JPH0740918B2 - 新規変異株及びこれを用いる醤油の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醤油中の重要な香気成分の１種であるイソアミ
ルアルコールを高生成する新規変異株及びこれを用いる
香気の優れた醤油の製造法に関する。

〔従来の技術〕

酵母によりエタノールと共に生成される高級アルコール
とそのエステルは、醤油中の重要な香気成分の一つであ
る。それら高級アルコールの中で、中心的役割をはたす
ものにイソアミルアルコールがある。これら高級アルコ
ールは、酵母の発酵過程で生成するが、その生成につい
ては、清酒酵母、ビール酵母等にて検討され、イソアミ
ルアルコールについても、アミノ酸の一つであるロイシ
ンより生成するエールリッヒ（Ehrlich）経路とグルコ
ースよりロイシンを生合成する経路の途中の中間体より
生成する生合成経路が知られている。グルコースより生
合成されるイソアミルアルコール生合成経路の律速酵素
はα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素であることが知ら
れている。そしてこのα−イソプロピルリンゴ酸合成酵
素はロイシン等の制御を受けており、その一つは、ロイ
シンによる酵素阻害である。この阻害について清酒酵
母、ビール酵母、ワイン酵母、焼酎酵母等のサッカロミ
セス．セレビシエ（Saccharomyces.cerevisiae）、サッ
カロミセス．カールスベルゲンシス（Saccharomyces.ca
rlsbergensis）においてα−ケトバレリアン酸からα−
イソプロピルリンゴ酸に変る反応に関与するα−イソプ
ロピルリンゴ酸合成酵素が蓄積したロイシンにより阻害
を受けることが知られている。そしてロイシンが蓄積し
てもロイシン生合成経路が阻害を受けない変異株を得
て、これを用いたアルコール飲料を製造する方法が知ら
れている。（特開昭62-6669号公報、Ashida.S Agr.Bio
l.C 51（８）.2061.（1987）） 一方サッカロミセス．セレビシエでは、もう一つの制御
としてロイシンとスレオニン、或いはペプトンによるα
−イソプロピルリンゴ酸合成酵素の抑制が知られてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者は、醤油香気成分のなお一層豊富な生成を目指
し、グルコースより生合成されるイソアミルアルコール
を高生成するチゴサッカロミセス属に属する酵母異変株
を取得することを目的とし検索を開始した。即ち、本発
明の目的は、チゴサッカロミセス酵母のグルコースより
生合成されるイソアミルアルコール生合成経路の律速酵
素であるα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素活性がロイ
シン等により阻害されないか、或いは阻害されないこと
に加え酵素生成が抑制を受けないことにより醤油中にイ
ソアミルアルコールを高生成するチゴサッカロミセス属
に属する酵母変異株を取得し、この変異酵母を用いて香
気の優れた醤油を得ることである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、種々のチゴサッカロミセス属に属する酵
母を対象として、これに種々の変異処理を加えることに
より、イソアミルアルコールを多量に生成する能力を有
する変異株を検索した結果、親株であるチゴサッカロミ
セスMA−１を変異処理することにより目的とするイソア
ミルアルコールを高生成する、チゴサッカロミセス属に
属する新規変異株を得ることに成功した。

即ち、本発明はチゴサッカロミセス・ルキシー属に属
し、５′,5′,5′−トリフルオロ−D,L−ロイシン耐性
を有する新規変異株であり、又本発明は該新規変異株を
醤油の諸味製造工程中に用いることを特徴とする醤油製
造法である。

以下、本発明を詳述する。

先ず、本発明の親株として使用する菌株としては、例え
ばチゴサッカロミセスMA−１は、チゴサッカロミセス・
ルキシーATCC13356を親株とし、これに通常の変異処理
を行なって得ることが出来、該チゴサッカロミセスMA−
１に変異処理を行なって本発明の変異株であるチゴサッ
カロミセスTFL−44を得ることが出来る。

次に、上記チゴサッカロミセスTFL−44株の菌学的性質
を以下に示す。

（ａ） 各培地における生育 YM寒天培地でクリーム色コロニーを形成し、栄養細
胞は主径３〜７μの球形ないし卵形で出芽により増殖す
る。YM液体培地では薄膜を形成しない。

