JPS6314911B2 - - Google Patents
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- JPS6314911B2 JPS6314911B2 JP56168646A JP16864681A JPS6314911B2 JP S6314911 B2 JPS6314911 B2 JP S6314911B2 JP 56168646 A JP56168646 A JP 56168646A JP 16864681 A JP16864681 A JP 16864681A JP S6314911 B2 JPS6314911 B2 JP S6314911B2
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/571—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses for venereal disease, e.g. syphilis, gonorrhoea
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Description
本発明は、梅毒トレポネーマ（病原性
Treponema pallidum Nicols、以下TPと略記す
る）菌の破砕菌体を動物赤血球等の担体に感作
し、得られた抗原感作担体を対応する抗体の存在
によつて凝集させる反応を利用して梅毒感染の診
断を行う、いわゆるTPHAテストの改良に関す
る。 さらに詳しくは、梅毒初期感染を高感度に検出
しうる梅毒検査用試薬の製造法に関する。 梅毒感染の検査法としては古くから脂質抗原法
が用いられていたが、この方法は特異性が不足し
ており、そのため近年ではTP菌を直接抗原とし
て用いて患者血清中のTP抗体との抗原抗体反応
を利用する検査法が多用されている。TP菌を抗
原とする検査法としては、TP菌体と直接反応し
た特異抗体の存在を蛍光標識した抗ガンマーグロ
ブリン抗体で検出するFTAテストが早くから実
用化されたが、この方法は手段の煩雑さから普及
率が低く、その後富沢らによつて開発された
TPHAテストが鋭敏性、特異性、操作の簡便性
等の利点から現在広く用いられており、梅毒の代
表的な臨床検査法として世界中にその優秀性が認
められている。 しかしながら、従来のTPHAテストには初期
梅毒の診断が不確実であるという欠点があつた。
すなわち、梅毒感染後２〜３カ月まではTPHA
テストでは陽性にならないことが多い。そこで、
初期梅毒をも確実に診断するためには、非特異反
応は多いが初期梅毒に対する鋭敏性の高い脂質抗
原法を併用しなければならないという実用上の大
きな問題点があつた。 本発明者らは、操作が簡便であつてかつ後期梅
毒と同様に初期梅毒に対しても特異性と鋭敏性が
高い梅毒検査用試薬を開発することを目的として
種々研究の結果、TPHAテストのごとき間接凝
集反応を利用した免疫測定法に用いる抗原感作担
体を製造する場合に、抗原を担体に感作するまえ
にあらかじめ抗原含有物から特定の不純物を除去
することによつて、初期感染をも確実に検出しう
る試薬を製造しうることを見出し、これに基いて
本発明を完成した。すなわち、従来のTPHAテ
ストにおいて動物赤血球の感作に用いられていた
TP抗原原液は製法上必然的に不純物が多く、不
純蛋白の90％以上がTP菌を培養した家兎睾丸由
来の不純物であつたが、本発明においては感作に
先立ちこれら不純物のうち特に比重1.01以下の画
分を除去した精製TP抗原原液を担体の感作に用
いることに特徴がある。 TP抗原原液の取得方法はいかなる方法でもよ
いが、TPHAテストで慣用されている方法をそ
のまま行なえばよい。TP種菌には、例えば
WHO病原性標準ニコルス株あるいは各検査機関
が梅毒検査用に使用しているTP菌をそのまま用
いればよい。なお、WHO病原性標準ニコルス株
は例えばCDC（Center for Disease Control、
Public Health Service、U.S.Department of
Health、Education and Welfare、Atlanta、
Georgia）から容易に入手することができる。
TP菌の培養集菌方法としては、例えば家兎睾丸
に種菌を接種して11〜14日間培養後ミラーらの方
法（Miller et al.、Journal of Immunology、
Vol.96、p450（1966））に従つて集菌すればよい。
