JPS621978B2 - - Google Patents
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- JPS621978B2 JPS621978B2 JP59261949A JP26194984A JPS621978B2 JP S621978 B2 JPS621978 B2 JP S621978B2 JP 59261949 A JP59261949 A JP 59261949A JP 26194984 A JP26194984 A JP 26194984A JP S621978 B2 JPS621978 B2 JP S621978B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/40—Triphenylmethane dye chromogens, e.g. fluorescein derivatives
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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Description
産業上の利用分野
本発明は、フエノールスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−ガラクトシド、その製法及び該化合物を
含有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを検出するた
めの診断剤に関する。 従来の技術 β−グリコシド結合を有するＤ−ガラクトース
を含有するオリゴー又はポリサツカリドは殆んど
すべての生物体中に産生する。それ故、相応する
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（EC3、２、１、23）
も広く分布しており、多数の微生物、動物及び植
物中で検出することができる。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼは哺乳動物で多様な
生理学的機能を果す。ラクトースの加水分解がそ
れにより行なわれるので炭水化物代謝で重要な働
きをする。更に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは糖
脂質、ムコポリサツカリド及び糖蛋白質が分解す
る際のキー酵素である。 その生理学的有用性に加えて、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼは最近診断分野で重要になつた。例え
ばこの酵素は酵素イムノアツセイの指示薬酵素と
して次第に多く使われている［例えば“Annals
of Clinical Biochemistry”、16巻、221〜240頁
（1979年）参照］。 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは活性の測
定は臨床化学でかつまた診断学で重要になつてい
る。その際に、全く一般的にはガラクトシダーゼ
含有試料に好適なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
を加える。この基質は酵素により分解される。分
解生成物の１つを好適な方法で検出する。酵素の
作用により遊離したグリコン又はアグリコンを測
定することができる。一般には後者を測定する。
基質としては天然の基質ラクトース並びに特に色
原体ガラクトシドが好適である。 フエニル−β−Ｄ−ガラクトシド並びに芳香族
環で置換されている若干の他の誘導体（例えばｏ
−ニトロフエニル−及びｐ−ニトロフエニル−β
−Ｄ−ガラクトシド）がβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの基質として記載されている［“Biochem.Z.
”、332巻、209頁（1960年）］。加水分解により遊
離したフエノールを光度測定によりUV範囲でも
しくはニトロフエノールでは短い可視波長範囲で
測定する。続いて、指示薬反応として、アミノア
ンチピリンとの酸化的結合を行なうこともできる
［“Analytical Biochem.”、40巻、281頁（1971
年）］。 組織化学的実験では、一方ではナフチル−β−
Ｄ−ガラクトシドが使われ、例えば１−ナフチル
化合物［“Histochemi”、35巻、199頁（1973
年）］、６−ブロム−２−ナフチル誘導体［“J.
Biol.Chem.”、195巻239頁（1952年）］又はナフ
トール−AS−BI−β−Ｄ−ガラクトシド
［“Histo−chemie”、37巻、89頁（1973年）］で
ある。その場合、生成するナフトールを種々のジ
アゾニウム塩と反応させてアゾ色素に変換して可
視化する。 更に、５−ブロム−４−クロル−インドキシル
−β−Ｄ−ガラクトシドがβ−ガラクトシダーゼ
の基質として公知である。この場合には、指示薬
反応は生成するインドキシルのインジゴへの酸化
的二量化である［“Histochemie”、23巻、266頁
（1970年）］か又はジアゾニウム塩とカツプリング
させてインドキシル−アゾ−色素を形成する
［“Histochemistry”、57巻、323頁（1978年）］。 前記の測定法は顕著な欠点を有し、１コはそれ
が敏感でないことであり、更に組織化学的検出で
使用される基質の溶解性が非常に不良なことであ
る。 アグリコンを螢光測定により検出することので
きるガラクトシドを基質として使用する場合に、
本質的により敏感な試験法が得られる：例えば
“プロシー−ジングス・オブ・ザ・ナシヨナル・
アカデミ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー
ナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.）”、47巻、1981頁（1961年）
に螢光−ジ−β−Ｄ−ガラクトシドが基質として
記載されている。更に、２−ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトシド［“Anglytical Biochem.”、42巻、
275頁（1971年）］又は４−メチル−ウンベリフエ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド〔“Biochem.J.”、
102巻、525頁（1967年）］が使われる。 螢光測定法の欠点は、著しい装置上の経費を必
要とすることである。 発明が解決しようとする問題点 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを簡単で迅
速なかつ信頼できる方法で測定することのできる
