JPH0737475B2 - 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬 - Google Patents

新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬

Info

Publication number
JPH0737475B2
JPH0737475B2 JP3161356A JP16135691A JPH0737475B2 JP H0737475 B2 JPH0737475 B2 JP H0737475B2 JP 3161356 A JP3161356 A JP 3161356A JP 16135691 A JP16135691 A JP 16135691A JP H0737475 B2 JPH0737475 B2 JP H0737475B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
galactopyranoside
galactosidase
substrate
nitrophenyl
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP3161356A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH04253991A (ja
Inventor
グーダー ハンス−ヨアヒム
ヘルマン ルーペルト
ツドゥネク ディートマル
Original Assignee
ベーリンガー マンハイム ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー マンハイム ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング filed Critical ベーリンガー マンハイム ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング
Publication of JPH04253991A publication Critical patent/JPH04253991A/ja
Publication of JPH0737475B2 publication Critical patent/JPH0737475B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規ガラクトピラノシ
ド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ
基質及び試料溶液中のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量
方法及びそのための試薬に関する。この新規ガラクトピ
ラノシドはＣＥＤＩＡ−システム（ＣＥＤＩＡ＝Ｍｉｃ
ｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｏｎｃ
ｏｒｄＣａｌｉｆｏｒｎｉａの商標；Ｃｌｏｎｅｄ Ｅ
ｎｚｙｕｍ Ｄｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙの略
である）を用いて試料溶液中のβ−ガラクトシダーゼを
検出するために特に好適である。
【０００２】
【従来の技術】体液、例えば血液、血清又は尿中の低濃
度被分析物の測定は、例えばイムノアッセイにより提供
されるような高度に敏感なテスト法を必要とする。一定
の免疫テストの検出システムは、検出工程においてマー
カー酵素β−ガラクトシダーゼと色原体酵素基質との反
応が生じるということに基づく。次いで、遊離した染料
の吸光は検出すべき被分析物の量の直接の指示である。
高い感度を達成するためには、その酵素的分解に関して
も、遊離する発色団のスペクトル特性においてもテスト
特異的要求を満たす敏感な酵素基質の使用が必要であ
る。
【０００３】ＣＥＤＩＡは２つの酵素的に不活性なβ−
ガラクトシダーゼ−フラグメントが１つの活性な全酵素
に会合することに基づく。これら両方のフラグメント、
いわゆる酵素供与体及び酵素受容体は遺伝子操作法によ
り製造可能である。ＣＥＤＩＡに好適な供与体及び受容
体は米国特許第４７０８９２９号明細書に開示されてい
る。
【０００４】このＣＥＤＩＡは、酵素フラグメントの１
つの活性酵素への自然に起こる再会合が阻止されないよ
うな方法で、ハプテンは酵素供与体に共有結合するとい
うことに基づく。しかしながら、ハプテン及び酵素供与
体からなる複合体へのハプテン特異性抗体の結合の際、
酵素供与体と酵素受容体との補体結合は阻止される。こ
うして、ハプテン特異性抗体は生じる活性β−ガラクト
シダーゼの量を制御する。これは相応する色原体基質の
加水分解により測光法で定量的に測定される。ＣＥＤＩ
