JPH084500B2 - 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 - Google Patents
組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法Info
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- JPH084500B2 JPH084500B2 JP61081246A JP8124686A JPH084500B2 JP H084500 B2 JPH084500 B2 JP H084500B2 JP 61081246 A JP61081246 A JP 61081246A JP 8124686 A JP8124686 A JP 8124686A JP H084500 B2 JPH084500 B2 JP H084500B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔ
−PA）の精製方法に関する。本発明において組織プラス
ミノーゲン・アクチベータという用語は、組織プラスミ
ノーゲン・アクチベータ活性を有するタンパクおよび合
成法または遺伝子工学法により得られるそれらの誘導体
を意味する。
−PA）の精製方法に関する。本発明において組織プラス
ミノーゲン・アクチベータという用語は、組織プラスミ
ノーゲン・アクチベータ活性を有するタンパクおよび合
成法または遺伝子工学法により得られるそれらの誘導体
を意味する。
プラスミノーゲンは、プラスミノーゲン・アクチベー
タ（PA）によりプラスミンに変わる。この反応の触媒に
はウロキナーゼおよびｔ−PAが含まれる。これらのアク
チベータを線維素溶解剤として治療に用いることは知ら
れている。フィブリンに対するその高い親和性の故に、
ｔ−PAは溶解療法に特に重要である。
タ（PA）によりプラスミンに変わる。この反応の触媒に
はウロキナーゼおよびｔ−PAが含まれる。これらのアク
チベータを線維素溶解剤として治療に用いることは知ら
れている。フィブリンに対するその高い親和性の故に、
ｔ−PAは溶解療法に特に重要である。
細胞培養上清および尿からPAを単離および精製する方
法は既に記載されている（西独特許出願公開第2,815,85
3号明細書、欧州特許第0,041,766号明細書）。これらの
方法は複雑であり従って工業的に用いるには適していな
い。
法は既に記載されている（西独特許出願公開第2,815,85
3号明細書、欧州特許第0,041,766号明細書）。これらの
方法は複雑であり従って工業的に用いるには適していな
い。
ｔ−PAを単離するための一方法は、欧州特許第0,041,
766号明細書に記載されている。これには、亜鉛キレー
トSepharose 、コンカナバリンＡ−Agarose 、および
Sephadex Ｇ−150（超微粒）が用いられる。これら精
製工程にはそれぞれ大きな欠点が伴う。すなわち、亜鉛
およびコンカナバリンＡは生成物に混入する可能性があ
り、またSephadex Ｇ−150（超微細）は、その能力お
よび流動性の故に工業的方法に用いることはできない。
欧州特許第0,023,869号明細書には、フィブリンの可溶
性断片が共有結合により固定化されける担体を用いたｔ
−PAの精製が記載されている。この方法も同様に工業的
単離方法に適していない。
766号明細書に記載されている。これには、亜鉛キレー
トSepharose 、コンカナバリンＡ−Agarose 、および
Sephadex Ｇ−150（超微粒）が用いられる。これら精
製工程にはそれぞれ大きな欠点が伴う。すなわち、亜鉛
およびコンカナバリンＡは生成物に混入する可能性があ
り、またSephadex Ｇ−150（超微細）は、その能力お
よび流動性の故に工業的方法に用いることはできない。
欧州特許第0,023,869号明細書には、フィブリンの可溶
性断片が共有結合により固定化されける担体を用いたｔ
−PAの精製が記載されている。この方法も同様に工業的
単離方法に適していない。
本発明の目的は、ｔ−PAの簡単な精製方法を開発する
ことにある。
ことにある。
驚くべきことに、前記したｔ−PAがサッカライドのポ
リサルフェートまたは硫酸化糖に対して高い親和性を示
し、また後者を担体に結合すればこれらｔ−PAの精製を
このタイプの物質を介して行うことが可能であることを
見出した。
リサルフェートまたは硫酸化糖に対して高い親和性を示
し、また後者を担体に結合すればこれらｔ−PAの精製を
このタイプの物質を介して行うことが可能であることを
見出した。
従って、本発明は、ｔ−PAを含む溶液を担体に結合さ
れたサッカライドのポリサルフェートまたは硫酸化糖か
らなる親和性材料と接触させ、液体を除去しそしてこの
材料により結合されたｔ−PAを溶出することよりなるｔ
−PAの精製方法に関する。
れたサッカライドのポリサルフェートまたは硫酸化糖か
らなる親和性材料と接触させ、液体を除去しそしてこの
材料により結合されたｔ−PAを溶出することよりなるｔ
−PAの精製方法に関する。
ｔ−PAは好ましくは、ヒト起源のものである。
親和性材料により結合された不純物は、好ましくは前
記アクチベータの溶出前に、洗浄により除去される。
記アクチベータの溶出前に、洗浄により除去される。
更に、負荷された親和性材料から、硫酸ナトリウム、硫
酸アンモニウム、NaCl、LiClまたはクエン酸塩を含む緩
衝液を用いて不純物を除去し、そして前記アクチベータ
を硝酸カリウム、塩化アンモニウム、塩化バリウム、臭
化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、チオ
チアン酸カリウム、尿素またはこれら物質の混合物を含
む緩衝液で溶出する方法が好ましい。
酸アンモニウム、NaCl、LiClまたはクエン酸塩を含む緩
衝液を用いて不純物を除去し、そして前記アクチベータ
を硝酸カリウム、塩化アンモニウム、塩化バリウム、臭