基質に対する要求が生じた。この要求を解決する
ことが課題であつた。 問題点を解決するための手段 ところで、スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドを基質として使用する場合に、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼを非常に敏感に可視スペクト
ル領域で視覚的に又は簡単な分光測光器で検出し
得ることが判明した。更に、この化合は極めて容
易に水に溶けるという利点を有する。 従つて、本発明の目的は、一般式： ［式中R1〜R4は同じか又は異なつていてよ
く、それぞれ［式中R1〜R4は同じか又は異なつ
ていてよく、水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミ
ノ基を表わし、 R5〜R12は同じか又は異なつていてよく、水
素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、
低級アルコキシ基、カルボキシル基又はニトロ基
を表わし、 Ｍ+はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土
類イオン又はアンモニウムイオンを表わす］のフ
エノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシドである。 一般式による全スルホンフタレイニル−β−
Ｄ−ガラクトシドは新規化合物である。これらは
炭水化物化学で公知の方法により製造することが
できる。 殊に、公知方法で一般式： ［式中R1〜R12は前記のものを表わす］のフエ
ノールスルホンフタレインを一般式： ［式中Ｘはハロゲンを表わしかつR13は炭水化
物化学で常用の保護基を表わす］のペル−Ｏ−置
換１−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトースと糖残基
のＣ−１原子でワルデン反転下に反応させて一般
式： ［式中R1〜R13及びＭ+は前記のものを表わ
す］のペル−Ｏ−置換スルホンフタレイニル−β
−Ｄ−ガラクトシドに変換しかつこのガラクトシ
ドから公知の方法で保護基R13を脱離する。 式との化合物の一般式のガラクトシドへ
の変換は、水性アセトン中で又は水／ベンゼン−
又は水／クロロホルム混合物中で（相移動条件下
に）水酸化アルカリ又は炭酸アルカリのような酸
受容体の存在において行なうと有利である。 更に、一般式のガラクトシドは、初めに一般
式のフエノールスルホンフタレインを水酸化ア
ルカリ又はアルカリアルコラートによりジアルカ
リ塩にもしくは場合により置換されているアミン
によりアンモニウム塩に変換しかつこれをアセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジクロルメタン、テ
トラヒドロフラン又はジメチルホルムアミドのよ
うな双極性中性溶剤中で一般式のペル−Ｏ−置
換１−ハロゲノ−ガラクトースと反応させて製造
することができる。 一般式のフエノールスルホンフタレインと一
般式の１−ハロゲノ−ガラクトースとから一般
式のガラクシドを合成する際に、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン又はジオ
キサンのような溶剤中、場合により塩化カルシウ
ム又はドリエリツト（Drierit）のような乾燥剤
の使用下に単独の銀塩又は銀塩の混合物（酸化
銀、炭酸銀、セライト上の炭酸銀、銀トリフラー
ト、サリチル酸銀）及び／又は単独の水銀塩又は
水銀塩の混合物（臭化水銀、シアン化水銀、酢酸
水銀、酸化水銀）の添加が有効であることが明ら
かになつた。 このようにして得られた一般式のペル−Ｏ−
置換スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ドもまた新規化合物である。 一般式のペル−Ｏ−置換スルホンフタレイニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドを一般式のスルホン
フタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドに変換する
ための保護基R13の脱離は炭水化物化学で常用の
方法［例えば“アドランセス カルボヒドレート
ケミー（Adrances Carbohydrate Chem.）”、
12巻、157頁（1957年）］により、例えばアシル保
護基ではナトリウムメチラート又はバリウムメチ
ラート又はメタノール中のアンモニアにより実施
する。 一般式のフエノールスルホンスタレインは周
知の市販されている物質であるかあるいは公知方
法により相応するフエノールと相応する。Ｏ−ス
ルホン安息香酸とから製造する［例えばD.S. ブ
レスロウ（Breslow）及びH. スコルニツク
（Skolnik）共著、A.バイスベルガー
（Weissberger）編集“ヘテロサイクリツク コ
ンパウンズ（Heterocylic Compounds）”、21
巻、118頁（1966年）インターサイエン パブリ
ツシヤース（Interscience Publishers）、（ニユー
ヨーク（New york）在）参照］か又は公知のス
ルホンフタレインから出発して後からハロゲン化
又はニトロ化して誘導する［例えばD.S. ブレス
ロウ（Breslow）及びH.スコルニツク
（Skolnik）共著、前記文献、141頁、144頁参
照］。 出発物質として使用した一般式のペル−Ｏ−
置換１−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトースも公知
の化合物である［例えば“ヒエミツシエ ベリヒ
テ（Chem.Ber.）”、35巻、836頁（1902年）；
“ネーチヤー（Nature）”、165巻、369頁（1950
年）；“アクタケミカ スカンジナビカ（Acta
chem.Scand.，Ser.B）”、33巻、116頁（1979
年）；“ジヤーナル オブ ケミカル ソサエテ
イ（J.Chem.Soc.）”、1419頁（1965年）；“カル
ボヒドル．レズ（Carbchydr.Res.）”、11巻、85
頁（1969年）］。 R1〜R12及びＸの定義におけるハロゲンとは弗
素、塩素、臭素及び沃素であり、R1〜R12では有
利に弗素、塩素及び臭素でありかつＸでは有利に
塩素及び臭素である。 R5〜R12の定義における低級アルキル基は炭素
原子１〜５個、殊に１〜３個を含有し、メトキシ
基が特に優れている。 Ｍ+の定義におけるアルカリ金属イオンとはリ
チウム−、ナトリウム−及びカリウムイオンであ
り、リチウムイオン及びナトリウムイオンが優れ
ている。 Ｍ+の定義におけるアルカリ土類イオンはマグ