Ａ−システム及びその可能な使用の十分な記載はカンナ
及びウァールシー（Ｋｈａｎｎａ及びＷｏｒｔｈｙ；Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，１９８９年１０月）の論文からわかる。
【０００５】ＣＥＤＩＡのための色原体基質の品質に関
する基準は動力学的測定範囲について表現され、この測
定範囲は２つのキャリブレーターより生じた検量線の傾
斜により表わされる。このためには基質が（ａ）高い吸
光係数及び（ｂ）β−ガラクトシダーゼによる高い酵素
切断速度を示すことが重要である。
【０００６】米国特許第４７０８９２９号明細書はＣＥ
ＤＩＡのための色原体酵素基質として２−ニトロフエニ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを開示している。しか
しながら、この基質の著しい欠点はその僅かな感度であ
る。従って、溶液中の低濃度の被分析物を測定するため
には改良された色原体基質を造り出すという要求があっ
た。
【０００７】改良されたβ−ガラクトシダーゼ基質とし
てはヨーロッパ特許公開第０２９２１６９号明細書中に
２−ハロゲン−４−ニトロフエニルガラクトシドが記載
されている。しかしながら、ＣＥＤＩＡ中での使用のた
めにはこの基質は考慮されない。
【０００８】
【発明が解決しょうとする課題】本発明の課題は、改良
されたβ−ガラクトシダーゼ基質を、特にＣＥＤＩＡ中
での使用のために開発することである。
【０００９】改良されたβ−ガラクトシダーゼ基質とし
て一般式Ｉ
【００１０】
【化５】
【００１１】〔式中、ＲはＣＦ3又はＣＮを表わす〕の
化合物が提供される。本発明による化合物を２−トリフ
ルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドもしくは２−シアノ−４−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドと言い表わす。
【００１２】更に本発明の課題は本発明による化合物の
製法である。一般式
【００１３】
【化６】
【００１４】〔式中、ＲはＣＦ3又はＣＮを表わす〕の
出発物質から出発するのが有利である。この化合物II中
にニトロ基を芳香環のヒドロキシ基に対してｐ−位で導
入すると、一般式
【００１５】
【化７】
【００１６】の化合物が得られる。引き続き、化合物II
Iを酸化銀及びアセトブロムガラクトースと反応させる
と、アセチル化β−Ｄ−ガラクトピラノシドが生じる。
アセチル基の切断により最終生成物Ｉが得られる。
【００１７】２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエ
ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造のためにはま
ず２−トリフルオロメチルフエノールを濃硝酸でニトロ
化し、生じた２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエ
ノールを獲得する。これを酸化銀及びアセトブロムガラ
クトースと反応させる。この反応によりアセチル化生成
物が生じ、これをアルカリ（例えばナトリウムメチラー
ト）で処理することによりアセチル基の切断下に最終生
成物に導びくことができる。
【００１８】２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドは同様な方法により得られる。こ
のためには２−ヒドロキシ−ベンゾニトリルから出発
し、濃硫酸及び硝酸からなる混合物と反応させて２−ヒ
ドロキシ−５−ニトロ−ベンゾニトリルにする。生じた
生成物を再び酸化銀及びアセトブロムガラクトースと反
応させ、この際アセチル化中間生成物が生じる。これか
ら再び最終生成物がアセチル基切断により得られる。
【００１９】本発明による化合物は特にβ−ガラクトシ
ダーゼ基質として使用するために好適である。β−ガラ
クトシダーゼが会合においてのみ酵素的に活性であり、
単独ではほぼ全く酵素的活性を有さない２つのポリペプ
チドフラグメントからなる場合が、この際特に有利であ
る。「ほぼ全く酵素的活性を有さない」とは個々のβ−
ガラクトシダーゼフラグメントの酵素的残留活性がＣＥ
ＤＩＡとの干渉のために小さすぎることを意味する。こ
の種のβ−ガラクトシダーゼ−供与体フラグメント及び
β−ガラクトシダーゼ−受容体フラグメントは米国特許
第４７０８９２９号明細書中に開示されている。本発明
による化合物をＣＥＤＩＡ−システム中のβ−ガラクト
シダーゼ基質として使用することが最も有利である。こ
の際、最適な結果がＴ４−ＣＥＤＩＡ−テスト中で生じ
るが、この際チロキシンＴ４を酵素供与体に共有結合し
たハプテンとして使用する（米国特許第４７０８９２９
号明細書）。
【００２０】本発明のもう１つの課題は更にＣＥＤＩＡ
