JPH0740949B2 - アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 - Google Patents
アスコルビン酸−２−リン酸の製造法Info
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- JPH0740949B2 JPH0740949B2 JP31974687A JP31974687A JPH0740949B2 JP H0740949 B2 JPH0740949 B2 JP H0740949B2 JP 31974687 A JP31974687 A JP 31974687A JP 31974687 A JP31974687 A JP 31974687A JP H0740949 B2 JPH0740949 B2 JP H0740949B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 アスコルビン酸−２−リン酸（以下AsA2Pと略記する）
は、アスコルビン酸（AsA）の安定化誘導体として有用
であり、化粧品素材、医薬品原料および食品添加物とし
て大きな需要がある。したがって、本発明は化学品、薬
品、食品の工業分野に属する。
は、アスコルビン酸（AsA）の安定化誘導体として有用
であり、化粧品素材、医薬品原料および食品添加物とし
て大きな需要がある。したがって、本発明は化学品、薬
品、食品の工業分野に属する。
従来の技術 従来、AsA2Pは化学的な合成法〔特公昭45−30328号公
報、特公昭48−15605号公報、特公昭52−18191号公報、
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー，47,3
453,（1982）記載〕により製造されており、微生物を用
いる製造法は知られていない。
報、特公昭48−15605号公報、特公昭52−18191号公報、
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー，47,3
453,（1982）記載〕により製造されており、微生物を用
いる製造法は知られていない。
発明が解決しようとする問題点 化学合成法によるAsA2Pの製造ではアスコルビン酸−２
−リン酸以外にアスコルビン酸−３−リン酸やアスコル
ビン酸−５−リン酸などの異性体が副生する。また化学
合成法は精製方法が煩雑で高価につくのでより効率的な
製造法の確立が望まれている。
−リン酸以外にアスコルビン酸−３−リン酸やアスコル
ビン酸−５−リン酸などの異性体が副生する。また化学
合成法は精製方法が煩雑で高価につくのでより効率的な
製造法の確立が望まれている。
問題点を解決するための手段 本発明者は、AsA2Pをより安価に工業的に製造すること
を目的として研究を行った。その結果、種々の微生物が
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPからA
sA2Pを生成する活性を有することを見いだし、本発明を
完成するに至った。
を目的として研究を行った。その結果、種々の微生物が
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPからA
sA2Pを生成する活性を有することを見いだし、本発明を
完成するに至った。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸
とATPとからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する活
性を有する微生物の菌体、培養液、培養液上清またはそ
れらの処理物の存在下水性媒体中でアスコルビン酸また
はアラボアスコルビン酸とATPを反応させてアスコルビ
ン酸−２−リン酸を生成させ、反応液から生成したアス
コルビン酸−２−リン酸を採取することを特徴とするア
スコルビン酸−２−リン酸の製造法を提供する。
とATPとからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する活
性を有する微生物の菌体、培養液、培養液上清またはそ
れらの処理物の存在下水性媒体中でアスコルビン酸また
はアラボアスコルビン酸とATPを反応させてアスコルビ
ン酸−２−リン酸を生成させ、反応液から生成したアス
コルビン酸−２−リン酸を採取することを特徴とするア
スコルビン酸−２−リン酸の製造法を提供する。
本発明に用いる微生物としては、エアロモナス属、クレ
ブシエラ属、フラボバクテリウム属、シュードモナス
属、バチルス属、またはベネッケア属に属し、アスコル
ビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPからAsA2Pを生
成する能力を有する微生物があげられる。具体的に好適
な菌株は下記のとおりである。
ブシエラ属、フラボバクテリウム属、シュードモナス
属、バチルス属、またはベネッケア属に属し、アスコル
ビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPからAsA2Pを生
成する能力を有する微生物があげられる。具体的に好適
な菌株は下記のとおりである。
Aeromonas caviae ATCC 13137 Bacillus subtilis ATCC 19221 Beneckea hyperoptica ATCC 15803 Flavobacterium devorans ATCC 10829 Klebsiella oxytoca ATCC 8724 Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417 Pseudomonas chlororaphis ATCC 9446 これらの微生物の培養には、通常の細菌の培養に用いら
れる培地、例えばポリペプトン10g/、肉エキス7g/