化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、チオ
チアン酸カリウム、尿素またはこれら物質の混合物を含
む緩衝液で溶出する方法が好ましい。
サッカライドのポリサルフェートまたは硫酸化糖を共
有結合カップリングするための担体材料としては、例え
ば不溶性アガロース、デキストラン、アクリルアミドま
たはポリエチレングリコールグリシジルメタクリレート
ポリマーまたはそれらの組合せを用いてもよい。デキス
トランまたはアガロースマトリックスが好ましい。
有結合カップリングするための担体材料としては、例え
ば不溶性アガロース、デキストラン、アクリルアミドま
たはポリエチレングリコールグリシジルメタクリレート
ポリマーまたはそれらの組合せを用いてもよい。デキス
トランまたはアガロースマトリックスが好ましい。
サッカライドのポリサルフェートまたは硫酸化糖のカ
ップリングは、既知の方法により、例えば、臭化シアン
で予め活性化された担体材料に結合するか、またはカル
ボジイミド縮合によりアミノ−官能化樹脂に結合するな
どして行われるが、カルボジイミド縮合によりリジン−
官能化担体材料にカップリングすることにより行うのが
好ましい。
ップリングは、既知の方法により、例えば、臭化シアン
で予め活性化された担体材料に結合するか、またはカル
ボジイミド縮合によりアミノ−官能化樹脂に結合するな
どして行われるが、カルボジイミド縮合によりリジン−
官能化担体材料にカップリングすることにより行うのが
好ましい。
デキストランサルフェート、ヘパランサルフェート、
コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、
デルマタンサルフェート、ペントサンサルフェートまた
はArteparon 、好ましくはヘパリンをサッカライドの
ポリサルフェートまたは硫酸化糖として用いることがで
きる。
コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、
デルマタンサルフェート、ペントサンサルフェートまた
はArteparon 、好ましくはヘパリンをサッカライドの
ポリサルフェートまたは硫酸化糖として用いることがで
きる。
もうひとつの有利な方法は、ｔ−PA含有溶液を、担体
に結合された、サッカライドのポリサルフェートまたは
硫酸化糖、好ましくはヘパリン−リジン−Sepharoseと
混合し、負荷された親和性材料を、所望によりNaClを含
有するpH3〜９の緩衝液で洗浄し、樹脂上に結合された
不純物を、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、NaCl、
LiClまたはクエン酸塩を含むpH3〜９の緩衝液、好まし
くはpH3〜９の0.1〜２モル/lクエン酸塩溶液、好ましく
はpH3.5〜６の0.5モル/lクエン酸塩で溶出し、そしてｔ
−PAを、所望により洗剤好ましくは0.1〜1g/l Tween 8
0（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を
含む、KNO3、KSCN、NH4Cl、CaCl2、MgCl2、KBr、BaCl2
または尿素を含むpH3〜９の緩衝液好ましくは１〜２モ
ル/l KSCN（好ましくはpH5〜８）で溶出することからな
る。
に結合された、サッカライドのポリサルフェートまたは
硫酸化糖、好ましくはヘパリン−リジン−Sepharoseと
混合し、負荷された親和性材料を、所望によりNaClを含
有するpH3〜９の緩衝液で洗浄し、樹脂上に結合された
不純物を、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、NaCl、
LiClまたはクエン酸塩を含むpH3〜９の緩衝液、好まし
くはpH3〜９の0.1〜２モル/lクエン酸塩溶液、好ましく
はpH3.5〜６の0.5モル/lクエン酸塩で溶出し、そしてｔ
−PAを、所望により洗剤好ましくは0.1〜1g/l Tween 8
0（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を
含む、KNO3、KSCN、NH4Cl、CaCl2、MgCl2、KBr、BaCl2
または尿素を含むpH3〜９の緩衝液好ましくは１〜２モ
ル/l KSCN（好ましくはpH5〜８）で溶出することからな
る。
特に好ましい実施態様においては、ｔ−PA含有溶液、
例えばメラノーマ細胞培養上清または尿（所望により鉱
物質除去）を、ヘパリン−、デキストランサルフェート
−またはペントサンサルフェート−Sepharose 好まし
くはヘパリン−Sepharose （ヘパリン−リジン−Sepha
rose が好ましい）と、親和性材料100gに対し細胞培養
上清10lの割合で混合し、その樹脂から不純物を、0.1〜
２モル/lクエン酸塩溶液（pH3〜９）、好ましくは0.5モ
ル/lクエン酸塩液（pH3.5〜６）を用いて除去し、そし
てｔ−PAを、所望により0.1〜1g/l Tween 80を含む１
〜２モル/l KSCN含有緩衝液（pH5〜８）で溶出する方法
とすることもできる。
例えばメラノーマ細胞培養上清または尿（所望により鉱
物質除去）を、ヘパリン−、デキストランサルフェート
−またはペントサンサルフェート−Sepharose 好まし
くはヘパリン−Sepharose （ヘパリン−リジン−Sepha
rose が好ましい）と、親和性材料100gに対し細胞培養
上清10lの割合で混合し、その樹脂から不純物を、0.1〜
２モル/lクエン酸塩溶液（pH3〜９）、好ましくは0.5モ
ル/lクエン酸塩液（pH3.5〜６）を用いて除去し、そし
てｔ−PAを、所望により0.1〜1g/l Tween 80を含む１
〜２モル/l KSCN含有緩衝液（pH5〜８）で溶出する方法
とすることもできる。
もうひとつの特に好ましい実施態様において、ｔ−PA
を、所望により0.1〜1g/lTween 80を含む、pH4〜９の
１〜２モル/l CaCl2含有緩衝液、好ましくはpH5〜８の