すなわち、不活性化した家兎血清と1/7Ｍ食塩水
とを等量含む溶媒で、培養後ミンチ化した睾丸砕
片から増殖したTP菌を抽出する。抽出液を
200xgで十分遠心し、睾丸組識の大きな粒子を沈
澱除去する。その後19000xgで90分間遠心して
TP菌を沈澱させる。得られた沈澱物を0.075M−
冷蓚酸ナトリウムで３回洗浄する。本発明におけ
るTP菌の培養方法および培養物からの集菌方法
はこのような例に制限されるものではなく、公知
方法のなかから任意に採用することができる。 従来は前記洗浄済みの沈澱物を適当な緩衝液に
懸濁し、直ちにホモゲナイザー処理、超音波処理
などによつてTP菌体を破砕し、これを担体感作
用原液として用いていた。本発明法においては、
前記抗原感作用原液中のTP菌以外の不純物のう
ち特に比重が1.01以下の画分を菌体破砕前または
後に何らかの方法で分離除去する工程を付加し
て、精製したTP抗原を感作用原液に用いたとこ
ろに特徴がある。 不純物の分離除去方法は一般の分子量分画につ
いて知られている方法のなかから適宜選択すれば
よく、例えば密度勾配法、ゲル過法、遠心沈降
法、限外過法、硫安分画法、電気泳動法などに
よつて分画除去すればよい。これらのなかでは、
特に密度勾配法および遠心沈降法がこの目的に適
している。この分離方法は分子量分画法のみでな
く、例えば固相化したTP抗体にTP菌を抗原抗体
反応で選択吸着させる方法であつてもよい。 本発明は、従来のTPHAのごとき抗原抗体反
応に基づく間接凝集反応を利用した梅毒抗体検出
法において、後期抗体（Ig−Ｇ）に比較して初期
抗体（Ig−Ｍ）に対する抗原感作担体の感度が低
かつたのは、このTPHAテストの本質的な欠陥
ではなく、担体に感作する抗原の純度が原因であ
つたこと、更に詳しくは特定の不純物画分の共存
に起因するという新知見に基づくものである。従
つて、本発明においては、比重1.01以下の画分は
抗原感作担体と梅毒Ig−Ｍ抗体との抗原抗体反応
を阻害しなくなる程度にまで除かれていればよ
く、必ずしも完全に除去される必要はない。また
この除去は、TP菌体の破砕前であつても破砕後
であつても本発明の目的を達しうるが、工業的に
は菌体破砕前に密度勾配法で分画することが最も
好ましい。本発明においてはTP菌培養物中の不
純物のうち比重が1.01以下のものを除去するので
あるが、抗原感作担体の充分な感度を確保する観
点から、比重が1.05以下の画分を除去するほうが
より望ましく、また、比重が1.20以上の画分も併
せて除去したほうがよい。従来のTPHAの製法
における家兎睾丸より抽出し洗浄したTP抽出液
すなわちTP抗原原液はTP菌109個あたり0.6mg以
上の蛋白質を含んでいるが、本発明法で得られる
精製抗原原液は大量の不純蛋白を除去しているた
めTP菌109個あたりの蛋白質は0.3mg以下であり、
通常は0.1mg以下になる。なお、この場合の蛋白
濃度はローリー法（Lowry et al.、J.Biol.
Chem.、Vol.193、pp265−275（1951））によつて
測定し、TP菌数は細菌計数器（C.A.Hauser ＆
Son社製）上に被検液を取つて暗視野顕微鏡に
て直接数えた。 TP菌体の破砕は従来のTPHA試薬作成の常法
に従つて行なえばよく、例えば、ホモゲナイザー
処理、超音波処理、界面活性剤処理、酵素処理、
自己融解法、凍結融解法などを用いうる。抗原の
精製が菌体破砕前に行なわれる場合には、不純物
を除去したTP菌区分を必要により緩衝液などに
懸濁して遠沈するなどして菌体を洗浄してから破
砕する。 破砕菌体は、必要により緩衝液などで希釈して
から、常法によつてヒツジ赤血球等の担体に感作
する。担体には、このほかニワトリ赤血球等の各
種動物の赤血球やラテツクスなど、抗原抗体反応
に基づく間接凝集反応に用いうるものであればい
かなるものであつても本発明の方法に適用しう
る。 抗原感作担体はそのままあるいは凍結乾燥し
て、常法どおり標準血清、未感作担体、非特異抗
原吸収液、希釈液、復元液等と組合せて梅毒検査
用試薬キツトとする。 本発明で得られた検査用試薬を用いれば梅毒検
査が簡単であり、この試薬は感染後相当期間経過
した梅毒患者のみならず感染後１カ月以内の初期
感染患者の血清についても特異的に安定して陽性
を示す。これは、従来の抗原感作担体において梅
毒Ig−Ｇ抗体に対する感度に比較して梅毒Ig−Ｍ
抗体に対する感度を相対的に低下せしめていた不
純物を除去することによつて得られたものであ
