JPH073427B2 - Ｈｂｃ抗体の測定法 - Google Patents
Ｈｂｃ抗体の測定法Info
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- JPH073427B2 JPH073427B2 JP60051678A JP5167885A JPH073427B2 JP H073427 B2 JPH073427 B2 JP H073427B2 JP 60051678 A JP60051678 A JP 60051678A JP 5167885 A JP5167885 A JP 5167885A JP H073427 B2 JPH073427 B2 JP H073427B2
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5761—Hepatitis B
- G01N33/5762—Hepatitis B core antigen
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景及び従来技術 Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（以下HBVと称する）に
よって引き起される疾病であり、臨床的にも疫学的にも
非常に重大な問題を含むが、いまだ有効な治療対策が見
出されていない。この疾病は世界中に広く分布している
が、とくにアジア、アフリカ地域に多発し適切な対策の
確立が要望されている。
よって引き起される疾病であり、臨床的にも疫学的にも
非常に重大な問題を含むが、いまだ有効な治療対策が見
出されていない。この疾病は世界中に広く分布している
が、とくにアジア、アフリカ地域に多発し適切な対策の
確立が要望されている。
HBVは直径42nmの球型ウイルスであり、それぞれ別の抗
原性をもつ外被（surface）と芯（core）からなり、そ
れぞれHBs抗原およびHBc抗原と呼ばれている。
原性をもつ外被（surface）と芯（core）からなり、そ
れぞれHBs抗原およびHBc抗原と呼ばれている。
さらにHBVに関連した抗原としてMagniusらが明らかにし
たHBe抗原〔ジャーナル．イムノロジー（J.Immunolog
y）160,1017（1972）〕が知られている。HBVに関連した
抗原・抗体系としては、HBs抗原・抗体系、HBc抗原・抗
体系、HBe抗原・抗体系がある。これらのうち、流血中
にはほとんど存在しないHBc抗原を除いて、他の５つの
抗原・抗体は、現在PHA法、ｒ−PHA法、EIA法、RIA法等
の免疫学的測定法により測定が可能となっている。その
うちHBVの感染性の指標として重要な意義を担っているH
Be抗原は、HBc抗原蛋白の一種の誘導体である。HBc遺伝
子産物が完全な粒子状に会合した状態ではHBcとしての
抗原性を示し、逆に解離するとHBeとしての別の抗原性
を示すようになると考えられている。［肝胆膵10,7−13
（1985）］ このような知見からもHBc抗原を用いたHBc抗体測定の意
義がきわめて大きいことがうかがわれる。
たHBe抗原〔ジャーナル．イムノロジー（J.Immunolog
y）160,1017（1972）〕が知られている。HBVに関連した
抗原・抗体系としては、HBs抗原・抗体系、HBc抗原・抗
体系、HBe抗原・抗体系がある。これらのうち、流血中
にはほとんど存在しないHBc抗原を除いて、他の５つの
抗原・抗体は、現在PHA法、ｒ−PHA法、EIA法、RIA法等
の免疫学的測定法により測定が可能となっている。その
うちHBVの感染性の指標として重要な意義を担っているH
Be抗原は、HBc抗原蛋白の一種の誘導体である。HBc遺伝
子産物が完全な粒子状に会合した状態ではHBcとしての
抗原性を示し、逆に解離するとHBeとしての別の抗原性
を示すようになると考えられている。［肝胆膵10,7−13
（1985）］ このような知見からもHBc抗原を用いたHBc抗体測定の意
義がきわめて大きいことがうかがわれる。
またHBc抗体は血中において肝臓内のHBV量と平行した動
向をとることが知られている。血中HBc抗体の測定は、H
Bs抗原およびHBe抗原・抗体では知り得ない肝臓内のHBV
の増殖または鎮静を知るには欠くことのできないもので
ある。本発明はこのような特性をもつHBc抗体の測定法
に関するものである。
向をとることが知られている。血中HBc抗体の測定は、H
Bs抗原およびHBe抗原・抗体では知り得ない肝臓内のHBV
の増殖または鎮静を知るには欠くことのできないもので
ある。本発明はこのような特性をもつHBc抗体の測定法
に関するものである。
ところで前記した如く、HBc抗体を測定するために必要
なHBc抗原は流血中には存在せず、ヒト肝臓からしか得
られず、採取の際の感染の危険がきわめて高く、製造上
多くの制約があり、ヒト由来のHBc抗原は研究室レベル
でのHBc抗体の測定にしか使用されていないのが現状で
ある。
なHBc抗原は流血中には存在せず、ヒト肝臓からしか得
られず、採取の際の感染の危険がきわめて高く、製造上
多くの制約があり、ヒト由来のHBc抗原は研究室レベル
でのHBc抗体の測定にしか使用されていないのが現状で
ある。
最近HBc抗原を大量に取得する方法として、組換えDNA技
術の利用が提案され、HBc抗原を大腸菌に発現せしめた
ものをヒツジ赤血球に感作して作製したHBc抗体検出用P
HA法試薬がすでに市販されている。〔臨床検査28,1227-
1232（1984）〕 このPHA試薬は臨床的にも使用でき、それ相応の結果を
得ているものの、感度的にいまだ十分に満足できうるも
のでなく、また大腸菌により産生したHBc抗原は大腸菌
内で壊れ易く、HBc抗原によって大腸菌の増殖が阻害さ
れるといわれている。
術の利用が提案され、HBc抗原を大腸菌に発現せしめた
ものをヒツジ赤血球に感作して作製したHBc抗体検出用P
HA法試薬がすでに市販されている。〔臨床検査28,1227-
1232（1984）〕 このPHA試薬は臨床的にも使用でき、それ相応の結果を
得ているものの、感度的にいまだ十分に満足できうるも
のでなく、また大腸菌により産生したHBc抗原は大腸菌
内で壊れ易く、HBc抗原によって大腸菌の増殖が阻害さ
れるといわれている。
発明の目的 本発明は、かかるHBc抗体測定の現状にかんがみなされ
たものであり、HBc抗原として組換えDNA技術を利用して
HBc抗原を酵母に発現せしめた酵母産生HBc抗原を用いる
ことを特徴とする。すなわち本発明者等は、先に組換え
DNA技術を利用し、HBc抗原を酵母菌に発現せしめること
に成功し、〔細胞工学3,367-370（1984）〕さらにこの