−システムを用いる試料溶液中の被分析物の検出法であ
り、この際検出酵素としてβ−ガラクトシダーゼを、か
つβ−ガラクトシダーゼ基質として２−トリフルオロメ
チル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド又は／及び２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドを使用する。
【００２１】更に、本発明はＣＥＤＩＡ−システムを用
いる被分析物の測定用試薬も包含し、この際β−ガラク
トシダーゼ基質として２−トリフルオロメチル−４−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド又は／及び
２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを使用する。
【００２２】本発明による新規基質をＣＥＤＩＡ中で従
来使用したＯ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドと比較すると、本発明による基質はその酵素的切
断速度及び感度に関して公知技術の基質に対して明らか
に優れていることが判明した。
【００２３】更に、本発明による基質はヨーロッパ特許
公開第０２９２１６９号広報による２−クロル−４−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドよりも優れ
ていることが確認された。
【００２４】
【実施例】次に実施例につき本発明を更に詳細に説明す
る。
【００２５】例１ ２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドの製造 １）２−ヒドロキシ−５−ニトロ−ベンゾニトリル 水２０ｍｌ中の２−ヒドロキシ−ベンゾニトリル２４ｇ
（０．２ｍｏｌ）に４０％硝酸７０ｍｌ及び濃硫酸１０
ｍｌからなる溶液を１０℃で１時間かけて滴加する。引
き続き２０℃で２４時間撹拌し、次いで酢酸エチル１０
０ｍｌで振出する。有機溶剤を蒸発濃縮させた後、固体
残分を更に２回沸騰ｎ−ヘキサン各５００ｍｌで抽出す
る。精製をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーに
より行なう（シリカゲル６０；溶離剤、酢酸エチル）。
【００２６】溶剤の蒸発及び酢酸エチル／トルオールか
ら結晶後、生成物２ｇが白色結晶として得られる。
【００２７】ＤＣ（シリカゲル６０；酢酸エチル）：Ｒ
Ｆ＝０．１１ ＵＶ−スペクトル（０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．０中）：λｍａｘ＝３７６ｎｍ（ε＝１５７００
ｌ／ｍｏｌｃｍ） ２）２−シアノ−４−ニトロフエニル２，３，４，６−
テトラ−０−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド 無水アセトニトリル２００ｍｌ中の２−ヒドロキシ−５
−ニトロ−ベンゾニトリル１ｇ（６．１ｍｍｏｌ）から
なる溶液に酸化銀１．５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を混合
し、２０℃で３時間撹拌する。引き続き、同じ温度で無
水アセトニトリル８０ｍｌ中のアセトブロムガラクトー
ス２．７ｇ（６．６ｍｍｏｌ）の溶液を加え、かつ室温
で１６時間撹拌する。銀塩をザイツフィルター（Ｓｅｉ
ｔｚｆｉｌｔｅｒ）を介して濾別し、濾液を蒸発乾固す
る。粗生成物をアセトン／水から再結晶する。
【００２８】収量：２．９ｇ（９６％） ＤＣ（シリカゲル６０；トルオール／酢酸エチル＝２／
１）：ＲＦ＝０．２７。
【００２９】３）２−シアノ−４−ニトロフエニル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド ２）からのアセチル化生成物２．９ｇ（５．８ｍｍｏ
ｌ）を無水メタノール１０ｍｌ中に溶かし、飽和ナトリ
ウムメチラート溶液４ｍｌを加える。２０℃で完全な変
換まで（約１時間、ＤＣ−管理）撹拌し、沈殿を濾別
し、少量の冷メタノールで洗浄し、かつ４０℃で真空乾
燥する。
【００３０】収量：１．０ｇ（５３％） ＤＣ（シリカゲル６０；クロロホルム／メタノール＝３
／１）：ＲＦ＝０．３５。
【００３１】１Ｈ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−
ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝８．７０（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ；１
Ｈ）、８．４９（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，９Ｈｚ；１Ｈ）、