２モル/l CaCl2溶液で溶出する方法とすることもでき
る。
を、所望により0.1〜1g/lTween 80を含む、pH4〜９の
１〜２モル/l CaCl2含有緩衝液、好ましくはpH5〜８の
２モル/l CaCl2溶液で溶出する方法とすることもでき
る。
この方法は、ｔ−PAを、ひとつの精製工程によって、
従来方法ではいくつかの精製工程を行なった後にのみ得
られる純度および比活性で得ることができるという点で
優れている。
従来方法ではいくつかの精製工程を行なった後にのみ得
られる純度および比活性で得ることができるという点で
優れている。
本発明を以下の実施例により説明する。
実施例１ ｔ−PA産生メラノーマ細胞の細胞培養上清10lを攪拌
しながら室温で100gのヘパリン−Sepharose と混合し
た。タンパク液を除去後、親和性材料を0.1％Tween 80
を含む0.1モル/l tris・HCl、0.1モル/l NaCl（pH7.5）
で洗浄し、次いで0.5モル/lクエン酸塩（pH5.0）を用い
て不純物を除いた。PAを0.1モル/l tris・HCl、２モル/
l KSCNおよび0.01％Tween 80を含む緩衝液（pH7.5）を
用いて溶出した。その溶出液を透析し、濃縮しそしてｔ
−PA活性を試験した。出発溶液中に存在するｔ−PA活性
のうち、99％はヘパリン−Sepharose に結合した。溶
出後、ｔ−PA活性の90％が回収された。
しながら室温で100gのヘパリン−Sepharose と混合し
た。タンパク液を除去後、親和性材料を0.1％Tween 80
を含む0.1モル/l tris・HCl、0.1モル/l NaCl（pH7.5）
で洗浄し、次いで0.5モル/lクエン酸塩（pH5.0）を用い
て不純物を除いた。PAを0.1モル/l tris・HCl、２モル/
l KSCNおよび0.01％Tween 80を含む緩衝液（pH7.5）を
用いて溶出した。その溶出液を透析し、濃縮しそしてｔ
−PA活性を試験した。出発溶液中に存在するｔ−PA活性
のうち、99％はヘパリン−Sepharose に結合した。溶
出後、ｔ−PA活性の90％が回収された。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動は異なる分子量の２
つのタンパクのバンドを示した。ひとつのバンドは免疫
学的にｔ−PAに帰属するものとされた。
つのタンパクのバンドを示した。ひとつのバンドは免疫
学的にｔ−PAに帰属するものとされた。
実施例２ 実施例１に記載と同様の方法により10lの細胞培養上
清を処理し、次いで0.1モル/l tris（pH8.0）および0.1
％Tween 80を含む２モル/l CaCl2溶液で溶出した。そ
の結果は実施例１に示したものと比較しうるものであっ
た。
清を処理し、次いで0.1モル/l tris（pH8.0）および0.1
％Tween 80を含む２モル/l CaCl2溶液で溶出した。そ
の結果は実施例１に示したものと比較しうるものであっ
た。
実施例３ ｔ−PA産生メラノーマ細胞の細胞培養上清10lを500g
のペントサンサルフェート−Sepharoseと混合した。タ
ンパク液を除去した後、親和性材料を、0.1モル/l tris
・HCl（pH7.5）で洗浄し、次いで２モル/l KSCN、0.1モ
ル/l tris・HClを含む緩衝液（pH7.5）で溶出した。約8
0％の活性がその樹脂に結合した。
のペントサンサルフェート−Sepharoseと混合した。タ
ンパク液を除去した後、親和性材料を、0.1モル/l tris
・HCl（pH7.5）で洗浄し、次いで２モル/l KSCN、0.1モ
ル/l tris・HClを含む緩衝液（pH7.5）で溶出した。約8
0％の活性がその樹脂に結合した。
Claims (10)
- 【請求項１】組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔ
−PA）を含む溶液を、担体に結合されたサッカライドの
ポリサルフェートまたは硫酸化糖からなる親和性材料と
接触させ、液体を除去し、その親和性材料から不純物を
除去し、そしてこの親和性材料により結合されたｔ−PA
を溶出することからなる、ｔ−PAの精製方法。 - 【請求項２】サッカライドのポリサルフェートまたは硫
酸化糖がリジンを介して担体に結合される特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】サッカライドのポリサルフェートがヘパリ
ンである特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】担体がアガロースである特許請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項５】ｔ−PAを溶出する前に、結合した不純物
を、NaCl、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、LiClま
たはアルカリ金属クエン酸塩、および所望により0.1〜1
g/lのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを
含む緩衝液で親和性材料を洗浄することにより除去する
特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】ｔ−PAを溶出する前に、結合した不純物
を、所望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレエートを含む0.1〜２モル/lクエン酸塩溶
液（pH3〜９）で親和性材料を洗浄することにより除去
する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】ｔ−PAを溶出する前に、結合した不純物
を、所望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレエートを含む0.4〜0.6モル/lクエン酸塩溶
液（pH3.5〜６）で親和性材料を洗浄することにより除
去する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項８】負荷された親和性材料から緩衝液を用いて
不純物を除去し、そしてｔ−PAを、所望により0.1〜1g/
lのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含
む硝酸カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、
塩化マグネシウム、臭化カリウム、塩化バリウム、尿素
またはチオシアン酸カリウムまたはこれら物質の混合物
の溶液で溶出する特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項９】負荷された親和性材料から緩衝液を用いて
不純物を除去し、そしてｔ−PAを、0.5〜２モル/l KSCN
（pH4〜９）および所望により0.1〜1g/lのポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレエートを含む緩衝液で溶出す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１０】負荷された親和性材料を、所望によりNa
Clを含むpH4〜９の緩衝液で洗浄し、結合した不純物
を、所望により0.1〜1g/lのポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレエートを含む0.4〜0.6モル/lアルカリ金属
クエン酸塩溶液（pH3.5〜６）で親和性材料を洗浄する
ことにより除去し、そしてｔ−PAを所望により0.1〜1g/
lのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含
む、0.5〜２モル/l KSCN含有緩衝液（pH4〜９）で溶出
する特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853512910 DE3512910A1 (de) | 1985-04-11 | 1985-04-11 | Verfahren zur reinigung von plasminogenaktivatoren |
| DE3512910.7 | 1985-04-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61236726A JPS61236726A (ja) | 1986-10-22 |
| JPH084500B2 true JPH084500B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=6267676
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61081246A Expired - Lifetime JPH084500B2 (ja) | 1985-04-11 | 1986-04-10 | 組織プラスミノーゲン・アクチベータの精製方法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5015583A (ja) |
| EP (1) | EP0210332B1 (ja) |
| JP (1) | JPH084500B2 (ja) |
| AT (1) | ATE49420T1 (ja) |
| AU (1) | AU603544B2 (ja) |
| DE (2) | DE3512910A1 (ja) |
| DK (1) | DK161986A (ja) |
| ES (1) | ES8703522A1 (ja) |
| IL (1) | IL78452A (ja) |
| MX (1) | MX167325B (ja) |
| NO (1) | NO174111C (ja) |
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| DE8710813U1 (de) * | 1987-08-07 | 1987-09-24 | Rhein-Conti Kunststoff-Technik Gmbh, 6900 Heidelberg | Tankstutzen mit Verschraubung von oben |
| US5225330A (en) * | 1988-08-01 | 1993-07-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Diagnostic kit and diagnostic method utilizing carbohydrate receptors |
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| JP2520975B2 (ja) * | 1989-09-21 | 1996-07-31 | 三井東圧化学株式会社 | 組織プラスミノ―ゲンアクチベ―タ―若しくはその誘導体を含有する血栓溶解剤 |
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| US20020076728A1 (en) * | 1997-03-21 | 2002-06-20 | Maclennan John Moore | Engineering affinity ligands for macromolecules |
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| US3998947A (en) * | 1973-11-30 | 1976-12-21 | Pierre Fabre S.A. | Process for obtaining a plasminogen activator |
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