JPH0736014B2 - 抗エンドセリン抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、エンドセリン（Endothelin）に対して特異的
に反応する抗体、該抗体の製造法、該抗体を使用したエ
ンドセリンの免疫学的測定法およびエンドセリンの免疫
学的測定用キットに関するものである。

技術背景 エンドセリンは血管内皮細胞より分泌される血管収縮活
性を有する新規な生理活性ペプチドであり（Nature,Vo
l.332,p411〜415（1988）参照）、該生理活性ペプチ
ド、その加水分解フラグメントまたは該ペプチドの前駆
体の血中濃度を測定することは本態性高血圧症のメカニ
ズムを解明するためにも有意義なことと考えられてい
る。

従来、ホルモン等の生理活性ペプチドの濃度を測定する
一手段としての免疫学的測定法が種々開発されている
〔内分泌実験講座第５巻「ホルモン測定法（上）」、同
講座第６巻「ホルモン測定法（下）」（以上、1982年５
月20日（株）講談社発行）など参照〕。しかし、エンド
セリンの場合にはエンドセリンに対して特異的に反応す
る抗体が調製されておらず、このためエンドセリンを免
疫学的測定法により測定することは不可能なことであっ
た。

したがって、本発明は、エンドセリンに対して特異的に
反応する抗体を取得することを第１の目的とし、次に取
得した抗体を用いてエンドセリンを免疫学的に測定する
方法の確立を第２の目的とするものである。

発明の開示 本発明者らは、エンドセリンに対して特異的に反応する
抗体を取得すべく研究を重ねた結果、該抗体の取得に成
功するとともに、取得した抗体を用いることによりエン
ドセリンを測定することができることを知見し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明はエンドセリンに対して特異的に反応
する抗体（以下、本発明抗体と称することもある）を提
供するものである。

また、本発明はエンドセリンに対して特異的に反応する
抗体の製造法を提供するものである。

また、本発明はエンドセリンに対して特異的に反応する
抗体を使用したエンドセリンの免疫学的測定法を提供す
るものである。

さらに、本発明はエンドセリンを免疫学的に測定するた
めのキットを提供するものである。

図面の簡単な説明 第１〜３図は抗血清の希釈率とその吸光度の関係を示し
たものである。第１図は、ヒト由来のエンドセリンとウ
シ血清アルブミンとの複合体を抗原として使用し、これ
をマウスに免疫して得られた抗血清を使用して作成した
ものである。第２図は、ヒト由来のエンドセリンとエッ
グアルブミンとの複合体を抗原として使用し、これをウ
サギに免疫して得られた抗血清を使用して作成したもの
である。第３図は、後述の合成ペプチドとウシ血清アル
ブミンとの複合体を抗原として使用し、これをマウスに
免疫して得られた抗血清を使用して作成したものであ
る。

第４図は本発明の抗エンドセリンモノクローナル抗体の
エンドセリンに対する中和作用を示したものである。第
４（ａ）図は本発明のモノクローナル抗体を投与してな
いときの結果を示したもので、第４（ｂ）図は本発明に
モノクローナル抗体を投与したときの結果を示したもの
である。

第５〜７図は本発明の抗エンドセリンモノクローナル抗
体を使用して作成した検量線である。図中、黒丸（●）
はヒト由来のエンドセリンの溶解溶液を抗原溶液として
使用した時の測定値、白丸（○）は後述の合成ペプチド
の溶解溶液を抗原溶液として使用した時の測定値をそれ
ぞれ示したものであり、黒丸および白丸に付記した上下
の線は同様の測定を５回行った時の標準偏差を表わす。
なお、第５図は第17ハイブリドーマ株産生のエンドセリ
ンのＣ末以外のところと特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を使用して作成したものであり、第６図は第16ハ
イブリドーマ株および第７図は第20ハイブリドーマ株が
それぞれ産生するエンドセリンのＣ末部分と特異的に反
応するモノクローナル抗体を使用して作成したものであ
る。

第８図は第１ハイブリドーマ株と第５ハイブリドーマ株
の産生する２種類のモノクローナル抗体を使用するサン
ドイッチ法により作成した検量線である。

発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。

I.抗原の調製 本発明抗体を調製するために使用する抗原としては、ヒ
ト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラ
ット、マウスなどの哺乳動物より調製したエンドセリ
ン、該エンドセリンを加水分解して得られるフラグメン
ト、または該エンドセリンと同一の抗原決定基を１種も
しくは２種以上有する合成ペプチドなどを例示すること
ができる。

哺乳動物より調製したエンドセリンの具体例としては、
たとえば下記式〔Ｉ〕のアミノ酸配列からなるヒトまた
はブタ由来のエンドセリンを例示することができる（た
だし、ヒト由来のエンドセリンとブタ由来のものは同一
の構造を有している）。

〔式中、CysはＬ−システィン、SerはＬ−セリン、Leu
はＬ−ロイシン、MetはＬ−メチオニン、AspはＬ−アス
パラギン酸、LysはＬ−リジン、GluはＬ−グルタミン
酸、ValはＬ−バリン、TyrはＬ−チロシン、PheはＬ−
フェニルアラニン、HisはＬ−ヒスチジン、IleはＬ−イ
ソロイシン、TrpはＬ−トリプトファンを示す。〕 エンドセリンを加水分解して得られるフラグメントとし
ては、たとえば、上記のヒトまたはブタ由来のエンドセ
リンをアミノペプチターゼ、カルボキシペプチターゼな
どのエキソペプチターゼを用いてＮ末端側および／また
はＣ末端側から順次切断して得られるフラグメント、セ
リンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシ
ルプロテアーゼ、メタルプロテアーゼなどのエンドペプ
チダーゼにより切断して得られるフラグメントなどの各
種酵素の加水分解フラグメントを例示することができ
る。

また、合成ペプチドとしては、たとえば上記のヒトまた
はブタ由来のエンドセリンのアミノ酸配列において３個
以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇
所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種もしくは
２種以上含有する合成ペプチドを例示することができ
る。

このようなエンドセリン、その加水分解フラグメントお
よびエンドセリン中に存在する抗原決定基と同一の抗原
決定基を１種もしくは２種以上有する合成ペプチド（以
下、これらを単に「エンドセリン抗原」と称する）は、
血管内皮細胞の培養液から単離する方法、化学的に合成
する方法などの常法から使用するエンドセリン抗原の種
類に応じた最良の調製法を適宜選択して調製すればよ
い。

血管内皮細胞の培養液からエンドセリン抗原を単離する
方法としては、たとえばブタなどの哺乳動物の大動脈よ
り擦過法により得た内皮細胞の培養上清をイオン交換ク
ロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの
ペプチドの通常の単離精製手段を適宜組み合わせて処理
することによりエンドセリン抗原を単離精製することが
できる（詳細は、Nature、Vol.332、411〜415（31.Marc
h.1988）、実験医学、第６巻（第４号）、第11〜16頁
（1988）参照）。