ネシウム−、カルシウム−及びバリウムイオンを
表わし、カルシウムイオンが優れている。 Ｍ+の定義におけるアンモニウムイオンは
［NR14R15R16R17］+であり、その際R14〜R17は同じ
か又は異なつていてよく、それぞれ水素、炭素原
子１〜４個、殊に１又は２個の低級アルキル基か
又はベンジル基を表わす。 炭水化物化学で常用の保護基R13としては特に
アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基又はトリ
メチルシリル基が好適である。 本発明の他の目的は、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの活性を測定するために一般式の新規のスル
ホンフタレイニル−β−ガラクトシドを含有する
診断剤である。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてスルホ
ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドを使用す
ることにより従来知られていたよりも明らかに敏
感なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ試験系が得られ
る。新規基質はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性
を測定するには生化学的分野でかつまた臨床化学
的分野で使用することができる。それは敏感であ
る。それ故いくつかの利点が得られる： ａ 低いβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定す
ることができる、 ｂ 少量の試料を使用することができる、 ｃ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定を極め
て短時間で行なうことができる、 ｄ 低い試料使用量及び有利な波長領域が他の試
料成分による方法の妨害を減少させる。 本発明による基質は、最適PH値の点で全く異な
つていてよい種々の由来のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの活性の測定に好適である。そのような場合
でも一般式の基質を含有する診断剤は明らかに
従来公知の試験剤よりも敏感に反応する。 一般式のスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドは、免疫反応後にその活性度を測定す
べき指示薬酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を使用する免疫学的測定法にも好適である。酵素
指示薬反応によりそのような免疫学的測定法は当
業者に酵素イムノアツセイとして知られている。
この方法は、範囲10-5〜10-12モル／の蛋白
質、ポリサツカリド、ホルモン、医薬及び他の低
分子物質の濃度の測定に使われる。相分離工程の
必要性に応じて均質−及び異質試験操作を区別す
る。拮抗性及び非拮抗試験原理で更に分けること
ができる。 しかしすべての試験原理は酵素−抗原−もしく
は酵素−抗体−接合体により行なう。酵素指示薬
反応はすべての酵素イムノアツセイに共通してい
る。 そのような目的に好適な指示薬酵素はβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼである。酵素イムノアツセイに
おけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定は常法
で、つまり好適なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
を添加し、これを酵素により分解しかつ常法で光
度測定法で測定する。 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ試験系の改
良により酵素イムノアツセイでも顕著な利点が得
られる： １ この場合にも、より高い感度が検出限界の一
層の低下、短い反応時間及び低い試料使用量そ
れ故他の試料成分による低い妨害を可能にす
る。 ２ 有利な測定波長が一定の反応操作で不溶成
分、例えば混濁による方法の妨害を低減する。 診断剤は一般式の本発明による基質１種又は
数種と共に好適な緩衝系並びに場合によりそのよ
うな診断剤に一般に使われる他の好適な添加物、
例えば湿潤剤、安定剤等を含有する。診断剤は溶
液の形で、凍結乾燥体、粉末混合物、試薬錠剤と
して又は吸収性担体上に吸収させて存在してよ
い。 溶液の形の本発明による診断剤は試験に必要な
全試薬を含有すると有利である。溶剤としては水
か又は水と水溶性有機溶剤、例えばメタノール、
エタノール、アセトン又はジメチルホルムアミド
との混合物が該当する。保存性という理由から、
試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分けてお
き、それらを本来の実験の際に初めて混合すると
有利である。 それぞれ全重量約５〜20mg、殊に約10mgの凍結
乾燥体形の診断剤の製造に当り、試験に必要な全
試薬と共に常用の骨格ビルダー、例えばポリビニ
ルピロリドン及び場合により他の充填剤、例えば
マンニツト、ソルビツト又はキシリツトを含有す
る溶液を乾燥させる。 粉末混合物又は試薬錠剤形の診断剤は、試験用
成分に常用のガーレン式添加物を混合しかつ造粒
して製造する。この種の添加物は例えばモノ−、
オリゴ−又はポリサツカリドのような炭水化物、
又はマンニツト、ソルビツト又はキシリツトのよ
うな糖アルコールもしくはポリエチレングリコー
ル又はポリビニルピロリドンのような他の可溶性
不活性化合物である。一般に、粉末混合物又は試
薬錠剤は最終重量約30〜200mg、殊に50〜80mgを
有する。 試験片としての診断剤の製造に当り、吸収性担
体、殊に紙、セルロース又は合成繊維フリース
を例えば水、メタノール、エタノール又はアセト
ンのような易揮発性溶剤中の試験片の製造に常用
の必要試薬の溶液で含浸する。これは一含浸工程
で行なうことができる。しかし含浸を数工程で実
施するとしばしば有利であり、その際に診断剤成
分の一部をそれぞれ含有する溶液を使用する。例
えば、第一工程で緩衝物質及び他の水溶性添加物
を含有する水溶液で、次に第二工程でβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ基質を含有する溶液で含浸するこ
とができる。調製した試験紙をそのままで使用す
るか又は公知のようにグリツプに接着するか又は
有利に西ドイツ国特許第2118455号明細書により
プラスチツクと細目メツシユ材との間に封入する
ことができる。 次の実施例により、本発明による化合物の合成