り、本発明で得られた製品では、初期感染患者血
清中に特異的に含まれる梅毒Ig−Ｍ抗体に対する
感度と中、後期患者血清に含まれる梅毒Ig−Ｇ抗
体に対する感度との比が従来品より大きくなつて
いる。以下、実験例をもつて本発明の効果を説明
する。 実験例 １ 実施例で得られた粗TP原液をタンニン酸法に
よりヒツジ赤血球に感作して抗原感作血球液を調
製した。梅毒抗体血清としては、Ig−Ｍ抗体だけ
の血清とIg−Ｇ抗体だけの血清をいずれも前記抗
原感作血球液を用いてTPHAテストを行なつた
場合に同じ力価を示すようにプールして調整して
おいた。 遠沈管の下層には25％ジアトリゾエイトナトリ
ウム液（ｄ＝1.161）、そして上層には第１図に示
す各種比重のジアトリゾエイトナトリウム液をお
き、そのうえに実施例で得られた粗TP原液を重
層して遠心沈降させ、二つのジアトリゾエイトナ
トリウム液の層間に集まつた画分を分取した。上
層の比重を変えて得られたこの中間層画分の各各
について、蛋白濃度をローリー法で測定するとと
もに、ヒツジ赤血球を用いてタンニン酸法で抗原
感作血球液を作成し、前記のIg−Ｍ抗体血清およ
びIg−Ｇ抗体血清を用いてTPHAテストで得ら
れた各抗原感作血球液の力価を測定した。 測定結果を第１図に示す。図の横軸は遠心沈降
の際に用いた上層のジアトリゾエイトナトリウム
の比重を示し、左方の縦軸は抗原感作血球液のIg
−Ｍ抗体に対する力価／Ig−Ｇ抗体に対する力価
の比（RM）を示している。右方の縦軸は蛋白濃
度を示しており、図中の丸印はRM値を、そして
三角印は蛋白濃度を表わしている。 図から明らかな如く、低比重側の画分を除去す
ることによつて梅毒Ig−Ｍ抗体に対する感度は梅
毒Ig−Ｇ抗体に対する感度を大きく上まわつて向
上しており、特に比重1.01以下の画分を除去する
ことの効果が大きい。この実験例において従来法
で得られた抗原感作血球のRM値は1.0であるか
ら、従来法では不可能であつた。RM値を本発明
によつてはじめて達成したのである。 なお、従来品のいくつかについて前記のIg−Ｍ
抗体血清およびIg−Ｇ抗体血清を用いてTPHA
テストを行なつて得られたRM値を第１図の左端
にＸ印で示す。その結果からわかるように、この
実験に用いた対照例の抗原感作血球は従来品のな
かではRM値がもつとも高いものであつた。 実験例 ２ 実施例で得られた抗原感作血球を用いた
TPHA試薬および実施例の粗TP原液より常法で
調整したTPHA試薬を用い、充分治療した古い
梅毒でIg−Ｇ抗体のみを含む３検体（G1、G2、
G3）および感染後３〜４週間の初期梅毒でIg−
Ｍ抗体のみを含む３検体（M1、M2、M3）につ
いて感作血球凝集反応の有無を測定したところ第
１表に示すような結果が得られた。
Treponema pallidum Nicols、以下TPと略記す
る）菌の破砕菌体を動物赤血球等の担体に感作
し、得られた抗原感作担体を対応する抗体の存在
によつて凝集させる反応を利用して梅毒感染の診
断を行う、いわゆるTPHAテストの改良に関す
る。 さらに詳しくは、梅毒初期感染を高感度に検出
しうる梅毒検査用試薬の製造法に関する。 梅毒感染の検査法としては古くから脂質抗原法
が用いられていたが、この方法は特異性が不足し
ており、そのため近年ではTP菌を直接抗原とし
て用いて患者血清中のTP抗体との抗原抗体反応
を利用する検査法が多用されている。TP菌を抗
原とする検査法としては、TP菌体と直接反応し
た特異抗体の存在を蛍光標識した抗ガンマーグロ
ブリン抗体で検出するFTAテストが早くから実
用化されたが、この方法は手段の煩雑さから普及
率が低く、その後富沢らによつて開発された
TPHAテストが鋭敏性、特異性、操作の簡便性
等の利点から現在広く用いられており、梅毒の代
表的な臨床検査法として世界中にその優秀性が認
められている。 しかしながら、従来のTPHAテストには初期
梅毒の診断が不確実であるという欠点があつた。
すなわち、梅毒感染後２〜３カ月まではTPHA
テストでは陽性にならないことが多い。そこで、
初期梅毒をも確実に診断するためには、非特異反
応は多いが初期梅毒に対する鋭敏性の高い脂質抗
原法を併用しなければならないという実用上の大
きな問題点があつた。 本発明者らは、操作が簡便であつてかつ後期梅
毒と同様に初期梅毒に対しても特異性と鋭敏性が
高い梅毒検査用試薬を開発することを目的として
種々研究の結果、TPHAテストのごとき間接凝
集反応を利用した免疫測定法に用いる抗原感作担