菌体よりHBc抗原を高度に精製する方法を見出すに至っ
た。本発明はかかるHBc抗原を用い、従来入手の困難で
あったHBc抗原を多量に安定的に供給して、臨床的にも
有効に測定できる高感度なHBc抗体の免疫学的測定法を
提供するものである。
たものであり、HBc抗原として組換えDNA技術を利用して
HBc抗原を酵母に発現せしめた酵母産生HBc抗原を用いる
ことを特徴とする。すなわち本発明者等は、先に組換え
DNA技術を利用し、HBc抗原を酵母菌に発現せしめること
に成功し、〔細胞工学3,367-370（1984）〕さらにこの
菌体よりHBc抗原を高度に精製する方法を見出すに至っ
た。本発明はかかるHBc抗原を用い、従来入手の困難で
あったHBc抗原を多量に安定的に供給して、臨床的にも
有効に測定できる高感度なHBc抗体の免疫学的測定法を
提供するものである。
発明の構成および効果 （１）HBc抗原の精製 組換えDNA技術を利用した組換え体により産生されるHBc
抗原の精製については、本発明者らは次の方法がきわめ
て有効であることを見出している。〔特願昭59-271432
号〕 ここで酵母産生HBc抗原とは、組換えDNA技術を利用し
て、HBc抗原を産生するように形質転換された組換え
体、すなわち酵母菌を適当な培地および培養条件で培養
してHBc抗原を産生、蓄積させたのちに、この培養物か
ら適当な方法でHBc抗原を精製して得られるものであ
る。
抗原の精製については、本発明者らは次の方法がきわめ
て有効であることを見出している。〔特願昭59-271432
号〕 ここで酵母産生HBc抗原とは、組換えDNA技術を利用し
て、HBc抗原を産生するように形質転換された組換え
体、すなわち酵母菌を適当な培地および培養条件で培養
してHBc抗原を産生、蓄積させたのちに、この培養物か
ら適当な方法でHBc抗原を精製して得られるものであ
る。
このようなHBc抗原を産生し得る組換え体は、本発明者
らにより発現せしめたもので、例えば下記のようにして
調製される。
らにより発現せしめたもので、例えば下記のようにして
調製される。
HBVの全DNA配列を含むプラスミドpHBV（特願昭57-14509
3号を参照）を制限酵素、例えばRsaIで消化して得られ
るHBc遺伝子を含むDNA配列をプラスミドpACYC177のXho
Iサイトに組込んで組換えプラスミドpAHBcを得る。この
pAHBcを制限酵素Xho Iで消化して得られるHBc遺伝子を
含むDNA配列をシヤトルベクターpAN82（特願昭57-14509
3号を参照）のXho Iサイトに組込んでHBc発現用プラス
ミドpAC301を得る。
3号を参照）を制限酵素、例えばRsaIで消化して得られ
るHBc遺伝子を含むDNA配列をプラスミドpACYC177のXho
Iサイトに組込んで組換えプラスミドpAHBcを得る。この
pAHBcを制限酵素Xho Iで消化して得られるHBc遺伝子を
含むDNA配列をシヤトルベクターpAN82（特願昭57-14509
3号を参照）のXho Iサイトに組込んでHBc発現用プラス
ミドpAC301を得る。
別法として、５′末端側のプレＣ領域を除くために上記
pHBcを制限酵素Xho Iで部分消化し、T4DNA合成酵素で付
着末端（cohesive end）を平滑末端（flush end）にし
たのち、EcoR IリンカーをつけてXho IサイトをEcoR I
サイトに加える。ついで、HBc遺伝子の５′側のXho Iサ
イトがEcoR Iサイトにかわったプラスミドを選ぶ。この
ようにして得られたプラスミドpHBc IをEcoR Iで消化
し、さらにBAL31で消化したのちSal Iリンカーを付け、
これを制限酵素Xho I、Sal Iで消化して約600bpのプレ
Ｃ領域の除かれたHBc遺伝子断片を得る。これをシヤト
ルベクターpAM81（特願昭57-145093号を参照）のSal I
サイトに組込み、HBc発現用ベクターpAC701を得る。
pHBcを制限酵素Xho Iで部分消化し、T4DNA合成酵素で付
着末端（cohesive end）を平滑末端（flush end）にし
たのち、EcoR IリンカーをつけてXho IサイトをEcoR I
サイトに加える。ついで、HBc遺伝子の５′側のXho Iサ
イトがEcoR Iサイトにかわったプラスミドを選ぶ。この
ようにして得られたプラスミドpHBc IをEcoR Iで消化
し、さらにBAL31で消化したのちSal Iリンカーを付け、
これを制限酵素Xho I、Sal Iで消化して約600bpのプレ
Ｃ領域の除かれたHBc遺伝子断片を得る。これをシヤト
ルベクターpAM81（特願昭57-145093号を参照）のSal I
サイトに組込み、HBc発現用ベクターpAC701を得る。
上記発現用ベクターを酵母菌サッカロミセス・セレビシ
エAH22〔a leu2 his4 canl（Cir+）〕（微工研条寄第31
2号）に上記日本特許出願に記載の方法と同様にして形
質転換させることによりHBc抗原産生能を有する形質転
換酵母サッカロミセス・セレビシエpAC301およびサッカ
ロミセス・セレビシエpA701が得られる。
エAH22〔a leu2 his4 canl（Cir+）〕（微工研条寄第31
2号）に上記日本特許出願に記載の方法と同様にして形
質転換させることによりHBc抗原産生能を有する形質転
換酵母サッカロミセス・セレビシエpAC301およびサッカ
ロミセス・セレビシエpA701が得られる。
これら形質転換酵母を常法により培養して所望の組換え
体培養物が得られる。
体培養物が得られる。
上記の培養物からHBc抗原を抽出精製する方法として
は、まず培養物から遠心分離により菌体を分離し、適当
な緩衝液中で破砕する。破砕の方法としては、超音波破
砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーリン破砕、ある
いは細胞の細胞壁を酵素的に溶解せしめてスフェロプラ
ストとしたのち、これに界面活性剤を作用させて破壊す
るなどの種々の方法またはこれらの組み合わせを用いる
ことができる。この細胞破壊物を低速遠心分離にかけ、
細胞壁破片などを分離し、さらに必要に応じてメンブラ
ンフィルターで濾過してHBc抗原原材料とする。
は、まず培養物から遠心分離により菌体を分離し、適当
な緩衝液中で破砕する。破砕の方法としては、超音波破
砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーリン破砕、ある
いは細胞の細胞壁を酵素的に溶解せしめてスフェロプラ
ストとしたのち、これに界面活性剤を作用させて破壊す
るなどの種々の方法またはこれらの組み合わせを用いる
ことができる。この細胞破壊物を低速遠心分離にかけ、