に適用することのできる多くの別法のうちのいく
つかを並びに新規なスルホンフタレイニル−β−
Ｄ−ガラクトシドのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活
性測定への使用について詳説する。ただし、本発
明の目的は実施例により限定されるものではな
い。 次の略語を使用する： HEPES ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジニル］−エタンスルン酸 BSA 牛血清アルブミン Tween−20 ポリオキシエチレン（20）ソルビ
タンモノラウレート Tricin ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）］メ
チル−グリシン 例 １ ３，3′−ジクロル−フエノールスルホンフタレ
イニル−β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩 ａ クロロホルム450ml中の２，３，４，６−テ
トラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノ
シルブロミド45ｇ（0.11モル）の溶液を60℃に
加熱する。撹拌下にこの温度で1.25N−カセイ
ソーダ水（0.142モル）114ml中のベンジルトリ
エチルアンモニウムブロミド29.9ｇ（0.11モ
ル）の溶液を、次に３，3′−ジクロル−フエノ
ールスルホンフタレイン（クロルフエノールレ
ツド）46.5ｇ（0.11モル）を添加する。色素残
分は容器壁から少量の水と1.25N−カセイソー
ダ水114mlで洗い落とす。 反応混合物を12時間還流沸騰させ、その後室
温で８時間放置する。有機相を分離し、水相を
数回クロロホルムで振盪する。 なお存在する出発物質を除去するために、合
した有機相を0.1N−カセイソーダ水で数回振
盪する。 クロロホルム相を水洗しかつ硫酸ナトリウム
で乾燥後、有機溶剤を濃縮する。残渣をエーテ
ルで擦ると、３，3′−ジクロル−フエノールス
ルホンフタレイニル−２，３，４，６−テトラ
−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトシドーナト
リウム塩46ｇが得られる。 黄色無定形物質（収率：理論量の54％） 融 点 190℃（分解） NMR：（DMSO−d6）：1.95（ｓ，3H）、1.99
（Ｓ，3H）、2.02（ｓ，3H）、2.12（ｓ，
3H）、4.0−4.6（ｍ，4H）、5.1−5.7（ｍ，
3H）、6.1−6.8（ｍ，1H）、6.9−7.7（ｍ，
8H）、7.8−8.0 ｂ 無水メタノール270ml中のａにより製造した
テトラアセチルガラクトシド28ｇ（0.036モ
ル）の溶液を０〜５℃に冷却する。脱アセチル
するためにこの温度で撹拌下にメタノール中の
１モル（0.072モル）−ナトリウムメチラート溶
液72mlを添加する。 ０〜５℃で15分後に、過剰のナトリウムイオ
ンを除去するためにこの溶液にアンバーライト
（Amberlite）IRC50約300mlを加え、混合物を
５℃で２時間撹拌する。イオン交換体による吸
引後に、これを数回メタノールで洗う。 合した液の濃縮後、残渣をカラムクロマト
グラフイ法により塩化メチレン／メタノール＝
５／１を用いて珪酸ゲルで精製する。３，3′−
ジクロル−フエノールスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩12ｇが得
られる。 黄色無定形粉末（収率：理論量の55％） 融 点 210℃（分解） NMR：（DMSO−d6）：3.3−3.7（ｍ，6H）、
3.9−5.0（ｍ，4H）、5.1（ｄ，Ｊ＝７Hz，
1H）、6.1−6.8（ｍ，1H）、6.9−7.6（ｍ，
8H）、7.8−8.0（ｍ，1H）。 例 ２ 例１と同様にして、２，３，４，６−テトラ−
Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロ
ミドを下記の出発物質の欄に記載のフエノールス
ルホンフタレインと反応させ、相応するペルアセ
チル化ガラクトシドを介して最終生成物の欄に挙
げたβ−Ｄ−ガラクトシドを製造する。
β−Ｄ−ガラクトシド、その製法及び該化合物を
含有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを検出するた
めの診断剤に関する。 従来の技術 β−グリコシド結合を有するＤ−ガラクトース
を含有するオリゴー又はポリサツカリドは殆んど
すべての生物体中に産生する。それ故、相応する
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（EC3、２、１、23）
も広く分布しており、多数の微生物、動物及び植
物中で検出することができる。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼは哺乳動物で多様な
生理学的機能を果す。ラクトースの加水分解がそ
れにより行なわれるので炭水化物代謝で重要な働
きをする。更に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは糖
脂質、ムコポリサツカリド及び糖蛋白質が分解す
る際のキー酵素である。 その生理学的有用性に加えて、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼは最近診断分野で重要になつた。例え
ばこの酵素は酵素イムノアツセイの指示薬酵素と
して次第に多く使われている［例えば“Annals
of Clinical Biochemistry”、16巻、221〜240頁
（1979年）参照］。 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは活性の測
定は臨床化学でかつまた診断学で重要になつてい
る。その際に、全く一般的にはガラクトシダーゼ
含有試料に好適なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
を加える。この基質は酵素により分解される。分
解生成物の１つを好適な方法で検出する。酵素の
作用により遊離したグリコン又はアグリコンを測
定することができる。一般には後者を測定する。
基質としては天然の基質ラクトース並びに特に色
原体ガラクトシドが好適である。 フエニル−β−Ｄ−ガラクトシド並びに芳香族
環で置換されている若干の他の誘導体（例えばｏ
−ニトロフエニル−及びｐ−ニトロフエニル−β
−Ｄ−ガラクトシド）がβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの基質として記載されている［“Biochem.Z.
”、332巻、209頁（1960年）］。加水分解により遊
離したフエノールを光度測定によりUV範囲でも
しくはニトロフエノールでは短い可視波長範囲で
測定する。続いて、指示薬反応として、アミノア
ンチピリンとの酸化的結合を行なうこともできる
［“Analytical Biochem.”、40巻、281頁（1971
年）］。 組織化学的実験では、一方ではナフチル−β−
Ｄ−ガラクトシドが使われ、例えば１−ナフチル
化合物［“Histochemi”、35巻、199頁（1973
年）］、６−ブロム−２−ナフチル誘導体［“J.
Biol.Chem.”、195巻239頁（1952年）］又はナフ
トール−AS−BI−β−Ｄ−ガラクトシド
［“Histo−chemie”、37巻、89頁（1973年）］で
ある。その場合、生成するナフトールを種々のジ
アゾニウム塩と反応させてアゾ色素に変換して可
視化する。 更に、５−ブロム−４−クロル−インドキシル
−β−Ｄ−ガラクトシドがβ−ガラクトシダーゼ
の基質として公知である。この場合には、指示薬
反応は生成するインドキシルのインジゴへの酸化
的二量化である［“Histochemie”、23巻、266頁
（1970年）］か又はジアゾニウム塩とカツプリング
させてインドキシル−アゾ−色素を形成する
［“Histochemistry”、57巻、323頁（1978年）］。 前記の測定法は顕著な欠点を有し、１コはそれ
が敏感でないことであり、更に組織化学的検出で
使用される基質の溶解性が非常に不良なことであ
る。 アグリコンを螢光測定により検出することので
きるガラクトシドを基質として使用する場合に、
本質的により敏感な試験法が得られる：例えば
“プロシー−ジングス・オブ・ザ・ナシヨナル・
アカデミ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユー
ナイテツド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.
Nat.Acad.Sci.U.S.）”、47巻、1981頁（1961年）
に螢光−ジ−β−Ｄ−ガラクトシドが基質として
記載されている。更に、２−ナフチル−β−Ｄ−
ガラクトシド［“Anglytical Biochem.”、42巻、
275頁（1971年）］又は４−メチル−ウンベリフエ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド〔“Biochem.J.”、
102巻、525頁（1967年）］が使われる。 螢光測定法の欠点は、著しい装置上の経費を必
要とすることである。 発明が解決しようとする問題点 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを簡単で迅
速なかつ信頼できる方法で測定することのできる
基質に対する要求が生じた。この要求を解決する
ことが課題であつた。 問題点を解決するための手段 ところで、スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドを基質として使用する場合に、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼを非常に敏感に可視スペクト
ル領域で視覚的に又は簡単な分光測光器で検出し
得ることが判明した。更に、この化合は極めて容
易に水に溶けるという利点を有する。 従つて、本発明の目的は、一般式： ［式中R1〜R4は同じか又は異なつていてよ
く、それぞれ［式中R1〜R4は同じか又は異なつ
ていてよく、水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミ
ノ基を表わし、 R5〜R12は同じか又は異なつていてよく、水
素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、
低級アルコキシ基、カルボキシル基又はニトロ基
を表わし、 Ｍ+はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土
類イオン又はアンモニウムイオンを表わす］のフ
エノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシドである。 一般式による全スルホンフタレイニル−β−
Ｄ−ガラクトシドは新規化合物である。これらは
炭水化物化学で公知の方法により製造することが
できる。 殊に、公知方法で一般式： ［式中R1〜R12は前記のものを表わす］のフエ
ノールスルホンフタレインを一般式： ［式中Ｘはハロゲンを表わしかつR13は炭水化
物化学で常用の保護基を表わす］のペル−Ｏ−置
換１−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトースと糖残基
のＣ−１原子でワルデン反転下に反応させて一般
式： ［式中R1〜R13及びＭ+は前記のものを表わ
す］のペル−Ｏ−置換スルホンフタレイニル−β
−Ｄ−ガラクトシドに変換しかつこのガラクトシ
ドから公知の方法で保護基R13を脱離する。 式との化合物の一般式のガラクトシドへ
の変換は、水性アセトン中で又は水／ベンゼン−
又は水／クロロホルム混合物中で（相移動条件下
に）水酸化アルカリ又は炭酸アルカリのような酸
受容体の存在において行なうと有利である。 更に、一般式のガラクトシドは、初めに一般
式のフエノールスルホンフタレインを水酸化ア
ルカリ又はアルカリアルコラートによりジアルカ
リ塩にもしくは場合により置換されているアミン
によりアンモニウム塩に変換しかつこれをアセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジクロルメタン、テ
トラヒドロフラン又はジメチルホルムアミドのよ
うな双極性中性溶剤中で一般式のペル−Ｏ−置
換１−ハロゲノ−ガラクトースと反応させて製造
することができる。 一般式のフエノールスルホンフタレインと一
般式の１−ハロゲノ−ガラクトースとから一般
式のガラクシドを合成する際に、塩化メチレ
ン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン又はジオ
キサンのような溶剤中、場合により塩化カルシウ
ム又はドリエリツト（Drierit）のような乾燥剤
の使用下に単独の銀塩又は銀塩の混合物（酸化
銀、炭酸銀、セライト上の炭酸銀、銀トリフラー
ト、サリチル酸銀）及び／又は単独の水銀塩又は
水銀塩の混合物（臭化水銀、シアン化水銀、酢酸
水銀、酸化水銀）の添加が有効であることが明ら
かになつた。 このようにして得られた一般式のペル−Ｏ−
置換スルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ドもまた新規化合物である。 一般式のペル−Ｏ−置換スルホンフタレイニ
ル−β−Ｄ−ガラクトシドを一般式のスルホン
フタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドに変換する
ための保護基R13の脱離は炭水化物化学で常用の
方法［例えば“アドランセス カルボヒドレート
ケミー（Adrances Carbohydrate Chem.）”、
12巻、157頁（1957年）］により、例えばアシル保
護基ではナトリウムメチラート又はバリウムメチ
ラート又はメタノール中のアンモニアにより実施
する。 一般式のフエノールスルホンスタレインは周
知の市販されている物質であるかあるいは公知方
法により相応するフエノールと相応する。Ｏ−ス
ルホン安息香酸とから製造する［例えばD.S. ブ
レスロウ（Breslow）及びH. スコルニツク
（Skolnik）共著、A.バイスベルガー
（Weissberger）編集“ヘテロサイクリツク コ
ンパウンズ（Heterocylic Compounds）”、21
巻、118頁（1966年）インターサイエン パブリ
ツシヤース（Interscience Publishers）、（ニユー
ヨーク（New york）在）参照］か又は公知のス
ルホンフタレインから出発して後からハロゲン化
又はニトロ化して誘導する［例えばD.S. ブレス
ロウ（Breslow）及びH.スコルニツク
（Skolnik）共著、前記文献、141頁、144頁参
照］。 出発物質として使用した一般式のペル−Ｏ−
置換１−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトースも公知
の化合物である［例えば“ヒエミツシエ ベリヒ
テ（Chem.Ber.）”、35巻、836頁（1902年）；
“ネーチヤー（Nature）”、165巻、369頁（1950
年）；“アクタケミカ スカンジナビカ（Acta
chem.Scand.，Ser.B）”、33巻、116頁（1979
年）；“ジヤーナル オブ ケミカル ソサエテ
イ（J.Chem.Soc.）”、1419頁（1965年）；“カル
ボヒドル．レズ（Carbchydr.Res.）”、11巻、85
頁（1969年）］。 R1〜R12及びＸの定義におけるハロゲンとは弗
素、塩素、臭素及び沃素であり、R1〜R12では有
利に弗素、塩素及び臭素でありかつＸでは有利に
塩素及び臭素である。 R5〜R12の定義における低級アルキル基は炭素
原子１〜５個、殊に１〜３個を含有し、メトキシ
基が特に優れている。 Ｍ+の定義におけるアルカリ金属イオンとはリ
チウム−、ナトリウム−及びカリウムイオンであ
り、リチウムイオン及びナトリウムイオンが優れ
ている。 Ｍ+の定義におけるアルカリ土類イオンはマグ
ネシウム−、カルシウム−及びバリウムイオンを
表わし、カルシウムイオンが優れている。 Ｍ+の定義におけるアンモニウムイオンは
［NR14R15R16R17］+であり、その際R14〜R17は同じ
か又は異なつていてよく、それぞれ水素、炭素原
子１〜４個、殊に１又は２個の低級アルキル基か
又はベンジル基を表わす。 炭水化物化学で常用の保護基R13としては特に
アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基又はトリ
メチルシリル基が好適である。 本発明の他の目的は、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの活性を測定するために一般式の新規のスル
ホンフタレイニル−β−ガラクトシドを含有する
診断剤である。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてスルホ
ンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシドを使用す
ることにより従来知られていたよりも明らかに敏
感なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ試験系が得られ
る。新規基質はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性
を測定するには生化学的分野でかつまた臨床化学
的分野で使用することができる。それは敏感であ
る。それ故いくつかの利点が得られる： ａ 低いβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定す
ることができる、 ｂ 少量の試料を使用することができる、 ｃ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定を極め
て短時間で行なうことができる、 ｄ 低い試料使用量及び有利な波長領域が他の試
料成分による方法の妨害を減少させる。 本発明による基質は、最適PH値の点で全く異な
つていてよい種々の由来のβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼの活性の測定に好適である。そのような場合
でも一般式の基質を含有する診断剤は明らかに
従来公知の試験剤よりも敏感に反応する。 一般式のスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシドは、免疫反応後にその活性度を測定す
べき指示薬酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
を使用する免疫学的測定法にも好適である。酵素
指示薬反応によりそのような免疫学的測定法は当
業者に酵素イムノアツセイとして知られている。
この方法は、範囲10-5〜10-12モル／の蛋白
質、ポリサツカリド、ホルモン、医薬及び他の低
分子物質の濃度の測定に使われる。相分離工程の
必要性に応じて均質−及び異質試験操作を区別す
る。拮抗性及び非拮抗試験原理で更に分けること
ができる。 しかしすべての試験原理は酵素−抗原−もしく
は酵素−抗体−接合体により行なう。酵素指示薬
反応はすべての酵素イムノアツセイに共通してい
る。 そのような目的に好適な指示薬酵素はβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼである。酵素イムノアツセイに
おけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの測定は常法
で、つまり好適なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ基質
を添加し、これを酵素により分解しかつ常法で光
度測定法で測定する。 それ故、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ試験系の改
良により酵素イムノアツセイでも顕著な利点が得
られる： １ この場合にも、より高い感度が検出限界の一
層の低下、短い反応時間及び低い試料使用量そ
れ故他の試料成分による低い妨害を可能にす
る。 ２ 有利な測定波長が一定の反応操作で不溶成
分、例えば混濁による方法の妨害を低減する。 診断剤は一般式の本発明による基質１種又は
数種と共に好適な緩衝系並びに場合によりそのよ
うな診断剤に一般に使われる他の好適な添加物、
例えば湿潤剤、安定剤等を含有する。診断剤は溶
液の形で、凍結乾燥体、粉末混合物、試薬錠剤と
して又は吸収性担体上に吸収させて存在してよ
い。 溶液の形の本発明による診断剤は試験に必要な
全試薬を含有すると有利である。溶剤としては水
か又は水と水溶性有機溶剤、例えばメタノール、
エタノール、アセトン又はジメチルホルムアミド
との混合物が該当する。保存性という理由から、
試験に必要な試薬を２種以上の溶液に分けてお
き、それらを本来の実験の際に初めて混合すると
有利である。 それぞれ全重量約５〜20mg、殊に約10mgの凍結
乾燥体形の診断剤の製造に当り、試験に必要な全
試薬と共に常用の骨格ビルダー、例えばポリビニ
ルピロリドン及び場合により他の充填剤、例えば
マンニツト、ソルビツト又はキシリツトを含有す
る溶液を乾燥させる。 粉末混合物又は試薬錠剤形の診断剤は、試験用
成分に常用のガーレン式添加物を混合しかつ造粒
して製造する。この種の添加物は例えばモノ−、
オリゴ−又はポリサツカリドのような炭水化物、
又はマンニツト、ソルビツト又はキシリツトのよ
うな糖アルコールもしくはポリエチレングリコー
ル又はポリビニルピロリドンのような他の可溶性
不活性化合物である。一般に、粉末混合物又は試
薬錠剤は最終重量約30〜200mg、殊に50〜80mgを
有する。 試験片としての診断剤の製造に当り、吸収性担
体、殊に紙、セルロース又は合成繊維フリース
を例えば水、メタノール、エタノール又はアセト
ンのような易揮発性溶剤中の試験片の製造に常用
の必要試薬の溶液で含浸する。これは一含浸工程
で行なうことができる。しかし含浸を数工程で実
施するとしばしば有利であり、その際に診断剤成
分の一部をそれぞれ含有する溶液を使用する。例
えば、第一工程で緩衝物質及び他の水溶性添加物
を含有する水溶液で、次に第二工程でβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ基質を含有する溶液で含浸するこ
とができる。調製した試験紙をそのままで使用す
るか又は公知のようにグリツプに接着するか又は
有利に西ドイツ国特許第2118455号明細書により
プラスチツクと細目メツシユ材との間に封入する
ことができる。 次の実施例により、本発明による化合物の合成
に適用することのできる多くの別法のうちのいく
つかを並びに新規なスルホンフタレイニル−β−
Ｄ−ガラクトシドのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活
性測定への使用について詳説する。ただし、本発
明の目的は実施例により限定されるものではな
い。 次の略語を使用する： HEPES ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジニル］−エタンスルン酸 BSA 牛血清アルブミン Tween−20 ポリオキシエチレン（20）ソルビ
タンモノラウレート Tricin ［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）］メ
チル−グリシン 例 １ ３，3′−ジクロル−フエノールスルホンフタレ
イニル−β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩 ａ クロロホルム450ml中の２，３，４，６−テ
トラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノ
シルブロミド45ｇ（0.11モル）の溶液を60℃に
加熱する。撹拌下にこの温度で1.25N−カセイ
ソーダ水（0.142モル）114ml中のベンジルトリ
エチルアンモニウムブロミド29.9ｇ（0.11モ
ル）の溶液を、次に３，3′−ジクロル−フエノ
ールスルホンフタレイン（クロルフエノールレ
ツド）46.5ｇ（0.11モル）を添加する。色素残
分は容器壁から少量の水と1.25N−カセイソー
ダ水114mlで洗い落とす。 反応混合物を12時間還流沸騰させ、その後室
温で８時間放置する。有機相を分離し、水相を
数回クロロホルムで振盪する。 なお存在する出発物質を除去するために、合
した有機相を0.1N−カセイソーダ水で数回振
盪する。 クロロホルム相を水洗しかつ硫酸ナトリウム
で乾燥後、有機溶剤を濃縮する。残渣をエーテ
ルで擦ると、３，3′−ジクロル−フエノールス
ルホンフタレイニル−２，３，４，６−テトラ
−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトシドーナト
リウム塩46ｇが得られる。 黄色無定形物質（収率：理論量の54％） 融 点 190℃（分解） NMR：（DMSO−d6）：1.95（ｓ，3H）、1.99
（Ｓ，3H）、2.02（ｓ，3H）、2.12（ｓ，
3H）、4.0−4.6（ｍ，4H）、5.1−5.7（ｍ，
3H）、6.1−6.8（ｍ，1H）、6.9−7.7（ｍ，
8H）、7.8−8.0 ｂ 無水メタノール270ml中のａにより製造した
