採取したCM1mlに加えた。試料
を室温で１時間保温し、ビーズを遠心分離により洗浄し
（PBS−ツイン緩衝液1mlで３回）、2.2％SDS、20％グリ
セリン、0.025％ブロモフエノールブルーおよび2.5％
（v/v）２−メルカプトエタノールを含む0.25M−トリス
−HCl（pH6.8）で37℃において１時間抽出した。生じた
上澄みをスラブゲル中のSDS-PAGEにより、または液体シ
ンチレーション計数により分析した。
スラブ（15×10×0.15cm）およびチューブ（10×0.5c
m）ゲル中のSDS-PAGEを次いでレイムリ（Laemmli），ネ
ーチャー（ロンドン）（Nature Lond.）），227,680（1
970）（その例証教示は参照によりこゝに加入される）
に従って行なった。堆積ゲルは４％ポリアクリルアミド
および９％ポリアクリルアミドの分離ゲルからなる（両
ゲルは３％の交叉結合を有した）。分離ゲル中7.5〜20
％勾配のポリアクリルアミドからなるスラブゲルもまた
調製した。電気泳動後、ゲルを固化させ、１％クーマシ
ーブリリアントブルー〔バイオラド（Bio Rad,Richmon
d,CA）製〕を含む50％トリクロロ酢酸または過ヨウ素酸
シツフ試薬で、ギンズバーグ（Ginsburg）ほか、「血液
学における方法（Method in Hematology）」，ハーカー
（Harker）ほか編、vol.8,pp.158〜176;チヤーチル・リ
ビングストン，ニユーヨーク（1983）のように染色し
た。
精製阻害物質の見掛け分子量の決定に用いた分子量標準
にはホスホリラーゼＢ（92,500）、ヒトプラスミノーゲ
ン（90,000）、トランスフエリン（77,000）、ウシ血清
アルブミン（66,200）、ヒト血清アルブミン（66,00
0）、オボアルブミン（43,500）、カルボニックアンヒ
ドラーゼ（31,000）、ダイズトリプシン阻害物質（21,5
00）、リソチーム（14,400）およびヒトフイブリノーゲ
ンの66,000、52,300および46,500サブユニットが含まれ
た。
放射性標識タンパク質を局在化するために、ボネル（Bo
nner）ほか、ユーロピアン・ジヤーナル・オブ・バイオ
ケミストリー（Eur.J.Biochem.），46,83（1974）に記
載されたようにオートラジオグラフイーのために染色ス
ラブゲルを乾燥して処理した。チューブゲル中の放射性
標識タンパク質の位置は、前記のようにゲルを1mm片に
スライスし、各ゲル切片を緩衝液中に抽出し、各画分中
の放射能を測定することにより決定した。
アルカリ性（SDS不含）連続PAGEはヒエルテン（Hjerte
n）ほか，アナリテイカル・バイオケミストリー（Anal.
Biochem.），11,219（1965）のように、0.37Mトリス−
グリシン（pH9.5）を両ゲル−および操作緩衝液として
用いて行なった。チューブゲルは2.5％の交叉結合を有
する10％ポリアクリルアミドであった。試料は40％スク
ロースに運ばれ、ゲルに適用され、初めに2.5mA/cm2で
0.5時間、次いで5mA/cm2で１〜1.5時間電気泳動にかけ
られた。
等電点電気泳動ゲルはオフアレル（O'Farrell），ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.），250,4007（1975）におけるようにガラス管
（2.5mm）中に調製した。生じたpH勾配はゲルを1mm切片
に切ることにより測定した。各２切片を合せて0.2mlH2O
中へ４℃で18時間抽出し、これらの抽出物をそれぞれ中
のpHおよび放射能を測定した。平行ゲルからの切片もま
た0.2mlPBS/ツイン中へ抽出し、阻害物質活性および放
射能について検定した。
ポリアクリルアミドゲル中の阻害物質活性はゲル抽出物
の125I−フイブリンのｕ−PA媒介溶解を阻害する能力の
直接測定により〔ロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロ
シーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・
オブ・アメリカ〔Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）〕，74,3
903（1977）のフイブリンプレート法〕、またはエリク
ソン（Erickson）ほか、アナリテイカル・バイオケミス
トリー（Anal.Biochem.），137,454（1984）におけるよ
うにリバースフイブリンオートグラフイーにより局在化
した。後者の手法においてインジケーターフイルム中の
白色溶解帯域がスラブゲル中の阻害物質の存在から生じ
た。
変性条件下の阻害物質の安定性を測定するために、精製
分子（20ミクログラム/ml）を、25ミクログラム/mlのヒ
ト血清アルブミンを含む0.02Mグリシン、pH2.7、中で37
℃において１時間保温した。試料は、検定緩衝液（pH8.
