JPH0740960B2

JPH0740960B2 - 核酸検出用キット

Info

Publication number: JPH0740960B2
Application number: JP60005610A
Authority: JP
Inventors: ポール・チアン
Original assignee: アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル; アンステイテユ・パストウール
Priority date: 1984-01-16
Filing date: 1985-01-16
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: ES539560A0; US4963477A; ES8605862A1; DE3474305D1; ATE37551T1; EP0158758B1; FR2558172A1; JPH07246100A; FR2558172B1; JPS60231693A; CA1258623A; EP0158758A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、細胞又はウイルスのDNA又はRNA配列を検出し
てその特徴を明らかにするための必要品一式即ちキツト
に係る。このキツトは所望の特定核酸と相同の修飾され
た核酸配列と相同である被修飾核酸を含むプローブと、
該プローブ自体に対する特異性を有し該プローブと所望
の特定核酸配列とハイブリツド形成処理後に該プローブ
を検出し得る抗体とからなる。

遺伝子又は遺伝子断片の如き特異的核酸列をこのような
配列を含み得る組成物中で検出するための標識されたプ
ローブは既に知られている。この種のプローブは所望の
隠酸配列又は遺伝子とハイブリツドを形成し得る相補的
核酸からなるDNA配列を含む。有利にはマーカーをウロ
ーブに担持する修飾基で構成し、この修飾基（又はこの
ようにして修飾されたDNA）が特異的抗体によつて認識
され得るようにする。例えば、プローブをＮ−アセトキ
シ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（以後AAFとい
う）で修飾する。このようなプローブを以後「DNA−AAF
プローブ」と称する。この種のプローブは仏国特許出願
第8124131号に記載されており、その塩基の少なくとも
１つに共有結合で固定されたＮ−２−アセチルアミノフ
ルオレン基を少なくとも１つ含んでいる。このプローブ
はＮ−２−（グアノシン−８−イル）−アスチルアミノ
フルオレン又はアセチルアミノフルオレン残基をもつプ
ローブ自体に対して予め形成しておいた抗体により認識
できる。このような抗体を以後「抗AAF抗体」と称す
る。

所与の組成物中に任意に含まれ得る核酸の配列又は所定
断片を検出するための前記仏国特許出願に記載の方法
は、前記組成物と適切な相補的配列を含むDNA−AAFプロ
ーブとを該プローブと所望の核酸配列又は遺伝子配列と
の間にハイブリダイゼーシヨンが生起するような条件下
で接触させ、次いで前記核酸配列又は遺伝子配列を顕現
せしめることからなる。

また、AAFのヨウ素含有誘導体即ち７−ヨード−Ｎ−ア
セトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン（以後AA
IFと称する）をDNAに固定して固定の結果得られる分子
モデルを調べる試みも行なわれた（フックス（Fuchs）
他、バイオケミストリィ（Bicchemistry）第15巻、1976
年、p.3347〜3351）。しかしながらこの技術を適切な抗
体によつて認識され得る修飾されたDNAプローブの製造
に転用することは現在に到るまで想到され得なかつた。
実際、Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−アセチルア
ミノフルオレンのヨウ素含有誘導体は、少なくとも本発
明者等の知る限りにおいて該誘導体の形成が可能な条件
下では不溶性であるため、ウサギの如き実験動物の免疫
化によつてこの分子に対する抗体を産生することは想到
され得なかつた。更に、ヨウ素原子は分子レベルでの大
きさが大きいことから、所望のハイブリツド形成能力を
低下させるおそれがあるとして、この種の基をプローブ
の標識に使用するのは不可能ではないかとも考えられて
いた。