、酵母エキス5g/、および食塩3g/を含みpH7.2に
調製した培地（KM102培地）など、これらの微生物が生
育でき、かつAsA2P生成活性を阻害しないものであれ
ば、炭素源、窒素源、その他の栄養素を含む天然培地、
半合成培地、合成培地などいかなる培地でも使用でき
る。
れる培地、例えばポリペプトン10g/、肉エキス7g/
、酵母エキス5g/、および食塩3g/を含みpH7.2に
調製した培地（KM102培地）など、これらの微生物が生
育でき、かつAsA2P生成活性を阻害しないものであれ
ば、炭素源、窒素源、その他の栄養素を含む天然培地、
半合成培地、合成培地などいかなる培地でも使用でき
る。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトースなどの各種の炭水化物、マンニトー
ル、ソルビトールなどの糖アルコールやグリセロールな
どのアルコール類、さらにピルビン酸、乳酸、クエン酸
などの各種の有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジ
ンなどの各種のアミノ酸、さらには澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサバ、バガス、コーン・ステ
ィープ・リカーなどの天然有機栄養源も使用できる。
ース、マルトースなどの各種の炭水化物、マンニトー
ル、ソルビトールなどの糖アルコールやグリセロールな
どのアルコール類、さらにピルビン酸、乳酸、クエン酸
などの各種の有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リジ
ンなどの各種のアミノ酸、さらには澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜、白糠、キャッサバ、バガス、コーン・ステ
ィープ・リカーなどの天然有機栄養源も使用できる。
窒素源としては、尿素、アンモニア、あるいは塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミ
ノ酸、あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティー
プ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物、さなぎ加水
分解物などの含窒素有機物などの種々の物が使用可能で
ある。
モニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩
類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミ
ノ酸、あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティー
プ・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物、さなぎ加水
分解物などの含窒素有機物などの種々の物が使用可能で
ある。
さらに、無機物としては、燐酸二水素カリウム、燐酸−
水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガン、モリ
ブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを必要に応じて添加す
る。微生物の生育に必要なビタミン、アミノ酸、核酸そ
の他のものは必要に応じて添加するが、前記したような
他の培地成分に伴って培地に供給されれば特に加えなく
ても良い。
水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、
塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガン、モリ
ブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを必要に応じて添加す
る。微生物の生育に必要なビタミン、アミノ酸、核酸そ
の他のものは必要に応じて添加するが、前記したような
他の培地成分に伴って培地に供給されれば特に加えなく
ても良い。
培養は、振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下で
行うことが望ましい。培養は20〜40℃好ましくは25〜35
℃、pH5〜10好ましくは6.5〜7.5で通常10〜100時間行
う。
行うことが望ましい。培養は20〜40℃好ましくは25〜35
℃、pH5〜10好ましくは6.5〜7.5で通常10〜100時間行
う。
アスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPとを
反応させてAsA2Pを生成させる反応は、微生物の培養中
培地にアスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とAT
Pを存在させる方法（方法１）、または微生物の培養
液、菌体、培養液上清またはそれらの処理物とアスコル
ビン酸またはアラボアスコルビン酸およびATPを含有す
る液を混合する方法（方法２）により行われる。
反応させてAsA2Pを生成させる反応は、微生物の培養中
培地にアスコルビン酸またはアラボアスコルビン酸とAT
Pを存在させる方法（方法１）、または微生物の培養
液、菌体、培養液上清またはそれらの処理物とアスコル
ビン酸またはアラボアスコルビン酸およびATPを含有す
る液を混合する方法（方法２）により行われる。
反応液中には必要に応じて界面活性剤、有機溶剤などを
存在させることによりAsA2Pの生成率を向上させること
ができる。
存在させることによりAsA2Pの生成率を向上させること
ができる。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製）、
セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなどのカチ
オン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸など
のアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタ
ン・モノステアレート（例えばノニオンST221、日本油
脂社製）などの両性界面活性剤など、アスコルビン酸ま
たはアラボアスコルビン酸とATPからAsA2Pを生成する反
応を促進するものであればいずれでも使用でき、これら
は通常１〜50mg/ml、好ましくは１〜20mg/mlの濃度で用
いられる。
アミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製）、
セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドなどのカチ
オン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸など
のアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタ
ン・モノステアレート（例えばノニオンST221、日本油
脂社製）などの両性界面活性剤など、アスコルビン酸ま
たはアラボアスコルビン酸とATPからAsA2Pを生成する反
応を促進するものであればいずれでも使用でき、これら
は通常１〜50mg/ml、好ましくは１〜20mg/mlの濃度で用
いられる。
有機溶剤としてはトルエン、キシレン、アセトン、脂肪
族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが0.1〜50μ
/ml、好ましくは１〜20μ/mlで用いられる。
族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが0.1〜50μ
/ml、好ましくは１〜20μ/mlで用いられる。
アスコルビン酸、アラボアスコルビン酸およびATPとし
ては、化学的な純品でも粗精製物でも良く、またアスコ
ルビン酸、アラボアスコルビン酸もしくはATPを含みAsA
2Pの生成を妨げないものであればいずれでも使用でき
る。水性媒体中アスコルビン酸およびアラボアスコルビ
ン酸は１〜500mM、ATPは１〜1,000mMの濃度範囲で用い
る。
ては、化学的な純品でも粗精製物でも良く、またアスコ
ルビン酸、アラボアスコルビン酸もしくはATPを含みAsA
2Pの生成を妨げないものであればいずれでも使用でき
る。水性媒体中アスコルビン酸およびアラボアスコルビ
ン酸は１〜500mM、ATPは１〜1,000mMの濃度範囲で用い
る。
方法２における反応は、温度20〜70℃で、アンモニア、
NaOH、KOHなどによりpHを３〜11に保ち、１〜48時間行
う。
NaOH、KOHなどによりpHを３〜11に保ち、１〜48時間行
う。
培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、乾燥物、界
面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理
物などがあげられる。また、菌体処理物としては、菌体
の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤処理物、
溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽出酵
素標品などがあげられる。
面活性剤および／または有機溶剤添加物、溶菌酵素処理
物などがあげられる。また、菌体処理物としては、菌体
の乾燥物、界面活性剤および／または有機溶剤処理物、
溶菌酵素処理物、固定化菌体あるいは菌体からの抽出酵
素標品などがあげられる。
分離菌体を用いる場合は、湿菌体重量にて１〜400mg/ml
の範囲が望ましい。AsA2Pは、ヌクレオシル10C18カラム
〔マシェレー−ナーゲル（Masherey−Nagel）社製〕を
用いる高速液体クロマトグラフィーを用いて、254nmの
吸収を測定することにより、合成法により製造された純
品を標準品として定量することができる。
の範囲が望ましい。AsA2Pは、ヌクレオシル10C18カラム
〔マシェレー−ナーゲル（Masherey−Nagel）社製〕を
用いる高速液体クロマトグラフィーを用いて、254nmの
吸収を測定することにより、合成法により製造された純
品を標準品として定量することができる。
培養液および水性媒体反応液からのAsA2Pの採取は、菌
体除去、除蛋白後、上清液を中和し、イオン交換樹脂、
セファデックスなどを用いるカラムクロマトグラフィー
や高速液体クロマトグラフィーにより行う。
体除去、除蛋白後、上清液を中和し、イオン交換樹脂、
セファデックスなどを用いるカラムクロマトグラフィー
や高速液体クロマトグラフィーにより行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1. Flavobacterium devorans ATCC 10829を、KM102培地30m
lを含む300ml三角フラスコに植菌し、30℃にて20時間種
培養した。ついでKM102培地を300ml含む２三角フラス
コに種培養液を12ml植菌し、30℃にて20時間培養した。
得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し、湿
菌体5.4gを得て、−20℃にて凍結保存した。200mlのビ
ーカーに、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）を含
む、アスコルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4 10mM、KH2PO
4 4mMの組成の反応液50mlを入れ、マグネチック・スタ
ーラーにて100rpmで撹拌しつつ、pHを苛性ソーダにて6.