また、エンドセリン抗原を化学的に合成する方法として
は、アジド法、酸クロリド法、非対称型酸無水物法（混
合酸無水物法、リン酸，ヒ酸無水物法など）、対称型酸
無水物法（N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（D
CC）法など）、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエ
ステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、
シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを
用いる方法、カルボニルジイミダゾール法、酸化還元
法、DCC/アディティブ（例、HONB、HOBT、HOSu）法など
通常用いられている方法を適宜選択して実施すればよ
い。また、これらの化学的合成法は液相法、固相法のい
ずれであってもよく、また、合成手順としてアミノ酸を
１個づつ縮合させていく段階的伸長法、数個のアミノ酸
からなるフラグメントを縮合させていくフラグメント縮
合法のいずれの方法も適用することができる。なお、こ
れらの合成法の具体的な手順、手法に関しては成書を参
照することができる〔「The Peptides」Vol.1、Academi
c Press,New York,USA（1966）、「ペプチド合成」（丸
善株式会社、1975年）〕。

このようにして得られたエンドセリン抗原は、分子量が
小さく、抗原性が低いため、適当な高分子量担体に結合
または吸着させた複合体を免疫抗原として使用する。

エンドセリン抗原を結合させるための高分子量の担体と
しては、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり
常用されている天然もしくは合成の担体を使用すること
ができる。天然の高分子担体としては、たとえば、ウシ
血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヒト血清アル
ブミンなどの動物血清アルブミン類、ウシ血清グロブリ
ン、ウサギ血清グロブリン、ヒト血清グロブリン、ヒツ
ジ血清グロブリンなどの動物血清グロブリン類、ウシチ
ログロブリン、ウサギチログロブリンなどの動物チログ
ロブリン類、ウシヘモグロビン、ヒツジヘモグロビン、
ヒトヘモグロビンなどの動物ヘモグロビン類、キーホー
ルリンペットヘモシアニンなどのヘモシアニン類などを
例示することができる。合成の高分子担体としては、た
とえば、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グル
タミン酸共重合物などのアミノ酸の重合物または共重合
物、スチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、
ジビニルベンゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、
（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エチル、（メ
タ）アクリルニトリル、（メタ）アクロレイン、（メ
タ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビ
ニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビ
ニル、塩化ビニリデンなどの芳香族ビニル化合物、α，
β−不飽和カルボン酸またはそのエステル類、α，β−
不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役
ジエン化合物などから調製した重合物または共重合物な
どの各種ラテックスなどを例示することができる。

このような担体とエンドセリン抗原との結合は、物理的
吸着法、共有結合法、イオン結合法などいずれの結合法
を採用してもよい。

物理的吸着法の具体例としては、たとえばポリビニルピ
ロリドンまたはラテックス粒子とエンドセリン抗原を室
温で１〜３時間ゆっくり攪拌することにより実施するこ
とができる（詳細は、Endocrinology,93、1092（197
3）、特開昭61−43124号公報など参照）。また共有結合
法は、エンドセリン抗原および担体中に存在しているア
ミノ基、カルボキシル基、スルフィドリル基などの各種
官能基を活性化してエンドセリン抗原と担体とを結合す
ることのできる結合剤の存在下、ホウ酸緩衝液、リン酸
緩衝液などの各種緩衝液中、高分子担体１モルに対して
エンドセリン抗原１〜50倍モルおよび過剰量の結合試薬
を使用して、反応温度０〜50℃で30分〜30時間反応させ
ることにより実施することができる。

エンドセリン抗原と担体との結合に使用する結合剤とし
ては、ハプテンまたはペプチドと担体または酵素との結
合の際に常用されているものであればよい。たとえば、
チロシン、ヒスチジン、トリプトファン中の複素環を架
橋するビスジアゾ化ベンチジン、ビスジアゾ化3,3′−
ジアニシジンなどのビスジアゾニウム化合物、アミノ基
同志を架橋させるグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジ
ポアルデヒドなどのジアルデヒド化合物、トルエン−2,
4−ジイソシアネート、キシレンジイソシアネートなど
のジイソシアネート化合物、2,4−ジニトロ−1,5−ジフ
ルオロベンゼン、p,p′−ジフルオロ−m,m′−ジニトロ
フェニルスルホンなどのハロニトロベンゼン化合物、ジ
エチルマロンイミデートなどのイミドエステル化合物、
チオール基同志を架橋させるN,N′−Ｏ−フェニレンジ
マレイミド、N,N′−ｍ−フェニレンジマレイミドなど
のジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋さ
せるＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−スクシ
ンイミド、４−（マレイミドメチル）安息香酸Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−
（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキ
シル−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの
マレイミド−スクシンイミド化合物、アミノ基とカルボ
キシル基を架橋するN,N′−ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイ
ミド、１−エチル−３−ジイソプロピルアミノカルボジ
イミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル
−４−エチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンス
ルホネートなどのカルボジイミド化合物、Ｎ−エチル−
５−フェニルイソオキサゾリウム−３′−スルホネート
などのイソオキサゾリウム塩化合物、エチルクロロホル
メート、イソブチルクロロホルメートなどのアルキルク
ロロホルメート化合物を使用することができる。

これらの結合剤は使用するエンドセリン抗原中の官能基
と担体中の官能基の種類に応じて適宜選択して使用すれ
ばよい。なお、エンドセリン抗原中の官能基としては、
たとえば、前記式〔Ｉ〕で表わされるヒトまたはブタ由
来のエンドセリンをエンドセリン抗原として使用する場
合の結合部位としては、エンドセリン中のチロシン、ト
リプトファン、ヒスチジンの複素環、アスパラギン酸、
グルタミン酸およびＣ末端部のカルボキシル基、Ｎ末端
部またはリジンのアミノ基、システィンのチオール基な
どを例示することができる。

このようにして調製した免疫抗原（エンドセリン抗原と
担体との複合体）は、透析法、ゲル濾過法などの常法に
従って単離精製することができる。

上述のようにして調製した免疫抗原のうち担体１モル当
り、２〜20倍モルのエンドセリン抗原が結合したもの
は、エンドセリンに対して特異的に反応する抗体の製造
に特に有用なものである。

II.抗体の製造 上述の免疫抗原を用いて抗体を製造する場合には、該免
疫抗原を動物に投与して生体内にエンドセリンに対して
特異的に反応する抗体を生産させ、これを採取するとい
う常法に従って実施することができる。