テトラアセチルガラクトシド28ｇ（0.036モ
ル）の溶液を０〜５℃に冷却する。脱アセチル
するためにこの温度で撹拌下にメタノール中の
１モル（0.072モル）−ナトリウムメチラート溶
液72mlを添加する。 ０〜５℃で15分後に、過剰のナトリウムイオ
ンを除去するためにこの溶液にアンバーライト
（Amberlite）IRC50約300mlを加え、混合物を
５℃で２時間撹拌する。イオン交換体による吸
引後に、これを数回メタノールで洗う。 合した液の濃縮後、残渣をカラムクロマト
グラフイ法により塩化メチレン／メタノール＝
５／１を用いて珪酸ゲルで精製する。３，3′−
ジクロル−フエノールスルホンフタレイニル−
β−Ｄ−ガラクトシド−ナトリウム塩12ｇが得
られる。 黄色無定形粉末（収率：理論量の55％） 融 点 210℃（分解） NMR：（DMSO−d6）：3.3−3.7（ｍ，6H）、
3.9−5.0（ｍ，4H）、5.1（ｄ，Ｊ＝７Hz，
1H）、6.1−6.8（ｍ，1H）、6.9−7.6（ｍ，
8H）、7.8−8.0（ｍ，1H）。 例 ２ 例１と同様にして、２，３，４，６−テトラ−
Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロ
ミドを下記の出発物質の欄に記載のフエノールス
ルホンフタレインと反応させ、相応するペルアセ
チル化ガラクトシドを介して最終生成物の欄に挙
げたβ−Ｄ−ガラクトシドを製造する。
【表】
トリウム塩
【表】
スルホンフ
タレイン
タレイン
【表】
ホンフタレ ウム塩
イン
イン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式： ［式中R1〜R4は同じか又は異なつていてよ
く、それぞれ水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミ
ノ基を表わし、 R5〜R12は同じか又は異なつていてよく、それ
ぞれ水素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキ
シ基、低級アルコキシ基、カルボキシル基又はニ
トロ基を表わし、 Ｍ+はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土
類イオン又はアンモニウムイオンを表わす］のフ
エノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシド。 ２ 一般式： ［式中R1〜R4は同じか又は異なつていてよ
く、水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミノ基を表
わし、 R5〜R12は同じか又は異なつていてよく、水
素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキシ基、
低級アルコキシ基、カルボキシル基又はニトロ基
を表わし、 Ｍ+はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土
類イオン又はアンモニウムイオンを表わす］のフ
エノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシドを製造する方法において、公知方法で一般
式： ［式中R1〜R12は前記のものを表わす］の化合
物を一般式： ［式中Ｘはハロゲンを表わしかつR13は炭水化
物化学で常用の保護基を表わす］のペル−Ｏ−置
換１−ハロゲノ−α−Ｄ−ガラクトースと糖残基
のＣ−１原子でワルデン反転下に反応させて一般
式： ［式中R1〜R13及びＭ+は前記のものを表わ
す］のペル−Ｏ−置換スルホンフタレイニル−β
−Ｄ−ガラクトシドに変換し、かつこのガラクト
シドから公知方法で保護基R13を脱離することを
特徴とするフエノールスルホンフタレイニル−β
−Ｄ−ガラクトシドの製法。 ３ 色原物質１種又は数種、好適な緩衝物質並び
に場合により他の常用の助剤を含有するβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼを検出するための診断剤におい
て、色原物質として一般式： ［式中R1〜R4は同じか又は異なつていてよ
く、それぞれ水素、ハロゲン、ニトロ基又はアミ
ノ基を表わし、 R5〜R12は同じか又は異なつていてよく、それ
ぞれ水素、ハロゲン、低級アルキル基、ヒドロキ
シ基、低級アルコキシ基、カルボキシル基又はニ
トロ基を表わし、 Ｍ+はプロトン、アルカリイオン、アルカリ土
類イオン又はアンモニウムイオンを表わす］のフ
エノールスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラク
トシドを含有することを特徴とするβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼを検出するための診断剤。 ４ 付加的な助剤として、湿潤剤、酸化剤、ガー
レン式添加物及び／又は骨格ビルダーを含有する
特許請求の範囲第３項記載の診断剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3345748.4 | 1983-12-17 | ||
| DE19833345748 DE3345748A1 (de) | 1983-12-17 | 1983-12-17 | Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60192767A JPS60192767A (ja) | 1985-10-01 |
| JPS621978B2 true JPS621978B2 (ja) | 1987-01-17 |
Family
ID=6217269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59261949A Granted JPS60192767A (ja) | 1983-12-17 | 1984-12-13 | フエノ−ルスルホンフタレイニル−β−Ｄ−ガラクトシド，その製法及び該化合物を含有するβ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼを検出するための診断剤 |
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