７．５５（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ；１Ｈ）、５．３６〜５．２
６（ｍ；２Ｈ）、４．９４（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ；１Ｈ）、
４．７０〜４．６０（ｍ；２Ｈ）、３．７５〜３．４０
（ｍ，６Ｈ）。
【００３２】質量分析：ｍ／ｅ＝３２６（ｎｅｇ．ＦＡ
Ｂ）。
【００３３】例２ ２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドの製造 １）２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエノール 水３０ｍｌ中の２−トリフルオロメチルフエノール１０
ｇ（０．０６ｍｏｌ）からなる懸濁液に、４０％硝酸水
溶液２０ｍｌ（０．１８ｍｏｌ）を１時間かけて氷冷下
に加える。２０℃で更に２時間撹拌し、引き続き酢酸エ
チル１００ｍｌで振出する。硫酸ナトリウム上で有機相
を乾燥させた後、溶剤を回転蒸発装置で蒸留し、生成物
をカラムクロマトグラフィーによりシリカゲル上で精製
する（シリカゲル６０；溶離剤、酢酸エチル／石油エー
テル＝１／３）。
【００３４】ＤＣ（シリカゲル６０；酢酸エチル／トル
オール＝１／２）：ＲＦ＝０．４４。
【００３５】このフラクションを集め、かつ回転蒸発装
置で真空下に濃縮する。更なる精製及び結晶化のために
は生成物を水１００ｍｌ中に溶かし、かつ１ＮＨＣｌで
ｐＨ２に調節する。４℃で２４時間後、生じた結晶を濾
別し、少量の冷水で洗浄し、４０℃真空下に乾燥する。
【００３６】収量：２．３ｇ（１９％） ＤＣ：（シリカゲル６０：酢酸エチル）：ＲＦ＝０．１
１ ＵＶ−スペクトル（０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ
７．０中）：λｍａｘ＝３８４ｎｍ（ε＝１８８００
ｌ／ｍｏｌ ｃｍ）。
【００３７】２）２−トリフルオロメチル−４−ニトロ
フエニル２，３，４，６−テトラ−０−アセチル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド 製造は２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエノール
２ｇ（９．７ｍｍｏｌ）アセトブロムガラクトース４．
１１ｇ（１０ｍｍｏｌ）及び酸化銀２．３２ｇ（１０ｍ
ｍｏｌ）から例１．２．と同様にして行なわれる。
【００３８】収量：２ｇ（３８％）。
【００３９】ＤＣ（シリカゲル６０、トルオール／酢酸
エチル＝２／１）：ＲＦ＝０．３５。
【００４０】３）２−トリフルオロメチル−４−ニトロ
フエノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ２）からのアセチル化化合物２．０ｇ（３．７ｍｍｏ
ｌ）を無水メタノール１０ｍｌ中に溶かし、飽和ナトリ
ウムメチラート溶液４ｍｌと混合する。２０℃で１時間
撹拌し、酸性イオン交換体（Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８、Ｈ
+）で中和し、真空中で蒸発乾固する。精製をシリカゲ
ルでカラムクロマトグラフィーにより行なう（溶離剤：
クロロホルム／メタノール＝３／１） 収量：０．２５ｇ（１８％）。
【００４１】ＤＣ（シリカゲル６０；クロロホルム／メ
タノール＝３／１）：ＲＦ＝０．５。１Ｈ−ＮＭＲ（１
００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ（ｐｐｍ）＝８．５
０（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，９Ｈｚ；１Ｈ）、８．３９
（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ；１Ｈ）、７．５８（ｄ，Ｊ＝９Ｈ
ｚ；１Ｈ）、５．３０〜５．０５（ｍ；２Ｈ）、５．０
３〜４．８３（ｍ；１Ｈ）、４．８０〜４．５５（ｍ；
２Ｈ）、３．８２〜３．４０（ｍ；６Ｈ）。
【００４２】例３ 本発明による基質、２−シアノ−４−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２−ＣＮ−４−ＮＰ
Ｇ）、２−トリフルオロメチル−４−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２−ＣＦ3−４−ＮＰ
Ｇ）と従来公知の基質２−クロル−４−ニトロフエニル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２−Ｃｌ−４−ＮＰ