すなわち、免疫抗原を投与する動物としては、ウシ、ウ
マ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ブ
タ、ウサギ、サルなどの哺乳動物類、ハト、ニワトリな
どの鳥類を使用することができ、特にマウス、ラット、
モルモット、ウサギが使用に好都合である。

このような動物への免疫抗原の投与は常法に従って行え
ばよく、たとえば、完全フロイントアジュバンド、不完
全フロイントアジュバンド、ミヨウバンアジュバンド、
水酸化アルミニウムアジュバンド、百日咳菌アジュンバ
ンドなどの各種アジュバンドと上述の免疫抗原との懸濁
液を調製し、これを上記動物の静脈、腹腔内、皮下また
は皮内に注射すればよい。

投与量は、動物としてウサギ、モルモットを使用する場
合には抗原量として0.01〜10mg/匹程度、またマウス、
ラットを使用する場合には、0.001〜1mg/匹程度であ
る。

初回投与後、１〜４週間おきに１〜５回程度の上記と同
様の追加免疫を行い、エンドセリンに対して特異的に反
応する抗体を得ることができる。

このようにして得られた抗体は、最終免疫の１〜２週間
後に採血し、これを遠心分離することによりエンドセリ
ンに対して特異的に反応する抗体を主成分として含有す
る抗血清として取得することができる。抗体の精製を必
要とする場合には、また前記免疫抗原を固定化して得た
固定化抗原を利用してエンドセリンとのみ特異的に反応
する抗体のみを分別精製したのち、さらに、溶解度差を
利用した選択的分別法（たとえば、塩析、アルコール沈
殿など）、電荷の差を利用した分別法（たとえばイオン
交換クロマトグラフィー、電気泳動など）、分子量の差
を利用した分別法（たとえば超遠心法、ゲル濾過法な
ど）などの常法を適宜組み合わせて抗血清中に存在する
抗体を抗体のクラスごとに分別精製してもよい。

次に、エンドセリンに対して特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体の調製について説明すれば、該モノクローナ
ル抗体は公知の細胞融合法、EBウイルスなどによるトラ
ンスフォーメーション法などを適宜応用することにより
調製することができる。

モノクローナル抗体の大量生産により好適な細胞融合法
を例に挙げ説明すれば、たとえば以下の手順でエンドセ
リンに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を取
得することができる。

ａ）抗体産生細胞の調製 前記免疫抗原を前記と同様の動物に同様の条件で投与
し、免疫を獲得した動物から抗体産生細胞（脾細胞、リ
ンパ節細胞または末梢血細胞）を常法により取得する。

ｂ）ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤
抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質
を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性
株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（Hypoxanthine phospho−ri
bosyl transferase）を欠損し、ヒポキサンチン・アミ
ノプリン・チミジン（HAT）培地に生育できない。また
細胞の性質として免疫クロブリンを分泌しない、いわゆ
る非分泌型の細胞株であることが好ましい。

ミエローマ細胞株の具体例としては、P3X 63Ag8（ATCC
TIB−９）（Nature,256,495−497（1975））、P3X63Ag8
U.1（P₃U₁）（ATCC CRL−1597）（Current Topics in
Mecrobiology and Immunology,81,1−７（1978））,P3X
63Ag8.653（ATCC CRL−1580）（J.lmmunology,123,1548
−1550（1979））、P3/NSI/1−Ag4−１（ATCC TIB−1
8）（European J.Immunology,６,.511−519（197
6））、Sp2/O−Ag14（ATCC CRL−1581）（Nature,276,2
69−270（1978））などのマウスミエローマ細胞株、21
0.RCY.Ag1.2.3（Y3−Ag1.2.3）（ATCC CRL−1631）（Na
ture,277,131−133（1979））などのラットミスローマ
細胞株、Ｕ−266−AR₁（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,7
7,5429（1980））、GM1500（Nature,288,488（198
0））、KR−４（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79,6651
（1982））などのヒトミエローマ細胞株を例示すること
ができる。

ｃ）細胞融合 細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグル最少基本培
地（MEM）、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、RPM
I1640培地などの動物細胞培養用培地中で10⁷〜10⁸のミ
エローマ細胞と抗体産生細胞を混合比1:4〜10に混合す
ることにより行うことができる。細胞融合を促進させる
ために、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリコー
ル（PEG）、ポリビニールアルコール、センダイウイル
スなどを融合促進剤を使用することができる。

また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用い
て抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもで
きる。

ｄ）選択培地におけるハイブリドーマの選別 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する手段としては、選択的培地における細胞の選択
的増殖を利用する方法を用いることができる。たとえ
ば、細胞液を15％ウシ胎児血清（FCS）含有RPM11640培
地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に10⁵〜10⁶
／ウエル程度まき、各ウエルに選択培地（たとえば、HA
T培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培
養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグアニン耐性
株、選択培地としてHAT培地を用いた場合は、未融合の
ミエローマ細胞は培養10日目ぐらいまでに死滅し、正常
細胞である抗体産生細胞もインビトロ（in vitro）では
長期間成育できないので、培養10〜14日目から成育して
くる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。

ｅ）エンドセリンに対して特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマの検索 エンドセリンに対して特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマの検索は、酵素標識免疫
定量法（ELISA）、放射性同位元素免疫定量法（RIA）な
どによって行うことができる。たとえば、エンドセリン
抗原を吸着させた96ウエルELISA用マイクロプレートに
モノクローナル抗体を含む培養上清を添加して特異抗体
を反応させ、次いで結合した特異抗体に酵素標識抗免疫
グロブリン抗体を反応させるか、ビチオン標識抗免疫グ
ロブリン抗体およびアビジンＤ−酵素標識体を反応さ
せ、各ウエルに酵素基質を加えて発色させる。発色の有
無によりエンドセリンと結合力を有する抗体を産生する
ハイブリドーマの検索を行うことができる。

ｆ）クローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などに
より行うことができる。

ｇ）モノクローナル抗体の生産 このようにして取得したハイブリドーマから抗エンドセ
リンモノクローナル抗体を生産する方法としては、通常
の細胞培養法や腹水形成法などが採用されうる。

細胞培養法において、ハイブリドーマを10〜15％FCS含
有RPMI160培地、無血清培地などの動物細胞培養用培地
中で培養し、その培養上清液から抗体を取得することが
できる。

腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物に、プリスタン（2,6,10,14−テ
トラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与
した後、ハイブリドーマを約10⁷個腹腔内投与する。ハ
イブリドーマは10〜18日ほどで腹水腫瘍を形成し、血清
および腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、DEAE
セルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン交換
クロマトグラフィー、プロティンＡ−セファロースなど
を用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子ふる
いクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法
など公知の方法を適宜に選択、組合せることにより精製
することができる。