5付近に、また温度を30℃に保って24時間反応させた。
反応終了時に反応液上清中には1.16mg/mlのAsA2Pに相当
する化合物が生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸
−５−リン酸、アスコルビン酸−３−リン酸などの副生
は認められなかった。
lを含む300ml三角フラスコに植菌し、30℃にて20時間種
培養した。ついでKM102培地を300ml含む２三角フラス
コに種培養液を12ml植菌し、30℃にて20時間培養した。
得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し、湿
菌体5.4gを得て、−20℃にて凍結保存した。200mlのビ
ーカーに、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体重量）を含
む、アスコルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4 10mM、KH2PO
4 4mMの組成の反応液50mlを入れ、マグネチック・スタ
ーラーにて100rpmで撹拌しつつ、pHを苛性ソーダにて6.
5付近に、また温度を30℃に保って24時間反応させた。
反応終了時に反応液上清中には1.16mg/mlのAsA2Pに相当
する化合物が生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸
−５−リン酸、アスコルビン酸−３−リン酸などの副生
は認められなかった。
得られた反応液50mlを、塩酸にてpH3.0に調整し、遠心
分離により除蛋白したのち、上清液を苛性ソーダで中和
してレジン量300mlのDowex1×８（Cl−型）カラムに通
塔した。0.2〜0.6MのNaHCO3濃度勾配溶出法にて溶出し
たAsA2Pを含む画分163mlを集め、塩酸にて中和後濃縮し
た。同画分163ml中にはAsA2P相当物42mgが含まれてい
た。500mlのセファデックス・カラムに充填したセファ
デックスＧ−10にてこの濃縮物を分画し、AsA2P相当物
を含む63mlの画分を得た。本画分中には30mgのAsA2P相
当物が含まれていた。この画分の濃縮物は高速液体クロ
マトグラムにて単一のピークを示した。以下、化学構造
の解析には本標品（RC1）を用いた。
分離により除蛋白したのち、上清液を苛性ソーダで中和
してレジン量300mlのDowex1×８（Cl−型）カラムに通
塔した。0.2〜0.6MのNaHCO3濃度勾配溶出法にて溶出し
たAsA2Pを含む画分163mlを集め、塩酸にて中和後濃縮し
た。同画分163ml中にはAsA2P相当物42mgが含まれてい
た。500mlのセファデックス・カラムに充填したセファ
デックスＧ−10にてこの濃縮物を分画し、AsA2P相当物
を含む63mlの画分を得た。本画分中には30mgのAsA2P相
当物が含まれていた。この画分の濃縮物は高速液体クロ
マトグラムにて単一のピークを示した。以下、化学構造
の解析には本標品（RC1）を用いた。
（１） 紫外部吸収曲線：第１図（Ａ）に標準品の、ま
た（Ｂ）にRC1の紫外部吸収曲線を示す。RC1は240nmに
吸収極大を持ち、標準品と全く同一のパターンを示し
た。
た（Ｂ）にRC1の紫外部吸収曲線を示す。RC1は240nmに
吸収極大を持ち、標準品と全く同一のパターンを示し
た。
（２） アルカリフォスファターゼによる分解:0.5Mグ
リシン緩衝液（pH10.5）20μ,0.1M ZnSO4 1μ,0.1M
MnSO41μ，アルカリフォスファターゼ〔シグマ社
製〕（20mg/ml）２μ，脱イオン水36μにRC1の水溶
液（25mg/ml）を15μ加え、37℃、30分間保ち、フォ
スファターゼによるRC1分解の程度を調べた。また、標
準品も同様にして反応を行った。反応前後のRC1および
標準品の反応上清を高速液体クロマトグラフィーにて解
析した結果を第１表に示す。
リシン緩衝液（pH10.5）20μ,0.1M ZnSO4 1μ,0.1M
MnSO41μ，アルカリフォスファターゼ〔シグマ社
製〕（20mg/ml）２μ，脱イオン水36μにRC1の水溶
液（25mg/ml）を15μ加え、37℃、30分間保ち、フォ
スファターゼによるRC1分解の程度を調べた。また、標
準品も同様にして反応を行った。反応前後のRC1および
標準品の反応上清を高速液体クロマトグラフィーにて解
析した結果を第１表に示す。
この結果は、RC1がアスコルビン酸のリン酸化された化
合物であることを示している。
合物であることを示している。
（３） プロトン・NMRによる解析：第２図（Ａ）は標
準品の、（Ｂ）はRC1の、また（Ｃ）は標準品とRC1を混
合した場合の核磁気共鳴吸収パターンを示す。両物質は
同一であることが明らかとなった。
準品の、（Ｂ）はRC1の、また（Ｃ）は標準品とRC1を混
合した場合の核磁気共鳴吸収パターンを示す。両物質は
同一であることが明らかとなった。
（４） 13C・NMRによる解析：第３図（Ａ）に標準品、
（Ｂ）にRC1の13C・NMRパターンを示す。標準品もRC1も
リン酸基が２の位置の炭素原子に結合していることが明
らかである。
（Ｂ）にRC1の13C・NMRパターンを示す。標準品もRC1も
リン酸基が２の位置の炭素原子に結合していることが明
らかである。
以上の解析結果より、反応生成物はASA2Pであると同定
された。
された。
実施例2. 第２表に示す各菌株を、KM102培地30mlを含む300ml三角
フラスコに植菌し、30℃にて20時間種培養した。ついで
KM102培地を300ml含む２三角フラスコに種培養液を12
ml植菌し、30℃にて20時間培養した。得られた培養液を
10,000×ｇにて10分間遠心分離し、−20℃にて凍結保存
した。200mlのビーカーに、凍結保存菌体50mg/ml、アス
コルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4 10mM、KH2PO4 40mMの
組成の反応液50mlを入れ、マグネチック・スターラーに
て100rpmで攪拌しつつ、pHを苛性ソーダにて6.5付近
に、温度を30℃に24時間保った。反応終了時に反応液上
清中に生成したAsA2P量を高速液体クロマトグラフにて
定量した。結果を第２表に示す。
フラスコに植菌し、30℃にて20時間種培養した。ついで
KM102培地を300ml含む２三角フラスコに種培養液を12
ml植菌し、30℃にて20時間培養した。得られた培養液を
10,000×ｇにて10分間遠心分離し、−20℃にて凍結保存
した。200mlのビーカーに、凍結保存菌体50mg/ml、アス
コルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4 10mM、KH2PO4 40mMの
組成の反応液50mlを入れ、マグネチック・スターラーに
て100rpmで攪拌しつつ、pHを苛性ソーダにて6.5付近
に、温度を30℃に24時間保った。反応終了時に反応液上
清中に生成したAsA2P量を高速液体クロマトグラフにて
定量した。結果を第２表に示す。
実施例3. Pseudomonas azotocolligans ATCC 12417を、KM102培地
30mlを含む300ml三角フラスコに植菌し、30℃にて20時
間種培養した。同じくKM102培地を300ml含む２三角フ
ラスコに種培養液を12ml植菌し、30℃にて20時間培養し
た。得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し
て菌体を得た。本菌体をそのまま、または風乾、凍結
（−20℃）後融解、さらには懸濁液に界面活性剤添加、
有機溶媒添加、界面活性剤および有機溶媒添加、超音波
破砕などの各種処理を行ったのち、AsA2P生成活性を測
定した。活性の測定は、200mlのビーカーを用い、凍結
保存菌体50mg（湿菌体重量）/ml（または同量の菌体を
処理したもの）、アスコルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4
10mM、KH2PO4 40mMの組成の反応液50ml、マグネチック
・スターラーにて100rpmで攪拌しつつ、pHを苛性ソーダ
にて6.5付近に、温度を30℃に24時間保って行った。反
応終了時に反応液上清中に存在するAsA2P量を高速液体
クロマトグラフィーにて定量した結果を第３表に示す。
30mlを含む300ml三角フラスコに植菌し、30℃にて20時
間種培養した。同じくKM102培地を300ml含む２三角フ
ラスコに種培養液を12ml植菌し、30℃にて20時間培養し
た。得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠心分離し
て菌体を得た。本菌体をそのまま、または風乾、凍結
（−20℃）後融解、さらには懸濁液に界面活性剤添加、
有機溶媒添加、界面活性剤および有機溶媒添加、超音波
破砕などの各種処理を行ったのち、AsA2P生成活性を測
定した。活性の測定は、200mlのビーカーを用い、凍結
保存菌体50mg（湿菌体重量）/ml（または同量の菌体を
処理したもの）、アスコルビン酸30mM、ATP40mM、MgSO4
10mM、KH2PO4 40mMの組成の反応液50ml、マグネチック
・スターラーにて100rpmで攪拌しつつ、pHを苛性ソーダ
にて6.5付近に、温度を30℃に24時間保って行った。反
応終了時に反応液上清中に存在するAsA2P量を高速液体
クロマトグラフィーにて定量した結果を第３表に示す。
実施例4. Flavobacterium devorans ATCC 10829を、実施例１と同
様に培養し、得られた遠心分離菌体をpH7.0のリン酸緩
衝液に湿菌体量にて200mg/mlとなるように懸濁し、氷冷
条件下で超音波破砕機（トミー精工社製、UR−200P型）
にて断続的に計10分間細胞を破砕した。培養液をその
まま、破砕液をそのまま、または12,000×ｇで15分
間遠心分離した上清液を用いて、実施例３と同様に反応
を行った結果、では0.102mg/ml、で0.175mg/ml、
で0.168mg/mlのAsA2Pが生成蓄積した。
様に培養し、得られた遠心分離菌体をpH7.0のリン酸緩
衝液に湿菌体量にて200mg/mlとなるように懸濁し、氷冷
条件下で超音波破砕機（トミー精工社製、UR−200P型）
にて断続的に計10分間細胞を破砕した。培養液をその
まま、破砕液をそのまま、または12,000×ｇで15分
間遠心分離した上清液を用いて、実施例３と同様に反応
を行った結果、では0.102mg/ml、で0.175mg/ml、
で0.168mg/mlのAsA2Pが生成蓄積した。
実施例5. Flavobacterium devorans ATCC 10829を、実施例１と同
様に培養し、得られた培養液にアスコルビン酸30mM、AT
P40mM、MgSO4 10mM、KH2PO4 40mMを添加し、マグネティ
ック・スターラーにて100rpmで攪拌しつつ、かつpHを苛
性ソーダにて6.5に、また温度を30℃に保ちつつ20時間
反応を行った。反応終了時に反応液上清中にはAsA2Pが
0.131mg/ml生成蓄積していた。
様に培養し、得られた培養液にアスコルビン酸30mM、AT
P40mM、MgSO4 10mM、KH2PO4 40mMを添加し、マグネティ
ック・スターラーにて100rpmで攪拌しつつ、かつpHを苛
性ソーダにて6.5に、また温度を30℃に保ちつつ20時間
反応を行った。反応終了時に反応液上清中にはAsA2Pが
0.131mg/ml生成蓄積していた。
実施例6. Flavobacterium devorans ATCC 10829を実施例１と同様
に培養した。得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠
心分離し、湿菌体5.4gを得て、−20℃にて凍結保存し
た。200mlのビーカーに、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体
重量）を含む、アラボアスコルビン酸30mM、ATP40mM、M
gSO4 10mM、KH2PO4 40mMの組成の反応液50mlを入れ、マ
グネチック・スターラーにて100rpmで撹拌しつつ、pHを
苛性ソーダにて6.5付近に、また温度を30℃に保って24
時間反応させた。反応終了時に反応液上清中にはAsA2P
が0.87mg/ml生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸
−５−リン酸、アスコルビン酸−３−リン酸などの副生
は認められなかった。
に培養した。得られた培養液を10,000×ｇにて10分間遠
心分離し、湿菌体5.4gを得て、−20℃にて凍結保存し
た。200mlのビーカーに、凍結保存菌体50mg/ml（湿菌体
重量）を含む、アラボアスコルビン酸30mM、ATP40mM、M
gSO4 10mM、KH2PO4 40mMの組成の反応液50mlを入れ、マ
グネチック・スターラーにて100rpmで撹拌しつつ、pHを
苛性ソーダにて6.5付近に、また温度を30℃に保って24
時間反応させた。反応終了時に反応液上清中にはAsA2P
が0.87mg/ml生成蓄積していた。なお、アスコルビン酸
−５−リン酸、アスコルビン酸−３−リン酸などの副生
は認められなかった。
発明の効果 本発明によれば、微生物の培養により、または微生物の
菌体、上清、菌体処理物を酵素源として用いて、アスコ
ルビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPとからAsA2P
を製造する方法を提供する。
菌体、上清、菌体処理物を酵素源として用いて、アスコ
ルビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPとからAsA2P
を製造する方法を提供する。
第１図は、AsA2Pの紫外部吸収曲線を示す。 Ａは標準品、Ｂは本発明実施例１で得られたAsA2P（RC
1）の場合を示す。 第２図は、AsA2PのプロトンNMR測定結果を示す。 Ａは標準品、Ｂは本発明実施例１で得られたAsA2P（RC
1）、Ｃは両者の混合物の場合を示す。 第３図は、AsA2Pの13C・NMRの測定結果を示す。 Ａは標準品、Ｂは本発明実施例１で得られたAsA2P（RC
1）の場合を示す。
1）の場合を示す。 第２図は、AsA2PのプロトンNMR測定結果を示す。 Ａは標準品、Ｂは本発明実施例１で得られたAsA2P（RC
1）、Ｃは両者の混合物の場合を示す。 第３図は、AsA2Pの13C・NMRの測定結果を示す。 Ａは標準品、Ｂは本発明実施例１で得られたAsA2P（RC
1）の場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:22 1:38）
Claims (1)
- 【請求項１】アスコルビン酸またはアラボアスコルビン
酸とATPとからアスコルビン酸−２−リン酸を生成する
活性を有するエアロモナス属、クレブシエラ属、フラボ
バクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属または
ベネッケア属に属する微生物の菌体、培養液、培養液上
清またはそれらの処理物の存在下水性媒体中でアスコル
ビン酸またはアラボアスコルビン酸とATPを反応させて
アスコルビン酸−２−リン酸を生成させ、反応液から生
成したアスコルビン酸−２−リン酸を採取することを特
徴とするアスコルビン酸−２−リン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31974687A JPH0740949B2 (ja) | 1986-12-18 | 1987-12-17 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-302409 | 1986-12-18 | ||
| JP30240986 | 1986-12-18 | ||
| JP31974687A JPH0740949B2 (ja) | 1986-12-18 | 1987-12-17 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63273489A JPS63273489A (ja) | 1988-11-10 |
| JPH0740949B2 true JPH0740949B2 (ja) | 1995-05-10 |
Family
ID=26563100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31974687A Expired - Lifetime JPH0740949B2 (ja) | 1986-12-18 | 1987-12-17 | アスコルビン酸−２−リン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0740949B2 (ja) |
-
1987
- 1987-12-17 JP JP31974687A patent/JPH0740949B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63273489A (ja) | 1988-11-10 |
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