バレイショ抽出液寒天培地で偽菌糸は形成しない。

（ｂ） 一般酵母用胞子形成培地では子のうを形成し難
いが、0.9％食塩を含むYM培地で接合子型子のうを形成
する。

（ｃ） YM寒天平面培養で射出胞子を形成せず。

（ｄ） 各生理的性質 15〜37℃でよく生育し最適温度は30℃、pH3〜７で
よく生育し最適pHは５である。

硝酸塩の同化性…なし。

塩化ナトリウム耐性…18％（W/W）以上の塩化ナト
リウム存在下でよく生育する。

ビタミン要求性…ビオチン、パントテン酸。

（ｅ） 資化性、発酵性の有無 資化性 発酵性 Ｄ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ − 麦芽糖 − − ショ糖 ＋ ＋ 乳糖 − − ラフィノース − − α−メチル−Ｄ−グルコシド − − アルブチン − − コハク酸塩 − − メリビオース − − セロビオース − − トレハロース − − エタノール − − Ｄ−マンニット ＋ ＋ （ｆ） イソアミルアルコール生成量 親株（チゴサッカロミセスMA−１）と本発明（チゴサッ
カロミセスTFL−44）を対比し、以下の試験を行なっ
た。チゴサッカロミセスMA−１とチゴサッカロミセスTF
L−44の両株を夫々窒素源としてＬ−プロリン2mMを含む
培養培地で５日間前培養し、次いでこれらをディフコ・
イーストナイトロジェンベース（アミノ酸及び硫酸アン
モニウムを含まない）0.2％（W/V）、ディフコ・バクト
・ソイトーン10％（W/V）、硫酸アンモニウム、75mM、
グルコース５％（W/V）、食塩５％（W/V）よりなる培養
培地で10日間静置培養した結果、培養培地中のイソアミ
ルアルコールの生成量は、親株であるチゴサッカロミセ
スMA−１が31.98（ppm/mg dry cell weight）であるに
対し、チゴサッカロミセスTFL−44は81.74（ppm/mg dry
cell weight）であった。

（ｇ） α−イソプロピルリンゴ酸合成酵素活性 チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356、チゴサッカ
ロミセスMA−１と本発明（チゴサッカロミセスTFL−4
4）を比較すると、チゴサッカロミセスTFL−44より得ら
れたα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素は、チゴサッカ
ロミセス・ルキシーATCC13356とチゴサッカロミセスMA
−１より得られたα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素と
異なりロイシンによる活性障害が脱感作されていた。ま
たα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素が抑制される培地
に於いて、チゴサッカロミセスTFL−44のイソプロピル
リンゴ酸合成酵素量は、チゴサッカロミセス・ルキシー
ATCC13356のα−イソプロピルリンゴ酸合成酵素量と比
べ５〜８倍程度に増加した。

以上の菌学的性質はクレガー編（N.J.W.Kreger−vanRi
j）の「ザ イースト」（「The Yeast a toxonomy Stud
y」Elsevier Science pub.）第３版により、いずれもチ
ゴサッカロミセス・ルキシーに属する菌株の有する性質
であり、各菌株間の違いは、以下に示す通りである。

チゴサッカロミセス・ルキシー（ATCC13356）と違いチ
ゴサッカロミセスMA−１とチゴサッカロミセスTFL−44
は、100mM程度以上の塩酸モノメチルアミンを含む培地
に生育でき、チゴサッカロミセスMA−１と違いチゴサッ
カロミセスTFL−44は、1mM程度以上の５′,5′,5′−ト
リフルオロ−D,L−ロイシンを含む培地に生育できる。
このことより本菌株チゴサッカロミセスTFL−44は新菌
株であると同定した。

なお、チゴサッカロミセスMA−１とチゴサッカロミセス
TFL−44は、それぞれ工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第9904号（FERM P−9904），第9905号（FE
RM P−9905）として寄託されている。

上記変異処理としては、如何なる方法でもよい。例えば
化学的方法としてＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（以下、MNNGと略称する）、エチルメタ
ンサルホネート、メチルメタンサルホネート、４−ニト
ロソキノン、亜硝酸、ブロモウラシル等の変異誘発剤を
用い、物理的方法として紫外線照射、Ｘ線照射、放射線
照射処理を行う。培地としては、酵母が利用し得る炭素
源、窒素源、無機塩類、その他酵母の生育に必要な成分
を、適宜配合した合成培地、天然培地が用いられる。な
お醤油の如く、高塩濃度の諸味への添加を意図する場合
には、該培地の食塩濃度を６−18％（W/V）程度に調整
することが望ましい。そして塩酸モノメチルアミン、或
いは５′,5′,5′−トリフルオロ−D,L−ロイシン耐性
を付与するため、前記酵母培養培地に塩酸モノメチルア
ミン、５′,5′,5′−トリフルオロ−D,L−ロイシンを
例えばそれぞれ200mM,1mM程度添加する。酵母の培養
は、振盪培養、通気培養、撹拌培養、静置培養等の好気
的、嫌気的培養等の適宜な方法が採用される。培養温度
は酵母菌体が生育し得る範囲内で可能であるが通常25−
30℃であり、培養時間は好気的培養の場合には10−50時
間、嫌気的培養の場合には120−170時間程度培養する。

このようにして固体培養の場合には生じたコロニーを分
離し、液体培養の場合には遠心分離、濾過等の通常の操
作方法に従い分離し、必要により洗浄して本変異株を得
る。

次に本変異株を用いて醤油を製造する方法について述べ
る。

まず、通常の蛋白質原料及び炭水化物原料を常法により
変性処理し、これに種麹を接種し、製麹を行って醤油麹
を得る。これに通常の仕込割合にて適当濃度の塩水を加
え、諸味を調製する。この諸味を発酵熟成させ、適宜の
時期に、ベルに調製した本菌株もしくはその培養液を適
量添加し通常の仕込管理を行って得られる熟成諸味を、
常法により圧搾、規格、火入を行い、火入醤油を得る。