細胞壁破片などを分離し、さらに必要に応じてメンブラ
ンフィルターで濾過してHBc抗原原材料とする。
このHBc抗原原材料に酸を添加し、pHを酸性側に移行せ
しめ、クロマトグラフィの妨げとなる脂質類や夾雑蛋白
質の大部分を沈澱物として、HBc抗原と分別して除去す
る。その後陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグ
ラフィさらには密度勾配遠心を行なえば、HBc抗原を高
度に精製できる。
しめ、クロマトグラフィの妨げとなる脂質類や夾雑蛋白
質の大部分を沈澱物として、HBc抗原と分別して除去す
る。その後陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグ
ラフィさらには密度勾配遠心を行なえば、HBc抗原を高
度に精製できる。
酸添加処理に用いる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸な
どの無機酸類および、酢酸、シュウ酸などの有機酸類な
どが挙げられる。酸添加処理の方法は、原材料液のpHが
６以下、好ましくは5.0〜5.5の範囲に収まるように酸を
加えてpHの調製を行なう。酸処理の温度は20℃以下、好
ましくは４〜10℃とするのがよい。pH調整後、析出した
沈澱物を遠心分離し、HBc抗原を含む上清液を得る。
どの無機酸類および、酢酸、シュウ酸などの有機酸類な
どが挙げられる。酸添加処理の方法は、原材料液のpHが
６以下、好ましくは5.0〜5.5の範囲に収まるように酸を
加えてpHの調製を行なう。酸処理の温度は20℃以下、好
ましくは４〜10℃とするのがよい。pH調整後、析出した
沈澱物を遠心分離し、HBc抗原を含む上清液を得る。
つぎに必要であれば、硫安塩析による精製および濃縮の
操作を行なう。酸添加処理によって得られたHBc抗原含
有上清液に、適当な濃度のアンモニア水を加え、上清液
のpHを6.0〜8.0の範囲に保ちながら硫安を添加し、HBc
抗原を沈澱させ、これを遠心分離にかけ上清と分離す
る。得られた沈澱をイオン強度が0.001〜1.0程度である
中性付近の適当な緩衝液、例えば、0.1Mリン酸緩衝液な
どに溶解し、これを同緩衝液に透析して陰イオン交換体
によるクロマトグラフィに付するための材料とする。
操作を行なう。酸添加処理によって得られたHBc抗原含
有上清液に、適当な濃度のアンモニア水を加え、上清液
のpHを6.0〜8.0の範囲に保ちながら硫安を添加し、HBc
抗原を沈澱させ、これを遠心分離にかけ上清と分離す
る。得られた沈澱をイオン強度が0.001〜1.0程度である
中性付近の適当な緩衝液、例えば、0.1Mリン酸緩衝液な
どに溶解し、これを同緩衝液に透析して陰イオン交換体
によるクロマトグラフィに付するための材料とする。
硫安塩析を実施しない場合は、HBc抗原含有上清液にア
ンモニア水を加えてpHを約7.0に調整したのち、前記と
同様の緩衝液で希釈あるいは透析することによりクロマ
トグラフィ用材料とする。
ンモニア水を加えてpHを約7.0に調整したのち、前記と
同様の緩衝液で希釈あるいは透析することによりクロマ
トグラフィ用材料とする。
本発明において用いる陰イオン交換体としてはジエチル
アミノエチルを官能基とする陰イオン交換体が最も有効
であり、DEAE−セファデックスＡ・25,DEAE−セファデ
ックスＡ−50,DEAE−セファローズ,DEAE−セファセル
（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）,DEAEバ
イオ・ゲルA,セレックスＤ（バイオ・ラッド社製）,DEA
E−セルロファイン（生化学工業株式会社製）の名称で
市販されており、これらのものがすべて用いられる。こ
の陰イオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィ
は下記の方法で行なわれる。
アミノエチルを官能基とする陰イオン交換体が最も有効
であり、DEAE−セファデックスＡ・25,DEAE−セファデ
ックスＡ−50,DEAE−セファローズ,DEAE−セファセル
（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）,DEAEバ
イオ・ゲルA,セレックスＤ（バイオ・ラッド社製）,DEA
E−セルロファイン（生化学工業株式会社製）の名称で
市販されており、これらのものがすべて用いられる。こ
の陰イオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィ
は下記の方法で行なわれる。
陰イオン交換体へのHBc抗原の吸着は、カラム法および
バッチ法の両方法が実施可能である。カラム法の場合、
陰イオン交換体を充填したカラムに、クロマトグラフィ
用材料調製時に用いたと同一の緩衝液を通液して平衡化
を行なったのち、該材料を通液し、HBc抗原を吸着させ
ることにより、宿主由来の夾雑物質を分離する。通液終
了後、平衡化緩衝液を通液し、カラムを洗浄して夾雑物
を洗い出したのち、下記溶出操作に付す。
バッチ法の両方法が実施可能である。カラム法の場合、
陰イオン交換体を充填したカラムに、クロマトグラフィ
用材料調製時に用いたと同一の緩衝液を通液して平衡化
を行なったのち、該材料を通液し、HBc抗原を吸着させ
ることにより、宿主由来の夾雑物質を分離する。通液終
了後、平衡化緩衝液を通液し、カラムを洗浄して夾雑物
を洗い出したのち、下記溶出操作に付す。
またバッチ法の場合は、緩衝液にて平衡化した陰イオン
交換体を材料液に添加し、緩い速度にて0.5〜２時間程
度攪拌してHBc抗原を吸着させる。吸着後、濾過器上で
陰イオン交換体を濾集し、このゲルに平衡化緩衝液を加
えて、洗浄、濾過分離を数回繰り返したのち溶出操作に
付す。なお、このバッチ法による吸着の場合も、溶出に
際しては、HBc抗原を吸着した陰イオン交換体をカラム
に充填してカラムによる溶出を実施するのが好ましい。
交換体を材料液に添加し、緩い速度にて0.5〜２時間程
度攪拌してHBc抗原を吸着させる。吸着後、濾過器上で
陰イオン交換体を濾集し、このゲルに平衡化緩衝液を加
えて、洗浄、濾過分離を数回繰り返したのち溶出操作に
付す。なお、このバッチ法による吸着の場合も、溶出に
際しては、HBc抗原を吸着した陰イオン交換体をカラム
に充填してカラムによる溶出を実施するのが好ましい。
溶出は、イオン強度が0.01〜0.5程度であり、かつ平衡
化緩衝液よりイオン強度が大である中性付近の緩衝液を
用いて、段階溶出あるいは濃度勾配溶出を実施し、吸着
夾雑物質とHBc抗原を分離溶出させ、HBc抗原を含有する
フラクションを分取する。濃度勾配溶出は、例えば、0.
