JPH0739396A - Ｌａｐ活性測定用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ＬＡＰによって生じる反応の発色光学濃度のバ
ラツキが小さくまたＬＡＰ活性の変化にともなう発色光
学濃度変化の大きなＬＡＰ活性測定用一体型多層分析要
素を提供する。 【構成】ロイシンアミノペプチダーゼに感応して自己顕
色性を示す基質、ｐＨ緩衝剤、ノニオン性界面活性剤お
よび親水性ポリマーを含有する多孔性展開層、吸水層、
水不透過性支持体がこの順に積層されている分析要素に
おいて、前記基質がＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド
の塩であることを特徴とするＬＡＰ活性測定用一体型多
層分析要素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体試料中のロイシン
アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性を測定するための一
体型多層分析要素に関するものである。さらに詳しくは
本発明は、水性液体試料の分析、特に体液を試料とする
臨床検査に有用なＬＡＰ活性測定用一体型層分析要素に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＬＡＰは胆道閉塞症のような胆汁の流出
障害をもたらす疾患や肝臓疾患があると血液や尿中のこ
の酵素の濃度が異常に増加するので、その測定はこれら
の疾患の検査方法として有用である。

【０００３】ＬＡＰ活性の測定法としては、1958年に基
質としてＬ−ロイシン−β−ナフチルアミドを用いたＬ
ＡＰ活性測定法が発表された(Cancer，11巻，283，1958
年）。しかし、この方法は反応過程が複雑で、かつ厳密
な操作を必要とするため、検査法として不便であった。
そればかりでなく、標準物質たるβ−ナフチルアミンの
毒性が著しく、近年膀胱の腫瘍や癌を発生することが明
らかとなったため、発癌物質として、その使用に特に厳
密な注意を要するなどの欠点もあった。

【０００４】ＬＡＰ活性測定用自己顕色性基質として
は、1967年に基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニ
リドを用いたＬＡＰ活性測定法が発表された（Cumulati
ve Klinische Wochonschrift，45, 474, 1967年)Ｌ−ロ
イシン−ｐ−ニトロアニリドを用いた場合には、これ
が、ロイシンアミノペプチダーゼによって分解されて生
ずるｐ−ニトロアニリンの吸光度を測定することによっ
て求めたｐ−ニトロアニリンの量からロイシンアミノペ
プチダーゼの量を算定することができる。波長405nmで
の吸光度の変化を測定することによって、Ｌ−ロイシン
−ｐ−ニトロアニリドがロイシンアミノペプチダーゼに
よって分解される速度、すなわちその反応速度が判る。

【０００５】ＬＡＰ活性測定用試薬としてのＬ−ロイシ
ン−ｐ−ニトロアニリドについてはいくつかの改良研究
がなされている。特開昭50−105618号公報には、湿式分
析法において難溶性のＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリ
ドが反応容器壁に付着して反応が円滑に進行しないこと
を防止する手段として、これを塩酸、硫酸等の無機酸の
塩あるいは酢酸等の有機酸の塩に変えて使用する方法を
提案している。

【０００６】一方、ＬＡＰ活性測定用の一体型多層分析
要素も知られている。特開昭58−170499号公報には、支
持体上に少なくとも１層の試薬層及び少なくとも１層の
展開層を有する分析素子に、Ｌ−ロイシンに各種のアニ
リン誘導体を結合させた合成基質を含有させたＬＡＰ測
定用分析素子を開示している。この分析素子は従来の合
成基質から生成される色素が親水性なため検体の水分に
よって拡散してリンギングを起こすためこれを改良する
べくなされたものである。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のＬ−ロイシン−
アニリン誘導体合成基質を用いたものはＬＡＰによって
分解されて生じたアニリン誘導体が水溶性で拡散してし
まうためこれを防止するために耐拡散性カプラーを使用
している。

【０００８】しかしながら、例えば、ＧＳＣＣ(German
Society for Clinical Chemistry）では、Ｌ−ロイシン
−ｐ−ニトロアニリドを用いる試薬処方がＬＡＰの基準
測定法として推奨されている（Z. Klin. Chem. u. Kli
n. Biochem., ８巻658頁(1970年））。しかも耐拡散性
カプラーを用いたＬＡＰ測定用分析素子では、検出・呈
色反応が２段階となり、測定時間が10分ないし30分と長
時間を要するという問題点がある。