Ｇ）及び２−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（ｏＮＰＧ）との比較 １．色素の吸光最大値の波長及びこれに属する吸光係数
（ε） 第 １ 表 色素 λｍａｘ（ｎｍ） ε（ｌ／ｍｏｌ ｃｍ ）２−Ｃｌ−４−ニトロフエノール ４０５ １６６００ ２−ＣＮ−４−ニトロフエノール ３７６ １５７００ ２−ＣＦ3−４−ニトロフエノール ３８４ １８８００ ２−ニトロフエノール ４０８ ２０４０ ０．１ｍｏｌ／ｌ 燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０中で色素の吸光最大値で 測定。
【００４３】２．基質の感度比較もしくは酵素的切断速
度の比較 酵素β−ガラクトシダーゼの同一の量を用いて各々の色
素の吸光最大値（第１表参照）の範囲で１分あたりの吸
光変化（ｍＥ／分）を調べたが、正確な条件は例４のI
I）ａ）及びｂ）に記載されている。
【００４４】 第 ２ 表 基質 ｍＥ／ｍｉｎ 測定波長（ｎｍ） ２−Ｃｌ−４−ＮＰＧ ０．０８５ ４０５ ２−ＣＮ−４−ＮＰＧ ０．１５０ ３７６ ２−ＣＦ3−４−ＮＰＧ ０．１０９ ３８４ ｏＮＰＧ ０．０２４ ４０８ ３．Ｔ４／ＣＥＤＩＡにおける評価（ハプテンとしてチ
ロキシンＴ４及びチロキシンＴ４に対するモノクローナ
ル抗体を有するＣＥＤＩＡ） テスト条件を例４、Ｉ）ａ）及びｂ）におけるようにし
た。個々の基質の評価のための基準は検量線の傾斜であ
った。これを例４、III）ａ）に記載されているように
調べた。
【００４５】 基質 比上昇 測定波長（ｎｍ） ２−Ｃｌ−４−ＮＰＧ ４９４ ４１５ ２−ＣＮ−４−ＮＰＧ ５６１ ３７６ ２−ＣＦ3−４−ＮＰＧ ５２８ ３７６ ｏＮＰＧ １００ ４１５ 例４ ＣＥＤＩＡテスト用の基質類似物の試験方法 ２種のテスト法を使用した。
【００４６】１）Ｔ４／ＣＥＤＩＡ−テスト中での活性 ２）β−ガラクトシダーゼのための基質としての効力 Ｉ）Ｔ４／ＣＥＤＩＡ−テストの実施 （定義：ＥＡ＝酵素受容体；ＥＤ＝酵素供与体；ＥＡ22
＝ＣＥＤＩＡのためのクローン化酵素受容体；ＥＤ4＝
ＣＥＤＩＡのためのクローン化酵素供与体）概念ＥＡ22
及びＥＤ4は米国特許第４７０８９２９号明細書により
使用されている。そこではこのポリペプチドのアミノ酸
配列も開示されている。
【００４７】ａ）試薬 １）ＥＡ緩衝液：ＮａＨ2ＰＯ4（２０ｍｍｏｌ／ｌ）、
Ｎａ2ＨＰＯ4（３０ｍｍｏｌ／ｌ）、〔エチレンビス
（オキシエチレンニトリロ）〕四酢酸（ＥＧＴＡ）（１
８ｍｍｏｌ／ｌ）、蔗糖（２５ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｍｇ
（ＯＡｃ）2（９．６７ｍｍｏｌ／ｌ）、４−モルホリ
ンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（１５０ｍｍｏｌ／
ｌ）、ＮａＣｌ（４００ｍｍｏｌ／ｌ）、Ｌ−メチオニ
ン（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、プルロニックＬ−１０１
（０．０５％）、ツウィーン２０（０．０５％）ｍ、ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（０．２
％）、ジチオトライトール（ＤＴＴ）（０．０５ｍｍｏ
ｌ／ｌ）、ＮａＮ3（２３ｍｍｏｌ／ｌ）ｐＨ７．４。
【００４８】２）ＥＤ緩衝液：ＮａＨ2ＰＯ4（４２ｍｍ
ｏｌ／ｌ）、Ｎａ2ＨＰＯ4（８ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＣ
ｌ（４００ｍｍｏｌ／ｌ）、ＭＯＰＳ（０．０２ｍｍｏ
ｌ／ｌ）、ＥＧＴＡ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、ツウィーン
２０（０．０５％）、プルロニックＬ−１０１（０．０
５％）、Ｎ−ラウリルザルコシン（０．０３％）、ＤＴ
Ｔ（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ）、ＮａＮ3（２３ｍｍｏｌ
／ｌ）、ｐＨ６．５。
【００４９】３）ＥＡ試薬：ＥＡ緩衝液中でＥＡ22５４
６Ｕ／ｍｌ、モノクローナル抗体〈Ｔ４〉６３ｎｍｏｌ
／ｌ（例えばＷｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒ
ａｄｏ、ＵＳＡより市販されている、米国特許第４７０
８９２９号明細書参照）及びＡＮＳ（８−アニリノナフ
タリン−１−スルホン酸、アンモニウム塩）８００μｍ
ｏｌ／ｌを使用する。
【００５０】４）ＥＤ試薬：ＥＤ緩衝液中で電解質とし
てＥＤ4−チロキシンＴ４複合体１１５ｎｍｏｌ／ｌ
（米国特許第４７０８９２９号明細書によるＥＤ−チロ
キシン複合体に相応して製造）、及びそれぞれ試験した
β−ガラクトシダーゼ基質（１ｍｇ／ｍｌ）を使用す
る。