これら種々の確認事項は当業界でAAIFを前述タイプの検
出プローブを製造するためのマーカーとして注目せしめ
るような性質のものではなかつた。この種のマーカーに
対して抱き得る先入観がなかつたとしても、これを容易
に認識せしめることのできるような方法は未だ発見され
ていなかつた。しかるに本発明は、AAF又はDNA−AAFに
対して予め形成した抗体が同一DNAをAAIFで修飾したも
のも認識し得るという発見のみならず、AAF以外の抗体
によるこのDNA−AAIFの検出の感度がこれらの抗体によ
るDNA−AAF検出の感度より約10倍高いという発見に基礎
をおく。更に注目すべきことは、「大きい分子」をDNA
に固定しても予備変性後のこれらDNAが別のDNAの相補的
配列と共にハイブリツドを形成する能力には何の変化も
ないことである。抗AAF抗体による標識DNA検出感度はマ
ーカーがこの抗体と直接相同するAAFからなる場合より
もAAIFからなる場合の方が大きいが、このことは濃度が
極めて低い状態、さらには高希釈度状態をも考慮に入れ
ると極めて重要な意味を持つものである。実際、試料中
に検出すべき特定核酸配列はこの検査すべき試料中に極
微量しか存在しないことが多く且つ検出自体は通常高希
釈度状態で行なわれるため、通常は前述の如き状態で操
作せざるを得ない。例えば、所望の特定DNA配列が3000
のオーダーの塩基対を含み且つこの配列が３×10^-9のオ
ーダーの塩基対をもつハプロイド細胞の全遺伝子に属す
る場合には検査すべき生物試料中に含まれるDNAでの所
望特定配列の相対濃度は10^-6のオーダーになる。このよ
うな極めて低い濃度に加えて、特に検査される全DNAの
予備分別テストでは所望配列の高希釈効果の問題もあ
る。それはこの分別処理が、使用するDNAの種々の分子
種を例えばポリアクリルアミドアガロースゲル中で夫々
の分子量に応じて差動的に移動させることにより分別す
る電気泳動タイプ又はこれと類似の操作からなる場合で
ある。このようにして分別し得る生物試料の量が必然的
に限定されることを考えれば10倍の検出感度は極めて重
要な意味をもつことになる。実際、AAFで標識したプロ
ーブが10ピコグラムのオーダーの特定配列量を検出する
のに対し、同じプローブをAAIFで標識した場合には１ピ
コグラムのオーダーの量が検出される。

これら種々の好ましい性質を有しているためAAIFは前述
の如き核酸プローブの極めて優れたマーカーを構成す
る。

本発明はこのようにして形成される全てのプローブに係
り、より特定的にはベクター特に遺伝子工学分野で従来
の技術によるクローニングの実現を可能にしてきたプラ
スミド又はフアージの核酸の全体又は一部分に挿入され
た所望の特異的配列の相補的特定核酸配列を含むクロー
ン化された全てのプローブに係る。

特にクローニングに使用されてきたベクターの核酸は前
記所定核酸配列に対して非相同であつた。換言すれば、
前記所定核酸配列とは異なる起源、即ち異なる微生物か
ら得られる核酸である。

本発明はまた、所定生物試料、より一般的にはインビト
ロ（in vitro）で形成される全ての標本、例えば適当な
デオキシリボヌクレオチドと逆転写酵素との存在下でRN
Aの逆転写により得られるcDNAの所定ヌクレオチド配列
を系統的に検出するために使用されるキツトにも係る。

所定核酸の配列又は断片を含み得る組成物中でこれら配
列又は断片を検出し且つその特徴を明らかにするための
本発明のキツトは、 −所望核酸の相補的配列を含み、その塩基の少なくとも
１つと共有結合したAAIF基を少なくとも一つ有するプロ
ーブと −抗AAF抗体とからなる。

本発明のキットにおいては、プローブと抗体は異なる容
器中に収容される。

勿論本発明のキツトはその使用に必要な他の全ての要
素、特に緩衝溶液を調製するための試薬、必要に応じ細
胞媒質から検査すべきDNAを抽出するための試薬、そし
て前述の抗AAF抗体が該抗体を直接視覚化せしめるべく
修飾されていない場合にはこれら抗AAF抗体と反応し得
且つそれ自体容易に視覚化され得るマーカーをもつ他の
異なる抗体又はポリペプチドをも含み得る。前記視覚化
は任意の方法で実施し得るが、好ましくは前記第２抗体
又は対応ポリペプチドを螢光分子又は酵素で修飾する。
この酵素は次の如き基質、即ちそれが酵素で修飾される
場合には１種以上の所定螢光放射線の該基質による吸光
度の比色又は分光測光によつて修飾が検出され得るよう
な基質と対応するものの中から選択するのが好ましい。