【０００９】本発明者らはこれを解決する手段として合
成基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを用い
ることを検討し、これを分析要素に組み込んだが発色光
学濃度のバラツキが大きいばかりでなくＬＡＰ活性の増
加にともなう発色光学濃度の増加も小さく分析精度が悪
いという問題を生じた。

【００１０】本発明の目的はＬＡＰによって生じる反応
の発色光学濃度のバラツキが小さくまたＬＡＰ活性の変
化にともなう発色光学濃度変化の大きなＬＡＰ活性測定
用一体型多層分析要素を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
したＬＡＰ活性測定用一体型多層分析要素を提供するも
のであり、ロイシンアミノペプチダーゼに感応して自己
顕色性を示す基質、緩衝剤、ノニオン性界面活性剤およ
び親水性ポリマーを含有する多孔性展開層、吸水層、水
不透過性支持体がこの順に積層されている分析要素にお
いて、上記基質がＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの
塩であることを特徴としている。

【００１２】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析
要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でか
つ水不透過性である支持体が好ましい。光透過性・水不
透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレ
ン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテー
ト、セルローストリアセテート、セルロースアセテート
プロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約50μｍ
から約１mm、好ましくは約80μｍから約300μｍの範囲
のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げること
ができる。

【００１３】支持体の表面には必要により下塗層を設け
て、支持体の上に設けられる吸水層と支持体との接着を
強固なものにすることができる。また、下塗層の代り
に、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理
を施して接着力の向上を図ってもよい。

【００１４】支持体の上には（場合によっては下塗層等
の他の層を介して）吸水層が設けられる。本発明のＬＡ
Ｐ活性測定用分析要素に備えられる吸水層は親水性結合
剤よりなる層、すなわち水を吸収して膨潤する親水性ポ
リマーを層形成成分として利用している層であることが
好ましい。

【００１５】吸水層の製造に用いることができる親水性
ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約150
％から約2000％、好ましくは約250％から約1500％の範
囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような
親水性ポリマーの例としては、特開昭58−171864号公報
および特開昭60−108753号明細書等に開示されているゼ
ラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、
ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシア
クリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラ
ン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることがで
きる。

【００１６】吸水層の乾燥時の厚さは約１μｍから約10
0μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約
３μｍから約30μｍの範囲である。また吸水層は実質的
に透明であることが好ましい。

【００１７】上記吸水層の上に必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。光遮蔽性は、光遮蔽性、または光
遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子または微粉末
（以下、単に微粒子という）が少量の被膜形成能を有す
る親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透
過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は吸水層にて
発生した検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性
を有する支持体側から反射測光する際に、後述する展開
層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血であ
る場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽するとともに光
反射層または背景層としても機能する。

【００１８】光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子
の例としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナタ
ーゼ型またはブルカイト型の粒子径が約0.1μｍから約
1.2μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アル
ミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることがで
き、光遮蔽性微粒子の例としては、カーボンブラック、
ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることが
でき、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリ
ウム微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ
型二酸化チタン微粒子である。

【００１９】被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーの例としては、前述の吸水層の製造に用いられる親
水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水
性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げる
ことができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチ
ン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合し
て用いることができる。

【００２０】光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリ
マーとの水性分散液を公知の方法により吸水層の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。また光遮
蔽層を設ける代りに、後述する展開層中に光遮蔽性微粒
子を含有させてもよい。

【００２１】なお、吸水層の上に、場合によっては光遮
蔽層等の層を介して、後述する展開層を接着し積層する
ために接着層を設けてもよい。

【００２２】接着層は水で湿潤しているとき、または水
を含んで膨潤しているときに展開層を接着することがで
き、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマ
ーからなることが好ましい。接着層の製造に用いること
ができる親水性ポリマーの例としては、吸水層の製造に
用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあ
げられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜
厚は一般に約0.5μｍから約20μｍ、好ましくは約１μ
ｍから約10μｍの範囲である。

【００２３】なお、接着層は吸水層上以外にも、他の層
間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよ
い。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられ
る界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や
吸水層等の上に塗布する方法などにより設けることがで
きる。これらの層の上には、多孔性展開層が設けられ
る。

