JPH06130060A - 粒子免疫測定用粒子の高比重化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 動物赤血球や人工担体などの粒子免疫測定用
粒子を金属塩溶液で処理することにより高比重化粒子を
作製する。 【効果】 本発明で得られる高比重化粒子をマイクロプ
レート凝集反応法の如き測定法に用いると、従来の粒子
免疫測定用粒子と比較して、より短時間の判定が可能と
なる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的検査、特に、粒
子免疫測定法における担体の高比重化法、並びにそのよ
うな粒子を用いて判定時間を短縮した免疫学的検査試薬
に関する。

【０００２】

【従来技術および問題点】疾病の診断においては、検査
対象の生体成分が微量であるために、一般には抗原抗体
反応を利用した免疫血清学的検査法が利用されてきた。
この検査法の最大の特徴は、体液中及び尿中に分泌され
る生体成分を極めて高い感度と特異性をもって測定でき
る点にある。このような検査法の一つに粒子免疫測定法
がある。一般に、粒子免疫測定法においては、適当な大
きさの粒子を担体とし、これに抗原または抗体を感作
（吸着または結合）させ、それぞれに対応する抗体また
は抗原の存在によってこの感作された担体が凝集を生ず
ることを原理としている。従来、上記粒子免疫測定法に
おいて最も一般的に使用されている担体粒子としては、
例えば、ヒツジまたはニワトリのような各種動物の赤血
球、またはポリスチレンラテックス粒子のような人工的
に合成された高分子粒子とがある。前者の動物血球を担
体として用いる方法はいわゆる血球凝集反応として古く
から行なわれており、この方法は対象とされ得る抗原及
び抗体の範囲が広く、マイクロタイター法を利用すると
２〜３時間のうちに判定を行なうことができるという点
では優れた物である。さらにまた、血球の大きさが動物
の種類によりそれぞれ一定しているという利点がある。

【０００３】一方、従来からのポリスチレン等の合成高
分子粒子は、一般に0.１〜１μm 程度の粒径を有し、特
にラテックス凝集反応用の担体として有用であり、それ
自体が抗原性を有しない点及び均質のものを大量に安定
して入手し得る点で優れている。さらに、最近、ゼラチ
ン、水溶性多糖類及びポリメタリン酸ナトリウムを含
み、アルデヒド系架橋剤により架橋された不溶化粒状人
工担体（特開昭57-153658号、特開昭57-160465号等）、
いわゆるゼラチン担体粒子及びポリアミノ酸を主原料と
したポリアミノ酸人工担体（特開平2-103470）が開発さ
れ、動物血球に代るものとして実用化され使用されてい
る。これらの人工担体は、免疫凝集反応用の担体として
は従来最も優れているとされていた動物赤血球と同等な
性能を有し、さらに化学的、物理的に均質かつ安定であ
り、抗原活性がなく任意の粒径のものを容易に大量生産
できるという利点を有する。しかしながら、従来の合成
高分子物質より成る粒子（例えばポスチレンラテックス
粒子）は、高い感度を得ると共に定量的な判定を行なう
ためにマイクロタイター法を利用すると、血球を担体と
して用いる場合に比して、沈降に長時間を必要とし、迅
速な判定を行なうことができない問題がある。また、動
物赤血球やゼラチン担体を用いた場合、２〜３時間と比
較的短時間で判定が可能ではあるが、最近の臨床検査の
分野における測定の迅速化及び自動化傾向に伴い、凝集
反応検査においても、さらに迅速な判定時間が望まれる
ようになった。

【０００４】判定時間を短縮するためには、使用する担
体の沈降速度を上げることが考えられる。沈降速度を上
げる一つの手段として、担体の粒径を増大させることが
ある。しかしながら、担体の粒径を増大させると、トー
タルの表面積が減少する結果、抗原または抗体の固定化
量を減少させることになり、適切な手段とは言い難い。
沈降速度を上げるもう一つの手段として、比重の大きい
担体、あるいは高比重化した担体を使用することが考え
られる。この方法であれば、トータルの表面積を減少さ
せることなく、沈降速度を上げることが可能である。し
かしながら、比重の大きい担体を作製するには、それを
作製するための原料から検討する必要があり、比重の大
きい担体が得られたとしても、それが従来より用いられ
ている粒子免疫測定用担体と比較して、測定系において
同等かそれ以上の感度を与えうる性質を有するかどうか
の問題が残る。一方、従来より使用されている担体を高
比重化する場合、それらの担体の有する特性を損なうこ
となく、簡便に高比重化できれば最も好ましい。なお、
絹についてはスズ塩を用いて増量する方法が知られては
いたが（坂口育三、（「続・絹糸の構造」北条ら編、信
州大学繊維学部発行）、p586-624(1980年））、今日ま
でこのような担体を高比重化した例は一切報告されてい
ない。

【０００５】

【問題を解決するための手段】これらの問題を鑑み、本
発明者らは鋭意研究を重ねた結果、前述した如き従来の
粒子免疫測定用粒子を簡便に高比重化する方法を見い出
した。すなわち、動物赤血球や人工担体を金属塩溶液で
処理することにより、容易に比重を高めることができ、
その結果、マイクロプレート凝集反応法の如き測定法に
おいて、より短時間で判定できるような担体を作製する
ことに成功した。すなわち、本発明は、粒子を金属塩溶
液で処理することを特徴とする粒子免疫測定用粒子の高
比重化法を提供する。又、このようにして高比重化され
た粒子免疫測定用粒子からなる検査試薬を提供する。本
発明において高比重化を行なう粒子には、従来より粒子
免疫測定用粒子として用いられているヒツジまたはニワ
トリのような各種動物の赤血球、またはポリスチレンラ
テックス粒子、ゼラチン担体、ポリアミノ酸担体などの
ような人工担体のいずれも使用可能である。本発明の高
比重化は、動物赤血球や人工担体を金属塩水溶液で攪拌
処理し、その後緩衝液で加熱処理することにより行なわ
れる。金属塩としては、スズ、鉛、カルシウム、マグネ
シウム、亜鉛等の塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸
塩、酢酸塩、塩化物などが用いられる。具体的には、塩
化第二スズ、アルミニウム硫酸塩、アルミニウム酢酸
塩、塩化アルミニウム、チタン硫酸塩、チタン酢酸塩、
塩化チタン、ストロンチウム硫酸塩、塩化ストロンチウ
ム等があげられ、なかでも塩化第二スズのようなスズ塩
が有効である。

【０００６】本発明の高比重化に用いられる金属塩は通
常20〜60w/w ％水溶液で用いるのがよい。20w/w ％以下
では、処理に長時間を要し、60w/w ％以上では操作性が
低下する。用いる金属塩の量は、通常担体の５倍重量以
上とするのがよい。処理時間は、担体の種類、量によっ
て異なるが通常30分から２時間程度である。処理温度
は、10〜70°C の範囲で可能であるが、通常室温、即ち
15〜25°C で行なわれる。上記、金属塩処理後、担体を
分離し、緩衝液で処理する。用いる緩衝液は通常ｐＨ６
から８程度のリン酸緩衝溶液が用いられる。また、通常
用いられる他の緩衝液、例えばクエン酸、酢酸、ホウ酸
緩衝液も使用可能である。処理温度は 20〜90°C であ
り、好ましくは50〜80℃であり、処理時間は15分から２
時間程度である。緩衝液処理後は、フィルタ−濾過、遠
心分離、デカンテ−ション等の分離操作により高比重化
された担体を得ることができる。本発明によって調製し
た粒子に対して抗原または抗体を感作するには、従来の
動物赤血球に対する感作法を用いて容易に行なう事が出
来る。例えば、得られた担体粒子を常法によりタンニン
酸処理した後、目的の抗原または抗体を吸着させる。感
作させる抗原または抗体としては、測定すべき抗原また
は抗体に対応する天然由来または遺伝子組換え、細胞融
合、化学合成等の人為的手段に由来する任意のものであ
り得る。

【０００７】

【発明の効果】本発明によれば、従来の粒子免疫測定法
に用いられる担体を非常に簡便に高比重化することが可
能である。また、得られた感作担体は、以下の実施例で
示すとおり、従来の動物血球あるいは人工担体と比較し
て、沈降速度が速いこと、すなわち、判定時間の短縮が
可能であり、かつ、判定時の力価も損なわないという大
きな利点を有している。以下、本発明及びその特徴を実
施例により具体的に説明する。

【０００８】

【実施例】

実施例１高比重化人工担体の作製 塩化第二スズ５水塩（和光純薬製）22.6gに水34.12gを
加え攪拌溶解し、塩化第二スズ水溶液を調製した。特開
平2-103470記載の方法により得られたポリアミノ酸人工
担体（サンプル１）の懸濁水溶液30ml（担体含有量12.5
v/v ％）をグラスフィルタ−（No.4）を用いて担体を分
離した後、塩化第二スズ水溶液３mlで洗浄した。更に塩
化第二スズ水溶液15mlを加え、25°C で60分間攪拌し
た。終了後グラスフィルタ−（No.4）で担体を分離した
後、リン酸緩衝溶液（Na濃度＝0.2mol/l，pH＝7.5 ）50
mlを加え液温60〜65℃で30分間攪拌、加熱した。終了後
デカンテ−ションで人工担体を分離し、生理食塩水を用
い、遠心沈降（700 〜3000rpm 、３〜５分間）を４、５
回繰り返して洗浄した。最後に、生理食塩水約50mlを加
え、５°C で一夜放置した後、超音波処理で担体表面の
余分な金属塩を除去し、担体を分散させた後、デカンテ
−ションで生理食塩水を分離し、更に生理食塩水を加
え、高比重化人工担体懸濁液50mlを得た（サンプル
２）。担体含有量は7.5v/v％であった。

【０００９】実施例２高比重化羊血球の作製 羊赤血球（サンプル３）を10v/v ％含有する懸濁水溶液
30mlを用い、実施例１と同様の処理を行なって、高比重
化処理血球懸濁液50mlを得た（サンプル４）。担体含有
量は6v/v％であった。 実施例３比重測定 塩化セシウム密度勾配遠心平衡法により担体の比重を測
定した。塩化セシウム（片山化学工業 密度勾配遠心用
塩化セシウム）水溶液10mlを遠心チュ−ブに小分けし、
１v/v ％担体分散液を0.2ml重層し、遠心操作を行なっ
た（遠心機：日立70P-72，ロ−タ：日立RPS40T，回転
数：30,000 rpm，遠心時間：72時間）。遠心後、サンプ
ル担体が浮遊している部分を採取し、リフラクトメ−タ
（ＡＴＡＧＯ Model 3 ）で屈折率を測定し、比重を数
式１により求めた。各種担体の比重測定結果を表１に示
した。

【数式１】 比重＝屈折率×10.2402-12.6483

【００１０】

【表１】 表１ 塩化セシウム 屈折率 比重 水溶液濃度 未処理 人工担体 50w/w％ 1.3753 1.4350 （サンプル１） 高比重化 人工担体 52.4w/w％ 1.3928 1.6143 （サンプル２） 未処理血球 40w/w％ 1.3619 1.2978 （サンプル３） 高比重化処理 血球 50w/w％ 1.3867 1.5518 （サンプル４）

【００１１】実施例４感作方法 下記の表２で示す各々の感作材料（抗原または抗体）を
実施例１で調製した本発明により得られた高比重化担体
（サンプル２）および参照として未処理ポリアミノ酸担
体（サンプル１）を、常法に従いタンニン酸感作した。
検体としては、各々の感作抗原、抗体に対応したヒト陽
性血清およびヒト陰性血清を用いた。例えば、HBs 抗原
感作担体についての試験の場合は、陽性検体としてHBs
抗体陽性ヒト血清を用い、陰性検体としてはHBs抗体陰
性ヒト血清を用いた。但し、牛血清アルブミン（BSA ）
感作担体については、抗BSAウサギ免疫血清を陽性検体
とした。なお、感作条件は次のようであった。まず、PB
S(pH7.2)中2.5v/v％担体と、同じくPBS 中８万倍希釈タ
ンニン酸を各々１容づつ混合し、37℃で約30分間処理し
て遠心分離し、PBS で洗浄した。次いで、得られたタン
ニン酸処理担体2.5v/v％PBS浮遊液１容と各感作材料の1
0μg ／ml液１容とを混合し、37℃、30分間処理して遠
心分離を行ないPBS で洗浄し、１v/v ％の濃度となるよ
うに保存用メジウム中に浮遊させた。マイクロタイター法凝集反応試験 得られた感作担体を用いて、担体凝集反応試験を通常の
マイクロタイター法により実施した。まず、マイクロタ
イタープレートに所定の希釈液25μlずつ滴下し、次い
で第一ウェルに検体25μl をとり、2倍段階希釈を行な
う。次に、各々の感作担体浮遊液（1v/v％）を25μl ず
つ滴下し、良く混和させたのち室温に静置させ、凝集を
示した最高の検体希釈倍数をもって凝集価（力価）とし
た。結果は下記の表２のとおりであり、本発明により得
られた担体は未処理担体と同等の力価を示した。

【００１２】

【表２】 表２ 力価 感作材料 陽性検体 陰性検体 ＨＢｃ抗原 サンプル１に感作 ２⁹ ２¹ （組換え酵母 由来） サンプル２に感作 ２⁹ ２¹ ＨＢｓ抗原 サンプル１に感作 ２⁷ ２¹ （プラズマ由来） サンプル２に感作 ２⁶ ２¹ ＨＢｓ抗原 サンプル１に感作 ２⁷ ２¹ （組換え酵母 由来） サンプル２に感作 ２⁷ ２¹ ＨＢｓ抗体 サンプル１に感作 ２⁸ ２¹ （モルモット） サンプル２に感作 ２⁸ ２¹ ＢＳＡ サンプル１に感作 ２⁹ ２¹ サンプル２に感作 ２⁹ ２¹

【００１３】実施例５判定時間の測定 マイクロタイタープレートに所定の希釈液25μl ずつ滴
下し、次に、各々の感作ポリアミノ酸担体浮遊液（1v/v
％）を25μl ずつ滴下し、良く混和させたのち室温に静
置させ、その陰性像の直径（mm）を時間毎に測定した結
果を表３に示した。

【００１４】

【表３】 表３ 時間 ＢＳＡ感作 ＢＳＡ感作 ＨＢ_C 抗原感作 ＨＢ_C 抗原感作 未処理担体 高比重化担体 未処理担体 高比重化担体 （分） （mm） （mm） （mm） （mm） １０ 測定不可能 0.33 測定不可能 0.33 ２０ 測定不可能 0.50 測定不可能 0.50 ３０ 0.33 0.66 0.33 0.65 ４０ 0.50 0.83 0.50 0.81 ５０ 0.67 0.92 0.66 0.90 ６０ 0.81 1.00 0.81 0.98 ９０ 0.92 1.00 0.92 0.98 １２０ 1.00 1.00 1.00 0.98 ９００ 1.03 1.02 1.02 0.99

【００１５】一般に、マイクロタイター法による陰性検
体の判定には、充分な時間放置後得られた陰性像の直径
（通常約１mm）に対して80％以上の陰性像が得られれば
判定可能である。従って、充分な判定を行なうのに未処
理担体は約60〜90分を要したのに対し、本発明の担体は
約40〜60分で判定可能であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 今川 義孝 熊本県熊本市東町４丁目16番 ２−205号 (72)発明者 平井 武徳 熊本県菊池郡西合志町須屋2080−10

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粒子を金属塩溶液で処理することを特徴
   とする粒子免疫測定用粒子の高比重化法。
2. 【請求項２】 金属塩溶液が塩化第二スズ溶液である請
   求項１記載の高比重化法。
3. 【請求項３】 塩化第二スズ溶液の濃度が２０〜６０w/
   w％である請求項２記載の高比重化法。
4. 【請求項４】 粒子が人工担体である請求項１記載の高
   比重化法。
5. 【請求項５】 人工担体がポリアミノ酸担体である請求
   項４記載の高比重化法。
6. 【請求項６】 人工担体がポリスチレンラテックス粒子
   である請求項４記載の高比重化法。
7. 【請求項７】 人工担体がゼラチン担体である請求項４
   記載の高比重化法。
8. 【請求項８】 粒子が動物赤血球である請求項１記載の
   高比重化法。
9. 【請求項９】 請求項１から８のいずれか１項記載の高
   比重化法により得られる粒子免疫測定用粒子からなる検
   査試薬。