【００５１】ｂ）方法 Ｔ４／ＣＥＤＩＡを日立７０４自動分析機により次の試
薬量を用いて、かつ記載された条件下に実施した： 試料容量 ：１２μｌ 試薬１（ＥＤ4−複合体＋基質） ：２３５μｌ 試薬２（ＥＡ22＋ＭＡＫ） ：１３５μｌ 総容積 ：３８２μｌ 測定波長 ：３７６／４
１５ｎｍ 温度 ：３７℃ △Ｅ／分は９〜１０分の間隔で測定した。
【００５２】II)酵素活性 ａ）試薬 １）０．０５Ｍ燐酸カリウム−緩衝液、ｐＨ７．０ ２）１０ｍｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム−溶液 ３）６９．８％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール溶液 ４）β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガーマンハイムＧ
ｍｂＨ、製造Ｎｏ．１０５０３１）、溶液ａ）中０．３
Ｕ／ｍｌ ５）基質、溶液ａ）中５．９ｍｇ／ｍｌ ｂ）方法 前恒温保持：次の基質をプラスチック製キュベット中に
ピペットで入れる： 空値 試料 緩衝液 （１） １１００μｌ １１００μｌ ＭｇＣｌ2 （２） １５０μｌ １５０μｌ 基質 （５） ２００μｌ ２００μｌ メルカプトエタノール （３） １５μｌ １５μｌ 混合後、反応を開始した： 緩衝液 （１） ２５μｌ −− β−ガラクトシダーゼ （４） −− ２５μｌ △Ｅ／分を直線範囲から計算した。
【００５３】III)テスト結果の評価 ａ）ＣＥＤＩＡ−テスト すべての基質のために検量線を作ったこの曲線から傾斜
を比較した。
【００５４】傾斜＝（ハイ・キャリブレーター・レイ
ト）−（ロウ・キャリブレーター・レイト）／（コンク
・ハイ・キャリブレーター）−（コンク・ロウ・キャリ
ブレーター）［（Ｈｉｇｈ Ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｒａ
ｔｅ）−（ＬｏｗＫａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｒａｔｅ）／
（Ｋｏｎｚ．ＨｉｇｈＫａｌｉｂｒａｔｏｒ）−（ｋｏ
ｎｚ．Ｌｏｗ Ｋａｌｉｂｒａｔｏｒ）］ 傾斜はＴ４／ＣＥＤＩＡのための２−ニトロフエニル−
β−ガラクトシド（＝１００％）のパーセンテージとし
て表わされる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルーペルト ヘルマン ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム イン デア アウ23 (72)発明者 ディートマル ツドゥネク ドイツ連邦共和国 ミュンヘン 40 ブリ ューテンシュトラーセ 21

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式 【化１】 〔式中、ＲはＣＦ3又はＣＮを表わす〕の新規ガラクド
    ピラノシド
  2. 【請求項２】 一般式 【化２】 〔式中、ＲはＣＦ3又はＣＮを表わす〕の出発化合物を
    芳香環でニトロ化し、一般式 【化３】 の化合物とし、この生じた化合物IIIを酸化銀及びアセ
    トブロムガラストースと反応させ、かつアセチル基切断
    により最終生成物 【化４】 を獲得することを特徴とする請求項１記載の新規ガラク
    トピラノシドの製法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載の新規ガラクトピラノシド
    からなるβ−ガラクトシダーゼ基質。
  4. 【請求項４】 β−ガラクトシダーゼ基質として２−ト
    リフルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシド又は／及び２−シアノ−４−ニトロフエ
    ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用することを特
    徴とする試料溶液中のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量
    方法。
  5. 【請求項５】 β−ガラクトシダーゼ基質として２−ト
    リフルオロメチル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラ
    クトピラノシド又は／及び２−シアノ−４−ニトロフエ
    ニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有することを特
    徴とする試料溶液中のβ−ガラクトシダーゼ活性の定量
    するための試薬。