【００２４】本発明の多孔性展開層は液体試料計量作用
を有していることが好ましい。液体試料計量作用を有す
る展開層とは、その上側の表面（支持体から遠い側の表
面）に点着供給された水性液体試料を、その中に含有し
ている成分を実質的に偏在させることなしに、横（水
平）方向に広げ、単位面積当りほぼ一定容量の割合で吸
水層に供給する作用を有する層である。また本発明の多
孔性展開層は、アナライトであるロイシンアミノペプチ
ダーゼが容易に透過・拡散しうる空間を有する多孔性展
開層であることが好ましい。

【００２５】以上の点から本発明のＬＡＰ活性測定用一
体型多層分析要素に備えられる多孔性展開層のマトリッ
クスを構成する材料としては、濾紙、不織布、織物生
地、編物生地、ガラス繊維、濾紙、ブラッシュポリマー
より形成されるメンブランフィルター、あるいはポリマ
ーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用い
ることが好ましい。

【００２６】展開層のマトリックスは、これらの材料か
ら分析条件等に応じて選択するが、試料として全血のよ
うな分析を阻害する非溶解性物質（全血の場合は血球）
を含む試料を用いる場合には、阻害物質を除去する作用
を有する繊維生地または編物生地を用いることが好まし
い。

【００２７】上記展開層に用いることができる織物生地
（織布）としては特開昭55−164356号および特開昭57−
66359号の各公報に開示の広範囲の種類の織物生地があ
げられる。織物生地のうちでは、たて（経）糸とよこ
（緯）糸とで織った平織物が好ましく、平織物のうちで
は細布生地、金巾生地、ブロード生地、ボブリン生地等
が好ましい。織物生地を構成する糸としては後述する編
物生地を構成する糸と同様の素材からなる糸があげら
れ、糸の形態としてはフィラメント糸、紡績糸（加捻
糸）のいずれをも用いることができ、これらのうちでは
紡績糸が好ましい。織物生地の糸の太さは綿紡績糸番手
で表して約20Ｓから約150Ｓ、好ましくは約40Ｓから約1
20Ｓ相当の範囲または絹糸デニールで表して約35Ｄから
約300Ｄ、好ましくは約45Ｄから約130Ｄ相当の範囲、織
物生地の厚さは約100μｍから約500μｍ、好ましくは約
120μｍから約350μｍの範囲、織物生地の有する空隙率
は約40％から約90％、好ましくは約50％から約85％の範
囲である。

【００２８】また、上記展開層に用いることができる編
物生地（編布、すなわち編んだ布状物）としては、広範
囲の種類の編物生地があげられ、それらのうちではたて
（経）メリヤスとよこ（緯）メリヤスが好ましい。たて
メリヤスとしては、一重アトラス編生地、トリコット編
生地、ダブルトリコット編生地、ミラニーズ編生地、ラ
ッシェル編生地等を用いることができ、よこメリヤスと
しては、平編生地、パール編生地、ゴム編生地、両面編
生地等を用いることができる。編物生地を編成する糸と
しては、綿、絹、羊毛等の天然繊維の糸、ビスコースレ
ーヨン、キュプラ等の再生セルロース、セルロースジア
セレート、セルローストリアセテート等の半合成有機ポ
リマー、ポリアミド（各種のナイロン類）、アセタール
化ポリビニルアルコール（ビニロン等）、ポリアクリロ
ニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ポリニチレ
ン、ポリプロピレン、ポリウレタン等の合成有機ポリマ
ーの細繊維からなる糸または単繊維からなる糸、天然繊
維と再生セルロース、半合成または合成有機ポリマー繊
維との混合繊維からなる糸があげられる。糸の形態とし
ては、フィラメント糸、紡績糸（加捻糸）のいずれをも
用いることができ、これらのうちでは紡績糸が好まし
い。編物生地の糸の太さは、綿紡績糸番手で表わして約
40Ｓから約150Ｓ、好ましくは約60Ｓから約120Ｓ相当の
範囲または絹糸デニールで表わして約35Ｄから約130
Ｄ、好ましくは約45Ｄから約90Ｄ相当の範囲である。編
物生地の編成工程時のゲージ数としては約20から約50の
範囲、編物生地の厚さは約100μｍから約600μｍ、好ま
しくは約150μｍから約400μｍの範囲、編物生地の有す
る空隙率は約40％から約90％、好ましくは約50％から約
85％の範囲である。たてメリヤスのうちでは縦方向の伸
縮が少なく、また編物展開層のラミネーション工程にお
ける操作のしやすさ、薮断時の編目ほどけのなさ等の観
点でトリコット編生地、ミラニーズ編生地、ダブルトリ
コット編生地、ラッセル編生地が好ましい。