1）３容量の添加により中和し、次に検定緩衝液中に行
なった種々の希釈で125I−フイブリンプレート検定によ
り残存活性について試験した。阻害物質（20ミクログラ
ム/ml）はまた37℃で１時間、0.025％SDSおよびアルブ
ミン（25ミクログラム/ml）を含むPBS中で保温した。0.
18％トライトンＸ−100〔ポリオキシエチレン（９）オ
クチルフエニルエーテル〕を含む検定緩衝液３容量の添
加によりSDSを中和し、残存阻害物質活性を測定した。
グリシンおよびSDSの代りにPBSで処理した試料をこれら
のスクリーニングの対照として扱った。精製プロテアー
ゼネキシン（160ミクログラム/ml）の阻害物質活性に対
する酸グリシンおよびSDSの影響を同様に測定した。
C.多クローン性受容体の形成 阻害物質に対する抗血清を、塩水1mlに溶解し、フロイ
ンド（Freund）完全アジユバント〔マイルズ・ラボラト
リーズ（Miles Laboratories,Naperville,IL）製〕1ml
で乳化した精製阻害物質20ミクログラムの皮下注射によ
りニユージーランドラビット中に高めた。塩水0.5ml中
の、不完全フロインドアジユバント（マイルズ・ラボラ
トリーズ（Miles Laboratories,Naperville,IL）製〕で
乳化した精製阻害物質10ミクログラムを用いるブースタ
ー注射を２週間隔で投与した。阻害物質に対する多クロ
ーン性受容体を含む血清を第３および第４免疫処置10日
後に採取し、プールした。
D.阻害物質のｔ−PAに対する結合検定 リン酸塩緩衝塩水（PBS）中の精製ｔ−PA（50ミクロリ
ットル／ウエル,1ミクログラム/ml）をＵ底ミクロタイ
タープレート〔PVCプラスチック、フアルコン（Falco
n）3911,ミクロテスト（Microtest）III、フアルコン
（Falcon,Oxnard CA）製〕中、４℃で一夜保温した。こ
の段階および各自の段階で、プレートをSPRIA緩衝液
（0.1％BSA、0.05％NaN3および0.05％ツイン20を捕足し
たPBS）で洗浄した。プラスチック上の残余部位を「ブ
ロック」するため３％BSA（200ミクロリットル／ウエ
ル）をウエル中で37℃において１時間保温した。試験試
料および標準曲線の精製阻害物質を希釈緩衝液（３％BS
A、5mM-EDTA、0.1％ツイン80および0.02％NaN3を捕足し
たPBS）中に調製し、50ミクロリットル／ウエルを37℃
で１時間保温した。結合した阻害物質をウサギ抗−阻害
物質受容体（希釈緩衝液中1:75希釈、50ミクロリットル
／ウエル）とともに37℃で２時間保温することにより検
出した。次いで結合した抗体−阻害物質−ｔ−PA錯体を
125I−標識ヤギ抗−ウサギIgG〔５×104cpm/ウエル，カ
ペル・ラボラトリーズ（Cappel Laboratories,Cochranv
ille,PA）製〕とともに37℃で２時間保温することによ
り定量した。ウエルをそれぞれ切り、各ウエル中の放射
能をガンマカウンター〔CT（80〜800）CT/T,ゼネラル・
エレクトリック（General Electric）,Milwaukee,WI）
製〕中で測定した。
E.その他 プラスミノーゲンはドイシユ（Deutsch）ほか、サイエ
ンス（Seience），170,1095（1970）に記載されたよう
にリシン−セフアロース上のアフイニテイ−クロマトグ
ラフイーにより古いヒト血清から精製した。タンパク質
はブラドフオード（Bradford），アナリテイカル・バイ
オケミストリー（Anal.Biochem.），12,248（1976）の
方法によりウシ血清アルブミンを標準として用いて測定
した。PA活性はロスクトフ（Loskutoff）ほか、プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オ
ブ・アメリカ〔Proc.Nat.Acad.Sci.（USA）〕，74,3903
（1977）〕により記載されたように125I−フイブリン被
覆マルチウエル組織培養皿上で検定した。タンパク質は
固態ラクトペルオキシダーゼ／グリコースオキシダーゼ
試薬〔バイオ−ラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Labora
tories,Richmond,CA）製〕および担体を含まないNa125I
〔アメルシヤム（Amersham,Arlington Height,IL）製〕
を用い125Iで酵素標識し、あるいはフレイカー（Frake
r）ほか、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル
・リサーチ・コミニユケーシヨンズ（Biochem.Biophys.
Res.Commun.），80,849（1978）のヨード産生手順によ
り標識間隔が単に５分で温度が４℃であるように変性し
た。最終生成物の典型的な特異的活性は１〜４×106cpm
/ミクログラム−タンパク質であった。ウシフイブリノ
ーゲン〔画分II、カルビオケム−ベーリング（Calbioch
em-Behring,La Jolla,CA）製〕はモセソン（Mosseso
n），オシミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ（Biochim.B
iophys.Acta），57,204（1962）に示唆されたように精
製してプラスミノーゲンを除去した。プロテアーゼネキ
シンは、スコット（Scott）ほか、ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），258,
10439（1983）のように培養し、Dr.ジエー・ベイカー
（Dr.J.Baker,University of Kansas,Lawrence,KS）の
好意で提供されたヒトｇ繊維細胞から精製した。125I−
プラスミノーゲン開裂検定はロスクトフ（Loskutoff）
ほか、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.），256,4142（1981）およびムッソニ
（Mussoni）ほか、トロンボシス・リサーチ（Thromb.Re
s.），34,241（1984）に記載されたように行なった。
前記は本発明の例示として意図され、限定ではない。本
発明の真の精神および範囲から逸脱しないで多くの変形
および変更を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−174759（ＪＰ，Ａ) 米国特許4343896（ＵＳ，Ａ) Ｐｖｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ’．Ｕ，Ｓ，Ａ，80，（1983），Ｐ．2956 −60 Ｃｅｌｌ．，20，（1980），Ｐ．865− 872。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】検定すべき試料における、プラスミノーゲ
    ン活性化因子阻害物質の存在及び量を検出する固相分析
    法であって、 （ａ）前記試料を分析する固体マトリックスを準備する
    段階、 （ｂ）前記阻害物質に結合する第１結合試薬を前記マト
    リックス上に添付して、固相支持体を形成する段階、前
    記第１結合試薬は、前記阻害物質に対する多クローン
    性または単クローン性受容体であるか、組織型プラス
    ミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼ型プラスミノ
    ーゲン活性化因子からなる群から選択されるプラスミノ
    ーゲン活性化因子であり、 （ｃ）分析すべき液体試料のアリコートを前記固相支持
    体と混合して、第１固−液相混合物を形成する段階、 （ｄ）前記第１結合試薬が前記試料中に存在する阻害物
    質と結合して、固相結合阻害物質−試薬複合体を形成す
    るに十分な時間、前記第１固−液相混合物を保持する段
    階、 （ｅ）前記第１固−液相混合物の固相と前記液相とを分
    離する段階、 （ｆ）前記固相支持体上に結合した前記固相結合阻害物
    質−試薬複合体の前記阻害物質部分と結合する第２結合
    試薬の液体水溶液を混合して、第２固−液相混合物を形
    成する段階、前記第２結合試薬は、前記工程（ｂ）で使
    用しなかった前記第１結合試薬の他方であり、 （ｇ）前記第２結合試薬が前記複合体中に存在する前記
    阻害物質と結合するに十分な時間前記第２固−液相混合
    物を保持する段階、 （ｈ）前記第２固−液相混合物の固相と液相とを分離す