01M→0.5Mのリン酸緩衝液濃度勾配を用いてもよいし、
0.01Mリン酸緩衝液食塩添加0.01→0.5M濃度勾配を用い
てもよく、さらにHBc抗原と夾雑物質との分離が良好な
他の適当な濃度勾配緩衝液を用いてもよい。段階溶出の
場合は、HBc抗原と夾雑物質のいずれか一方のみが溶出
されるイオン強度の緩衝液を通液し、続いて、イオン強
度の大きい緩衝液を通液することにより、高度に精製さ
れたHBc抗原を含有するフラクションを分取する。
化緩衝液よりイオン強度が大である中性付近の緩衝液を
用いて、段階溶出あるいは濃度勾配溶出を実施し、吸着
夾雑物質とHBc抗原を分離溶出させ、HBc抗原を含有する
フラクションを分取する。濃度勾配溶出は、例えば、0.
01M→0.5Mのリン酸緩衝液濃度勾配を用いてもよいし、
0.01Mリン酸緩衝液食塩添加0.01→0.5M濃度勾配を用い
てもよく、さらにHBc抗原と夾雑物質との分離が良好な
他の適当な濃度勾配緩衝液を用いてもよい。段階溶出の
場合は、HBc抗原と夾雑物質のいずれか一方のみが溶出
されるイオン強度の緩衝液を通液し、続いて、イオン強
度の大きい緩衝液を通液することにより、高度に精製さ
れたHBc抗原を含有するフラクションを分取する。
このようにして得られたHBc抗原を、さらに、蔗糖ステ
ップグラディエント遠心または蔗糖リニアグラディエン
ト遠心、次いで、塩化セシウムを用いた沈降平衡遠心ま
たはリニアグラディエント遠心にかけることにより、高
度に精製されたHBc抗原を得ることができる。
ップグラディエント遠心または蔗糖リニアグラディエン
ト遠心、次いで、塩化セシウムを用いた沈降平衡遠心ま
たはリニアグラディエント遠心にかけることにより、高
度に精製されたHBc抗原を得ることができる。
このようにして得られたHBc抗原は、PHA法、ｒ−PHA
法、EIA法、RIA法その他任意のHBc抗体の免疫学的測定
法のHBc抗原として有利に使用できる。以下に示すとお
りである。
法、EIA法、RIA法その他任意のHBc抗体の免疫学的測定
法のHBc抗原として有利に使用できる。以下に示すとお
りである。
（２）受身担体疑集反応による測定（PHA法） 前記のとおり精製したHBc抗原を、適当な担体にタンニ
ン酸等を用いて感作して、受身担体凝集反応用感作担体
を作製する。このときの担体としては、たとえばホルマ
リン、グルタルアルデハイド等で固定した哺乳類又は鳥
類の赤血球、もしくは人工担体が用いられる。人工担体
としては、ラテックス（スチレン重合体）粒子、ゼラチ
ン、エポキシ樹脂、セルロース樹脂、活性炭末などが用
いられる。このようにして作製した抗原感作担体は、あ
る量の感作抗原に対する抗体が存在するとき特有の凝集
像を示す。この為この凝集像を判定することにより、HB
c抗体の測定ができる。
ン酸等を用いて感作して、受身担体凝集反応用感作担体
を作製する。このときの担体としては、たとえばホルマ
リン、グルタルアルデハイド等で固定した哺乳類又は鳥
類の赤血球、もしくは人工担体が用いられる。人工担体
としては、ラテックス（スチレン重合体）粒子、ゼラチ
ン、エポキシ樹脂、セルロース樹脂、活性炭末などが用
いられる。このようにして作製した抗原感作担体は、あ
る量の感作抗原に対する抗体が存在するとき特有の凝集
像を示す。この為この凝集像を判定することにより、HB
c抗体の測定ができる。
なお、抗原感作担体は１％正常ウサギ血清（NRS）と0.1
％窒化ソーダを含む燐酸緩衝食塩水（PBS）中に保存す
れば、必要に応じて随時使用できる。
％窒化ソーダを含む燐酸緩衝食塩水（PBS）中に保存す
れば、必要に応じて随時使用できる。
（３）EIA法、またはRIA法による測定 EIA法あるいはRIA法によるときは、担体としてポリスチ
レンビーズ、ポリスチレンチューブ、ELISA用平底プレ
ート（ヌンク社製イミュノプレート、ダイナテック社製
イミュロンプレート等）が利用できる。
レンビーズ、ポリスチレンチューブ、ELISA用平底プレ
ート（ヌンク社製イミュノプレート、ダイナテック社製
イミュロンプレート等）が利用できる。
（３・１）感作方法 固相担体に対する抗原感作は非特異的吸着による方法あ
るいはグルタルアルデハイド等の架橋試薬を用いる方法
がある。
るいはグルタルアルデハイド等の架橋試薬を用いる方法
がある。
非特異的吸着による場合は、pH9〜10のたとえば炭酸バ
ッファーにHBc抗原の適度な量を含む抗原液を調製し、
この液に浸漬（ビーズ等の場合）するか、またはウェル
あるいはチューブに適量入れて、十分な時間をかけて固
相に吸着せしめる。時間としては37℃、２時間あるいは
４℃一晩静置が好ましい。ついで非特異反応を低減する
ため、１％の牛アルブミン（BSA）を含むPBS等で同様に
処理して固相を調製する。
ッファーにHBc抗原の適度な量を含む抗原液を調製し、
この液に浸漬（ビーズ等の場合）するか、またはウェル
あるいはチューブに適量入れて、十分な時間をかけて固
相に吸着せしめる。時間としては37℃、２時間あるいは
４℃一晩静置が好ましい。ついで非特異反応を低減する