III検体中のエンドセリンの免疫学測定法 本発明の測定法の特徴は、本発明抗体またはその活性フ
ラグメント〔たとえば、Ｆ（ab′）₂、Fab′、Fabな
ど〕を抗体試薬として使用するところにあり、採用する
免疫学的測定のシステム自体には制限されない。すなわ
ち、測定すべき抗原とそれに特異的に反応する抗体との
結合能を利用して抗原−抗体反応を行わせ、反応後の検
体中の抗原量に対応した抗体、抗原または抗体−抗体複
合体の量を化学的または物理的手段により測定し、既知
量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線から測
定値に対応する抗原量を算出する方法であれば、いずれ
の測定法であっても本発明の測定法として採用すること
ができる。

このような測定法とては、ネフロメトリー（たとえば凝
集阻止反応を利用した免疫比ろう法、免疫比濁法な
ど）、競合反応法（たとえば液相法、固相法など）、イ
ムノメトリック法、サンドイッチ法などを例示すること
ができる。また、測定システムで使用する標準物質とし
ては、たとえば、放射性同位元素（たとえば¹²⁵I、
¹³¹I、³H、¹⁴Cなど）、酵素（たとえば、β−ガラクト
シターゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなど）、
補酵素・補欠分子族（たとえば、FAD、FNM、ATP、ビチ
オン、ヘムなど）、蛍光色素〔フルオレセイン誘導体
（たとえば、フルオレセインイソチオシアナート、フル
オレセインチオフルバミルなど）、ローダミン誘導体
（たとえば、テトラメチルローダミンＢイソチオシアナ
ートなど）、ウムベリフェロン、１−アニリノ−８−ナ
フタレンスルホン酸など〕、ルミノール誘導体（たとえ
ば、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘ
キシル）−Ｎ−エチルイソルミノールなど）、ニトロオ
キサイドラジカル（たとえば、３−置換−2,2,5,5−テ
トラメチルピロリジン−１−オキシルなど）、金属錯体
などを使用することができる。

これら個々の免疫学的測定法を本発明方法に応用する場
合、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それ
ぞれの方法における通常の条件、手段に当業者の通常の
技術的配慮を加えて、その方法の抗体試薬として本発明
抗体またはその活性フラグメントを使用し、測定目的の
エンドセリンを感度よく測定できるように測定システム
を構成すればよい。これらの一般的技術手段の詳細につ
いては、総説、成書などを参照することができる〔たと
えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和49年４月10日発行）、入江 寛編「続ラジオ
イムノアッセイ」（（株）講談社、昭和54年５月１日発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（（株）医学書
院、1978年12月15日発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第２版）（（株）医学書院、1982年12月15日発
行）、臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行
会、1983年発行）、「免疫測定法の新しい活用事例と診
断試薬・治療開発への応用−総合技術資料集−」（経営
教育出版、昭和60年６月20日発行）、有機合成化学、第
38巻第２号（1980）、第151〜163頁、「Methods in Enz
ymology」Vol.70（Immunochemical Techniques（Part
A））、同書Vol.73（Immunochemical Techniques（Part
B））、同書Vol.74（Immunochemical Techniques（Part
C））、同書Vol.84（Immunochemical Techniques（Part
D:Selected Immunoassay））、同書Vol.92（Immunochem
ical Techniques（PartE:Monoclonal Antibodies and G
eneral Immunoassay Methods））（以上、アカデミック
プレス社発行）など参照〕。

これらの免疫学的測定法のうち、代表的な方法の測定シ
ステムは次のとおりである。

競合反応法 検体中の抗原と一定量の標識抗原とを抗体に対して競合
反応させ、未反応の抗原（Ｆ）と抗体と結合した抗原
（Ｂ）とを分離し（B/F分離）、ＢおよびＦのいずれか
の標識量を測定し、検体中の抗原量を定量する。

本反応法には抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離を
ポリエチレングリコール、前記抗体に対する第二抗体な
どを用いる液相法と抗体として固相化抗体を用いるか、
第一抗体は可溶性のものを用いて第二抗体として固相化
抗体を用いる固相化法とがある。

イムノメトリック法 検体中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対
して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるい
は検体中の抗原と過剰量の標識化抗体を反応させたのち
固相化抗原を加えて未反応の標識化抗体と反応させた後
固相と液相を分離し、いずれかの相の標識量を測定し、
検体中の抗原量を定量する。

サンドイッチ法 試料中の抗原を固相化した第一抗体と反応させ、さらに
第一抗体の結合部位とは別の抗原の部位を認識する標識
化第二抗体を反応させ、液相と固相とを分離し、液相ま
たは固相の標識量を測定し、試料中の抗原量を定量す
る。この時、第一抗体および第二抗体はポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体のいずれも使用でき、ま
た、第一抗体としてポリクローナル抗体および第二抗体
としてモノクローナル抗体を使用する組合せあるいはそ
の逆の組合せであってもよい。

変法として、第二抗体に直接標識化せずに、測定抗原と
は異なる抗原または結合子（ビチオンなどの化合物）を
第二抗体に結合させたものを用い、第二抗体と測定抗原
との反応終了後、第二抗体に結合された抗原に対する第
三抗体または結合子に対する結合性物質（アビシンな
ど）の標識化物を反応させ、液相と固相とを分離してい
ずれかの標識量を測定する間接標識法もある。結合子と
結合性物質の組み合わせとしてビオチン−アビジン系が
広く用いられている。

IVエンドセリン測定用試薬キット 本発明の測定用試薬キットは、キットを構成する抗体試
薬として本発明抗体またはその活性フラグメントを使用
することを特徴とする。このため、抗体および抗原試薬
の使用態様およびキットを構成する各試薬の選択など
は、採用した測定システムに適合するように適宜選択
し、公知の方法を応用して調製することができる。以
下、抗体および抗原試薬の使用態様として繁用されてい
る固相化抗体（抗原）および標識化抗体（抗原）の調製
法について説明する。

固相化抗体の調製 抗体を担持させるための担体の材質としては、多糖類
（たとえば、セルロース、デキストラン、デンプン、デ
キストリン、ヒドロキシエチルセルロース、ｐ−アミノ
フェノキシヒドロキシプロピルデキストラン、アガロー
ス、セファデックスなど）のハロゲン化シアン活性化物
（特公昭45−38543号公報参照）、多糖類のメタ過ヨウ
素酸ナトリウム活性化物（特開昭58−756号公報参
照）、セルロースまたはその誘導体のアミノエチルもし
くはアミノプロピル化物（特開昭59−42452号公報参
照）、セルロースまたはその誘導体のメルカプト化物
（特開昭58−80558号公報参照）、多糖類のシアネート
化物（特公昭49−23031号公報参照）、多糖類のエピク
ロルヒドリン−ｐ−アミノフェノール処理物（特開昭54
−158994号公報参照）、芳香続アミノ基を含む多糖類誘
導体のジアゾ化物（希塩酸、亜硝酸ナトリウム処理）、
セルロースカルボナート誘導体、酢酸セルロース、天然
繊維（綿、麻、ウールなど）などの天然高分子誘導体担
体、エチレン、プロピレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、
プロピオン酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸エステ
ル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、スチレン、
メチルスチレン、ブタジエン、イソプレン、アクリルア
ミド、アクリロニトリル、メタクロニトリルなどの重合
体もしくは共重合体担体、またはこれらに公知の手段に
よりアミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スル
ホン基、チオール基、アジド基、イソシアノ基などの反
応性官能基を導入したものなどが挙げられる。