この様にして香気の優れた火入醤油をえることが出来
る。

〔発明の効果〕

本発明の新規変異株は、従来のチゴサッカロミセスルキ
シーに属する菌株に比し、著しくイソアミルアルコール
の生成能が優れたものであり、本菌株を用いて醤油醸造
を行なった場合、得られた醤油はイソアミルアルコール
等の高級アルコール成分を著しく多量に含み、顕著に香
気の優れたものである。

以下実施例により本発明を具体的に示す。

〔実施例〕

実施例１ チゴサッカロミセス・ルキシーATCC13356株を、窒素源
としてＬ−プロリンを含む以下のプロリン培地50mlで （プロリン培地） ディフコイーストナイトロジエンベース 0.2％（W/V）
（アミノ酸と硫酸アンモニウムを含まない） Ｌ−プロリン 2mM NaCl（食塩） ５％（W/V） ５日静置培養した後遠心分離して、食塩５％含有100mM
リン酸バッファー（pH＝7.0）にて洗浄した。この洗浄
菌体を食塩５％、グルコース５％含有100mMリン酸バッ
ファー（pH＝7.0）に懸濁し、MNNG（Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を1mg/lになるよ
うに加えた後、30℃１時間ゆっくりと振盪しながら変異
処理を行い、その菌体を遠心分離し、プロリン培地にて
20時間、30℃で培養後、塩酸モノメチルアミン（最終濃
度200mM）を含むプロリン寒天培地に塗沫し、生育した
多数の耐性株よりチゴサッカロミセスMA−１（FERM P−
9904）を得た。次にチゴサッカロミセスMA−１を窒素源
としてＬ−プロリンを含むプロリン培地50mlで （プロリン培地） ディフコイーストナイトロジエンベース 0.2％（W/V）
（アミノ酸と硫酸アンモニウムを含まない） Ｌ−プロリン 2mM NaCl（食塩） ５％（W/V） グルコース ５％（W/V） ５日静置培養した後遠心分離し、食塩５％含有100mMリ
ン酸バッファー（pH＝7.0）にて洗浄した。この洗浄菌
体を食塩５％、グルコース５％含有100mMリン酸バッフ
ァー（pH＝7.0）に懸濁し、MNNG1mg/lになるように加え
た後、30℃１時間ゆっくりと振盪しながら変異処理を行
い、その菌体を遠心分離し、プロリン培地にて20時間、
30℃で培養後、５′−５′−５′−トリフルオロ−DL−
ロイシン（最終濃度1mM）を含むプロリン寒天培地に塗
沫し、生育した多数の耐性株よりチゴサッカロミセスTF
L−44（FERM P−9905）を得た。

実施例２ 脱脂大豆100kgを蒸煮変性したものと、小麦105kgを炒熬
割砕したものを混合し、これに種麹を接種し、42時間の
通風製麹を行い醤油麹を得た。

これに食塩90kgを含む15℃に冷却した塩水360lを加え60
0l密閉仕込タンクに仕込んだ。その際、ペディオコッカ
ス．ハロフィルスIAM1693を生菌数が諸味1g当り１×10⁵
個となるように添加した。添加後ときどき撹拌し、仕込
後14日目より加温し、仕込後60日目に、別に仕込後20日
目の醤油諸味液汁を食塩15％に調製した後、無菌濾過し
て得た培地（pH＝5.2）に、実施例１で得たチゴサッカ
ロミセスTFL−44（FERM P−9905）を接種し、30℃で４
日間好気培養した培養液を、生菌数が諸味1g当り１×10
⁵個となるように添加した。その後６カ月通常の仕込管
理を行って熟成諸味を得た。これを常法により圧搾した
後、NaC117.0％,T.N1.57％に調製し、80℃で４時間の火
入を行い、火入醤油（本製品）を得た。

一方上記チゴサッカロミセスTFL−44の代わりに、チゴ
サッカロミセスMA−１を添加する以外は、上記と全く同
様にして火入醤油（対照製品）を得た。

上記火入醤油の一般分析を醤油技術会編「しょうゆ基準
分析法」に従って行い、併せてイソアミルアルコール量
の測定結果を表１に示す。また上記火入醤油について、
26名のパネルによりトライアングル法で官能検査を実施
したところ、表２に示す結果を得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】チゴサッカロミセス・ルキシーに属し、
   ５′,5′,5′−トリフルオロ−D,L−ロイシン耐性を有
   する新規変異株。
2. 【請求項２】請求項（１）記載の新規変異株を醤油諸味
   製造工程中に用いることを特徴とする醤油の製造法。