体を製造する場合に、抗原を担体に感作するまえ
にあらかじめ抗原含有物から特定の不純物を除去
することによつて、初期感染をも確実に検出しう
る試薬を製造しうることを見出し、これに基いて
本発明を完成した。すなわち、従来のTPHAテ
ストにおいて動物赤血球の感作に用いられていた
TP抗原原液は製法上必然的に不純物が多く、不
純蛋白の90％以上がTP菌を培養した家兎睾丸由
来の不純物であつたが、本発明においては感作に
先立ちこれら不純物のうち特に比重1.01以下の画
分を除去した精製TP抗原原液を担体の感作に用
いることに特徴がある。 TP抗原原液の取得方法はいかなる方法でもよ
いが、TPHAテストで慣用されている方法をそ
のまま行なえばよい。TP種菌には、例えば
WHO病原性標準ニコルス株あるいは各検査機関
が梅毒検査用に使用しているTP菌をそのまま用
いればよい。なお、WHO病原性標準ニコルス株
は例えばCDC（Center for Disease Control、
Public Health Service、U.S.Department of
Health、Education and Welfare、Atlanta、
Georgia）から容易に入手することができる。
TP菌の培養集菌方法としては、例えば家兎睾丸
に種菌を接種して11〜14日間培養後ミラーらの方
法（Miller et al.、Journal of Immunology、
Vol.96、p450（1966））に従つて集菌すればよい。
すなわち、不活性化した家兎血清と1/7Ｍ食塩水
とを等量含む溶媒で、培養後ミンチ化した睾丸砕
片から増殖したTP菌を抽出する。抽出液を
200xgで十分遠心し、睾丸組識の大きな粒子を沈
澱除去する。その後19000xgで90分間遠心して
TP菌を沈澱させる。得られた沈澱物を0.075M−
冷蓚酸ナトリウムで３回洗浄する。本発明におけ
るTP菌の培養方法および培養物からの集菌方法
はこのような例に制限されるものではなく、公知
方法のなかから任意に採用することができる。 従来は前記洗浄済みの沈澱物を適当な緩衝液に
懸濁し、直ちにホモゲナイザー処理、超音波処理
などによつてTP菌体を破砕し、これを担体感作
用原液として用いていた。本発明法においては、
前記抗原感作用原液中のTP菌以外の不純物のう
ち特に比重が1.01以下の画分を菌体破砕前または
後に何らかの方法で分離除去する工程を付加し
て、精製したTP抗原を感作用原液に用いたとこ
ろに特徴がある。 不純物の分離除去方法は一般の分子量分画につ
いて知られている方法のなかから適宜選択すれば
よく、例えば密度勾配法、ゲル過法、遠心沈降
法、限外過法、硫安分画法、電気泳動法などに
よつて分画除去すればよい。これらのなかでは、
特に密度勾配法および遠心沈降法がこの目的に適
している。この分離方法は分子量分画法のみでな
く、例えば固相化したTP抗体にTP菌を抗原抗体
反応で選択吸着させる方法であつてもよい。 本発明は、従来のTPHAのごとき抗原抗体反
応に基づく間接凝集反応を利用した梅毒抗体検出
法において、後期抗体（Ig−Ｇ）に比較して初期
抗体（Ig−Ｍ）に対する抗原感作担体の感度が低
かつたのは、このTPHAテストの本質的な欠陥
ではなく、担体に感作する抗原の純度が原因であ
つたこと、更に詳しくは特定の不純物画分の共存
に起因するという新知見に基づくものである。従
つて、本発明においては、比重1.01以下の画分は
抗原感作担体と梅毒Ig−Ｍ抗体との抗原抗体反応
を阻害しなくなる程度にまで除かれていればよ
く、必ずしも完全に除去される必要はない。また
この除去は、TP菌体の破砕前であつても破砕後
であつても本発明の目的を達しうるが、工業的に
は菌体破砕前に密度勾配法で分画することが最も
好ましい。本発明においてはTP菌培養物中の不
純物のうち比重が1.01以下のものを除去するので
あるが、抗原感作担体の充分な感度を確保する観
点から、比重が1.05以下の画分を除去するほうが
より望ましく、また、比重が1.20以上の画分も併
せて除去したほうがよい。従来のTPHAの製法
における家兎睾丸より抽出し洗浄したTP抽出液
すなわちTP抗原原液はTP菌109個あたり0.6mg以
上の蛋白質を含んでいるが、本発明法で得られる
精製抗原原液は大量の不純蛋白を除去しているた
めTP菌109個あたりの蛋白質は0.3mg以下であり、
通常は0.1mg以下になる。なお、この場合の蛋白
濃度はローリー法（Lowry et al.、J.Biol.