    る段階、及び （ｉ）前記阻害物質と結合した第２結合試薬の量を測定
    することによって、阻害物質の量を決定する段階、 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記阻害物質に結合した前記第２結合試薬
    の量をラベル手段を有する標識手段により測定する、請
    求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】前記第２結合試薬と前記標識手段とが別の
    分子である、請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記第２結合試薬がラベル手段に結合され
    ている、請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】前記別分子標識手段を含む液体水溶液を、
    前記工程（ｈ）で得られた前記固相と混合して、第３固
    −液相混合物を形成する段階、 前記別分子標識手段が前記第２結合試薬と結合するに十
    分な時間前記第３固−液相混合物を保持する段階、 前記第３固−液相混合物の固相と液体相とを分離する段
    階、および 前記第２結合試薬に結合した前記別分子標識手段の量を
    測定する段階、 を更に含む、請求の範囲第３項記載の方法。
  6. 【請求項６】前記第２結合試薬が、ウサギ抗−阻害物質
    抗体である、請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記別分子標識手段が、125I−ヤギ抗−ウ
    サギIgG抗体である、請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記第１結合試薬が、組織型プラスミノー
    ゲン活性化因子およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン
    活性化因子からなる群から選択され、前記第２結合試薬
    が、前記阻害物質と結合する多クローン性または単クロ
    ーン性受容体である、請求の範囲第５項記載の方法。
  9. 【請求項９】（ａ）動物宿主中で産生させたプラスミノ
    ーゲン活性化因子阻害物質に対する受容体と、 （ｂ）標識手段と、 を含む生化学試薬であって、前記受容体が、組織型また
    はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合し
    て阻害する特異性プラスミノーゲン活性化因子阻害物質
    に結合し、そして前記標識手段が、前記阻害物質に結合
    した前記受容体の存在を指示し、それにより分析すべき
    試料中の前記阻害物質の存在を指示することを特徴とす
    る生化学試薬。
  10. 【請求項１０】試料中のプラスミノーゲン活性化因子阻
    害物質の存在および量を検出するための診断装置であっ
    て、少なくとも１個の容器において、以下の要素： （ａ）活性成分としての有効量の生化学試薬であって、 動物宿主中で産生させたプラスミノーゲン活性化因子
    阻害物質に対する受容体と、 標識手段と、 を有し、前記受容体が、組織型またはウロキナーゼ型プ
    ラスミノーゲン活性化因子に結合して阻害する特異性プ
    ラスミノーゲン活性化因子阻害物質に結合し、そして前
    記標識手段が、前記阻害物質に結合した前記受容体の存
    在を指示し、それによって検定すべき試料中の前記阻害
    物質の存在を指示する生化学試薬、および （ｂ）組織型プラスミノーゲン活性化因子およびウロキ
    ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子からなる群から選
    択されるプラスミノーゲン活性化因子、 を含む診断装置。
  11. 【請求項１１】前記プラスミノーゲン活性化因子が、固
    相支持体としての固体マトリックスに結合している、請
    求の範囲第10項記載の診断装置。
  12. 【請求項１２】前記生化学試薬および前記プラスミノー
    ゲン活性化因子が別個に包装されている、請求の範囲第
    10項記載の診断装置。
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