JP3161356A 1990-07-03 1991-07-02 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬 Expired - Fee Related JPH0737475B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4021063A DE4021063A1 (de) 1990-07-03 1990-07-03 Neue ss-galactosidase-substrate fuer den cedia
DE4021063.4 1990-07-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04253991A JPH04253991A (ja) 1992-09-09
JPH0737475B2 true JPH0737475B2 (ja) 1995-04-26

Family

ID=6409519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3161356A Expired - Fee Related JPH0737475B2 (ja) 1990-07-03 1991-07-02 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬

Country Status (6)

Country Link
US (1) US5254677A (ja)
EP (1) EP0465998B1 (ja)
JP (1) JPH0737475B2 (ja)
AT (1) ATE135010T1 (ja)
DE (2) DE4021063A1 (ja)
ES (1) ES2084733T3 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE187733T1 (de) * 1994-02-07 2000-01-15 Qiagen Gmbh Verfahren zur herstellung endotoxinfreier oder an endotoxin abgereicherter nucleinsäuren und/oder oligonucleotide für die gentherapie
ES2229341T3 (es) * 1997-05-27 2005-04-16 Microgenics Corporation Conjugados e inmunoensayos especificos para el metabolito de la metadona 2-etilidina-1,5-dimetil-3,3-difenil-pirrolidina.
JPH11299498A (ja) * 1998-02-19 1999-11-02 Toyobo Co Ltd アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬
US6262265B1 (en) 1999-06-18 2001-07-17 Microgenics Corporation Non-hydrolyzable analogs of heroin metabolites suitable for use in immunoassay
US7138504B2 (en) * 2004-08-12 2006-11-21 Microgenics Corporation Reagents and methods for mycophenolic acid immunoassay
US20060240496A1 (en) * 2005-04-21 2006-10-26 Lakshmi Anne Immunogens, derivatives and immunoassay for ethyl glucuronide

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228274A (en) * 1976-09-28 1980-10-14 Merck & Co., Inc. 1-Substituted glycopyranosides
DE3323245A1 (de) * 1983-06-28 1985-01-10 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase
US4708929A (en) * 1984-10-29 1987-11-24 Microgenics Corporation Methods for protein binding enzyme complementation assays
DE3587549T2 (de) * 1984-10-29 1994-02-17 Microgenics Corp Ergänzungstestverfahren von proteine bindenden enzymen.