Chem.、Vol.193、pp265−275（1951））によつて
測定し、TP菌数は細菌計数器（C.A.Hauser ＆
Son社製）上に被検液を取つて暗視野顕微鏡に
て直接数えた。 TP菌体の破砕は従来のTPHA試薬作成の常法
に従つて行なえばよく、例えば、ホモゲナイザー
処理、超音波処理、界面活性剤処理、酵素処理、
自己融解法、凍結融解法などを用いうる。抗原の
精製が菌体破砕前に行なわれる場合には、不純物
を除去したTP菌区分を必要により緩衝液などに
懸濁して遠沈するなどして菌体を洗浄してから破
砕する。 破砕菌体は、必要により緩衝液などで希釈して
から、常法によつてヒツジ赤血球等の担体に感作
する。担体には、このほかニワトリ赤血球等の各
種動物の赤血球やラテツクスなど、抗原抗体反応
に基づく間接凝集反応に用いうるものであればい
かなるものであつても本発明の方法に適用しう
る。 抗原感作担体はそのままあるいは凍結乾燥し
て、常法どおり標準血清、未感作担体、非特異抗
原吸収液、希釈液、復元液等と組合せて梅毒検査
用試薬キツトとする。 本発明で得られた検査用試薬を用いれば梅毒検
査が簡単であり、この試薬は感染後相当期間経過
した梅毒患者のみならず感染後１カ月以内の初期
感染患者の血清についても特異的に安定して陽性
を示す。これは、従来の抗原感作担体において梅
毒Ig−Ｇ抗体に対する感度に比較して梅毒Ig−Ｍ
抗体に対する感度を相対的に低下せしめていた不
純物を除去することによつて得られたものであ
り、本発明で得られた製品では、初期感染患者血
清中に特異的に含まれる梅毒Ig−Ｍ抗体に対する
感度と中、後期患者血清に含まれる梅毒Ig−Ｇ抗
体に対する感度との比が従来品より大きくなつて
いる。以下、実験例をもつて本発明の効果を説明
する。 実験例 １ 実施例で得られた粗TP原液をタンニン酸法に
よりヒツジ赤血球に感作して抗原感作血球液を調
製した。梅毒抗体血清としては、Ig−Ｍ抗体だけ
の血清とIg−Ｇ抗体だけの血清をいずれも前記抗
原感作血球液を用いてTPHAテストを行なつた
場合に同じ力価を示すようにプールして調整して
おいた。 遠沈管の下層には25％ジアトリゾエイトナトリ
ウム液（ｄ＝1.161）、そして上層には第１図に示
す各種比重のジアトリゾエイトナトリウム液をお
き、そのうえに実施例で得られた粗TP原液を重
層して遠心沈降させ、二つのジアトリゾエイトナ
トリウム液の層間に集まつた画分を分取した。上
層の比重を変えて得られたこの中間層画分の各各
について、蛋白濃度をローリー法で測定するとと
もに、ヒツジ赤血球を用いてタンニン酸法で抗原
感作血球液を作成し、前記のIg−Ｍ抗体血清およ
びIg−Ｇ抗体血清を用いてTPHAテストで得ら
れた各抗原感作血球液の力価を測定した。 測定結果を第１図に示す。図の横軸は遠心沈降
の際に用いた上層のジアトリゾエイトナトリウム
の比重を示し、左方の縦軸は抗原感作血球液のIg
−Ｍ抗体に対する力価／Ig−Ｇ抗体に対する力価
の比（RM）を示している。右方の縦軸は蛋白濃
度を示しており、図中の丸印はRM値を、そして
三角印は蛋白濃度を表わしている。 図から明らかな如く、低比重側の画分を除去す
ることによつて梅毒Ig−Ｍ抗体に対する感度は梅
毒Ig−Ｇ抗体に対する感度を大きく上まわつて向
上しており、特に比重1.01以下の画分を除去する
ことの効果が大きい。この実験例において従来法
で得られた抗原感作血球のRM値は1.0であるか
ら、従来法では不可能であつた。RM値を本発明
によつてはじめて達成したのである。 なお、従来品のいくつかについて前記のIg−Ｍ
抗体血清およびIg−Ｇ抗体血清を用いてTPHA
テストを行なつて得られたRM値を第１図の左端
にＸ印で示す。その結果からわかるように、この
実験に用いた対照例の抗原感作血球は従来品のな
かではRM値がもつとも高いものであつた。 実験例 ２ 実施例で得られた抗原感作血球を用いた
TPHA試薬および実施例の粗TP原液より常法で
調整したTPHA試薬を用い、充分治療した古い
梅毒でIg−Ｇ抗体のみを含む３検体（G1、G2、
G3）および感染後３〜４週間の初期梅毒でIg−
Ｍ抗体のみを含む３検体（M1、M2、M3）につ
いて感作血球凝集反応の有無を測定したところ第
１表に示すような結果が得られた。
【表】
註１ ＋…陽性、−…陰性
註２ ( )内は抗体価を表わす。抗体価80以上を
陽性とした。
すなわち、従来品では総て陰性となる初期梅毒
３検体について、本発明品はいずれも陽性を示
す。 なお、上記の初期梅毒３検体（M1、M2、M3）
に対する他の梅毒検査法の反応結果を第２表に示
す。
註２ ( )内は抗体価を表わす。抗体価80以上を
陽性とした。
すなわち、従来品では総て陰性となる初期梅毒
３検体について、本発明品はいずれも陽性を示
す。 なお、上記の初期梅毒３検体（M1、M2、M3）
に対する他の梅毒検査法の反応結果を第２表に示
す。
【表】
註 ＋は梅毒反応陽性を示す。
実施例 国立予防衛生研究所より分与を受けたWHO病
原性標準ニコルス株トレポネーマ・パリーダムの
6.0×107／mlの懸濁液を家兎睾丸実質１個当り、
１mlずつ接種した。12日間培養後、家兎10羽より
睾丸を採取し、ミンチ後、不活性化した家兎血清
と1/7Ｍ食塩水とを等量含む抽出溶媒1000mlにて、
増殖したTP菌を抽出した。抽出液を200×g10分
間遠心分離し、沈澱を除去、上清をさらに19000