【００２９】多孔性展開層に用いられる織物または編物
生地は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製造時、織
物製造時あるいは編物編成時に供給または付着した油脂
類を実質的に除去した織物または編物生地であるが、さ
らにその織物または編物生地は特開昭57−66359号公報
に開示の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理
またはコロナ放電処理等）を生地の少なくとも片面に施
すか、あるいは特開昭55−164356号、特開昭57−66359
号公報等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親水化処
理、またはこれらの処理工程を逐次実施することにより
織物または編物を親水化し、下側（支持体に近い側）の
層との接着力を強化することができる。

【００３０】織物または編物生地からなる展開層を吸水
層または接着層に接着、積層するには、特開昭55−1643
56号および特開昭57−66359号各公報等に開示の方法に
従って作成することができる。すなわち、吸水層または
接着層の塗布後末乾燥のうちに、または乾燥後の層に水
（または界面活性剤を少量含む水）を実質的に均一に供
給して層を膨潤させ、ついで織物または編物生地を湿潤
または膨潤している層の上に実質的に均一に軽く圧力を
かけながら接着、積層し一体化する。

【００３１】また展開層がブラッシュポリマーまたはメ
ンブランフィルターからなる場合には特公昭53−21677
号公報等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状
構造物層である場合には特開昭55−90859号公報等、濾
紙または不織物からなる場合には特開昭57−148250号公
報等にそれぞれ記載の方法に従って設けることができ
る。

【００３２】吸水層または接着層の親水性ポリマーバイ
ンダーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、層
の塗布後ゼラチン（誘導体）が未乾燥のゲル状態の間に
上記多孔性展開層を構成する材料（織物または編物生地
等）を接着、積層し一体化する方法を採用することがで
きる。

【００３３】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析
要素では、自己顕色性基質は展開層に含有させる。自己
顕色性基質とはＬＡＰの基質として、Ｌ−ロイシル基の
水解反応を受け検出可能な発色または変色を示す物質の
ことである。本発明の分析要素においてはこの自己顕色
性基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドの塩を
用いる。この塩の種類としては塩酸、硫酸等の無機酸の
塩及び酢酸等の有機酸の塩のいずれであってもよい。特
に好ましい塩は塩酸塩である。含有量はＬ−ロイシン−
ｐ−ニトロアニリドに換算して約0.5ｇ／ｍ²〜約2.5ｇ
／ｍ²の範囲である。

【００３４】測定感度のＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニ
リドの量依存性が実質的に現れず、未使用時の多層分析
要素の保存安定性が良好であり、かつ基質阻害が実質的
に起こらないなどの観点から、Ｌ−ロイシン−ｐ−ニト
ロアニリドに換算して約1.0ｇ／ｍ²〜約2.0ｇ／ｍ²の範
囲が好ましい。

【００３５】本発明のＬＡＰ活性測定用分析要素の展開
層に含有させることができる緩衝剤の例としては、炭酸
塩、ホウ酸塩、燐酸塩、トリス塩およびグッド（Good）
の緩衝剤などの公知の緩衝剤を挙げることができる。こ
れらの緩衝剤は「蛋白質・酵素の基礎実験法」（梶尾武
一他，南江堂，1981）等の公知文献を参考にして選択
し、使用することができる。含有量は一体型多層分析要
素で通常使用されている量と同程度でよく、約3.5ｇ／
ｍ²〜約10ｇ／ｍ²の範囲、好ましくは約５ｇ／ｍ²〜約
８ｇ／ｍ²の範囲である。

【００３６】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析
要素の展開層又は吸水層には界面活性剤、例えばノニオ
ン性界面活性剤を含有させることができる。ノニオン性
界面活性剤の具体例として、ｐ−オクチルフェノキシン
ポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエ
トキシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ
−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコ
シド等がある。これらのノニオン性界面活性剤のうちで
は、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、
ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノ
ニルフェノキシポリグリシドールなどが好ましい。ノニ
オン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性
液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好に
なる。ノニオン性界面活性剤を吸水層に含有させること
により分析操作時に水性液体試料中の水が吸水層に実質
的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液体接
触が迅速にかつ実質的に一様になる。

【００３７】さらに本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多
層分析要素は、展開層が親水性ポリマーも含有する。本
発明に用いることができる親水性ポリマーとしては、澱
粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよびこれらの
誘導体（例、ヒドロキシメチル化およびヒドロキシプロ
ピル化等）、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと
各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン
重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの
共重合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各
種ビニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができ
る。上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン誘
導体が好ましい。

【００３８】本発明のＬＡＰ活性測定用分析要素の展開
層には、上記自己顕色性基質、緩衝剤、ノニオン性界面
活性剤および親水性ポリマー以外にも、光遮蔽性微粒子
等の試薬を必要に応じて含有させることができる。

【００３９】展開層に上記の自己顕色性基質、緩衝剤、
ノニオン性界面活性剤、親水性ポリマーおよび光遮蔽性
微粒子等の試薬を含有させるに際しては、下記のような
様々な方法を用いることができる。

【００４０】たとえば、上記試薬等を含有する塗布液を
展開層の上から塗布または噴霧し乾燥する方法を用いる
ことができる。

【００４１】また展開層がラミネートにより積層する展
開層材料、例えば、織物、編物、濾紙、不織布およびガ
ラス繊維濾紙等からなる場合には、上記試薬等を含有す
る溶液に展開層を浸漬したのち乾燥または半乾燥状態で
他の層に積層し一体化する方法を用いることができる。

【００４２】塗布により形成される展開層、例えばブラ
ッシュポリマー層やミクロビーズ三次元格子状粒子構造
体等からなる展開層の場合には、展開層と試薬等の塗布
液を混合して塗布してもよい。

【００４３】なお、これらの展開層に試薬等を含有させ
る方法を用いる場合には、いくつかの試薬毎に異なる方
法を用いることができる。また、いくつかの試薬毎に数
回に分けて行なうこともできる。

【００４４】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析
要素は以上のように、支持体、吸水層および展開層を積
層してなるものであり、これらの支持体、吸水層および
展開層はこの順で積層されていることが好ましい。なお
本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析要素は、前述
のように上記の必須の層以外にも他の機能層を含んでい
てもよいことは勿論である。

【００４５】本発明の一体型多層分析要素は、一辺約15
mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小
片に裁断し特開昭57−63452号、特開昭54−156079号、
実開昭56−142454号、実開昭58−32350号および特開昭5
8−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納めて分
析スライドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存お
よび測定操作等の全ての観点で好ましい。

【００４６】本発明の一体型多層分析要素は、前述の諸
公報に開示の方法に従い約５μｌから約30μｌ、好まし
くは約８μｌから約15μｌの水性液体試料を多孔性展開
層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45℃の範囲
の実質的に一定の温度でインクベーションの後に、光透
過性支持体側から一体型多層分析要素内の色変化、発色
等の検出可能な変化を反射測光し比色法の原理により液
体試料中の測定対象成分を分析する。

【００４７】

【作用】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分析要素
では、多孔性展開層（以下、展開層と略す）が、緩衝剤
とノニオン性界面活性剤と親水性ポリマーおよび自己顕
色性基質としてＬ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド塩酸
塩からなるものである。上記基質は、展開層中に安定的
に分散し、溶解速度の早い非晶質状態で均一に含有され
る性質を有するものである。また、上記界面活性剤は、
展開層の展開性を大幅に向上させる作用を有するもので
ある。さらに、親水性ポリマーは、点着された試料液中
の微少量の水分を有効に保水し、アナライトである酵素
の触媒反応を効率よく促進させる作用を有する。