ため、１％の牛アルブミン（BSA）を含むPBS等で同様に
処理して固相を調製する。
グルタルアルデハイド等の架橋試薬を用いる場合は、固
相を数％の架橋試薬を含むPH9〜10のたとえば炭酸バッ
ファーで十分な時間処理する。時間としては37℃２時間
あるいは４℃一晩静置が好ましい。その後前記と同様の
方法により抗原およびBSAを感作し固相を調製する。
相を数％の架橋試薬を含むPH9〜10のたとえば炭酸バッ
ファーで十分な時間処理する。時間としては37℃２時間
あるいは４℃一晩静置が好ましい。その後前記と同様の
方法により抗原およびBSAを感作し固相を調製する。
（３・２）測定方法 調製した固相を用いてHBc抗体を測定する方法には非競
合法と競合法がある。
合法と競合法がある。
・非競合法 非競合法による場合は、固相と検体を反応させた後、固
相を洗浄する。ついでHBc抗原に反応したIgGを検出する
ため、検体がヒト由来の場合は、パーオキシダーゼ等の
酵素で標識した抗ヒトIgG抗体又はプロティンＡを反応
させる。洗浄後標識された酵素の働きで発色する基質を
加えた後、適当な停止液を加えて反応を停止し、反応液
の発色の度合いを光度計で測定する。
相を洗浄する。ついでHBc抗原に反応したIgGを検出する
ため、検体がヒト由来の場合は、パーオキシダーゼ等の
酵素で標識した抗ヒトIgG抗体又はプロティンＡを反応
させる。洗浄後標識された酵素の働きで発色する基質を
加えた後、適当な停止液を加えて反応を停止し、反応液
の発色の度合いを光度計で測定する。
・競合法 競合法による場合は、固相と検体を反応させる際、一定
量の酵素標識抗HBc抗体を同時に存在させておくと、検
体中の抗HBc抗体と酵素標識抗HBc抗体が固相上の抗原を
奪い合う（競合）形になり、反応後前記と同様に発色操
作を行なうと、抗体中に存在する抗HBc抗体の存在量に
比例して発色の度合いが低くなる。
量の酵素標識抗HBc抗体を同時に存在させておくと、検
体中の抗HBc抗体と酵素標識抗HBc抗体が固相上の抗原を
奪い合う（競合）形になり、反応後前記と同様に発色操
作を行なうと、抗体中に存在する抗HBc抗体の存在量に
比例して発色の度合いが低くなる。
RIA法による場合は、EIA法で用いた酵素標識抗ヒトIgG
抗体のかわりに、ラジオアイソトープ標識抗ヒトIgG抗
体あるいはラジオアイソトープ標識プロティンＡを、酵
素標識抗HBc抗体のかわりに、ラジオアイソトープ標識
抗HBc抗体を用い、そして標識に使用したラジオアイソ
トープを検出できる適当な機器を用いて、放射能を測定
することにより、全く同じ原理によりHBc抗体の測定が
できる。
抗体のかわりに、ラジオアイソトープ標識抗ヒトIgG抗
体あるいはラジオアイソトープ標識プロティンＡを、酵
素標識抗HBc抗体のかわりに、ラジオアイソトープ標識
抗HBc抗体を用い、そして標識に使用したラジオアイソ
トープを検出できる適当な機器を用いて、放射能を測定
することにより、全く同じ原理によりHBc抗体の測定が
できる。
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
HBc抗原の調製例１ 組換え酵母サッカロミセス・セレビシエAH22pho80/pAC7
01を培養後、遠心により集菌した菌体約600gに50mMリン
酸緩衝液（pH7.2）3lを加え、これを600kg/cm2の圧力で
約３時間、マントンゴーリン破砕機にかけ、菌体を破壊
する。菌体破壊物を遠心にかけ、粗大菌体破片を分離し
て、HBe抗原活性約30,000cpm〔400倍希釈、RIAキット:H
BeRIAキット（アボット社製）〕であるHBc抗原粗抽出液
を得る。
01を培養後、遠心により集菌した菌体約600gに50mMリン
酸緩衝液（pH7.2）3lを加え、これを600kg/cm2の圧力で
約３時間、マントンゴーリン破砕機にかけ、菌体を破壊
する。菌体破壊物を遠心にかけ、粗大菌体破片を分離し
て、HBe抗原活性約30,000cpm〔400倍希釈、RIAキット:H
BeRIAキット（アボット社製）〕であるHBc抗原粗抽出液
を得る。
次いで、pHメーターでチェックしつつ粗抽出液に酢酸を
滴下し、pHを5.4に調製する。４℃で約30分間攪拌した
のち、遠心により沈澱物を除去する。遠心上清にアンモ
ニア水を加えて、pHを約6.5に保ちつつ、最終濃度2.5M
となるように硫安を徐々に加える。４℃で30分間攪拌
し、１晩放置後、遠心によりHBc抗原を含有する沈澱を
分離回収する。
滴下し、pHを5.4に調製する。４℃で約30分間攪拌した
のち、遠心により沈澱物を除去する。遠心上清にアンモ
ニア水を加えて、pHを約6.5に保ちつつ、最終濃度2.5M
となるように硫安を徐々に加える。４℃で30分間攪拌
し、１晩放置後、遠心によりHBc抗原を含有する沈澱を
分離回収する。
回収した沈澱を、10mMリン酸緩衝液、50mM塩化カリウム
（pH7.3）約300mlに懸濁させ、透析チューブにて、約10
0倍量の同緩衝液に対して透析する。透析後、10mMリン
酸緩衝液、50mM塩化カリウム（pH7.3）で約３倍に希釈
し、同緩衝液で平衡化しておいたDEAE−セルロースカラ
ム（ゲル量約１）に添加し、HBc抗原を吸着させる。
平衡化緩衝液でカラムを充分に洗浄したのち、約4.0lの
50mM→500mM塩化カリウム濃度勾配リン酸緩衝液を通液
して溶出を行ない、HBc抗原を含むフラクションを集め
る。
（pH7.3）約300mlに懸濁させ、透析チューブにて、約10
0倍量の同緩衝液に対して透析する。透析後、10mMリン
酸緩衝液、50mM塩化カリウム（pH7.3）で約３倍に希釈
し、同緩衝液で平衡化しておいたDEAE−セルロースカラ
ム（ゲル量約１）に添加し、HBc抗原を吸着させる。
平衡化緩衝液でカラムを充分に洗浄したのち、約4.0lの
50mM→500mM塩化カリウム濃度勾配リン酸緩衝液を通液
して溶出を行ない、HBc抗原を含むフラクションを集め
る。
この集めたフラクションをプールし、限外濾過濃縮装置
アミコンTCF-10（アミコン社製）により濃縮を行ない、
超遠心チューブに60％蔗糖溶液、20％蔗糖溶液、HBc抗
原濃縮液をそれぞれ、10ml,35ml,35ml重層し、30,000rp
m,4℃で19時間超遠心を行ない、HBc抗原を蔗糖液層界面
に濃縮、精製する。
アミコンTCF-10（アミコン社製）により濃縮を行ない、
超遠心チューブに60％蔗糖溶液、20％蔗糖溶液、HBc抗
原濃縮液をそれぞれ、10ml,35ml,35ml重層し、30,000rp
m,4℃で19時間超遠心を行ない、HBc抗原を蔗糖液層界面
に濃縮、精製する。
塩化セシウムを1.32g/mlの濃度となるように加えて、3
0,000rpm、４℃で60時間超遠心し、濃縮、精製されたHB
c抗原を得る。
0,000rpm、４℃で60時間超遠心し、濃縮、精製されたHB
c抗原を得る。
各工程までのHBc抗原の回収率および精製度を第１表に
示す。
示す。
HBc抗原の調製例２ 組換え酵母サッカロミセス・セレビシエAH22pho80/pAC7
01を培養後、遠心により集菌した菌体（100g）に50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2）500mlを加え、これを約90分間、４
℃で超音波処理にかけ、菌体を破壊する。これを実施例
１と同様にして遠心により菌体破片を除き、粗抽出液を
得る。
01を培養後、遠心により集菌した菌体（100g）に50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2）500mlを加え、これを約90分間、４
℃で超音波処理にかけ、菌体を破壊する。これを実施例
１と同様にして遠心により菌体破片を除き、粗抽出液を
得る。
この粗抽出液について実施例１と同様に精製処理してHB
c抗原を得る。各工程までのHBc抗原の回収率および精製
度を第２表に示す。
c抗原を得る。各工程までのHBc抗原の回収率および精製
度を第２表に示す。
HBc抗原の調製例３ 組換え酵母サッカロミセス・セレビシエAH22pho80/pAC7
01を培養後、遠心により集菌した菌体（200g）に100μg
/mlのザイモリエース（生化学工業製）を含む50mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.2）600mlを加え、30℃で30分間
攪拌し、遠心してスフェロプラスト化した酵母を沈澱と
して得る。この沈澱に0.1％トリトンX100を含む50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2）200mlを加え、室温で１時間攪拌
し、溶菌液を得、これを遠心して菌体破片を除き、粗抽
出液を得る。
01を培養後、遠心により集菌した菌体（200g）に100μg
/mlのザイモリエース（生化学工業製）を含む50mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.2）600mlを加え、30℃で30分間
攪拌し、遠心してスフェロプラスト化した酵母を沈澱と
して得る。この沈澱に0.1％トリトンX100を含む50mMリ
ン酸緩衝液（pH7.2）200mlを加え、室温で１時間攪拌
し、溶菌液を得、これを遠心して菌体破片を除き、粗抽
出液を得る。
この抽出液に40％（w/w）ポリエチレングリコール6000
を加えて、ポリエチレングリコール最終濃度３％とす
る。４℃で１時間攪拌後、遠心により上清を除き、沈澱
に10mMリン酸カリウム緩衝液、50mM塩化カリウム（pH7.
2）80mlを加えて、懸濁する。この懸濁液を５分間超音
波処理して可溶化する。これを10mMリン酸カリウム緩衝
液、50mMKCl（pH7.2）に対して４℃一晩透析後、DEAE−
セルロースに添加する。以下、実施例１と同様にして精
製処理してHBc抗原を得る。各工程までのHBc抗原の回収
率および精製度を第３表に示す。
を加えて、ポリエチレングリコール最終濃度３％とす
る。４℃で１時間攪拌後、遠心により上清を除き、沈澱
に10mMリン酸カリウム緩衝液、50mM塩化カリウム（pH7.