×ｇで90分間遠心し、TP菌を沈澱させた。得ら
れた沈澱を0.075M冷シユウ酸ナトリウムで３回
洗浄した後PH6.4の1/15Ｍリン酸緩衝液10mlに懸
濁して菌数計算後２×109／mlに調整し、これを
粗TP原液とした。 容量15mlのセルローズチユーブ内にジアトリゾ
エイトナトリウム（Sodium Diatrizoate）で
60.0％、37.5％、25.0％、19.0％（いずれもＷ／
Ｖ％）の順に密度勾配をつくり、最後に粗TP原
液１mlを重層した。この重層物をミユーズ社製超
遠心機（Super Speed 65）にて、25000r.p.m.
（76000×ｇ）で20℃２時間遠心した。遠心後重層
物の上端から１mlずつ15のフラクシヨンに分取し
た。 粗TP原液のTP菌数、蛋白濃度および上記各フ
ラクシヨンの菌数（三角印）、密度（白丸印）、蛋
白濃度（×印）、TP抗原活性（黒丸印）を測定
し、第２図の結果を得た。使用した測定方法を以
下に略記する。 菌数： C.A.Hausser ＆ Son社製細菌計数器
上に被検液を取り、暗視野顕微鏡にて計数し
た。 密度： 100μのピペツトに被検液を取り計量
した。 蛋白濃度： ローリー法で測定した。すなわち、
試料に酒石酸カリウムナトリウムと、硫酸銅を
含む炭酸ナトリウム溶液を加え、室温で10分以
上反応させてからフオーリン試薬を加え30分以
上経過してから750nmで比色した。 抗原活性： 被検液を超音波処理し、TP菌体を
破壊後次の術式に従つて実施した。 (1) 各抗原フラクシヨンをマイクロトレーの左
端に25μずつとる。 (2) 一定濃度に希釈した梅毒抗体を希釈液とし
て、(1)でとつた抗原をトレー上で倍倍希釈し
てゆく。 (3) 37℃30分反応させる、このときトレーの左
の方のウエル内の抗体は抗原と結合して消費
されてしまうが、抗原濃度のうすい右方のウ
エル内の抗体は、消費されずに残る。 (4) 感作血球を加え、消費されずに残つている
抗体と凝集反応を起したウエルNo.をもつて抗
原活性とする。 第２図中TP菌濃度高く蛋白濃度の低い区分、
すなわちフラクシヨン４〜７を合わせ精製抗原原
液1.0mlを得た。本原液中のTP菌数は1.91×109、
蛋白含量は0.116mgであつた。粗抗原原液中のTP
菌数は2.0×109、蛋白含量は1.213mgであつた。し
たがつて、TP109個当りの蛋白含量は未精製抗原
原液で0.607mg、精製抗原原液で0.058mgであつ
た。 精製原液を用い、タンニン酸法により、それぞ
れ羊赤血球に感作、凍結乾燥し、復元液、希釈
液、吸収液、標準血清と組み合せ、梅毒診断用検
査試薬（キツト）とした。
実施例 国立予防衛生研究所より分与を受けたWHO病
原性標準ニコルス株トレポネーマ・パリーダムの
6.0×107／mlの懸濁液を家兎睾丸実質１個当り、
１mlずつ接種した。12日間培養後、家兎10羽より
睾丸を採取し、ミンチ後、不活性化した家兎血清
と1/7Ｍ食塩水とを等量含む抽出溶媒1000mlにて、
増殖したTP菌を抽出した。抽出液を200×g10分
間遠心分離し、沈澱を除去、上清をさらに19000
×ｇで90分間遠心し、TP菌を沈澱させた。得ら
れた沈澱を0.075M冷シユウ酸ナトリウムで３回
洗浄した後PH6.4の1/15Ｍリン酸緩衝液10mlに懸
濁して菌数計算後２×109／mlに調整し、これを
粗TP原液とした。 容量15mlのセルローズチユーブ内にジアトリゾ
エイトナトリウム（Sodium Diatrizoate）で
60.0％、37.5％、25.0％、19.0％（いずれもＷ／
Ｖ％）の順に密度勾配をつくり、最後に粗TP原
液１mlを重層した。この重層物をミユーズ社製超
遠心機（Super Speed 65）にて、25000r.p.m.
（76000×ｇ）で20℃２時間遠心した。遠心後重層
物の上端から１mlずつ15のフラクシヨンに分取し
た。 粗TP原液のTP菌数、蛋白濃度および上記各フ
ラクシヨンの菌数（三角印）、密度（白丸印）、蛋
白濃度（×印）、TP抗原活性（黒丸印）を測定
し、第２図の結果を得た。使用した測定方法を以
下に略記する。 菌数： C.A.Hausser ＆ Son社製細菌計数器
上に被検液を取り、暗視野顕微鏡にて計数し
た。 密度： 100μのピペツトに被検液を取り計量
した。 蛋白濃度： ローリー法で測定した。すなわち、
試料に酒石酸カリウムナトリウムと、硫酸銅を
含む炭酸ナトリウム溶液を加え、室温で10分以
上反応させてからフオーリン試薬を加え30分以
上経過してから750nmで比色した。 抗原活性： 被検液を超音波処理し、TP菌体を
破壊後次の術式に従つて実施した。 (1) 各抗原フラクシヨンをマイクロトレーの左
端に25μずつとる。 (2) 一定濃度に希釈した梅毒抗体を希釈液とし
て、(1)でとつた抗原をトレー上で倍倍希釈し
てゆく。 (3) 37℃30分反応させる、このときトレーの左
の方のウエル内の抗体は抗原と結合して消費
されてしまうが、抗原濃度のうすい右方のウ
エル内の抗体は、消費されずに残る。 (4) 感作血球を加え、消費されずに残つている
抗体と凝集反応を起したウエルNo.をもつて抗
原活性とする。 第２図中TP菌濃度高く蛋白濃度の低い区分、
すなわちフラクシヨン４〜７を合わせ精製抗原原
液1.0mlを得た。本原液中のTP菌数は1.91×109、
蛋白含量は0.116mgであつた。粗抗原原液中のTP
菌数は2.0×109、蛋白含量は1.213mgであつた。し
たがつて、TP109個当りの蛋白含量は未精製抗原
原液で0.607mg、精製抗原原液で0.058mgであつ
た。 精製原液を用い、タンニン酸法により、それぞ
れ羊赤血球に感作、凍結乾燥し、復元液、希釈
液、吸収液、標準血清と組み合せ、梅毒診断用検
査試薬（キツト）とした。
粗TP原液から分画した各比重の区分について、
第１図はIg−Ｍ抗体価／Ig−Ｇ抗体価の比と蛋白
濃度を測定した結果を示すものであり、第２図は
TP菌数、抗原活性、比重および蛋白濃度を測定
した結果を示すものである。
第１図はIg−Ｍ抗体価／Ig−Ｇ抗体価の比と蛋白
濃度を測定した結果を示すものであり、第２図は
TP菌数、抗原活性、比重および蛋白濃度を測定
した結果を示すものである。
Claims (1)
- １ 梅毒トレポネーマ菌由来の抗原を感作した担
体が対応する抗体の存在によつて凝集することを
利用した梅毒検査用試薬の製造法において、前記
担体に感作する抗原原液として、梅毒トレポネー
マ菌培養物のうち比重1.01以下の画分を除去した
抗原含有物を用いることを特徴とする梅毒検査用
試薬の製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56168646A JPS5871457A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | 梅毒検査用試薬の製造法 |
| US06/430,238 US4618588A (en) | 1981-10-23 | 1982-09-30 | Reagent and merchandising kit for use in the diagnosis of syphilis and preparation thereof |
| EP82305564A EP0079145B1 (en) | 1981-10-23 | 1982-10-19 | Reagent for use in diagnosis of syphilis and preparation thereof |
| DE8282305564T DE3266859D1 (en) | 1981-10-23 | 1982-10-19 | Reagent for use in diagnosis of syphilis and preparation thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56168646A JPS5871457A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | 梅毒検査用試薬の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871457A JPS5871457A (ja) | 1983-04-28 |
| JPS6314911B2 true JPS6314911B2 (ja) | 1988-04-02 |
Family
ID=15871885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56168646A Granted JPS5871457A (ja) | 1981-10-23 | 1981-10-23 | 梅毒検査用試薬の製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4618588A (ja) |
| EP (1) | EP0079145B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5871457A (ja) |
| DE (1) | DE3266859D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4738932A (en) * | 1985-12-03 | 1988-04-19 | Advanced Polymer Systems, Inc. | Reaginic test for syphilis |
| US5474900A (en) * | 1990-03-16 | 1995-12-12 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Process for preparing purified syphilis antigen from Treponema palljdum |
| JPH0743385B2 (ja) * | 1990-03-16 | 1995-05-15 | 積水化学工業株式会社 | 梅毒抗原の製造法 |
| JPH0486559A (ja) * | 1990-07-30 | 1992-03-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 梅毒検査試薬 |
| GB9314011D0 (en) * | 1993-07-07 | 1993-08-18 | Porton Cambridge Ltd | New diagnostic assay for detection of syphilis |
| US5578456A (en) * | 1994-02-28 | 1996-11-26 | Fujirebio Inc. | Anti-treponema pallidum antibody immunoassay |