GB2192108B (en) * 1986-03-11 1989-11-08 Plessey Co Plc Improvements relating to communication systems
US4963479A (en) * 1986-10-07 1990-10-16 Hoechst Celanese Corporation Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside
IL85581A (en) * 1987-05-21 1992-05-25 Technicon Instr Substrate for beta-galactosidase comprising derivatives of 4-nitrophenyl-beta-d-galactopyranoside and beta-galactosidase immunoassay containing said substrate
US4959324A (en) * 1989-03-16 1990-09-25 Chemtrak, Inc. Sample pad assay initiation device and method of making
DE3803775A1 (de) * 1988-02-09 1989-08-17 Boehringer Mannheim Gmbh Neue substituierte lactame, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel, die diese verbindungen enthalten
US5444161A (en) * 1989-08-16 1995-08-22 Microgenics Corporation Substrates for β-galactosidase
DE3929355A1 (de) * 1989-09-04 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase

Also Published As

Publication number Publication date
ES2084733T3 (es) 1996-05-16
ATE135010T1 (de) 1996-03-15
EP0465998A1 (de) 1992-01-15
DE4021063A1 (de) 1992-01-09
JPH04253991A (ja) 1992-09-09
DE59107500D1 (de) 1996-04-11
US5254677A (en) 1993-10-19
EP0465998B1 (de) 1996-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0157326B1 (en) Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample
EP0158204B1 (en) Composition and test device for determining the presence of leukocytes, containing a zwitterion coupling agent
JP3001368B2 (ja) Ｎａｄ（ｐ）ｈを比色検出するための方法および薬剤、ならびにニトロソアニリン化合物
EP3296405B1 (en) Method and kit for super-high-sensitivity measurement of protein and nucleic acid, and novel enzyme substrate
JP2732501B2 (ja) β―ガラクトシダーゼのための基質
JPS6062999A (ja) α−アミラ−ゼの分析方法および分析試薬
JPH0764986B2 (ja) 新規な発色試薬
JPS621978B2 (ja)
JPH027589B2 (ja)
JPH0737475B2 (ja) 新規ガラクトピラノシド、その製法、該化合物からなるβ−ガラクトシダーゼ基質及びβ−ガラクトシダーゼ活性の定量方法及びそのための試薬
JPH0859686A (ja) ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法
US4719097A (en) Phosphates of resorufin derivatives and compositions thereof for the determination of the activity of phosphatases
KR900005623B1 (ko) Nag 아제의 측정 방법 및 그의 시약
JPS58994A (ja) 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体およびこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼ活性測定法
US4191809A (en) Method of measuring enzymatic activity using novel peptide derivatives
EP0292169B1 (en) Substrates for B-galactosidase
JP5614281B2 (ja) フェニルホスホリルコリン誘導体
US6534637B2 (en) Synthesis of chlorophenol red glucuronic acid
JPH04338398A (ja) ジフェニルメタン誘導体類、その製造方法およびそれを含有するヨードチロニン類を結合する蛋白からヨードチロニン類を置換するための試薬
US4260681A (en) Reagent system and method for assaying peptidase enzymes
JPS60238000A (ja) 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法
CN108761068A (zh) 克隆酶供体免疫检测试剂、制备方法、检测系统、检测方法以及试剂盒
US5068180A (en) Substrates for β-galactosidase
JP2003002894A (ja) α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法
JP2583440B2 (ja) 酵素活性測定用の基質及びそれを用いる酵素活性測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees