JPH0734743B2 - プラスミノーゲン活性化剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、治療剤および診断剤として有用な、新規プラ
スミノーゲン活性化剤（plasminogen activator）に関
する。

プラスミノーゲン活性化剤は血塊（blood clot）の処置
に有用であることが認められている。このような活性化
剤を人間の血流中に十分な量でかつ十分な期間にわたり
導入することにより、発生した血塊を溶解することがで
きる。

これまでに使用されているプラスミノーゲン活性化剤を
単離する方法は、複雑であり、かつ経費を要することが
知られている。たとえば、ウロキナーゼは尿中に見出さ
れるプラスミノーゲン活性化剤であるが、既知の工業的
方法によるその収率は非常に低いので、１人の患者を処
置するために大量の尿を集めかつ処理しなければならな
い。他の原料、たとえば腎組織培地からのウロキナーゼ
の単離、あるいはストレプトキナーゼのような他のプラ
スミノーゲン活性化剤の単離も同様に多くの工程を必要
とし、それらの工程は経費を要するか、あるいは不利な
免疫反応を伴うことがある。さらに、臨床的に使用され
る商業的に入手可能な活性化剤、すなわちアボキナーゼ
（Abbokinase）やストレプトキナーゼ（Streptokinas
e）は、フイブリン血塊に対する親和性が低いことが知
られており、それゆえ充分に効果的ではないか、あるい
は全身性蛋白分解による不利な副作用を伴うことがあ
る。

ウロキナーゼの従来の単離法に関する参考文献として
は、次のものが知られている： （ａ）ダブリュウ・エフ・ホワイトら：「人間尿からの
プラスミノーゲン活性化剤［ウロキナーゼ］の単離と特
性化」バイオケミストリー（W.F.White,et al.:The Iso
lation and Characterization of Plasminogen Activat
ors［Urokinase］from Human Urine,Biochemistry）５
巻2160〜2169頁（1966年））； （ｂ）イー・ケイ・パイら：「親和性クロマトグラフィ
によるウロキナーゼの精製：血栓症とウロキナーゼ」ア
ール・パオレッティら編、アカデミック・プレス、ロン
ドン、ニューヨーク、サンフランシスコ（E.K.Pye,et a
l.:Purification of Urokinase by Affinity Chromotog
raphy In:Thrombosis and Urokinase,Eds.R.Paoletti e
t al.,Academic Press,London,New York,San Fransisc
o）（1977年））。

本発明は、従来のプラスミノーゲン活性化剤とは物理
的、化学的および生物学的特性を異にする新規なプラス
ミノーゲン活性化剤を提供するものである。特に新規プ
ラスミノーゲン活性化剤は従来知られている複鎖ウロキ
ナーゼ（分子量約56,000ダルトン）に比較して単鎖構造
（分子量約56,000ダルトン）をとる点で特徴的であり、
従って本明細書中では該物質を以下「高分子量単鎖ウロ
キナーゼ」と呼ぶことにする。尿中において、この高分
子量単鎖ウロキナーゼはフイブリン−セライトに対して
高い親和性を示すので、尿からこれを効率良く分離、回
収することができる。また、高分子量単鎖ウロキナーゼ
は血栓症に対する治療剤または診断剤もしくはその他の
診断剤として使用することができる。

本発明のプラスミノーゲン活性化剤である高分子量単鎖
ウロキナーゼは、該物質を含む溶液状の原料物質、特に
尿や培地のような該物質を含有する生物学的原料物質か
らここれを単離、採取することができるものであり、た
とえばフイブリンを表面に有する固体状吸着性マトリツ
クス（好ましくはケイソウ土）を用意し、これに高分子
量単鎖ウロキナーゼ含有母液を接触させ、これによって
該母液中の高分子量単鎖ウロキナーゼ分子をフイブリン
分子に結合させ、残りの母液を除去し、フイブリン含有
マトリツクスから高分子量単鎖ウロキナーゼを分離すれ
ばよい。

上記したように、尿中の高分子量単鎖ウロキナーゼは、
固体状の吸着性マトリツクス上に沈着したフイブリンに
対してかなり高い親和性を示す。これと対照的にフイブ
リンを活性化アガロース（たとえば臭化シアノーゲンに
より活性化されたアガロース）へ共有結合させた場合に
は、上記のような親和性を生じない。この差異の理由は
未だ詳らかではないが、共有結合しないで吸着性マトリ
ツクス上に沈着したフイブリンにはフイブリンのリジン
残基のε−アミノ基がある程度遊離の状態で残されてい
るものと考えられ、リジン残基のこれらのε−アミノ基
が高分子量単鎖ウロキナーゼの親和性に寄与するものと
信じられる。対照的にフイブリンが活性化アガロースへ
共有結合すると、リジン残基のアミノ基は親和性を実質
的にブロツクするような方法でアガロースに共有結合す
ることになるものと思われる。

本発明に従って高分子量単鎖ウロキナーゼを実際に単離
する場合、さらに種々の好ましい条件を採用することが
可能である。具体的には、たとえば高分子量単鎖ウロキ
ナーゼが存在する液体培地の中へフイブリン固体粒子を
添加し、攪はんを行って高分子量単鎖ウロキナーゼをフ
イブリン含有マトリツクスに接触させる。固体マトリツ
クス上に沈着しているフイブリンに結合した高分子量単
鎖ウロキナーゼはフイブリン表面から溶出される。フイ
ブリン表面から溶出された高分子量単鎖ウロキナーゼ含
有する溶出液をゲルろ過カラムを通過させ、溶離剤およ
びフイブリンきょう雑物から高分子量単鎖ウロキナーゼ
を分離せしめる。

フイブリンを表面に有する固体マトリツクスを調製する
ための好ましい方法としては、たとえばフイブリノーゲ
ンをトロンビンでマトリツクスの存在下に処理すること
により、フイブリンをマトリツクス上に沈着させてもよ
い。この方法を適用するには、緩衝液中で吸着性のマト
リツクス表面に過剰のフイブリノーゲンを接触させ、吸
着性表面のすべてのフイブリノーゲンで充分に被覆し、
その後該緩衝液にトロンビンを導入してフイブリノーゲ
ンをフイブリンに変え、これによって吸着性表面をフイ
ブリンで効果的に充たすようにすればよい。

また、高分子量単鎖ウロキナーゼを単離する他の方法と
して、吸着性固体マトリツクス（好ましくはケイソウ
土）の存在下にフイブリノーゲンをトロンビンで処理し
てフイブリンをその表面上に沈着させ、尿または培地の
ような高分子量単鎖ウロキナーゼを含む液体状の生物学
的原料を接触させることにより高分子量単鎖ウロキナー
ゼをそれに結合させ、非結合性の物質を緩衝液で除去し
た後、アルギニン、リジンおよびε−アミノカプロン酸
から成る群の１種を含有する水溶液でフイブリン表面か
ら高分子量単鎖ウロキナーゼを溶離させ、その後に高分
子量単鎖ウロキナーゼを該溶離液から分離すればよい。

この方法において、好ましくは尿や培地のような高分子
量単鎖ウロキナーゼを含有する液体状の生物学的原料
は、フイブリン担持マトリツクスと混合、接触せしめた
うえ、液体を傾斜およびろ過により除去し、フイブリン
マトリックスとこれに結合した高分子量単鎖ウロキナー
ゼを緩衝液で反復洗浄する。

本発明による新規なプラスミノーゲン活性化剤、すなわ
ち高分子量単鎖ウロキナーゼは血栓溶解剤として有用で
あり、医師に対しては凍結乾燥の状態で提供される。

具体的には、高分子量単鎖ウロキナーゼは尿または培地
のような生物源から単離することができる。この新規な
生成物は、約56,000ダルトンの分子量（ゲルろ過法によ
る）を有し、フイブリンプレート上で効力検定したとき
40,000〜50,000CTA単位/mgの比活性を示し、非還元状態
でドデシル硫酸ナトリウム−ゲル電気泳動に付したとき
7.5％ポリアクリルアミドゲル上で56,00ダルトンの分子
量に相当する単一蛋白バンドを与える。この生成物を0.
1モルジチオスレイトール（dithiothreitol）で還元し
たものは、ドデシル硫酸ナトリウム−ゲル電気泳動に付
したとき、7.5％ポリアクリルアミドゲル上で単一のバ
ンドを与えるところから、単一鎖構造であることが理解
される。該新規物質は尿中においてフイブリンに対する
実質的な結合親和性を発揮するものであり、これはフイ
ブリン−セライトに対する高い親和性によって証明され
る。

本発明による血塊を検知するプラスミノーゲン活性化剤
トレーサーは本質的に放射性標識物質たとえばヨウ素や
テクネチウムが結合する高分子量単鎖ウロキナーゼから
なる。高分子量単鎖ウロキナーゼがフイブリンに対して
有する高い親和性は、放射性標識を行ったうえでこれを
核走査を通してフイブリン血栓を検出するための新規な
診断剤を提供する根拠となる性質である。

本発明の分離方法は高分子量単鎖ウロキナーゼのフイブ
リンに対する結合性を利用するものである。後記するよ
うに、この原理は尿からフイブリンに対して高い親和性
を有する高分子量単鎖ウロキナーゼを単離するのに応用
されるが、腎組織の培地抽出物のような他の原料から高
分子量単鎖ウロキナーゼを抽出するためにも応用するこ
とができる。

本発明の方法はフイブリノーゲンを吸着する性質をもつ
物質から成るマトリツクスを利用する。後記する実施例
はケイソウ土、セライトなどがこの目的に適しているこ
とを示している。この物質の粉末形態のものが大きい表
面積を与える点で好んで使用される。このマトリツクス
をフイブリノーゲンと混合した後、フイブリノーゲンを
トロンビンに接触させてフイブリンに変え、マトリツク
ス上にフイブリンを沈着させる。このマトリツクスはフ
イブリノーゲンをトロンビンに接触させたとき通常認め
られるゲルの形成を回避するものである。フイブリン−
セライトを尿中でかきまぜると、高分子量単鎖ウロキナ
ーゼが親和性マトリツクスに結合する。次いで結合した
活性化剤をフイブリン−セライトから溶離液による洗浄
により除去する。溶離された高分子量単鎖ウロキナーゼ
は少量のフイブリンにより汚染されているだけであり、
カラムから溶離剤で洗浄し、これは溶離物質と一緒にゲ
ルろ過により容易に分離される。次いで、活性化剤を含
有する最終溶液を凍結乾燥する。

本発明による分離方法の具体例を挙げると、次のとおり
である。

10gの粉末状ケイソウ土（セライト、分析ろ過助剤、フ
ィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー製）、
すなわちマトリツクスを蒸留水で洗浄し、25mlの緩衝液
（0.05モルリン酸ナトリウム、pH7.4、0.1モルNaClおよ
び１ミリモルEDTA含有）中の２％ヒトフイブリノーゲン
（スウエーデン、ストックホルム、カビ社製）と混合す
る。緩衝液1ml中のトロンビン（パーク・デービス社
製、ボビン・トピカル）100uを一定の速度でかきまぜな
がら室温において加える。この際に良く混合を行うこと
はフイブリン−マトリツクスの凝集を防ぐ効果がある。
30分後、フイブリン−マトリツクスを焼結ガラスの漏斗
でろ過し、同じ緩衝液（１）で洗浄し、次いで0.2モ
ルアルギニン含有緩衝液で洗浄する。最後の洗浄は、１
ミリモルEDTおよび0.3モルNaClを含有する0.05モルリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）を用いて行う。洗浄した
フイブリン−マトリツクス（沈降体積15ml）を１の新
鮮なヒトの尿に加え、この混合物を１時間冷却時（４
℃）にかきまぜる。ろ過後、フイブリン−マトリツクス
をカラムに詰め、平衡緩衝液（上記フイブリン−アナト
リックスの最後の洗浄に使用したリン酸ナトリウム緩衝
液と同一の組成を有する。）で洗浄する（８〜10カラム
容積）。次いで活性化剤はフイブリンからアルギニン
（上記緩衝液中0.2モル）により単一の鋭いピークで溶
離される。別法として、溶離はリジンまたはε−アミノ
カプロン酸で行うことができる。次にアルギニンと汚染
フイブリン誘導体とをセフアデツクスＧ−100（スウエ
ーデン、ウプサラ、ファルマシア・ケミカルス製）によ
り除去し、活性化剤を含有する溶液を凍結乾燥する。

新鮮なヒトの尿１からほぼ12.00〜30.00CTA単位の高
分子量単鎖ウロキナーゼが得られる。高分子量単鎖ウロ
キナーゼの分子量は超微細セフアデツクスＧ−200のゲ
ルろ過によりほぼ56,000ダルトンであると決定される
（測定法についてはピー・アンドリュウス：メソッズ・
オブ・バイオケミカル・アナリシス（P.Andrews;Method
s Biochem.Anal.）８巻１〜53頁（1970年））。該物質
はプラスミノーゲンに富んだフイブリンプレート上でフ
イブリンの急速な分解を誘発する。フイブリンプレート
上で検定した場合、40,000〜50,000CTA単位/mgの比活性
を示す（測定法についてはピー・ブラックマン：「フイ
ブリノリーシス：標準化フイブリンプレート法ととプラ
スミノーゲンの線溶的定量」アムステルダム、スケルチ
マら出版（P.Brakman,“Fibrinolysis:A Standardized
Fibrin Plate Methot and a Fibrinolytic Assay of Pl
asmiongen"published by Scheltima et al.Amsterdam）
１〜124頁（1967年））。

適当に実施された場合のフイブリンプレート試験は複鎖
ウロキナーゼのような従来知られている精製プラスミノ
ーゲン活性化剤に対して信頼するに足る検定法である。
この試験に対しては次のような酵素の蛋白分解効果が検
定の結果を決定する：（１）ウロキナーゼ（複鎖）がプ
レート上のプラスミノーゲンを活性化してプラスミンを
形成せしめる；（２）次いでプラスミンがプレート上の
フイブリンを分解する。

高分子量単鎖ウロキナーゼと市販ウロキナーゼ（アボッ
ト社製）との間には、下表に要約されるような２つの基
本的な差異と１つの性質が見出される： さらに、生理学的条件下のフイブリンのいっそう効果的
な分解が、市販のウロキナーゼに比較して、高分子量単
鎖ウロキナーゼについて見出された。

市販ウロキナーゼ（アボット社製）は主として低分子量
の形態を含有する。市販ウロキナーゼ（アボット社製）
中に見出された高分子量ウロキナーゼの部分は、還元
後、ドデシル硫酸ナトリウム−ゲル電気泳動により２つ
の蛋白質バンドを与えるところから、２つの鎖構造をも
つように思われる（測定法についてはケー・ウエーバー
ら；「ジ・プロテイン」エイチ・ノイラスら編、アカデ
ミック・プレス、ニューヨーク（K.Weber et al.,「The
Proteins」,Eds.H.Neurath et al.,Academic Press,Ne
w York）１巻179〜223頁（1975年））。のウロキナーゼ
の高分子量の形態は本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼ
のウロキナーゼに比較してフイブリンに対して低い親和
性を有するが、低分子量ウロキナーゼは親和性をもたな
い。結局、高分子量ウロキナーゼと低分子量ウロキナー
ゼとの混合物である市販ウロキナーゼは、前述のよう
に、フイブリンに対して非常に低い親和性を有すること
が知られている。

本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼの分子量56,000ダル
トンと言う測定値は分子量が47,000〜56,000の間である
として種々報告され、最も広く受け入れられている分子
量54,000ダルトンの値を有する市販のウロキナーゼ中の
高分子量形のものに匹敵する値であり、低分子量ウロキ
ナーゼの分子量30,000〜35,000ダルトンと言う値とは顕
著に相違するものである。しかしながら、高分子量単鎖
ウロキナーゼは0.1モルジチオスレイトールで還元後、
7.5％ポリアクリルアミドゲル上のドデシル硫酸ナトリ
ウム−ゲル電気泳動により単一のタンパク質バンドを与
えることにより証明されるように、単鎖構造をとるもの
と考えられる（ウエーバーらの前記文献参照）。

本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼがその吸着に用いた
条件下で、フイブリン−セライトに対し結合能を有する
ことは、それがフイブリンに対し比較的高い結合親和性
をもつことを示す。

本発明者らが初めて単離した高分子量単鎖ウロキナーゼ
はその本来の分子の形態を保持しているものと考えられ
る。単離が少ない工程数で素早く実施されるため、単一
鎖分子構造の保持が可能なのであろう。

他方、比較的遅くかつ多数の工程を経て実施される従来
技術の方法にあっては、分子が分解され、複鎖構造であ
って、フイブリンに対する親和性が低いものが生ずるも
のと考えられる。

上記の他、本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼの性状と
して、至適pH約8.8、安定pH範囲２〜９が挙げられる。
なお、本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼは一種のチモ
ーゲンであるから、作用適温の範囲、pH、温度などによ
る失活の条件、阻害化などについてはこれを示すことは
出来ないが、活性化のためにプラスミンまたはカリクレ
インとの処理が挙げられ、安定化のために凍結乾燥やpH
4.8の緩衝液中−20℃における貯蔵が好適条件として挙
げられる。

本発明の方法は、次のように従来法よりも優れたいくつ
かの利点を有している： 1.本発明方法は長時間を要する多工程の単離法ではな
く、迅速に実施し得る単一工程の方法である。現在用い
られている長時間を要する方法では、ウロキナーゼの望
ましくない変性、自己分解または他の蛋白質分解酵素に
よる分解が生じる。

2.本発明方法は低親和性プラスミノーゲン活性化剤から
高親和性のものを分離するものであり、新鮮な尿が高い
親和性のウロキナーゼを含有すること（被採取者にもよ
るが、通常、ウロキナーゼ全量の40〜80％）を初めて見
出したものである。

3.本発明方法は、低親和性ウロキナーゼを与えることな
く、尿から全高分子量単鎖ウロキナーゼを高い収率（約
60％）で収得する方法を提供する。これと対照的に、現
在臨床的使用されている市販ウロキナーゼ（アボキナー
ゼ）は、本質的に高分子量単鎖ウロキナーゼを含有しな
い低親和性プラスミノーゲン活性化剤である。

上記した抽出法は経済的かつ迅速に実施し得るものであ
るから、科学的研究および臨床的目的のため、単鎖構造
とフイブリンに対する比較的高い親和性によって特徴づ
けられるヒトウロキナーゼを比較的安価にかつ豊富に供
給することができる。

肺動脈寒栓症の血栓崩壊治療のためのFDAの認可を得て
いる、２種の市販プラスミノーゲン活性化剤すなわちス
トレプトキナーゼ（ヘキスト社製およびカビ社製）およ
びウロキナーゼ（アボット社製）は低い親和性の活性化
剤である。その結果、大量の活性化剤（100,000〜200,0
00CTA単位／時）を注入して血塊の分解を達成しなくて
はならない。プラスミンは広い特異性をもつ酵素である
から、これらの活性化剤を注入することにより、いくつ
かの血漿蛋白質（フイブリノーゲン、因子ＶおよびVII
I）を分解する、全身蛋白分解という望ましくない状態
を引き起こす。

これと対照的に、本発明により発見されかつ効率的に単
離される高分子量単鎖ウロキナーゼはそのフイブリンに
対する親和性もしくはその単鎖構造のため、低濃度にお
いて遥かに特異的な線維素溶解を達成する。

高分子量単鎖ウロキナーゼのフイブリン結合性は脈管内
の血塊または血栓の検知に利用することもできる。適当
な放射性同位元素（たとえば、125ヨウ素またはテクネ
チウム）を分子に結合させ、かくして標識化された高分
子量単鎖ウロキナーゼを脈管内に注射することにより、
放射性核走査により脈管内のフイブリンを同定すること
ができる。たとえば、標識化された高分子量単鎖ウロキ
ナーゼを肺の走査による肺動脈寒栓（肺の血塊）の特異
的検知に使用することができる。普通の方法は特異性で
あるため、そのような方法によってこのような診断を行
うことは困難である。

放射核走査のため放射標識プラスミノーゲン活性化剤を
使用しようとする従来の試みは、使用したプラスミノー
ゲン活性化剤がフイブリンに対する高い親和性に欠けて
いたため、あまり効果を挙げていない。この点の従来技
術に関する参考文献としては次のものがある： （ａ）ダブリュー・ティー・ミラーら：「テクネチウム
99m標識静脈系血栓の探索」（予報）ランセット（W.T.M
illar,et al.:「Localization of Deepvenous Thrombos
is Using Technitium 99m−labelled Urokinase」（pre
liminary communication）,Lancet）２巻695〜696頁（1
974年））； （ｂ）ブイ・ケンピら：「99mTc−ストレプトキナーゼ
による静脈血栓症の診断−静脈撮影との臨床的比較」ブ
リティッシュ・メディカル・ジャーナル（V.Kempi,et a
l.:「Diagnosis of Deep Vein Thrombosis with 99mTc
−streptokinase:A Clinical Comparison with Phlebog
raphy」,British Medical Journal）２巻748〜749頁（1
974年））。

なお、本発明の高分子量単鎖ウロキナーゼは「プロウロ
キナーゼ」と呼ぶこともできる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リピンスキ−・ボグスロウ アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州ニユ− トンビル・ビユ−マウント・アベニユ−97 (72)発明者 グルウイツチ・ビクタ− アメリカ合衆国マサチユ−セツツ州ケンブ リツジ・スウイ−ト309マウント・オ−バ ン・ストリ−ト300 (56)参考文献 Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓ. 38（1977） Ｐ．136

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）ゲルろ過法によって測定したとき約
   56,000ダルトンの分子量を示し、（ｂ）非還元状態のも
   のについてドデシル硫酸ナトリウム−ゲル電気泳動法で
   測定したとき、7.5％ポリアクリルアミドゲル上に約56,
   000ダルトンの分子量に相当する単一蛋白質バンドを与
   え、（ｃ）0.1モルジチオスレイトールによる還元後、
   ドデシル硫酸ナトリウム−ゲル電気泳動法を適用した場
   合、上記と同様の挙動を示して単一鎖構造であることを
   示し、（ｄ）尿中でフイブリン−セライトに対し高い結
   合親和性を示し、（ｅ）フィブリンプレート上で効力検
   定したとき、40,000〜50,000CTA単位/mgの比活性を示
   す、高分子量単鎖ウロキナーゼから成るプラスミノーゲ
   ン活性化剤。
2. 【請求項２】生物源から分離された高分子量単鎖ウロキ
   ナーゼから成る請求の範囲第１項記載のプラスミノーゲ
   ン活性化剤。
3. 【請求項３】高分子量単鎖ウロキナーゼがトレーサーと
   して使用される請求の範囲第１項記載のプラスミノーゲ
   ン活性化剤。
4. 【請求項４】高分子量単鎖ウロキナーゼが放射性元素と
   結合してトレーサーとして使用される請求の範囲第３項
   記載のプラスミノーゲン活性化剤。
5. 【請求項５】診断剤として使用される請求の範囲第１項
   記載のプラスミノーゲン活性化剤。
6. 【請求項６】血栓診断剤として使用される請求の範囲第
   ５項記載のプラスミノーゲン活性化剤。
7. 【請求項７】治療剤として使用される請求の範囲第１項
   記載のプラスミノーゲン活性化剤。
8. 【請求項８】血栓溶解剤として使用される請求の範囲第
   ７項記載のプラスミノーゲン活性化剤。