本発明の方法の特徴は核酸の配列又は所定断片を含むと
思われる組成物に、所望の核酸配列又は遺伝子との間で
ハイブリツドを形成し得る相補的核酸を含むと共にその
塩基の少なくとも１つに共有結合したAAIF基を少なくと
も１つ有するプローブをハイブリツド形成が生起するよ
うな条件下で接触させ、必要に応じ非ハイブリツド化プ
ローブを分離した後でハイブリツド化したプローブを抗
AAF抗体との接触により顕現させることにある。

本発明のプローブは細胞もしくはウイルスのDNA或いはR
NAの特定断片又はcDAの特定断片を含み得る。

該プローブはまた、特に本発明の方法及びキツトを使用
する場合には、より大きなDNA断片、例えば微生物特に
バクテリア又はウイルスのゲノムの断片或いは完全体を
AAIFで標識したもので構成し得る。従つてこれ等のプロ
ーブは前記微生物をこれらを含むと思われるあらゆる媒
質中で追跡又は検出するのに使用し得る。

本発明のプローブとして使用されるDNA−AAIFは相補的
配列を対にせしめる条件下で検査すべきDNAと接触させ
るが、そのためには相互間でハイブリツド形成を行なう
DNAを公知の条件下で予め変性しておく必要が当然考え
られる。

有利にはこれに次いで所定量の反応生成物を当業者公知
の条件下でセルロースフイルタ又は類似サポート上に配
置し且つ固定させる。

変形例として、ハイブリツド形成を行なう前に検査すべ
きDNAを含む組成物を所定量だけ前述の如きサポート上
に配置し固定させてもよい。この場合はハイブリツド形
成を直接サポート上で行なう。ハイブリツド形成操作
後、特異的にハイブリツド化されなかつたDNA−AAIFを
洗浄によつて除去し、その後で形成されたハイブリツド
の検出を特に抗AAF抗体との接触によつて行なう。これ
ら抗体は所望のDNA配列が使用組成物中に存在すれば、
修飾され且つ前記DNA配列と共にハイブリツド化された
プローブに固定され得る。

過剰分の抗体を洗浄により除去した後、固定した抗体を
沈降又は顕現させ得る。

顕現操作は抗AAF抗体と反応し得る別の抗体を用いて行
なうのが好ましい。これら別の抗体は特定基質に対する
活性が検出又は測定され得るような酵素で標識する。有
利には対応基質レベルで呈色反応を生起し得る酵素を使
用する。

この呈色反応を生じる酵素を用いれば顕現操作の時間が
大幅に短縮される。

この方法は、例えば産前診断の場合の如く、その場での
ハイブリツド形成後に遺伝子を染色体上に集中させるべ
く増幅系統（酵素に対応する抗体の連珠、枝又は球）を
使用すると感度が極めて高くなる。

この方法では呈色の強さを測定することにより定量も行
ない得る。

また、前述の別の抗体に代えて例えば標識したイムノグ
ロブリン又はスタフイロコツカスアウレウス（Staphylo
coccusaureus）のプロテインＡなどを使用してもよい。
これらは当業者に公知の類似の条件下で使用し得る。

本発明の別の特徴は本発明の方法の実施法の一例を示す
以下の説明で明らかにされよう。

下記の材料及び方法を使用する。

バイオラッズインク．（Biolabs Inc.）（英国ネル
（Nelle））のλフアージDNA。

ウシ肝臓から得たリボソームRNA及びシグマ（Sigma）社
のアルカリホスフアターゼ実験用試薬（RRフアーストブ
ルー塩、ナフトールAS−MXホスフエート）。

シュライシャー（Schleicher）及びシュール（Schl
l）のBA−85型ニトロセルロースフイルタ。ベデスダ
リサーチラボラトリーズ（Bethesda Research Laborato
ries）のホルマリンで固定されたスタフ．エー（Staph.
A）細胞（イムノプレシピチン（Immunoprcipitine）
の名称で市販）。

アマーシャム（Amersham）の“ニック−トランスレーシ
ョン（nick−translation）”キツト（ref.N−5000）及
び放射活性標識ヌクレオチドα−³²p−dCTP,800Ci/mmol
e。

AAF及びAAIFはバイオケミストリィ（Biochemistry）,1
5,3347〜3351（ワックス（FUCHS）他）及びバイオケミ
ストリィ（Biochemistry）17,2561〜2567（レフエブル
（LEFEVRE）他）に記載の方法に従つて合成し、窒素下
−20℃でアルミニウム箔被覆した管に保持する。

抗DNA−AAF抗体及び抗Guo−AAF抗体はフェブレスト．
（Febs Lett.）92,207〜210（レング（LENG）他），バ
イオケミストリィ（Biochemistry）,18,1328〜1332（サ
ージ（SAGE）他）及びヌクレイックアシッズリス．
（Nucleic Acids Res.）,6,733−744（グイゲス（GUIGU
ES）他）に記載の方法で得る。マイルスラボラトリー
ズ（Miles Laboratories）及びパスツール研究所（Inst
itut Pasteur）のパーオキシダーゼ及びアルカリホスフ
アターゼに結合する抗体。

仏国クレテイユ（Crteil），アンリモンドー（Henr
i Mondor）ホスピタル，ユニテインセルム（INSERM）U9
1及びエール（Yale）医大（米国ニューヘイブン（New H
aven））医学部から入手したプラスミド及びヒトゼータ
グロビン細胞DNA挿入クローンM13。4p7−７はpBR322のP
stI位置に挿入したゼータグロビンの464対の塩基をもつ
細胞DNAの断片を有する。これと同じ断片をM13に挿入る
（DNA1,355〜363,コヘン−ソラル（COHEN−SOLAL）
他）。

一重鎖（monocatnaire）M13DNAをヌクレイックアシ
ッズリス．（Nucleic Acids Res.）,9,309−321に記
載のメッシング（Messing）他の方法により製造する。

仏国ツールーズ（Toulouse）,CNRS生化学細胞遺伝学研
究センター（Centre de Recherches de Biochimie et d
e Gｎtique Cellulaire du CNRS）からのクローンp
WE6。このクローンはpBR322のEcoRI位置に挿入された6.
6キロベースのマウスリボソームDNA45Sを含む（ミコッ
ト（MICHOT）他、ヌクレイックアシッズリス．（Nu
cleic Acids Res.）,10,5273〜5283及びミコット（MICH
OT）他、ヌクレイックアシッズリス．（Nucleic Ac
ids Res.）,11,3375〜3391）。

プローブの調製 1. 二重鎖（bicatnaires）核酸の使用修飾すべき核
酸を超音波処理によつて約1000対の塩基（pb）をもつ断
片に細分し、クエン酸ナトリウム緩衝液（2mM,pH7）に
約500μg/mlの濃度で溶解する。加熱（100℃,5分間）に
より変性処理し氷中で急冷した後該溶液に1/10量のAAIF
エタノール溶液を加える。添加するAAIFの合計量は修飾
すべき核酸の重量の約３倍に等しくなければならない。
この混合物を暗所37℃で３時間インキユベートする。イ
ンキユベーシヨン後過剰AAIFを低温エチルエーテルで３
回抽出することにより除去し、得られた調合物を100℃
のホウ酸塩緩衝液（50mM,pH9）で３分間処理する。これ
は生起したかもしれない鎖間結合を除去するためであ
る。トリスHCl緩衝液（100mM,pH7）で中性化すれば該調
合物はハイブリツド形成に即使用し得る。この調合物は
＋４℃又は好ましくは−20℃で数年間保存できる。

放射性DNAを使用する場合は“ニック−トランスレート
（nick−translate）"DNAを前記クエン酸塩緩衝液中の
残留エタノールで沈降させ且つ熱によつて変性させる。
アリコートを音波処理ステツプを除いて前述の如く処理
する。非操作DNAを純粋エタノールで処理する。処理後E
DTAを最終モル濃度が2mMになるまで加え、修飾された核
酸を暗所に４℃で保存する。

2. 一重鎖核酸の使用音波処理ステツプを除いて１゜の如く操作する。

修飾された塩基の割合の測定修飾された塩基の割合はフックス（FUCHS）他、バイオ
ケミストリイ（Biochemistry）,11,2659〜2666及びフッ
クス（FUCHS）他、フェブスレト．（Febs Lett.）,3
4,295〜298に記載の方法で310nm〜260nmの吸光度を測定
することにより求める。試料が小さすぎてこの測光法を
使用できない場合はニトロセルロースフイルタ上に種々
の希釈度のテストすべき試料及び測定済試料を配置す
る。免疫化学的に着色した後斑点の色の強さを比較す
る。

ハイブリツド形成操作ニトロセルロースフイルタに吸収されたDNAのテストを
一般的方法によつて行なつた（ベテスダリサーチラ
ボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）によ
り市販の“ハイブリドット（Hybridot）”タイプの装置
を用いる過、又はジェー．モル．バイオール．（J.Mo
l.Biol.）,98,p.503,1975年に記載のサザーン（Souther
n）の方法に従う毛管現象によるトランスフアー。但
し、冷えばパル（PALL）市販の“バイオダイン（Biodyn
e）”タイプのナイロンフイルタ、DBM（ジアゾベンジル
オキシメチル）ペーパーの如き他のサポートも使用し得
る（ノイエス（Noyes）及びスターク（Stark），セル
（Cell）第５巻p301,1975年、アルウィン（Alwine）
他、1977年、ピー・エヌ・エー・エス（PNAS）,1974
年、p.5350、ケンプコル．（Kemp Coll.）））。

これらフイルタは下記の成分を含む溶液中65℃で２時間
前ハイブリツド形成にかける。

−NaCl ……300 mM −クエン酸ナトリウム,pH7 ……30 mM −ファルマシアファインケミカルズ（Pharmacia Fine
Chemicals）社からフィコール（Ficoll）400の名称で
市販されている試薬 ……0.1％ −ポリビニルピロリドン350 ……0.1％ −グリシン ……0.1％修飾されたプローブ（DNA−AAIF又はRNA−AAIF）とのハ
イブリツド形成は下記の如き溶液中で65℃で所望時間行
なう。

−NaCl ……300 mM −クエン酸ナトリウム,pH7 ……30 mM −Ficoll 400 ……0.02％ −ポリビニルピロリドン350 ……0.02％ −グリシン ……0.02％ −KH₂PO₄,pH7 ……25 mM −EDTA,pH7 ……2 mM −ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） ……0.5 ％ハイブリツド形成操作の所要時間はプローブの濃度と所
望の配列の複雑さとに依存する。この時間は公知の方法
で計算し得る。核酸の再結合を促進する物質（例えば硫
酸デキストラン）又はハイブリツド形成温度を低下させ
る物質（例えばホルムアミド）の使用も可能である。

ハイブリツド形成後は文献に開示されている一般的プロ
トコールに従い過剰プローブを除去すべくフイルタを洗
浄する。

プローブの検出ハイブリツド化されたフイルタを次の処理にかける。

−下記の成分を含む溶液中で室温で１時間インキユベー
トすることによりタンパク質を飽和せる。

子ウシ血清 ……20％ NaCl ……300nM クエン酸Na,pH7 ……30nM NP40 ……１％（飽和用溶液） −第１抗体（修飾AAIFを認識する抗体）の存在下に室温
で１時間おく。この抗体は前記飽和用溶液で希釈する。
希釈率は使用する抗体によつて異なる。

−下記の成分を含む溶液で洗浄する。

NaCl ……300mM クエン酸ナトリウム,pH7 ……30mM NP40 ……１％（洗浄用溶液） −第１抗体を認識する第２抗体と共に室温で１時間イン
キユベートする（第１抗体がウサギ抗体の場合は第２抗
体として例えばアルカリホスフアターゼと結合する抗ウ
サギIgG抗体などを使用し得る）。第２抗体は前記飽和
用溶液で希釈するがその希釈率は使用する抗体によつて
異なる。

−前出の洗浄用溶液と同一の溶液で洗浄する。

−公知技術（例えばアルカリホスフアターゼの呈色酵素
反応）により第２抗体を顕現させる。

測定の感度ターゲツトとしてウイルス（λフアージ）DNA又はヒト
遺伝子（胎児ビータグロビン,460pb）もしくはマウス遺
伝子（リボソームDNA,6.6kb）をバクテリアプラスミ（p
BR322）中でクローン化したものを用い、プローブとし
て二重鎖DNA（λフアージDNA又はプラスミドpBR322DN
A）、一重鎖DNA（ヒトゼータグロビンの464pbが挿入さ
れたM13フアージDNA）又はRNA（ウシリボソームRNA）を
用いてテストを行なつた。

プローブを検出すべく、第１抗体として希釈度1/200の
抗グアノシン−AAFウサギ抗体（未処理血清）を用い、
第２抗体としてアルカリホスフアターゼと結合する抗ウ
サギIgG抗体を希釈度1/400で使用した。

この条件下で得られた感度は次の通りである。

−500ng/ml（500×10^-9g/ml）以上の濃度で使用した二
重鎖DNAからなるプローブの場合:2pg（２×10^-12g）の
ターゲツトDNAを上回る感度。

−100ng/ml以上の濃度で使用した一重鎖DNAからなるプ
ローブの場合： 2pgのターゲツトDNAを上回る感度 −濃度200ng/mlのリボソームRNAからなるプローブの場
合：約200pgの感度尚、2pgのターゲツトDNAという感度は７μｇのヒト全DN
A中で1000pbの遺伝子が検出されたことを意味する。こ
の感度は鎌状赤血球貧血の産前診断に必要な感度と同程
度のものである。

DNA−AAFプローブ及びDNA−AAIFプローブの感度の比較リボ核酸又はデオキシリボ核酸は中性pHでAAF及びAAIF
と容易にインビトロ（in vitro）反応する。その誘導体
は前述の条件下では共有結合により原則としてグアニン
残基の炭素８と結合する。ウサギをDNA−AAF及びGuo−A
AFで免疫化して得た抗体はAAFで修飾したDNAを特異的に
認識し、AAIFで修飾したDNA及びRNAも認識する。表Ｉに
まとめた結果から明らかなように、DNAをAAIFで修飾す
るとより多量のDNAが沈降物中に検出される。

抗DNA−AAF抗体は少量の正常DNAを沈降させる。修飾DNA
を非修飾DNAから区別すべく、好ましくは抗Guo−AAF抗
体を用いる。このようにするとより良い結果が得られ
る。即ち、精製抗Guo−AAF抗体を用いると非修飾DNAは
無視し得る量しか沈降せず、そのためこの種のプローブ
を用いて特定遺伝子配列を複合混合物から分離すること
が可能になる。

核化学（nuclochimique）技術により修飾された核酸
の検出を下記の如く行なう。

修飾DNAをニトロセルロースフイルタに固定し、これら
フイルタを前述の処理にかける。調べるパラメータの数
が極めて多いため、この実験では操作し易いという理由
から直径25mmの円形小フイルタを用いる。AAIFで修飾し
たDNA（５％の修飾塩基）を用いると、感度の限界は第
２抗体がアルカリ性ホスフアターゼに結合する場合は1p
gより小さく、パーオキシダーゼに結合する場合は約8pg
である。

DNAの溶解温度はAAF及びAAIFで修飾した塩基が１％の場
合には夫々約1.1℃及び0.4℃低下する（フックス（FUCH
S）他、バイオケミストリィ（Biochemistry）,15,3347
〜3351;フックス（FUCHS）他、フェブレト．（Febs L
ett.）,34,295〜298;クリーク（KRIEK）他、バイオケミ
ストリィ（Biochemistry）,6,117〜182;カプラー（KAPU
LER）他、バイオケム．バイオフィズ．アクタ（Bioche
m.Biophys.Acta）,232,436〜450）。

二重鎖DNAプローブに対するAAF及びAAIFでの修飾の効果
を評価すべく斑点毎にハイブリツド形成操作を行なつ
た。３つのpBR322DNA斑点（422pg,2ng,20ng）と１つのD
NA斑点（1ng）とをもつニトロセルロースフイルタを非
修飾の又はAAFもしくはAAIFで修飾した塩基５％をもつ
放射性DNAプローブとのハイブリツド形成にかける。ハ
イブリツド形成後所定フイルタアセンブリを適当な洗浄
力をもつて洗浄し、乾燥させ且つ18時間オートラジオグ
ラフイにかける。非特異的ハイブリツド形成は皆無であ
つた。洗浄力を弱めても（NaCl/クエン酸ナトリウム、
室温で15分）結果は同じであつた。

DNA斑点（10pg,100pg,1ng,10ng）をもつフイルタのハイ
ブリツドの安定性をテストする。これら斑点は先ず放射
性修飾DNAプローブ又は対照プローブとのハイブリツド
形成にかけ、その後種々の洗浄力で洗浄する。

各洗浄力毎にフイルタアセンブリを乾燥させオートラジ
オグラフイにかける。３つのプローブ間には何らの差異
も認められなかつた。非操作DNAとのハイブリツド形成
にかけたフイルタには洗浄力に係りなく斑点が全く見ら
れない。AAFで修飾したプローブとのハイブリツド形成
にかけたフイルタでは10ngに該当する斑点がかすかに見
られる。AAIFで修飾したプローブとのハイブリツド形成
にかけたフイルタでは1ngに該当する斑点も見える。

前述のいずれの実験でも、プローブ濃度は2ng/ml、比活
性は５×10⁷cpm/μg,オートラジオグラフイは18時間で
ある。この条件下では夫々AAF及びAAIFで修飾したプロ
ーブを用いて得られる検出感度はオートラジオグラフイ
によつて得られる感度に比べて約1/100及び1/10であ
る。

如何なるタイプの核酸もAAF又はAAIFで修飾し得るた
め、一重鎖M13DNAプローブと免疫核RNA（immunonucli
que RNA）プローブとをハイブリツド形成テストで使用
する可能性を調べた。一重鎖M13DNAを用いるハイブリツ
ド形成では各フイルタにλフアージDNAの非操作斑点１
つと種々の量のプラスミド4p7−7DNA斑点とを与える。
ゼータグロビンの464の塩基対が同様に挿入されたM13組
換え体フアージの一重鎖DNAをAAF又はAAIFで修飾する
（５％の修飾塩基対）。プローブ濃度を125〜1500ng/ml
まで様々に変えてテストする。ハイブリツド形成及び洗
浄は65℃で行なう。この場合、プローブのハイブリツド
形成可能配列の濃度は約33ng/ml、斑点上のターゲツト
配列は660〜5ngである。陰性非操作斑点以外は全ての斑
点が着色される。これら斑点の着色度はAAIFで修飾した
プローブを用いた時の方が強い。

AAIFで修飾したRNAプローブを用いて同様のテストを行
なう。

ウシ肝臓リボソームRNA（シグマ（Sigma）、Ref.R550
2）をクエン酸塩緩衝液（2mM,pH6.7）中に溶解し、短時
間音波処理して約1000塩基の断片に細分し、AAIFで修飾
する。pBR322DNA（100ng）を用いて陰性対照斑点を形成
し、6.6kbのマウス46SリボソームDNAが挿入された組換
え体プラスミドpWE6のDNAを用いて種々の量の斑点を形
成する。これら斑点上のハイブリツド形成可能配列の量
は約30ng〜230pgである。プローブ濃度は200〜2300ng/m
lまで様々に変える。これ以上高い濃度にしても着色度
は殆んど変わらない。高濃度免疫核プローブを使用する
とフイルタのバツクグラウンド放射活性が極めて低い状
態に保持される。高いプローブ濃度を使用し得るとハイ
ブリツド形成操作を短時間で行ないたい時に有利であ
る。

これらの結果全体から判断するとAAIFで修飾した核酸は
特定配列の検出に適した性質を有すると考えられる。

AAFに代えてヨウ素含有誘導体AAIFを用いると感度は10
倍になる。

また、使用する第２抗体がアルカリホスフアターゼに結
合する場合は感度がピコグラムの範囲になる。

本発明は勿論以上説明してきた非限定的実施例には限定
されず、その範囲内で種々の変形が可能である。

本発明のプローブと共に形成したハイブリツドを検出す
るために使用し得る別の方法として、例えば高に固定さ
れるヨウ素125もしくは131又は放射活性プロテインＡで
放射活性を保持させた抗DNA−AAF抗体を使用することな
どにより、形成されたハイブリツドの（放射活性によ
る）顕現を行なつてもよい。

また、本発明のプローブは別の使用例として、出発組成
物に含まれる相補的DNAの精製に用いることもできる。
その場合は主に、 −固体サポート（例えばアガロース球で構成したもの）
に結合したプロテインA, −固体サポート（アガロース球、ラテツクス球等等）に
固定された又は固定されていない沈降作用抗体を用いて形成されたハイブリツドの選択的沈降を生起せ
しめる。

このように本発明は次式で示されるＮ−２−アセチルアミノ−７−ヨードフルオ
レン基と等価の修飾基によつて標識した全てのプローブ
をその範囲内に包含する。

これらマーカー基の等価物としては、７位のヨウ素原子
がヨウ素と同様にフルオレン核の挿入を不可能にする別
の単一原子又は複数の原子からなる置換基で置換された
全ての基が挙げられる。この場合フルオレン核は２つの
塩基対間で前記置換原子又は置換基と結合する。このよ
うな置換基は例えばアルキル基、特にメチル基又は好ま
しくは３級ブチル基で構成される。ペプチド基を用いて
もよい。また、フルオレン核上の置換を例えば９位など
別の部位で任意に行なつてもよい。例えば９位の二重メ
チル化がこれに当たる。

フルオレン基に他の置換基を導入するか又は本質的免疫
特性を変化させない置換基でフルオレン基を修飾して
も、このように修飾されたDNAプローブがＮ−２−（グ
アノシン−８−イル）−アセチルアミノフルオレン又は
該基の修飾の結果得られる分子に対して予め形成した抗
体により必ず認識される以上は、等価物しか構成され得
ない。但しこれらの修飾は前記タイプの分子に対する抗
体の産生に必要な範囲の水溶液への可溶性を損なうもの
であつてはならない。周知の如くこの免疫化は問題の分
子をその免疫性の強化に役立つ担体分子、例えば血清ア
ルブミンと結合させた後で行なうのが普通である。前記
可溶性を損なうことのない別の修飾法として、Ｎ−２−
（グアノシン−８−イル）−２−アセチルアミノフルオ
レンにおけるＮ−２−アセチル基をＮ−２−ホルミル基
又はＮ−２−プロピオニル基で置換する方法も挙げられ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヌクレオチドの所定配列又はより一般的に
は所定DNAをこれを含み得る生物試料中で検出するため
のキットであって、 −所望の核酸の相補的配列を含み、且つその塩基の少な
くとも１つに共有結合で固定された７−ヨード−Ｎ−２
−アセチルアミノフルオレン基（AAIF基）を少なくとも
１つ有するプローブと、 −Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−アセチルアミノ
フルオレンと反応し得る抗体か又はＮ−２−アセチルア
ミノフルオレン基で修飾された核酸配列に対し予め形成
された抗体（AAF抗体）を含むことを特徴とする前記キ
ット。
【請求項２】前記プローブが、前記相補的配列である特
定核酸配列を含むクローン化されたプローブであって、
この特定配列が異種であるベクター又はその断片に挿入
されており且つAAIF基で修飾されているプローブである
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のキッ
ト。
【請求項３】ヌクレオチドの所定配列又はより一般的に
は所定DNAをこれを含み得る生物試料中で検出するため
のキットであって、 −所望の核酸の相補的配列を含み、且つその塩基の少な
くとも１つに共有結合で固定された１−ヨード−Ｎ−２
−アセチルアミノフルオレン基（AAIF基）を少なくとも
１つ有するプローブ、 −Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−アスチルアミノ
フルオレンと反応し得る抗体か又はＮ−２−アセチルア
ミノフルオレン基で修飾された核酸配列に対し予め形成
された抗体（AAF抗体）、及び −抗AAF抗体を視覚化する手段を含むことを特徴とする
前記キット。
【請求項４】視覚化手段が抗AAF抗体と反応し得且つ酵
素もしくは螢光分子の如きマーカー担持している別の抗
体又は別のポリペプチドで構成されることを特徴とする
特許請求の範囲第３項に記載のキット。
【請求項５】前記プローブが、前記相補的配列である特
定核酸配列を含むクローン化されたプローブであって、
この特定配列が異種であるベクター又はその断片に挿入
されており且つAAIF基で修飾されているプローブである
ことを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載のキッ
ト。