担体の形状としては、チューブ状、テストプレート状、
ビーズ状、ディスク状、球状、スティック状、ラテック
ス状などが例示できる。

担体に固定化する抗体は、抗体自体あるいは抗体の活性
フラグメントであるＦ（ab′）₂、Fab′もしくはFabで
あってもよい。

固相化法としては、物理的吸着法、共有結合法、架橋
法、包括法のいずれも適用することができる。このよう
な固相化法の詳細については、固相化酵素における方法
を応用すればよく、たとえば千畑一郎編、「固定化酵
素」（昭和50年３月20日、株式会社講談社発行）第９〜
75頁などの成書や総説を参照すればよい。

固相化抗原の調製 抗原を担持させるための担体の材質および形状は上記の
固相化抗体の調製時に使用したものと同じもの使用する
ことができる。

担体に固定化する抗原としては、エンドセリンと蛋白質
との複合体を使用することができる。エンドセリンと蛋
白質との複合体は、前述の免疫抗原を調製する方法と同
じ方法により調製したものを使用することができる。

固相化法は、固相化抗体と同様に物理的吸着法、共有結
合法、架橋法、包括法のいずれも適用することができ
る。

標識化抗体の調製 標識化抗体の調製は、使用する標識もしくは標識系にお
いて確立された公知の方法を応用することにより実施す
ることができる。たとえば、放射性同位元素を標識化す
る場合は、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ
法、グルコースオキシダーゼ法、結合法（Bolton−Hunt
er法）などを用いることができる。酵素を標識化する場
合は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミ
ド法、ピリジル・ジスルフィド法などを用いることがで
きる。また、抗体に直接酸素を標識化する方法以外にも
ビチオン標識抗体と酵素標識アビジンを用いる間接標識
法などを用いることもできる。

標識化抗原 標識化抗原の調製は、標識化抗体と同様に公知の方法を
応用することにより実施することができる。たとえば、
放射性同位元素を標識化する場合は、クロラミンＴ法、
ラクトペルオキシダーゼ法、グルコースオキシダーゼ法
などが適用できる。また酵素を標識化する場合は、抗原
と酵素との間にスペーサーを介して間接的に結合させる
方法などを適用することができる。該スペーサーとして
は、前述の免疫抗原を調製する時に例示した結合剤を使
用することができる。

以上に詳述した固相化抗体、固相化抗原、標識化抗体ま
たは標識化抗原の１つ以上を用いたエンドセリンの測定
用試薬キットの具体的構成例をエンザイムノアッセイ用
キットの例に基づいてより具体的に説明する。

キット〔Ａ〕は競合反応法に基づく測定キットであり、
以下の試薬を主要構成要素とする。

イ、担体上に固定化した固相化抗原 ロ、酵素標識抗エンドセリンモノクローナル抗体 ハ、エンドセリンの標準溶液 ニ、酵素活性測定に必要な基質溶液 ホ、酵素反応停止溶液 キット〔Ｂ〕はサンドイッチ法に基づく測定キットであ
り、以下の試薬を主要構成要素とする。

イ、担体上に固定化した固相化抗エンドセリンモノクロ
ーナル抗体 ロ、抗エンドセリンポリクローナル抗体（第二抗体溶
液） ハ、ビチオン標識抗IgG抗体 ニ、酵素標識アビジン ホ、エンドセリンの標準溶液 ヘ、酵素活性測定に必要な基質溶液 ト、酵素反応停止溶液 以上の構成要素にさらに必要に応じて希釈溶液、呈色溶
液、洗浄溶液などを追加補充することができる。

上記のキット〔Ａ〕はたとえば下記の方法により使用す
ることができる。

固相化抗原に対してエンドセリン標準溶液もしくは被検
液と酵素標識抗体を０〜40℃で0.5〜５時間反応させ
る。液相と固相を分離後、液相および固相のいずれかの
相に基質溶液を加え、酵素反応させたのち、酵素反応を
停止させ、反応液中の光学的強度を測定する。

また、上記キット〔Ｂ〕もたとえば下記の方法により使
用することができる。

固相化抗体とエンドセリン標準溶液もしくは被検液を０
〜40℃で0.5〜５時間反応させる。担体を洗浄後、さら
に第二抗体溶液を添加し、０〜40℃で0.5〜５時間反応
させる。担体を洗浄後、ビチオン標識抗IgG抗体を加え
て反応させ、次に酵素標識アビジンを加え反応させる。
液相と固相を分離後、液相および固相のいずれかの相に
基質溶液を加え酵素反応させたのち、酵素反応を停止さ
せ、吸光度を測定する。

次に、本発明について、具体的実施例を挙げて説明す
る。なお、以下の実施例ではエンドセリンとしてヒト由
来のものと同一構造を有する合成品を使用した。

実施例１抗エンドセリン抗血清 エンドセリンとウシ血清アルブミンとの複合体の製造 ウシ血清アルブミン（BSA）10mgとエンドセリン１〜2mg
を、0.1Mりん酸緩衝液（pH7.0）1mlに溶解し、これに21
mMグルタルアルデヒド〔0.1Mりん酸緩衝液（pH7.0）に
溶解したもの〕0.5mlを攪拌しながら滴下して室温で24
時間反応させた。反応後、反応液を0.1Mりん酸緩衝液
（pH7.0）に対して透析して未反応物質を除き、エンド
セリンとBSAとの複合体を得た。

得られた複合体はBSA1分子当り平均５分子のエンドセリ
ンが結合したものであった。

抗エンドセリン抗血清の調製 上記複合体と完全フロイントアジュバンドとを1:1で混
合してエマルジョンとし、これをBalb/cマウス（メス、
６週令）に１匹当り25μｇを３週間おきに４回腹腔内投
与した。最終免疫の10日経過後に採血し、４℃で16時間
放置後3000rpm、10分間遠心して得られた上清を抗エン
ドセリン抗血清とした。

このようにして得られた抗エンドセリン抗血清のエンド
セリンとの反応性をELISA法により調べた。すなわち、B
SAとエンドセリンとの複合体と同様の反応条件で調製し
たエンドセリンとマウス血清アルブミン（MSA）との複
合体またはMSAを0.1Mりん酸緩衝生理食塩水（PBS）に２
μg/mlになるように溶解し、これを96ウエルマイクロプ
レートにウエルあたり50μｌを添加し、４℃で１夜放置
して96ウエルマイクロプレートにエンドセリンとMSAと
の複合体またはMSAをコートした。

コート処理後、ウエルをPBSで２回洗浄し、３％ゼラチ
ン含有PBSを各ウエルに添加して室温で30分間放置する
ことによりブロッキング処理を行った。

ブロッキング処理後の各ウエルに上記抗エンドセリン抗
血清の希釈液を50μｌ加え、室温で１時間反応させた。
反応後、PBSで３回洗浄し、ビチオン化抗マウスIgG溶液
（ベクター社製）50μｌ加えて室温で１時間反応させ
た。

次に、アビジンＤ−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ベクター社製）溶液50μｌを加え、室温で30分間反
応させた。PBSで３回洗浄後、基質溶液（４−アミノア
ンチピリン（0.25mg/ml）、フェノール（0.25mg/ml）、
0.00125％過酸化水素含有）200μｌを加えて室温にて反
応させ、各ウエルの550nmにおける吸光度を96ウエルマ
イクロプレートフォトメーターを用いて測定した。

測定した結果を第１図に示す。第１図に示すように、本
発明の抗エンドセリン抗血清は、エンドセリンと特異的
に反応し、検体中のエンドセリンの測定に使用できるも
のであった。

実施例２抗エンドセリン抗血清 実施例１とと同様にしてエッグアルブミンとエンドセ
リンとの複合体を調製した。得られた複合体はエッグア
ルブミン１分子当りエンドセリン５分子が結合したもの
であった。

この複合体と完全フロイントアジュバンドとの1:1のエ
マルジョンを調製し、ウサギ１匹当り0.5mgを３週間お
きに２回免疫した。最終免疫の10日後に採血し、3000rp
m.10分間遠心し、上清を抗エンドセリン抗血清とした。

このようにして得られた抗血清のエンドセリンとの反応
性を実施例１記載のEILISA法で測定し、その結果を第２
図に示す。第２図に示したとおり、ウサギより得られた
抗血清はエンドセリンと特異的に反応するものであっ
た。

実施例３抗エンドセリン抗血清 合成ペプチド（NH₂−Arg−Cys−His−Leu−Asp−Ile−I
le−Trp−COOH）とBSAとの複合体を実施例１と同様に調
製した。得られた複合体はBSA1分子当り合成ペプチド６
分子が結合したものであった。

この複合体を実施例１と同様にマウスに免疫し、得られ
た抗血清とエンドセリンとの反応性を実施例１記載のEL
ISA法で調べた。その結果を第３図に示す。第３図に示
したように、合成ペプチドをエンドセリン抗原として用
いてエンドセリンと特異的に反応する抗血清を調製する
ことができた。

実施例４抗エンドセリンモノクローナル抗体 抗エンドセリンモノクローナル抗体の調製 実施例１のエンドセリン−BSA複合体を生理食塩水に溶
解させたもの（1ml/1ml）と完全フロインドアジュバン
ドと1:1で混合してエマルジョンとし、これをBalb/cマ
ウス（メス、６週令）の腹腔内に50μｇ投与して初回免
疫とした。

初回免疫後、２週間おきに数回、同様の方法で免疫した
後、最終免疫として50μｇをマウスの尾静脈に投与し
た。

最終免疫から３日後にマウスの脾細胞を摘出し、イーグ
ル最少基本培地（MEM）で洗浄した。一方、マウスミエ
ローマP3×63Ag8U.1（P₃U₁）（ATCC CRL−1597）をMEM
で洗浄したものと上述の脾細胞とを10:1で混合し、遠心
分離して得たペレットに50％ポリエチレングリコール
（PEG）1000含有MEM溶液1mlを徐々に加えて、細胞融合
を行った。さらに、MEM溶液を加えて全量を10mlとした
後、遠心分離して得たペレットを10％ウシ胎児血清（FC
S）含有RPMI 1640培地にP₃U₁として３×10⁴cell/0.1ml
となるように懸濁させ、96ウエルマイクロプレートに各
ウエルあたり0.1mlずつ分注した。１日後、HAT培地を0.
1ml添加し、その後３〜４日ごとに培地の半分量を新し
いHAT培地で交換し、ハイブリドーマの生育が認められ
たウエルの上清100μｇを分取し、PBS200μｌで希釈し
た。あらかじめMSAでコートした96ウエルマイクロプレ
ートおよびエンドセリン−MSA複合体（10μg/ml）でコ
ートした96ウエルマイクロプレートに上記の希釈した培
養上清液をそれぞれ50μｌずつ添加した。次にビチオン
化ウマ抗マウスIgG抗体（ベクター社製）を加えた後、
アビジンＤ−酵素結合体として、アビジンＤ−ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ（ベクター社製）、基質お
よび発色剤として過酸化水素および４−アミノアンチピ
リン−フェノールを用いたELISA法によりエンドセリン
−MSA複合体と反応し、MSAと反応しない抗体を産生する
ハイブリドーマ21株を選択した。

次に限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを
行った。クローニング後、細胞（ハイブリドーマ）を培
養して数を増やし、あらかじめプリスタンを腹腔内に投
与して１ヶ月位たったマウスの腹腔内へ一匹当り３×10
⁶細胞を投与した。

２週間後マウス１匹あたり約20mlの腹水を採取した。腹
水約40ml（２匹分）と同量のPBSを加えて希釈した後、
飽和硫安80mlを加え、50％硫安飽和条件下にて沈澱する
画分を遠心することにより採取した。この沈澱画分に約
10mlの0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.2）を加えて溶解
させ、これを同緩衝液に対して２日間透析した。

次に抗体溶液をDE52（ワットマン社製）を充填したカラ
ム（22mm×65cm）に添加し、素通り画分を集め、次にこ
の素通り画分をウルトロゲルAcA44（LKB社製）を充填し
たカラム（22mm×65cm）に添加しゲル濾過することによ
り、精製抗体を得た。

抗エンドセリンモノクローナル抗体の免疫学的性質得
られたモノクローナル抗体の特異性を調べるため、ま
ず、エンドセリン−MSA複合体、合成ペプチド−MSA複合
体およびMSAのそれぞれを96ウエルマイクロプレートに
実施例１と同様にコート処理およびブロッキング処理を
行い、抗原を固定化した96ウエルマイクロプレートを調
製した。

なお、合成ペプチドとしては実施例３と同じものを使用
した。

この合成ペプチドはヒト由来のエンドセリンのＣ末端部
の７残基と同一のアミノ酸配列をもつ合成ペプチドであ
り、該合成ペプチドとMSAとの複合体はエンドセリン−B
SA複合体調製と同様の方法で調製した。

このようにして調製した抗原固定化96ウエルマイクロプ
レートの各ウエルに、各ハイブリドーマ株の培養上清を
50μｌ添加し、基質溶液として４−アミノアンチピリン
およびフェノールの代わりにＯ−フェニレンジアミンを
使用する以外は実施例１記載のELISA法と同様の方法に
より492nmの吸光度を測定して各ハイブリドーマ株産生
のモノクローナル抗体の特異性を比較検討した。その結
果を第１表に示す。なお、コントロールとして、培養上
清の代わりに１％BSA含有PBSを用いた。

第１表より明らかなようにエンドセリンのＣ末端部７残
基に特異性を示すモノクローナル抗体（第２、第５、第
９、第13、第14、第16、第18〜21の各ハイブリドーマ株
が産生するモノクローナル抗体）とエンドセリンのＣ末
端部の７残基以外の部位に特異性を示すモノクローナル
抗体（第１、第３、第３、第６〜８、第10〜12、第15、
第17の各ハイブリドーマ株が産生するモノクローナル抗
体）の２種類の特異性を有するモノクローナル抗体を取
得することができた。

抗エンドセリンモノクローナル抗体のサブクラスエン
ドセリン−MSA複合体（２μg/ml）を実施例１と同様に9
6ウエルマイクロプレートにコート処理およびブロッキ
ング処理を施し、これに各ハイブリドーマ株の培養上清
を50μｌ添加して室温で１時間反応させた。

反応後、ウサギ抗マウスIgサブクラス抗体（サイメッド
社製）、ビチオン化ヤギ抗ウサギIgG抗体（ベクター社
製）、アビジンＤ−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ（ベクター社製）、基質溶液（過酸化水素、Ｏ−フェ
ニレンジアミン含有）、反応停止後（2N硫酸）とを順反
応させるELISA法によりそれぞれのハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体のサブクラスを調べた。その
結果は第１表に併せて示した。

抗エンドセリンモノクローナル抗体の中和作用 抗エンドセリンモノクローナル抗体によるエンドセリン
の中和作用をインビボ（in vivo）の系で検討した。

ウイスターキョートラット（WKY、オス、８〜10週令、
体重300〜350g）の大腿動脈および頸動脈にカニューレ
を挿入した。

薬剤（アンジオテンシンIIおよびエンドセリン）は無麻
酔および無拘束条件下、頸動脈に挿入したカニューレか
ら注入し、薬剤の及ぼす血圧及び心拍数に対する作用を
大腿動脈に挿入したカニューレに接続した圧トランスデ
ューサーにより測定した。まず、アンジオテンシンII30
0pmol/kg、エンドセリン300pmol/kgおよびエンドセリン
1nmol/kgを注入した時の血圧または心拍数の変化を第４
（ａ）図に示す。

次に、第20ハイブリドーマ株が産生するモノクローナル
抗体を8mg/kg静注後、５〜10分経過した時点で上述と同
じ薬剤を同量注入した時の血圧および心拍数の変化を第
４（ｂ）図に示す。

第４図より明らかなように、本発明の抗エンドセリン抗
体を投与しない場合にはエンドセリンによる血圧および
心拍数の変動が観察される（第４（ａ）図（ａ−２）お
よび（ａ−３））ものの、エンドセリンを投与する前に
抗エンドセリン抗体を投与した場合にはそのような変動
は全く観察されず（第４（ｂ）図（ｂ−２）および（ｂ
−３））、本発明の抗エンドセリンモノクローナル抗体
がエンドセリンの活性を完全に中和（抑制）しているこ
とが確認された。また、第４図（ａ−１）および（ｂ−
１）に示されているように、アンジオテンシンIIによる
血圧および心拍数の変動は本発明抗体の投与に関係なく
観察され、本発明抗体がエンドセリンを特異的に中和し
ていることも確認された。

実施例５エンドセリンの測定（競合反応） エンドセリン−MSA複合体（0.6μg/ml）を96ウエルマイ
クロプレートにウエルあたり50μｌ添加して、４℃で一
夜放置し、エンドセリン−MSA複合体を96ウエルマイク
ロプレートにコートして固相化抗原とした。

実施例４で得られたハイブリドーマの中から第16、第17
および第20ハイブリドーマ株の培養上清を適宜１％BSA
含有PBSで希釈（30〜300倍に希釈）したものを抗体溶液
とした。

エンドセリンおよび実施例３記載の合成ペプチドを用い
てそれぞれ０〜2560pMの濃度範囲になるように１％BSA
含有PBSで段階希釈したものを標準抗原溶液とした。

このようにして調製した固相化抗原、抗体溶液および標
準抗原溶液を用いて、以下に示す手順で検量線を作成し
た。

抗体溶液と抗原溶液をそれぞれ30μｌを混合し、室温
で30分間反応させる。

反応液50μｌを固相化抗原に添加し、室温で１時間反
応させる。

PBSで２回洗浄し、ビオチン化ウマ抗マウスIgG溶液
（ベクター社製）を50μｌ添加し、室温で１時間反応さ
せる。

PBSで２回洗浄し、アビジンＤ−ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ（ベクター社製）溶液を50μｌ添加
し、室温で15分間反応させる。

PBSで４回洗浄し、基質溶液〔オルトフェニレンジア
ミン（0.2mg/ml）、過酸化水素（0.005％）含有0.1Mク
エン酸緩衝液（pH5.0）〕100μｌを加えて発色させ、2N
硫酸溶液100μｌを加えて反応停止後、492nmにおける吸
光度を測定する。

このようにして作成した検量線を第５〜７図に示す。第
５〜７図より明らかなように、上記方法において40pMの
エンドセリンを測定することが可能であることが明らか
となった。また第17ハイブリドーマ株より得られた抗体
を使用すれば、エンドセリンのＣ末７残基以外の部位も
特異的に測定することができるため、エンドセリンの加
水分解物をも測定できることが示された。

また、上述の固相化抗原、抗体溶液、標準抗原溶液、ビ
オチン化ウマ抗マウスIgG溶液、アビジンＤ−ホースラ
ディシュペルオキシダーゼ溶液、基質溶液および2N硫酸
溶液（反応停止液）からなる各試薬を１つの小箱に充填
し、エンドセリン測定用キットとした。

実施例６エンドセリンの測定（サンドイッチ法） 固相化抗体としては、第１ハイブリドーマ株の産生する
モノクローナル抗体（50μl/ml）を96ウエルマイクロプ
レートにウエルあたり50μｌ添加し、４℃で一夜放置し
てモノクローナル抗体を96ウエルマイクロプレートにコ
ートしたものを使用した。

標準抗原溶液としては、エンドセリンを０〜12.8（ng/m
l）の濃度範囲になるように0.5M塩化ナトリウム、10％B
S（ウシ血清）および５％トラジロール含有0.1Mトリス
−塩酸緩衝液（pH8.0）で段階希釈したものを使用し
た。

第二抗体溶液としては、第５ハイブリドーマ株の産生す
るモノクローナル抗体を常法によりビオチン化し、１％
BSA含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）に２μg/mlの濃度に
なるように溶解したものを使用した。

測定は次の手順で行った。

抗体をコートした96ウエルマイクロプレートに抗原溶
液をウエルあたり50μｌ添加し、室温で２時間反応させ
る。

PBSで洗浄後、第二抗体溶液をウエルあたり50μｌ添
加し、室温で１時間反応させる。

PBSで洗浄後、アビジンＤ−ホースラディッシュペル
オキシダーゼ（ベクター社製）溶液をウエルあたり50μ
ｌ添加し、室温で30分間反応させる。

PBSで洗浄後、基質溶液〔オルトフェニレンジアミン
（0.2mg/ml）、過酸化水素（0.005％）含有0.1Mクエン
酸緩衝液（pH5.0）〕をウエルあたり100μｌ加えて発色
させ、2N硫酸溶液100μｌを加えて反応を停止後、492nm
における吸光度を測定する。

このようにして得られた検量線を第８図に示す。第８図
から明らかなように、本発明抗体をサンドイッチ法に適
用することにより0.2ng/ml（80pM）まで測定することが
可能であることが確認された。

また、上述の固相化抗体、標準抗原溶液、第二抗体溶
液、アビジンＤ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ
溶液、基質溶液、2N硫酸溶液（反応停止液）からなる各
試薬を１つの小箱に充填し、エンドセリン測定用キット
とした。

産業上の利用可能性 本発明の抗体はエンドセリンと特異的に反応するため、
血中のエンドセリンを免疫学的に測定する際に使用する
抗体として有用である。特に抗エンドセリンモノクロー
ナル抗体は、抗エンドセリン抗血清と比較して以下の特
徴を有しており、特に有用なものである。

抗血清と比較して反応特異性および親和性が限定され
ている。

たとえば、実施例４で示したモノクローナル抗体は、エ
ンドセリンのＣ末端部もしくはＣ末端部以外の部位のい
ずれかに特異性を示し、この２種類のモノクローナル抗
体を使用することによりエンドセリン自体はもとより、
エンドセリンの血中での加水分解フラグメントをも特異
的に測定することができる。

抗血清を比較して、モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを樹立することにより品質の一定したモノ
クローナル抗体を安定に供給することができる。

競合反応法により40pMのエンドセリンを測定すること
ができ、きわめて高感度のアッセイ系を組み立てること
ができる。また、実施例６で示したように、特異性の異
なる２種類のモノクローナル抗体を使用したサンドイッ
チ法により80pMのエンドセリンを測定することのできる
アッセイ系を組み立てることができる。

本発明の抗エンドセリンモノクローナル抗体を生体内
に投与した場合、エンドセリンの作用を中和することが
でき（実施例４の参照）、医薬としての可能性も有し
ている。

また、実施例３で示すごとく、合成ペプチドを用いるこ
とによりエンドセリンと反応する抗血清およびモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。このことは、抗原
として使用するエンドセリン分子全体を化学的に合成す
る時間と手間を大幅に短縮することができるものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (72)発明者 加藤 裕久 千葉県銚子市栄町２丁目２番地―２ 審査官 柏崎 康司 (56)参考文献 特開 昭59−163565（ＪＰ，Ａ) Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ，231（２）, Ｐ．440−444，（1988) Ｎａｔｕｒｅ，332（6163），Ｐ．411− 415，（1988)

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エンドセリンに対して特異的に反応するモ
   ノクローナル抗体。
2. 【請求項２】エンドセリンのＣ末端部の７残基に対して
   特異的に反応する、請求の範囲第１項記載のモノクロー
   ナル抗体。
3. 【請求項３】エンドセリンのＣ末端部の７残基以外の部
   位に対して特異的に反応する、請求の範囲第１項記載の
   モノクローナル抗体。
4. 【請求項４】エンドセリンがヒト由来のものである、請
   求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
5. 【請求項５】エンドセリンが下記式〔Ｉ〕で表されるも
   のである、請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗
   体。 〔式中、CysはＬ−システィン、SerはＬ−セリン、Leu
   はＬ−ロイジン、MetはＬ−メチオニン、AspはＬ−アス
   パラギン酸、LysはＬ−リジン、GluはＬ−グルタミン
   酸、ValはＬ−バリン、TyrはＬ−チロシン、PheはＬ−
   フェニルアラニン、HisはＬ−ヒスチジン、IleはＬ−イ
   ソロイシン、TrpはＬ−トリプトファンを示す。〕
6. 【請求項６】検体中のエンドセリンを免疫学的に測定す
   るための方法であって、抗体試薬としてエンドセリンに
   対して特異的に反応するモノクローナル抗体を使用する
   ことを特徴とするエンドセリンの免疫学的測定法。
7. 【請求項７】測定法が競合反応法である、請求の範囲第
   ６項記載の免疫学的測定法。
8. 【請求項８】測定法がサンドイッチ法である、請求の範
   囲第６項記載の免疫学的測定法。
9. 【請求項９】測定法が、エンドセリンのＣ末端部の７残
   基に特異的に反応するモノクローナル抗体とエンドセリ
   ンのＣ末端部の７残基以外の部位に特異的に反応するモ
   ノクローナル抗体の二種類のモノクローナル抗体を用い
   たサンドイッチ法である、請求の範囲第６項記載の免疫
   学的測定法。
10. 【請求項１０】エンドセリンに対して特異的に反応する
    モノクローナル抗体を主要構成要素として含有してなる
    エンドセリン測定用キット。
11. 【請求項１１】測定法が競合反応法である、請求の範囲
    第10項記載の測定用キット。
12. 【請求項１２】測定法がサンドイッチ法である、請求の
    範囲第10項記載の測定用キット。
13. 【請求項１３】測定法が、エンドセリンのＣ末端部の７
    残基に特異的に反応するモノクローナル抗体とエンドセ
    リンのＣ末端部の７残基以外の部位に特異的に反応する
    モノクローナル抗体の二種類のモノクローナル抗体を用
    いたサンドイッチ法である、請求の範囲第10項記載の測
    定用キット。