2）80mlを加えて、懸濁する。この懸濁液を５分間超音
波処理して可溶化する。これを10mMリン酸カリウム緩衝
液、50mMKCl（pH7.2）に対して４℃一晩透析後、DEAE−
セルロースに添加する。以下、実施例１と同様にして精
製処理してHBc抗原を得る。各工程までのHBc抗原の回収
率および精製度を第３表に示す。
実施例１ 〔羊赤血球の固定〕 羊の血液を100ml採血し、オルセバ液100mlと混合し、ガ
ーゼ濾過し、ヘマトクリットにより血球の濃度を測定し
た。
ーゼ濾過し、ヘマトクリットにより血球の濃度を測定し
た。
生理食塩液で５回洗浄し、その後Methods in Immunolog
y and Immunochemistry,IV.33〜34（1977）（WILLIAMS,
CHASE編Academic Press New York）のAbram B,Stavitsk
yの記載に従い、ホルマリン固定羊血球を調製した。
y and Immunochemistry,IV.33〜34（1977）（WILLIAMS,
CHASE編Academic Press New York）のAbram B,Stavitsk
yの記載に従い、ホルマリン固定羊血球を調製した。
すなわち、洗浄遠心した赤血球沈澱の容量の８倍量の冷
３％ホルムアルデヒド生理食塩液を加え４℃24時間ゆっ
くり攪拌する。更に赤血球沈澱の容量の２倍量の冷37％
ホルムアルデヒド溶液を追加し、４℃24時間攪拌する。
それから、赤血球はガーゼで濾過し、生理食塩液で８回
洗浄し、PBSで2.5％になるように懸濁し、1/100量窒化
ソーダを加え４℃に保存する。
３％ホルムアルデヒド生理食塩液を加え４℃24時間ゆっ
くり攪拌する。更に赤血球沈澱の容量の２倍量の冷37％
ホルムアルデヒド溶液を追加し、４℃24時間攪拌する。
それから、赤血球はガーゼで濾過し、生理食塩液で８回
洗浄し、PBSで2.5％になるように懸濁し、1/100量窒化
ソーダを加え４℃に保存する。
前記固定羊赤血球をPBSで２回洗浄し、PBS中赤血球濃度
が2.5％になるように懸濁した。Methods in Immunology
and Immunochemistry,IV.36（前出）を参考に、抗原を
感作した。すなわち、タンニン酸をPBSで0.0005％に希
釈し、30mlの2.5％羊赤血球と等量混合し、37℃で45分
反応させた。その後、PBSで３回洗浄し、赤血球濃度が
2.5％になるようにPBSに再懸濁した。HBc抗原調製例１
で精製したHBc抗原をPBSでOD280＝0.005〜0.2になるよ
うに希釈し、タンニン酸処理血球と等量混合し37℃で30
分感作した。その後、PBSで３回洗浄し、１％正常ウサ
ギ血清（NRS）と0.1％窒化ソーダを含むPBSに0.75％に
なるように懸濁し感作血球を100ml得た。
が2.5％になるように懸濁した。Methods in Immunology
and Immunochemistry,IV.36（前出）を参考に、抗原を
感作した。すなわち、タンニン酸をPBSで0.0005％に希
釈し、30mlの2.5％羊赤血球と等量混合し、37℃で45分
反応させた。その後、PBSで３回洗浄し、赤血球濃度が
2.5％になるようにPBSに再懸濁した。HBc抗原調製例１
で精製したHBc抗原をPBSでOD280＝0.005〜0.2になるよ
うに希釈し、タンニン酸処理血球と等量混合し37℃で30
分感作した。その後、PBSで３回洗浄し、１％正常ウサ
ギ血清（NRS）と0.1％窒化ソーダを含むPBSに0.75％に
なるように懸濁し感作血球を100ml得た。
ヒト血清45例をマイクロタイタープレートで２倍連続希
釈した。希釈液は１％NRSを含むPBSを用いた。希釈後、
感作血球を加え、室温で２時間静置し、凝集パターンに
より抗体価を判定した。その結果をPHA法（Ａ社、大腸
菌由来HBc抗原を使用）及びRIA法（Ｂ社、ヒト由来HBc
抗原を使用）と比較して第４表に示した。
釈した。希釈液は１％NRSを含むPBSを用いた。希釈後、
感作血球を加え、室温で２時間静置し、凝集パターンに
より抗体価を判定した。その結果をPHA法（Ａ社、大腸
菌由来HBc抗原を使用）及びRIA法（Ｂ社、ヒト由来HBc
抗原を使用）と比較して第４表に示した。
本発明におけるPHA法及び、PHA法（Ａ社）の力価は2n表
示のｎの値であり、ｎが５以上を陽性、５未満は陰性と
判定した。RIA法（Ｂ社）の場合は力価を阻害率％で表
わし、70％以上を陽性、30％以下を陰性とした。
示のｎの値であり、ｎが５以上を陽性、５未満は陰性と
判定した。RIA法（Ｂ社）の場合は力価を阻害率％で表
わし、70％以上を陽性、30％以下を陰性とした。
その結果、本発明とPHA法（Ａ社）、及び本発明とRIA法
（Ｂ社）の判定結果は完全に一致した。
（Ｂ社）の判定結果は完全に一致した。
また本発明とPHA法（Ａ社）の抗体価はよく相関した。
更にPHA法（Ａ社）と比較して、本発明の抗体価は１管
高く出た。第１図に示すとおりである。すなわち感度が
２倍高いということである。
更にPHA法（Ａ社）と比較して、本発明の抗体価は１管
高く出た。第１図に示すとおりである。すなわち感度が
２倍高いということである。
また本発明とRIA法（Ｂ社）の相関図は第２図に示すと
おりである。
おりである。
実施例２ 〔担体の作製〕 直径約6mmのポリスチレンビーズを2.5％のグルタルアル
デハイドを含むpH9.5の炭酸バッファー中に一晩浸漬し
て表面を処理する。次に蒸留水で軽く洗った後、酵母産
生HBc抗原（yHBcAg）を含むリン酸バッファー（pH7.2）
に一晩浸漬して感作する。ついで非特異反応を低減する
ため、さらにBSA（Bovine Serum Albumin）を同様に感
作してビーズを作成する。ついでHBc抗体,HBs抗体およ
びHBe抗体に対する反応性をヒト由来HBc抗原（hHBcAg）
（Ｂ社製）のそれぞれに対する反応性と比較した。
デハイドを含むpH9.5の炭酸バッファー中に一晩浸漬し
て表面を処理する。次に蒸留水で軽く洗った後、酵母産
生HBc抗原（yHBcAg）を含むリン酸バッファー（pH7.2）
に一晩浸漬して感作する。ついで非特異反応を低減する
ため、さらにBSA（Bovine Serum Albumin）を同様に感
作してビーズを作成する。ついでHBc抗体,HBs抗体およ
びHBe抗体に対する反応性をヒト由来HBc抗原（hHBcAg）
（Ｂ社製）のそれぞれに対する反応性と比較した。
（１）HBc抗体及びHBs抗体に対する反応性の比較yHBcAg
で感作したビーズ、BSAのみで感作したビーズを用意す
る。これをhHBcAgを感作したビーズ（Ｂ社）と比較する
ため、これらを適当な大きさのチューブに入れ、これに
125IでラベルしたHBc抗体、あるいはHBs抗体200μｌを
加え、室温で一晩反応させた。蒸留水で洗浄した後、ビ
ーズに結合した抗体量をガンマーカウンターで測定し
た。測定結果を第５表に示す。
で感作したビーズ、BSAのみで感作したビーズを用意す
る。これをhHBcAgを感作したビーズ（Ｂ社）と比較する
ため、これらを適当な大きさのチューブに入れ、これに
125IでラベルしたHBc抗体、あるいはHBs抗体200μｌを
加え、室温で一晩反応させた。蒸留水で洗浄した後、ビ
ーズに結合した抗体量をガンマーカウンターで測定し
た。測定結果を第５表に示す。
yHBcAgを感作したビーズは、hHBcAgを感作したビーズに
比し、HBs抗体に対する反応性が10倍以上も低かった。h
HBcAgはヒト由来のプラズマあるいは肝臓を原材料とし
たものであるため、抗原の精製に当って、混在するHBsA
gを完全には除去しきれなかったものと考えられる。yHB
cAgにHBsAgが混入することは原理的にはあり得ずヒト血
清を対象とする臨床検査用の感作抗原としては非特異反
応を低減する上で有利である。HBc抗体に対する反応性
は両者でほとんど差がない。
比し、HBs抗体に対する反応性が10倍以上も低かった。h
HBcAgはヒト由来のプラズマあるいは肝臓を原材料とし
たものであるため、抗原の精製に当って、混在するHBsA
gを完全には除去しきれなかったものと考えられる。yHB
cAgにHBsAgが混入することは原理的にはあり得ずヒト血
清を対象とする臨床検査用の感作抗原としては非特異反
応を低減する上で有利である。HBc抗体に対する反応性
は両者でほとんど差がない。
（２）HBe担体に対する反応性の比較 酵母菌で発現させたHBc抗原とヒト由来HBc抗原とでHBe
に関する抗原性に違いがみられるかどうか検討するた
め、本発明にかかるyHBcAgを感作したビーズとhHBcAgを
感作したビーズを用い、（１）と同様の方法により125I
ラベルHBe抗体に対する反応性をみた。その結果を第３
図に示す。図からも分るように両者でほとんど差のない
ことがわかった。以上の結果から酵母産生HBc抗原を感
作したビーズはRIA法によるHBc抗体の測定においてヒト
由来HBc抗原感作ビーズにとってかわりうることがわか
る。これはEIA法においても同じ結果がえられることが
明らかである。
に関する抗原性に違いがみられるかどうか検討するた
め、本発明にかかるyHBcAgを感作したビーズとhHBcAgを
感作したビーズを用い、（１）と同様の方法により125I
ラベルHBe抗体に対する反応性をみた。その結果を第３
図に示す。図からも分るように両者でほとんど差のない
ことがわかった。以上の結果から酵母産生HBc抗原を感
作したビーズはRIA法によるHBc抗体の測定においてヒト
由来HBc抗原感作ビーズにとってかわりうることがわか
る。これはEIA法においても同じ結果がえられることが
明らかである。
第１図は本発明によるPHA法と従来品によるPHA法（Ａ
社）の力価相関図であり、第２図は本発明によるPHA法
の力価とRIA法（Ｂ社）の阻害率（％）の相関図であ
る。また第３図は本発明によるyHBcAg感作ビーズとhHBc
Ag（Ｂ社）感作ビーズのHBe抗体に対する反応性を示す
図である。
社）の力価相関図であり、第２図は本発明によるPHA法
の力価とRIA法（Ｂ社）の阻害率（％）の相関図であ
る。また第３図は本発明によるyHBcAg感作ビーズとhHBc
Ag（Ｂ社）感作ビーズのHBe抗体に対する反応性を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−113009（ＪＰ，Ａ) 「細胞工学」Ｖｏｌ．３ Ｎｏ．４ （1984）Ｐ．367−370
Claims (5)
- 【請求項１】組換えDNA技術を利用して酵母に発現せし
めたHBc抗原を含有するHBc抗原原材料を、酸処理した
後、陰イオン交換体によるイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけることにより精製された酵母産生HBc抗原を用
いるHBc抗体の測定法。 - 【請求項２】HBc抗原を含有するHBc抗原原材料が、組換
え体細胞を破壊して得られるHBc抗原粗抽出物である前
記第（１）項記載のHBc抗体の測定法。 - 【請求項３】酸処理に用いる酸が、塩酸、硫酸、リン
酸、酢酸、シュウ酸から選ばれる少なくとも一種である
前記第（１）項記載のHBc抗体の測定方法。 - 【請求項４】イオン交換クロマトグラフィーにおける陰
イオン交換体としてジエチルアミノエチル基を官能基と
する陰イオン交換体を用いる前記第（１）項記載のHBc
抗体の測定法。 - 【請求項５】精製された酵母産生HBc抗原を用いて、受
身担体凝集反応、EIA法またはRIA法を行わせる前記第１
項記載のHBc抗体の測定法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60051678A JPH073427B2 (ja) | 1985-03-14 | 1985-03-14 | Ｈｂｃ抗体の測定法 |
| CA000498178A CA1268437A (en) | 1984-12-21 | 1985-12-19 | Method for purification of hbc antigen and method for measurement of hbc antibody by using said purified hbc antigen |
| KR1019850009659A KR930012113B1 (ko) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | HBc 항원의 정재방법 및 정제된 HBc 항원을 이용한 HBc 항체의 측정방법 |
| DE8585116388T DE3583927D1 (de) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | Verfahren zur reinigung vom hbc-antigen und verfahren zum messen von hbc-antikoerpern mit diesem gereinigten hbc-antigen. |
| AT85116388T ATE66679T1 (de) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | Verfahren zur reinigung vom hbc-antigen und verfahren zum messen von hbc-antikoerpern mit diesem gereinigten hbc-antigen. |
| EP85116388A EP0185391B1 (en) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | Method for the purification of the hbc antigen and method for the measurement of hbc antibodies by using said purified hbc antigen |
| US06/811,399 US4839277A (en) | 1984-12-21 | 1985-12-20 | Method for purification of HBc antigen and method for measurement of HBc antibody by using said purified HBc antigen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60051678A JPH073427B2 (ja) | 1985-03-14 | 1985-03-14 | Ｈｂｃ抗体の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61209357A JPS61209357A (ja) | 1986-09-17 |
| JPH073427B2 true JPH073427B2 (ja) | 1995-01-18 |
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- 1985-03-14 JP JP60051678A patent/JPH073427B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 「細胞工学」Ｖｏｌ．３Ｎｏ．４（１９８４）Ｐ．３６７−３７０ |
Also Published As
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|---|---|
| JPS61209357A (ja) | 1986-09-17 |
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