【００４８】

【実施例】

実施例１ ゼラチン下塗りされている厚さ180μｍポリエチレンテ
レフタレート無色透明平滑フィルムに下記の組成の水
溶液を乾燥後の厚さが12μｍになるように塗布(133cc／
ｍ²)し乾燥して吸水層を設けた。 ゼラチン 12.0ｇ 界面活性剤（下記構造） 0.12ｇ 架橋剤（下記構造） 0.12ｇ 水 87.76ｇ 界面活性剤：（オーリン社製 Ｓurfactant 10Ｇ） Ｃ₉Ｈ₁₉−Ｐｈ−Ｏ−(ＣＨ₂ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ₂−Ｏ)10
Ｈ 架 橋 剤：ビニルスルホン系架橋剤 ＣＨ₂＝ＣＨＳＯ₂ＣＨ₂ＣＯＮＨ−(ＣＨ₂)₂−ＮＨＣＯ
ＣＨ₂ＳＯ₂ＣＨ＝ＣＨ₂

【００４９】次に上記吸水層上に約30ｇ／ｍ²の割合で
水を全面に供給して湿潤させた後、トリコット編物布地
（ポリエチレンテレフタレート紡績糸製40ゲイジ）を軽
く圧力をかけてラミネートし、乾燥させて展開層を設け
た。67時間45℃の加熱処理を行った後にこの布（展開
層）に下記の組成の水溶液を170mL／ｍ²の割合でほぼ
均一に塗布し、乾燥させＬＡＰ測定用一体型多層分析要
素を作製した。 Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩 1.47ｇ ポリビニルピロリドン Ｋ90（平均分子量120万） 13.67ｇ Ｔris ^* 6.55ｇ 界面活性剤（前記化学構造） 3.33ｇ エタノール 14.1ｇ 水 131.7ｇ （希塩酸溶液でｐＨ7.4に調整） ＊トリスヒドロキシメチルアミノメタン

【００５０】比較例 Ｌ−Ｌeu−ｐＮＡ塩酸塩の代わりにＬ−Ｌeu−ｐＮＡを
用い、その他の成分を組成と同一にした組成の水溶
液を作製した。その際、Ｌ−Ｌeu−ｐＮＡは溶解しなか
った。

【００５１】実施例１と同じ展開層に、この溶液を分散
させながら170mL／ｍ²の割合でほぼ均一に塗布し、乾燥
させた比較品を作製した。 Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド 1.28ｇ ポリビニルピロリドン Ｋ90（平均分子量120万） 13.67ｇ Ｔris ^* 6.55ｇ 界面活性剤（前記化学構造） 3.33ｇ エタノール 14.1ｇ 水 131.7ｇ （希塩酸溶液でｐＨ7.4に調整） ＊トリスヒドロキシメチルアミノメタン

【００５２】測定例 市販のロイシンアミノペプチダーゼ測定用試薬キット
（「ＬＡＰ試薬・Ａ」，国際試薬(株)製）を用いてその
用法に従い２種類の血清のＬＡＰ活性を測定した。この
ＬＡＰ活性の検定された２種類の血清を実施例及び比較
例の分析要素それぞれに10μＬ点着した。37℃にて４分
間インクベーションしながら、400nmにて反射濃度を測
定した。２分〜４分の反射濃度の変化量を表１にまとめ
た。

【００５３】表１から明かな様に、本発明品では活性値
に応じて変化量が増大しているが比較品ではほとんど増
大していない。又、その同時再現性（ＣＶ）も本発明の
方が優れている。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【発明の効果】本発明のＬＡＰ活性測定用一体型多層分
析要素は発色光学濃度のバラツキが小さく、またＬＡＰ
活性変化にともなう発色光学濃度変化も大きい。本発明
の分析要素は、巾広い定量域を示し、かつ簡易な操作で
高精度の測定結果を保証し、高い分析精度を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山田 潔 埼玉県朝霞市泉水三丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ロイシンアミノペプチダーゼに感応して
   自己顕色性を示す基質、ｐＨ緩衝剤、ノニオン性界面活
   性剤および親水性ポリマーを含有する多孔性展開層、吸
   水層、水不透過性支持体がこの順に積層されている分析
   要素において、前記基質がＬ−ロイシン−ｐ−ニトロア
   ニリドの塩であることを特徴とするＬＡＰ活性測定用一
   体型多層分析要素。