| RU2139539C1 (ru) * | 1997-05-20 | 1999-10-10 | Базиков Игорь Александрович | Способ получения трепонемного антигенного диагностикума |
| WO2005061532A1 (es) | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Berthet Francois Xavier | Composiciones y procedimientos para detectar infección patógena |
| RU2275635C2 (ru) * | 2004-06-03 | 2006-04-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | ПАНЕЛЬ СЫВОРОТОК С НОРМИРОВАННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТИТЕЛ КЛАССА IgG K АНТИГЕНАМ p17 И p41 TREPONEMA PALLIDUM И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ |
| CN110394200B (zh) * | 2019-06-17 | 2021-05-07 | 南京帝基生物科技有限公司 | 一种使用方便的梅毒检测试剂盒 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2892755A (en) * | 1956-09-12 | 1959-06-30 | Portnoy Joseph | Process for preparing a serologically active fraction of virulent treponema pallidum and resulting product |
| US3564089A (en) * | 1966-09-29 | 1971-02-16 | Sandra Jean Kiddy | Diagnostic reagent for syphilis |
| FR2233024A1 (en) * | 1973-06-15 | 1975-01-10 | Greyward Lab Interconti | Treponema haemagglutination test - using tanned avian erythrocytes as carrier for ireponema antigen |
| US4123427A (en) * | 1976-07-27 | 1978-10-31 | Daniel Thomas M | Method for the purification of mycobacterial protein antigens and resulting product |
| GB1577131A (en) * | 1977-03-18 | 1980-10-22 | Whitley D | Serological testing |
| US4288426A (en) * | 1980-03-20 | 1981-09-08 | Research Corporation | Serological test for syphilis |
| JPS56143955A (en) * | 1980-04-10 | 1981-11-10 | Fujirebio Inc | Method for diagnosis of initial infection of syphilis |
-
1981
- 1981-10-23 JP JP56168646A patent/JPS5871457A/ja active Granted
-
1982
- 1982-09-30 US US06/430,238 patent/US4618588A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-10-19 EP EP82305564A patent/EP0079145B1/en not_active Expired
- 1982-10-19 DE DE8282305564T patent/DE3266859D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4618588A (en) | 1986-10-21 |
| EP0079145A1 (en) | 1983-05-18 |
| EP0079145B1 (en) | 1985-10-09 |
| JPS5871457A (ja) | 1983-04-28 |
| DE3266859D1 (en) | 1985-11-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
| S199 | Written request for registration of transfer of right |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313199 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |