JPH07246100A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 所望の核酸の相補的配列を含み、且つその塩
基の少なくとも１つに共有結合で固定された７−ヨード
−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン基を少なくとも１
つ有するプローブを使用してＤＮＡ又はＲＮＡの特異的
核酸配列を検出し、その特徴を明らかにする方法。 【効果】 所望の核酸を高感度で検出することができ
る。
基の少なくとも１つに共有結合で固定された７−ヨード
−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン基を少なくとも１
つ有するプローブを使用してＤＮＡ又はＲＮＡの特異的
核酸配列を検出し、その特徴を明らかにする方法。 【効果】 所望の核酸を高感度で検出することができ
る。
Description
【０００１】本発明は、修飾核酸を含み且つ特異抗体に
よって認識し得る高感度プローブを使用してＤＮＡ又は
ＲＮＡの特異的核酸配列を検出しその特徴を明らかにす
る方法に係る。
よって認識し得る高感度プローブを使用してＤＮＡ又は
ＲＮＡの特異的核酸配列を検出しその特徴を明らかにす
る方法に係る。
【０００２】遺伝子又は遺伝子断片の如き特異的核酸配
列をこのような配列を含み得る組成物中で検出するため
の標識されたプローブは既に知られている。この種のプ
ローブは所望の核酸配列又は遺伝子とハイブリッドを形
成し得る相補的核酸からなるＤＮＡ配列を含む。有利に
はマーカーをプローブに担持する修飾基で構成し、この
修飾基（又はこのようにして修飾されたＤＮＡ）が特異
的抗体によって認識され得るようにする。例えば、プロ
ーブをＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオ
レン（以後ＡＡＦという）で修飾する。このようなプロ
ーブを以後「ＤＮＡ−ＡＡＦプローブ」と称する。この
種のプローブは仏国特許出願第８１２４１３１号に記載
されており、その塩基の少なくとも１つに共有結合で固
定されたＮ−２−アセチルアミノフルオレン基を少なく
とも１つ含んでいる。このプローブはＮ−２−（グアノ
シン−８−イル）−アセチルアミノフルオレン又はアセ
チルアミノフルオレン残基をもつプローブ自体に対して
予め形成しておいた抗体により認識できる。このような
抗体を以後「抗ＡＡＦ抗体」と称する。
列をこのような配列を含み得る組成物中で検出するため
の標識されたプローブは既に知られている。この種のプ
ローブは所望の核酸配列又は遺伝子とハイブリッドを形
成し得る相補的核酸からなるＤＮＡ配列を含む。有利に
はマーカーをプローブに担持する修飾基で構成し、この
修飾基（又はこのようにして修飾されたＤＮＡ）が特異
的抗体によって認識され得るようにする。例えば、プロ
ーブをＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオ
レン（以後ＡＡＦという）で修飾する。このようなプロ
ーブを以後「ＤＮＡ−ＡＡＦプローブ」と称する。この
種のプローブは仏国特許出願第８１２４１３１号に記載
されており、その塩基の少なくとも１つに共有結合で固
定されたＮ−２−アセチルアミノフルオレン基を少なく
とも１つ含んでいる。このプローブはＮ−２−（グアノ
シン−８−イル）−アセチルアミノフルオレン又はアセ
チルアミノフルオレン残基をもつプローブ自体に対して
予め形成しておいた抗体により認識できる。このような
抗体を以後「抗ＡＡＦ抗体」と称する。
【０００３】所与の組成物中に任意に含まれ得る核酸の
配列又は所定断片を検出するための前記仏国特許出願に
記載の方法は、前記組成物と適切な相補的配列を含むＤ
ＮＡ−ＡＡＦプローブとを該プローブと所望の核酸配列
又は遺伝子配列との間にハイブリダイゼーションが生起
するような条件下で接触させ、次いで前記核酸配列又は
遺伝子配列を顕現せしめることからなる。
配列又は所定断片を検出するための前記仏国特許出願に
記載の方法は、前記組成物と適切な相補的配列を含むＤ
ＮＡ−ＡＡＦプローブとを該プローブと所望の核酸配列
又は遺伝子配列との間にハイブリダイゼーションが生起
するような条件下で接触させ、次いで前記核酸配列又は
遺伝子配列を顕現せしめることからなる。
【０００４】また、ＡＡＦのヨウ素含有誘導体即ち７−
ヨード−Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフル
オレン（以後ＡＡＩＦと称する）をＤＮＡに固定して固
定の結果得られる分子モデルを調べる試みも行なわれた
（Ｆｕｃｈｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第１５
巻、１９７６年、ｐ．３３４７〜３３５１）。しかしな
がらこの技術を適切な抗体によって認識され得る修飾さ
れたＤＮＡプローブ の製造に転用することは現在に至
るまで想到され得なかった。実際、Ｎ−２−（グアノシ
ン−８−イル）−アセチルアミノフルオレンのヨウ素含
有誘導体は、少なくとも本発明者等の知る限りにおいて
該誘導体の形成が可能な条件下では不溶性であるため、
ウサギの如き実験動物の免疫化によってこの分子に対す
る抗体を産生することは想到され得なかった。更に、ヨ
ウ素原子は分子レベルでの大きさが大きいことから、所
望のハイブリッド形成能力を低下させるおそれがあると
して、この種の基をプローブの標識に使用するのは不可
能ではないかとも考えられていた。
ヨード−Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフル
オレン（以後ＡＡＩＦと称する）をＤＮＡに固定して固
定の結果得られる分子モデルを調べる試みも行なわれた
（Ｆｕｃｈｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第１５
巻、１９７６年、ｐ．３３４７〜３３５１）。しかしな
がらこの技術を適切な抗体によって認識され得る修飾さ
れたＤＮＡプローブ の製造に転用することは現在に至
るまで想到され得なかった。実際、Ｎ−２−（グアノシ
ン−８−イル）−アセチルアミノフルオレンのヨウ素含
有誘導体は、少なくとも本発明者等の知る限りにおいて
該誘導体の形成が可能な条件下では不溶性であるため、
ウサギの如き実験動物の免疫化によってこの分子に対す
る抗体を産生することは想到され得なかった。更に、ヨ
ウ素原子は分子レベルでの大きさが大きいことから、所
望のハイブリッド形成能力を低下させるおそれがあると
して、この種の基をプローブの標識に使用するのは不可
能ではないかとも考えられていた。
【０００５】これら種々の確認事項は当業界でＡＡＩＦ
を前述タイプの検出プローブを製造するためのマーカー
として注目せしめるような性質のものではなかった。こ
の種のマーカーに対して抱き得る先入観がなかったとし
ても、これを容易に認識せしめることのできるような方
法は未だ発見されていなかった。しかるに本発明は、Ａ
ＡＦ又はＤＮＡ−ＡＡＦ対して予め形成した抗体が同一
ＤＮＡをＡＡＩＦで修飾したものも認識し得るという発
見のみならず、ＡＡＦ以外の抗体によるこのＤＮＡ−Ａ
ＡＦＩの検出の感度がこれらの抗体によるＤＮＡ−ＡＡ
Ｆ検出の感度より約１０倍高いという発見に基礎をお
く。更に注目すべきことは、「大きい分子」をＤＮＡに
固定しても予備変性後のこれらＤＮＡが別のＤＮＡの相
補的配列と共にハイブリッドを形成する能力には何の変
化もないことである。抗ＡＡＦ抗体による標識ＤＮＡ検
出感度はマーカーがこの抗体と直接相同するＡＡＦから
なる場合よりもＡＡＩＦからなる場合の方が大きいが、
このことは濃度が極めて低い状態、さらには高希釈度状
態をも考慮に入れると極めて重要な意味を持つものであ
る。実際、試料中に検出すべき特定核酸配列はこの検査
すべき試料中に極微量しか存在しないことが多く且つ検
出自体は通常高希釈度状態で行なわれるため、通常は前
述の如き状態で操作せざるを得ない。例えば、所望の特
定ＤＮＡ配列が３０００のオーダーの塩基対を含み且つ
この配列が３×１０-9のオーダーの塩基対をもつハプロ
イド細胞の全遺伝子に属する場合には検査すべき生物試
料中に含まれるＤＮＡでの所望特定配列の相対濃度は１
０-6のオーダーになる。このような極めて低い濃度に加
えて、特に検査される全ＤＮＡの予備分別テストでは所
望配列の高希釈効果の問題もある。それはこの分別処理
が、使用するＤＮＡの種々の分子種を例えばポリアクリ
ルアミドアガロースゲル中で夫々の分子量に応じて差動
的に移動させることにより分別する電気泳動タイプ又は
これと類似の操作からなる場合である。このようにして
分別し得る生物試料の量が必然的に限定されることを考
えれば１０倍の検出感度は極めて重要な意味をもつこと
になる。実際、ＡＡＦで標識したプローブが１０ピコグ
ラムのオーダーの特定配列量を検出するのに対し、同じ
プローブをＡＡＩＦで標識した場合には１ピコグラムの
オーダーの量が検出される。
を前述タイプの検出プローブを製造するためのマーカー
として注目せしめるような性質のものではなかった。こ
の種のマーカーに対して抱き得る先入観がなかったとし
ても、これを容易に認識せしめることのできるような方
法は未だ発見されていなかった。しかるに本発明は、Ａ
ＡＦ又はＤＮＡ−ＡＡＦ対して予め形成した抗体が同一
ＤＮＡをＡＡＩＦで修飾したものも認識し得るという発
見のみならず、ＡＡＦ以外の抗体によるこのＤＮＡ−Ａ
ＡＦＩの検出の感度がこれらの抗体によるＤＮＡ−ＡＡ
Ｆ検出の感度より約１０倍高いという発見に基礎をお
く。更に注目すべきことは、「大きい分子」をＤＮＡに
固定しても予備変性後のこれらＤＮＡが別のＤＮＡの相
補的配列と共にハイブリッドを形成する能力には何の変
化もないことである。抗ＡＡＦ抗体による標識ＤＮＡ検
出感度はマーカーがこの抗体と直接相同するＡＡＦから
なる場合よりもＡＡＩＦからなる場合の方が大きいが、
このことは濃度が極めて低い状態、さらには高希釈度状
態をも考慮に入れると極めて重要な意味を持つものであ
る。実際、試料中に検出すべき特定核酸配列はこの検査
すべき試料中に極微量しか存在しないことが多く且つ検
出自体は通常高希釈度状態で行なわれるため、通常は前
述の如き状態で操作せざるを得ない。例えば、所望の特
定ＤＮＡ配列が３０００のオーダーの塩基対を含み且つ
この配列が３×１０-9のオーダーの塩基対をもつハプロ
イド細胞の全遺伝子に属する場合には検査すべき生物試
料中に含まれるＤＮＡでの所望特定配列の相対濃度は１
０-6のオーダーになる。このような極めて低い濃度に加
えて、特に検査される全ＤＮＡの予備分別テストでは所
望配列の高希釈効果の問題もある。それはこの分別処理
が、使用するＤＮＡの種々の分子種を例えばポリアクリ
ルアミドアガロースゲル中で夫々の分子量に応じて差動
的に移動させることにより分別する電気泳動タイプ又は
これと類似の操作からなる場合である。このようにして
分別し得る生物試料の量が必然的に限定されることを考
えれば１０倍の検出感度は極めて重要な意味をもつこと
になる。実際、ＡＡＦで標識したプローブが１０ピコグ
ラムのオーダーの特定配列量を検出するのに対し、同じ
プローブをＡＡＩＦで標識した場合には１ピコグラムの
オーダーの量が検出される。
【０００６】これら種々の好ましい性質を有しているた
めＡＡＩＦは前述の如き核酸プローブの極めて優れたマ
ーカーを構成する。
めＡＡＩＦは前述の如き核酸プローブの極めて優れたマ
ーカーを構成する。
【０００７】本発明はこのようにして形成される全ての
プローブに係り、より特定的にはベクター特に遺伝子工
学分野で従来の技術によるクローニングの実現を可能に
してきたプラスミド又はファージの核酸の全体又は一部
分に挿入された所望の特異的配列の相補的特定核酸配列
を含むクローン化された全てのプローブに係る。
プローブに係り、より特定的にはベクター特に遺伝子工
学分野で従来の技術によるクローニングの実現を可能に
してきたプラスミド又はファージの核酸の全体又は一部
分に挿入された所望の特異的配列の相補的特定核酸配列
を含むクローン化された全てのプローブに係る。
【０００８】特にクローニングに使用されてきたベクタ
ーの核酸は前記所定核酸配列に対して非相同であった。
換言すれば、前記所定核酸配列とは異なる起源、即ち異
なる微生物から得られる核酸である。
ーの核酸は前記所定核酸配列に対して非相同であった。
換言すれば、前記所定核酸配列とは異なる起源、即ち異
なる微生物から得られる核酸である。
【０００９】本発明はまた、所定生物試料、より一般的
にはｉｎ ｖｉｔｒｏで形成される全ての標本、例えば
適当なデオキシリボヌクレオチドと逆転写酵素との存在
下でＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡの所定ヌク
レオチド配列を系統的に検出するために使用されるキッ
トにも係る。
にはｉｎ ｖｉｔｒｏで形成される全ての標本、例えば
適当なデオキシリボヌクレオチドと逆転写酵素との存在
下でＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡの所定ヌク
レオチド配列を系統的に検出するために使用されるキッ
トにも係る。
【００１０】所定核酸の配列又は断片を含み得る組成物
中でこれら配列又は断片を検出し且つその特徴を明らか
にするための本発明のキットは、 − 所望核酸の相補的配列を含み、その塩基の少なくと
も１つと共有結合したＡＡＩＦ基を少なくとも一つ有す
るプローブと − 抗ＡＡＦ抗体 とからなる。
中でこれら配列又は断片を検出し且つその特徴を明らか
にするための本発明のキットは、 − 所望核酸の相補的配列を含み、その塩基の少なくと
も１つと共有結合したＡＡＩＦ基を少なくとも一つ有す
るプローブと − 抗ＡＡＦ抗体 とからなる。
【００１１】勿論本発明のキットはその使用に必要な他
の全ての要素、特に緩衝溶液を調製するための試薬、必
要に応じ細胞媒質から検査すべきＤＮＡを抽出するため
の試薬、そして前述の抗ＡＡＦ抗体が該抗体を直接視覚
化せしめるべく修飾されていない場合にはこれら抗ＡＡ
Ｆ抗体と反応し得且つそれ自体容易に視覚化され得るマ
ーカーをもつ他の異なる抗体又はポリペプチドをも含み
得る。前記視覚化は任意の方法で実施し得るが、好まし
くは前記第２抗体または対応ポリペプチドを螢光分子又
は酵素で修飾する。この酵素は次の如き基質、即ちそれ
が酵素で修飾される場合には１種以上の所定螢光放射線
の該基質による吸光度の比色又は分光測光によって修飾
が検出され得るような基質と対応するものの中から選択
するのが好ましい。
の全ての要素、特に緩衝溶液を調製するための試薬、必
要に応じ細胞媒質から検査すべきＤＮＡを抽出するため
の試薬、そして前述の抗ＡＡＦ抗体が該抗体を直接視覚
化せしめるべく修飾されていない場合にはこれら抗ＡＡ
Ｆ抗体と反応し得且つそれ自体容易に視覚化され得るマ
ーカーをもつ他の異なる抗体又はポリペプチドをも含み
得る。前記視覚化は任意の方法で実施し得るが、好まし
くは前記第２抗体または対応ポリペプチドを螢光分子又
は酵素で修飾する。この酵素は次の如き基質、即ちそれ
が酵素で修飾される場合には１種以上の所定螢光放射線
の該基質による吸光度の比色又は分光測光によって修飾
が検出され得るような基質と対応するものの中から選択
するのが好ましい。
【００１２】本発明の方法の特徴は核酸の配列又は所定
断片を含むと思われる組成物に、所望の核酸配列又は遺
伝子との間でハイブリッドを形成し得る相補的核酸を含
むと共にその塩基の少なくとも１つに共有結合したＡＡ
ＩＦ基を少なくとも１つ有するプローブをハイブリッド
形成が生起するような条件下で接触させ、必要に応じ非
ハイブリッド化プローブを分離した後でハイブリッド化
したプローブを抗ＡＡＦ抗体との接触により顕現させる
ことにある。
断片を含むと思われる組成物に、所望の核酸配列又は遺
伝子との間でハイブリッドを形成し得る相補的核酸を含
むと共にその塩基の少なくとも１つに共有結合したＡＡ
ＩＦ基を少なくとも１つ有するプローブをハイブリッド
形成が生起するような条件下で接触させ、必要に応じ非
ハイブリッド化プローブを分離した後でハイブリッド化
したプローブを抗ＡＡＦ抗体との接触により顕現させる
ことにある。
【００１３】本発明のプローブは細胞もしくはウイルス
のＤＮＡ或いはＲＮＡの特定断片又はｃＤＮＡの特定断
片を含み得る。
のＤＮＡ或いはＲＮＡの特定断片又はｃＤＮＡの特定断
片を含み得る。
【００１４】該プローブはまた、特に本発明の方法及び
キットを使用する場合には、より大きなＤＮＡ断片、例
えば微生物特にバクテリア又はウイルスのゲノムの断片
或いは完全体をＡＡＩＦで標識したもので構成し得る。
従ってこれ等のプローブは前記微生物をこれらを含むと
思われるあらゆる媒質中で追跡又は検出するのに使用し
得る。
キットを使用する場合には、より大きなＤＮＡ断片、例
えば微生物特にバクテリア又はウイルスのゲノムの断片
或いは完全体をＡＡＩＦで標識したもので構成し得る。
従ってこれ等のプローブは前記微生物をこれらを含むと
思われるあらゆる媒質中で追跡又は検出するのに使用し
得る。
【００１５】本発明のプローブとして使用されるＤＮＡ
−ＡＡＩＦは相補的配列を対にせしめる条件下で検査す
べきＤＮＡと接触させるが、そのためには相互間でハイ
ブリッド形成を行なうＤＮＡを公知の条件下で予め変性
しておく必要が当然考えられる。
−ＡＡＩＦは相補的配列を対にせしめる条件下で検査す
べきＤＮＡと接触させるが、そのためには相互間でハイ
ブリッド形成を行なうＤＮＡを公知の条件下で予め変性
しておく必要が当然考えられる。
【００１６】有利にはこれに次いで所定量の反応生成物
を当業者公知の条件下でセルロースフィルタ又は類似サ
ポート上に配置し且つ固定させる。
を当業者公知の条件下でセルロースフィルタ又は類似サ
ポート上に配置し且つ固定させる。
【００１７】変形例として、ハイブリッド形成を行なう
前に検査すべきＤＮＡを含む組成物を所定量だけ前述の
如きサポート上に配置し固定させてもよい。この場合は
ハイブリッド形成を直接サポート上で行なう。ハイブリ
ッド形成操作後、特異的にハイブリッド化されなかった
ＤＮＡ−ＡＡＩＦを洗浄によって除去し、その後で形成
されたハイブリッドの検出を特に抗ＡＡＦ抗体との接触
によって行なう。これら抗体は所望のＤＮＡ配列が使用
組成物中に存在すれば、修飾され且つ前記ＤＮＡ配列と
共にハイブリッド化されたプローブに固定され得る。
前に検査すべきＤＮＡを含む組成物を所定量だけ前述の
如きサポート上に配置し固定させてもよい。この場合は
ハイブリッド形成を直接サポート上で行なう。ハイブリ
ッド形成操作後、特異的にハイブリッド化されなかった
ＤＮＡ−ＡＡＩＦを洗浄によって除去し、その後で形成
されたハイブリッドの検出を特に抗ＡＡＦ抗体との接触
によって行なう。これら抗体は所望のＤＮＡ配列が使用
組成物中に存在すれば、修飾され且つ前記ＤＮＡ配列と
共にハイブリッド化されたプローブに固定され得る。
【００１８】過剰分の抗体を洗浄により除去した後、固
定した抗体を沈降又は顕現させ得る。
定した抗体を沈降又は顕現させ得る。
【００１９】顕現操作は抗ＡＡＦ抗体と反応し得る別の
抗体を用いて行なうのが好ましい。これら別の抗体は特
定基質に対する活性が検出または測定され得るような酵
素で標識する。有利には対応基質レベルで呈色反応を生
起し得る酵素を使用する。
抗体を用いて行なうのが好ましい。これら別の抗体は特
定基質に対する活性が検出または測定され得るような酵
素で標識する。有利には対応基質レベルで呈色反応を生
起し得る酵素を使用する。
【００２０】この呈色反応を生じる酵素を用いれば顕現
操作の時間が大幅に短縮される。
操作の時間が大幅に短縮される。
【００２１】この方法は、例えば産前診断の場合の如
く、その場でのハイブリッド形成後に遺伝子を染色体上
に集中させるべく増幅系統（酵素に対応する抗体の連
珠、枝又球）を使用すると感度が極めて高くなる。
く、その場でのハイブリッド形成後に遺伝子を染色体上
に集中させるべく増幅系統（酵素に対応する抗体の連
珠、枝又球）を使用すると感度が極めて高くなる。
【００２２】この方法では呈色の強さを測定することに
より定量も行ない得る。
より定量も行ない得る。
【００２３】また、前述の別の抗体に代えて例えば標識
したイムノグロブリン又はスタフィロコッカスアウレウ
ス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡなどを使
用してもよい。これらは当業者に公知の類似の条件下で
使用し得る。
したイムノグロブリン又はスタフィロコッカスアウレウ
ス（Staphylococcus aureus）のプロテインＡなどを使
用してもよい。これらは当業者に公知の類似の条件下で
使用し得る。
【００２４】本発明の別の特徴は本発明の方法の実施例
の一例を示す以下の説明で明らかにされよう。
の一例を示す以下の説明で明らかにされよう。
【００２５】下記の材料および方法を使用する。
【００２６】Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（英国Ｎｅｌｌ
ｅ）のλファージＤＮＡ。
ｅ）のλファージＤＮＡ。
【００２７】ウシ肝臓から得たリボソームＲＮＡ及びＳ
ｉｇｍａ社のアルカリホスファターゼ実験用試薬（ＲＲ
ファーストブルー塩、ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェー
ト）。
ｉｇｍａ社のアルカリホスファターゼ実験用試薬（ＲＲ
ファーストブルー塩、ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェー
ト）。
【００２８】Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ
のＢＡ−８５型ニトロセルロースフィルタ。Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
のホルマリンで固定されたＳｔａｐｈ．Ａ細胞（Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎｅの名称で市販）Ａｍｅｒ
ｓｈａｍの“ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”キッ
ト（ｒｅｆ．Ｎ−５０００）及び放射性標識ヌクレオチ
ドα−32Ｐ−ｄＣＴＰ，８００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ。
のＢＡ−８５型ニトロセルロースフィルタ。Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
のホルマリンで固定されたＳｔａｐｈ．Ａ細胞（Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎｅの名称で市販）Ａｍｅｒ
ｓｈａｍの“ｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”キッ
ト（ｒｅｆ．Ｎ−５０００）及び放射性標識ヌクレオチ
ドα−32Ｐ−ｄＣＴＰ，８００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ。
【００２９】ＡＡＦ及びＡＡＩＦはＢｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，１５，３３４７〜３３５１（ＦＵＣＨＳ他）及
びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７，２５６１〜２５６
７（ＬＥＦＥＶＲＥ他）に記載の方法に従って合成し、
窒素下−２０℃でアルミニウム箔被覆した管に保存す
る。
ｔｒｙ，１５，３３４７〜３３５１（ＦＵＣＨＳ他）及
びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７，２５６１〜２５６
７（ＬＥＦＥＶＲＥ他）に記載の方法に従って合成し、
窒素下−２０℃でアルミニウム箔被覆した管に保存す
る。
【００３０】抗ＤＮＡ−ＡＡＦ抗体及び抗Ｇｕｏ−ＡＡ
Ｆ抗体はＦｅｂｓ Ｌｅｔｔ． ９２，２０７〜２１０
（ＬＥＮＧ他），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，１
３２８〜１３３２（ＳＡＧＥ他）及びＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６，７３３〜７４４（ＧＵＩ
ＧＵＥＳ他）に記載の方法で得る。
Ｆ抗体はＦｅｂｓ Ｌｅｔｔ． ９２，２０７〜２１０
（ＬＥＮＧ他），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，１
３２８〜１３３２（ＳＡＧＥ他）及びＮｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６，７３３〜７４４（ＧＵＩ
ＧＵＥＳ他）に記載の方法で得る。
【００３１】Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及
びＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒのパーオキシダー
ゼ及びアルカリホスファターゼに結合する抗体。
びＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒのパーオキシダー
ゼ及びアルカリホスファターゼに結合する抗体。
【００３２】仏国Ｃｒｅｔｅｉｌ， Ｈｅｎｒｉ Ｍｏ
ｎｄｏｒホスピタル，ユニテ ＩＮＳＥＲＭ Ｕ９１及
びＹａｌｅ医大（米国Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）医学部から
入手したプラスミド及びヒトゼータグロビン細胞ＤＮＡ
挿入クローンＭ１３。４ｐ７−７はｐＢＲ３２２のＰｓ
ｔＩ位置に挿入したゼータグロビンの４６４対の塩基を
もつ細胞ＤＮＡの断片を有する。これと同じ断片をＭ１
３に挿入する（ＤＮＡ１， ３５５〜３６３，ＣＯＨＥ
Ｎ−ＳＯＬＡＬ他）。
ｎｄｏｒホスピタル，ユニテ ＩＮＳＥＲＭ Ｕ９１及
びＹａｌｅ医大（米国Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）医学部から
入手したプラスミド及びヒトゼータグロビン細胞ＤＮＡ
挿入クローンＭ１３。４ｐ７−７はｐＢＲ３２２のＰｓ
ｔＩ位置に挿入したゼータグロビンの４６４対の塩基を
もつ細胞ＤＮＡの断片を有する。これと同じ断片をＭ１
３に挿入する（ＤＮＡ１， ３５５〜３６３，ＣＯＨＥ
Ｎ−ＳＯＬＡＬ他）。
【００３３】一重鎖（ｍｏｎｏｃａｔｅｎａｉｒｅ）Ｍ
１３ＤＮＡをＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
９， ３０９−３２１に記載のＭｅｓｓｉｎｇ他の方
法により製造する。
１３ＤＮＡをＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
９， ３０９−３２１に記載のＭｅｓｓｉｎｇ他の方
法により製造する。
【００３４】仏国Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｃｅｎｔｒｅ ｄ
ｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅＢｉｏｃｈｉｍｉｅ
ｅｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒ
ｅｄｕ ＣＮＲＳからのクローンｐＷＥ６。このクロー
ンはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ位置に挿入された６．６
キロベースのマウスリボソームＤＮＡ４５Ｓを含む（Ｍ
ＩＣＨＯＴ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１０，５２７３〜５２８３及びＭＩＣＨＯＴ他、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，３３７
５〜３３９１）。
ｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅＢｉｏｃｈｉｍｉｅ
ｅｔ ｄｅ Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ Ｃｅｌｌｕｌａｉｒ
ｅｄｕ ＣＮＲＳからのクローンｐＷＥ６。このクロー
ンはｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ位置に挿入された６．６
キロベースのマウスリボソームＤＮＡ４５Ｓを含む（Ｍ
ＩＣＨＯＴ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１０，５２７３〜５２８３及びＭＩＣＨＯＴ他、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，３３７
５〜３３９１）。
【００３５】プローブの調製 １． 二重鎖（ｂｉｃａｔｅｎａｉｒｅｓ）核酸の使用 修飾すべき核酸を超音波処理によって約１０００対の塩
基（ｐｂ）をもつ断片に細分し、クエン酸ナトリウム緩
衝液（２ｍＭ，ｐＨ７）に約５００μｇ／ｍｌの濃度で
溶解する。加熱（１００℃，５分間）により変性処理し
氷中で急冷した後該溶液に１／１０量のＡＡＩＦエタノ
ール溶液を加える。添加するＡＡＩＦの合計量は修飾す
べき核酸の重量の約３倍に等しくなければならない。こ
の混合物を暗所３７℃で３時間インキュベートする。イ
ンキュベーション後過剰ＡＡＩＦを低温エチルエーテル
で３回抽出することにより除去し、得られた調合物を１
００℃のホウ酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９）で３分間
処理する。これは生起したかもしれない鎖間結合を除去
するためである。トリスにＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，
ｐＨ７）で中性化すれば該調合物はハイブリッド形成に
即使用し得る。この調合物は＋４℃又は好ましくは−２
０℃で数年間保存できる。
基（ｐｂ）をもつ断片に細分し、クエン酸ナトリウム緩
衝液（２ｍＭ，ｐＨ７）に約５００μｇ／ｍｌの濃度で
溶解する。加熱（１００℃，５分間）により変性処理し
氷中で急冷した後該溶液に１／１０量のＡＡＩＦエタノ
ール溶液を加える。添加するＡＡＩＦの合計量は修飾す
べき核酸の重量の約３倍に等しくなければならない。こ
の混合物を暗所３７℃で３時間インキュベートする。イ
ンキュベーション後過剰ＡＡＩＦを低温エチルエーテル
で３回抽出することにより除去し、得られた調合物を１
００℃のホウ酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ９）で３分間
処理する。これは生起したかもしれない鎖間結合を除去
するためである。トリスにＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ，
ｐＨ７）で中性化すれば該調合物はハイブリッド形成に
即使用し得る。この調合物は＋４℃又は好ましくは−２
０℃で数年間保存できる。
【００３６】放射性ＤＮＡを使用する場合は“ｎｉｃｋ
−ｔｒａｎｓｌａｔｅ”ＤＮＡを前記クエン酸塩緩衝液
中の残留エタノールで沈降させ且つ熱によって変性させ
る。アリコートを音波処理ステップを除いて前述の如く
処理する。非操作ＤＮＡを純粋エタノールで処理する。
処理後ＥＤＴＡを最終モル濃度が２ｍＭになるまで加
え、修飾された核酸を暗所に４℃で保存する。
−ｔｒａｎｓｌａｔｅ”ＤＮＡを前記クエン酸塩緩衝液
中の残留エタノールで沈降させ且つ熱によって変性させ
る。アリコートを音波処理ステップを除いて前述の如く
処理する。非操作ＤＮＡを純粋エタノールで処理する。
処理後ＥＤＴＡを最終モル濃度が２ｍＭになるまで加
え、修飾された核酸を暗所に４℃で保存する。
【００３７】２． 一重鎖核酸の使用 音波処理ステップを除いて上記１の如く操作する。
【００３８】修飾された塩基の割合の測定 修飾された塩基の割合はＦＵＣＨＳ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ， １１，２６５９〜２６６６及びＦＵＣＨ
Ｓ他、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．， ３４，２９５〜２９８
に記載の方法で３１０ｎｍ〜２６０ｎｍの吸光度を測定
することにより求める。試料が小さすぎてこの測光法を
使用できない場合はニトロセルロースフィルタ上に種々
の希釈度のテストすべき試料及び測定済試料を配置す
る。免疫化学的に着色した後斑点の色の強さを比較す
る。
ｉｓｔｒｙ， １１，２６５９〜２６６６及びＦＵＣＨ
Ｓ他、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．， ３４，２９５〜２９８
に記載の方法で３１０ｎｍ〜２６０ｎｍの吸光度を測定
することにより求める。試料が小さすぎてこの測光法を
使用できない場合はニトロセルロースフィルタ上に種々
の希釈度のテストすべき試料及び測定済試料を配置す
る。免疫化学的に着色した後斑点の色の強さを比較す
る。
【００３９】ハイブリッド形成操作 ニトロセルロースフィルタに吸収されたＤＮＡのテスト
を一般的方法によって行なった（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより市販
の“Ｈｙｂｒｉｄｏｔ”タイプの装置を用いる濾過、又
はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，ｐ．５０３，１９７
５年に記載のＳｏｕｔｈｅｒｎの方法に従う毛管現象に
よるトランスファー。但し、例えばＰＡＬＬ市販の“Ｂ
ｉｏｄｙｎｅ”タイプのナイロンフィルタ、ＤＢＭ（ジ
アゾベンジルオキシメチル）ペーパーの如き他のサポー
トも使用し得る（Ｎｏｙｅｓ及びＳｔａｒｋ， Ｃｅｌ
ｌ第５巻 ｐ３０１，１９７５年、Ａｌｗｉｎｅ他、１
９７７年、ＰＮＡＳ，１９７４年、ｐ．５３５０、Ｋｅ
ｍｐ Ｃｏｌｌ．））。
を一般的方法によって行なった（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより市販
の“Ｈｙｂｒｉｄｏｔ”タイプの装置を用いる濾過、又
はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，ｐ．５０３，１９７
５年に記載のＳｏｕｔｈｅｒｎの方法に従う毛管現象に
よるトランスファー。但し、例えばＰＡＬＬ市販の“Ｂ
ｉｏｄｙｎｅ”タイプのナイロンフィルタ、ＤＢＭ（ジ
アゾベンジルオキシメチル）ペーパーの如き他のサポー
トも使用し得る（Ｎｏｙｅｓ及びＳｔａｒｋ， Ｃｅｌ
ｌ第５巻 ｐ３０１，１９７５年、Ａｌｗｉｎｅ他、１
９７７年、ＰＮＡＳ，１９７４年、ｐ．５３５０、Ｋｅ
ｍｐ Ｃｏｌｌ．））。
【００４０】これらフィルタは下記の成分を含む溶液中
６５℃で２時間前ハイブリッド形成にかける。
６５℃で２時間前ハイブリッド形成にかける。
【００４１】 −ＮａＣｌ ３００ｍＭ −クエン酸ナトリウム，ｐＨ７ ３０ｍＭ −Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から Ｆｉｃｏｌｌ ４００の名称で市販されている試薬 ０．１％ −ポリビニルピロリドン３５０ ０．１％ −グリシン ０．１％ 修飾されたプローブ（ＤＮＡ−ＡＡＩＦ又はＲＮＡ−Ａ
ＡＩＦ）とのハイブリッド形成は下記の如き溶液中で６
５℃で所望時間行なう。
ＡＩＦ）とのハイブリッド形成は下記の如き溶液中で６
５℃で所望時間行なう。
【００４２】 −ＮａＣｌ ３００ｍＭ −クエン酸ナトリウム，ｐＨ７ ３０ｍＭ −Ｆｉｃｏｌｌ ４００ ０．０２％ −ポリビニルピロリドン３５０ ０．０２％ −グリシン ０．０２％ −ＫＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ７ ２５ｍＭ −ＥＤＴＡ，ｐＨ７ ２ｍＭ −ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） ０．５％ ハイブリッド形成操作の所要時間はプローブの濃度と所
望の配列の複雑さとに依存する。この時間は公知の方法
で計算し得る。核酸の再結合を促進する物質（例えば硫
酸デキストラン）又はハイブリッド形成温度を低下させ
る物質（例えばホルムアミド）の使用も可能である。
望の配列の複雑さとに依存する。この時間は公知の方法
で計算し得る。核酸の再結合を促進する物質（例えば硫
酸デキストラン）又はハイブリッド形成温度を低下させ
る物質（例えばホルムアミド）の使用も可能である。
【００４３】ハイブリッド形成後は文献に開示されてい
る一般的プロトコールに従い過剰プローブを除去すべく
フィルタを洗浄する。
る一般的プロトコールに従い過剰プローブを除去すべく
フィルタを洗浄する。
【００４４】プローブの検出 ハイブリッド化されたフィルタを次の処理にかける。
【００４５】−下記の成分を含む溶液中で室温で１時間
インキュベートすることによりタンパク質を飽和させ
る。
インキュベートすることによりタンパク質を飽和させ
る。
【００４６】 −子ウシ血清 ２０％ −ＮａＣｌ ３００ｎＭ −クエン酸Ｎａ，ｐＨ７ ３０ｎＭ −ＮＰ４０ １％ （飽和用溶液） −第１抗体（修飾ＡＡＩＦを認識する抗体）の存在下に
室温で１時間おく。この抗体は前記飽和用溶液で希釈す
る。希釈率は使用する抗体によって異なる。
室温で１時間おく。この抗体は前記飽和用溶液で希釈す
る。希釈率は使用する抗体によって異なる。
【００４７】−下記の成分を含む溶液で洗浄する。
【００４８】 −ＮａＣｌ ３００ｍＭ −クエン酸ナトリウム，ｐＨ７ ３０ｍＭ −ＮＰ４０ １％ （洗浄用溶液） −第１抗体を認識する第２抗体と共に室温で１時間イン
キュベートする（第１抗体がウサギ抗体の場合は第２抗
体として例えばアルカリホスファターゼと結合する抗ウ
サギＩｇＧ抗体などを使用し得る）。第２抗体は前記飽
和用溶液で希釈するがその希釈率は使用する抗体によっ
て異なる。
キュベートする（第１抗体がウサギ抗体の場合は第２抗
体として例えばアルカリホスファターゼと結合する抗ウ
サギＩｇＧ抗体などを使用し得る）。第２抗体は前記飽
和用溶液で希釈するがその希釈率は使用する抗体によっ
て異なる。
【００４９】−前述の洗浄用溶液と同一の溶液で洗浄す
る。
る。
【００５０】−公知技術（例えばアルカリホスファター
ゼの呈色酵素反応）により第２抗体を顕現させる。
ゼの呈色酵素反応）により第２抗体を顕現させる。
【００５１】測定の感度 ターゲットとしてウイルス（λファージ）ＤＮＡ又はヒ
ト遺伝子（胎児ゼータグロビン，４６０ｐｂ）もしくは
マウス遺伝子（リボソームＤＮＡ，６．６ｋｂ）をバク
テリアプラスミド（ｐＢＲ３２２）中でクローン化した
ものを用い、プローブとして二重鎖ＤＮＡ（λファージ
ＤＮＡ又はプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ）、一重鎖Ｄ
ＮＡ（ヒトゼータグロビンの４６４ｐｂが挿入されたＭ
１３ファージＤＮＡ）又はＲＮＡ（ウシリボソームＲＮ
Ａ）を用いてテストを行なった。
ト遺伝子（胎児ゼータグロビン，４６０ｐｂ）もしくは
マウス遺伝子（リボソームＤＮＡ，６．６ｋｂ）をバク
テリアプラスミド（ｐＢＲ３２２）中でクローン化した
ものを用い、プローブとして二重鎖ＤＮＡ（λファージ
ＤＮＡ又はプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ）、一重鎖Ｄ
ＮＡ（ヒトゼータグロビンの４６４ｐｂが挿入されたＭ
１３ファージＤＮＡ）又はＲＮＡ（ウシリボソームＲＮ
Ａ）を用いてテストを行なった。
【００５２】プローブを検出すべく、第１抗体として希
釈度１／２００の抗グアノシン−ＡＡＦウサギ抗体（未
処理血清）を用い、第２抗体としてアルカリホスファタ
ーゼと結合する抗ウサギＩｇＧ抗体を希釈度１／４００
で使用した。
釈度１／２００の抗グアノシン−ＡＡＦウサギ抗体（未
処理血清）を用い、第２抗体としてアルカリホスファタ
ーゼと結合する抗ウサギＩｇＧ抗体を希釈度１／４００
で使用した。
【００５３】この条件下で得られた感度は次の通りであ
るる −５００ｎｇ／ｍｌ（５００×１０-9ｇ／ｍｌ）以上の
濃度で使用した二重鎖ＤＮＡからなるプローブの場合：
２ｐｇ（２×１０-12 ｇ）のターゲットＤＮＡを上回る
感度。
るる −５００ｎｇ／ｍｌ（５００×１０-9ｇ／ｍｌ）以上の
濃度で使用した二重鎖ＤＮＡからなるプローブの場合：
２ｐｇ（２×１０-12 ｇ）のターゲットＤＮＡを上回る
感度。
【００５４】−１００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で使用した
一重鎖ＤＮＡからなるプローブの場合：２ｐｇのターゲ
ットＤＮＡを上回る感度 −濃度２００ｎｇ／ｍｌのリボソームＲＮＡからなるプ
ローブの場合：約２００ｐｇの感度 尚、２ｐｇのターゲットＤＮＡという感度は７μｇのヒ
ト全ＤＮＡ中で１０００ｐｂの遺伝子が検出されたこと
を意味する。この感度は鎌状赤血球貧血の産前診断に必
要な感度と同程度のものである。
一重鎖ＤＮＡからなるプローブの場合：２ｐｇのターゲ
ットＤＮＡを上回る感度 −濃度２００ｎｇ／ｍｌのリボソームＲＮＡからなるプ
ローブの場合：約２００ｐｇの感度 尚、２ｐｇのターゲットＤＮＡという感度は７μｇのヒ
ト全ＤＮＡ中で１０００ｐｂの遺伝子が検出されたこと
を意味する。この感度は鎌状赤血球貧血の産前診断に必
要な感度と同程度のものである。
【００５５】ＤＮＡ−ＡＡＦプローブ及びＤＮＡ−ＡＡ
ＩＦプローブの感度の比較 リボ核酸又はデオキシリボ核酸は中性ｐＨでＡＡＦ及び
ＡＡＩＦと容易にｉｎｖｉｔｒｏ反応する。その誘導体
は前述の条件下で共有結合により原則としてグアニン残
基の炭素８と結合する。ウサギをＤＮＡ−ＡＡＦプロー
ブ及びＧｕｏ−ＡＡＦで免疫化して得た抗体はＡＡＦで
修飾したＤＮＡを特異的に認識し、ＡＡＩＦで修飾した
ＤＮＡ及びＲＮＡも認識する。表Ｉにまとめた結果から
明らかなように、ＤＮＡをＡＡＩＦで修飾するとより多
量のＤＮＡが沈物中に検出される。
ＩＦプローブの感度の比較 リボ核酸又はデオキシリボ核酸は中性ｐＨでＡＡＦ及び
ＡＡＩＦと容易にｉｎｖｉｔｒｏ反応する。その誘導体
は前述の条件下で共有結合により原則としてグアニン残
基の炭素８と結合する。ウサギをＤＮＡ−ＡＡＦプロー
ブ及びＧｕｏ−ＡＡＦで免疫化して得た抗体はＡＡＦで
修飾したＤＮＡを特異的に認識し、ＡＡＩＦで修飾した
ＤＮＡ及びＲＮＡも認識する。表Ｉにまとめた結果から
明らかなように、ＤＮＡをＡＡＩＦで修飾するとより多
量のＤＮＡが沈物中に検出される。
【００５６】抗ＤＮＡ−ＡＡＦ抗体は少量の正常ＤＮＡ
を沈降させる。修飾ＤＮＡを非修飾ＤＮＡから区別すべ
く、好ましくは抗Ｇｏｕ−ＡＡＦ抗体を用いる。このよ
うにするとより良い結果が得られる。即ち、精製抗Ｇｕ
ｏ−ＡＡＦ抗体を用いると非修飾ＤＮＡは無視し得る量
しか沈降せず、そのためこの種のプローブを用いて特定
遺伝子配列を複合混合物から分離することが可能にな
る。
を沈降させる。修飾ＤＮＡを非修飾ＤＮＡから区別すべ
く、好ましくは抗Ｇｏｕ−ＡＡＦ抗体を用いる。このよ
うにするとより良い結果が得られる。即ち、精製抗Ｇｕ
ｏ−ＡＡＦ抗体を用いると非修飾ＤＮＡは無視し得る量
しか沈降せず、そのためこの種のプローブを用いて特定
遺伝子配列を複合混合物から分離することが可能にな
る。
【００５７】核化学（ｎｕｃｌｅｏｃｈｉｍｉｑｕｅ）
技術により修飾された核酸の検出を下記の如く行なう。
技術により修飾された核酸の検出を下記の如く行なう。
【００５８】修飾ＤＮＡをニトロセルロースフィルタに
固定し、これらフィルタを前述の処理にかける。調べる
パラメータの数が極めて多いため、この実験では操作し
易いという理由から直径２５ｍｍの円形小フィルタを用
いる。ＡＡＩＦで修飾したＤＮＡ（５％の修飾塩基）を
用いると、感度の限界は第２抗体がアルカリ性ホスファ
ターゼに結合する場合は１ｐｇより小さく、パーオキシ
ダーゼに結合する場合は約８ｐｇである。
固定し、これらフィルタを前述の処理にかける。調べる
パラメータの数が極めて多いため、この実験では操作し
易いという理由から直径２５ｍｍの円形小フィルタを用
いる。ＡＡＩＦで修飾したＤＮＡ（５％の修飾塩基）を
用いると、感度の限界は第２抗体がアルカリ性ホスファ
ターゼに結合する場合は１ｐｇより小さく、パーオキシ
ダーゼに結合する場合は約８ｐｇである。
【００５９】ＤＮＡの溶解温度はＡＡは及びＡＡＩＦで
修飾した塩基が１％の場合には夫々約１．１℃及び０．
４℃低下する（ＦＵＣＨＳ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，１５，３３４７〜３３５１；ＦＵＣＨＳ他、Ｆｅｂ
ｓ Ｌｅｔｔ．，３４，２９５〜２９８；ＫＲＩＥＫ
他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，１７７〜１８２；
ＫＡＰＵＬＥＲ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ，２３２，４３６〜４５０）。
修飾した塩基が１％の場合には夫々約１．１℃及び０．
４℃低下する（ＦＵＣＨＳ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，１５，３３４７〜３３５１；ＦＵＣＨＳ他、Ｆｅｂ
ｓ Ｌｅｔｔ．，３４，２９５〜２９８；ＫＲＩＥＫ
他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６，１７７〜１８２；
ＫＡＰＵＬＥＲ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ａｃｔａ，２３２，４３６〜４５０）。
【００６０】二重鎖ＤＮＡプローブに対するＡＡＦ及び
ＡＡＩＦでの修飾の効果を評価すべく斑点毎にハイブリ
ッド形成操作を行なった。３つのｐＢＲ３２２ＤＮＡ斑
点（４２２ｐｇ，２ｎｇ，２０ｎｇ）と１つのＤＮＡ斑
点（１ｎｇ）とをもつニトロセルロースフィルタを非修
飾の又はＡＡＦもしくはＡＡＩＦで修飾した塩基５％を
もつ放射性ＤＮＡプローブとのハイブリッド形成にかけ
る。ハイブリッド形成後所定フィルタアセンブリを適当
な洗浄力をもって洗浄し、乾燥させ且つ１８時間オート
ラジオグラフィにかける。非特異的ハイブリッド形成は
皆無であった。洗浄力を弱めても（ＮａＣｌ／クエン酸
ナトリウム、室温で１５分）結果は同じであった。
ＡＡＩＦでの修飾の効果を評価すべく斑点毎にハイブリ
ッド形成操作を行なった。３つのｐＢＲ３２２ＤＮＡ斑
点（４２２ｐｇ，２ｎｇ，２０ｎｇ）と１つのＤＮＡ斑
点（１ｎｇ）とをもつニトロセルロースフィルタを非修
飾の又はＡＡＦもしくはＡＡＩＦで修飾した塩基５％を
もつ放射性ＤＮＡプローブとのハイブリッド形成にかけ
る。ハイブリッド形成後所定フィルタアセンブリを適当
な洗浄力をもって洗浄し、乾燥させ且つ１８時間オート
ラジオグラフィにかける。非特異的ハイブリッド形成は
皆無であった。洗浄力を弱めても（ＮａＣｌ／クエン酸
ナトリウム、室温で１５分）結果は同じであった。
【００６１】ＤＮＡ斑点（１０ｐｇ，１００ｐｇ，１ｎ
ｇ，１０ｎｇ）をもつフィルタのハイブリッドの安定性
をテストする。これら斑点は先ず放射性修飾ＤＮＡプロ
ーブ又は対照プローブとのハイブリッド形成にかけ、そ
の後種々の洗浄力で洗浄する。
ｇ，１０ｎｇ）をもつフィルタのハイブリッドの安定性
をテストする。これら斑点は先ず放射性修飾ＤＮＡプロ
ーブ又は対照プローブとのハイブリッド形成にかけ、そ
の後種々の洗浄力で洗浄する。
【００６２】各洗浄力毎にフィルタアセンブリを乾燥さ
せオートラジオグラフィにかける。３つのプローブ間に
は何らの差異も認められなかった。非操作ＤＮＡとのハ
イブリッド形成にかけたフィルタは洗浄力に係りなく斑
点が全く見られない。ＡＡＦで修飾したプローブとのハ
イブリッド形成にかけたフィルタでは１０ｎｇに該当す
る斑点がかすかに見られる。ＡＡＩＦで修飾したプロー
ブとのハイブリッド形成にかけたフィルタでは１ｎｇに
該当する斑点も見える。
せオートラジオグラフィにかける。３つのプローブ間に
は何らの差異も認められなかった。非操作ＤＮＡとのハ
イブリッド形成にかけたフィルタは洗浄力に係りなく斑
点が全く見られない。ＡＡＦで修飾したプローブとのハ
イブリッド形成にかけたフィルタでは１０ｎｇに該当す
る斑点がかすかに見られる。ＡＡＩＦで修飾したプロー
ブとのハイブリッド形成にかけたフィルタでは１ｎｇに
該当する斑点も見える。
【００６３】前述のいずれの実験でも、プローブ濃度は
２ｎｇ／ｍｌ、比活性は５×１０7 ｃｐｍ／μｇ，オー
トラジオグラフィは１８時間である。この条件下では夫
々ＡＡＦ及びＡＡＩＦで修飾したプローブを用いて得ら
れる検出感度はオートラジオグラフィによって得られる
感度に比べて約１／１００及び１／１０である。
２ｎｇ／ｍｌ、比活性は５×１０7 ｃｐｍ／μｇ，オー
トラジオグラフィは１８時間である。この条件下では夫
々ＡＡＦ及びＡＡＩＦで修飾したプローブを用いて得ら
れる検出感度はオートラジオグラフィによって得られる
感度に比べて約１／１００及び１／１０である。
【００６４】如何なるタイプの核酸もＡＡＦ又はＡＡＩ
Ｆで修飾し得るため、一重鎖Ｍ１３ＤＮＡプローブと免
疫核ＲＮＡ（ｉｍｍｕｎｏｎｕｃｌｅｉｑｕｅ ＲＮ
Ａ）プローブとをハイブリッド形成テストで使用する可
能性を調べた。一重鎖Ｍ１３ＤＮＡを用いるハイブリッ
ド形成では各フィルタにλファージＤＮＡの非操作斑点
１つと種々の量のプラスミド４ｐ７−７ＤＮＡ斑点とを
与える。ゼータグロビンの４６４の塩基対が同様に挿入
されたＭ１３組換え体ファージの一重鎖ＤＮＡをＡＡＦ
又はＡＡＩＦで修飾する（５％の修飾塩基対）。プロー
ブ濃度を１２５〜１５００ｎｇ／ｍｌまで様々に変えて
テストする。ハイブリッド形成及び洗浄は６５℃で行な
う。この場合、プローブのハイブリッド形成可能配列の
濃度は約３３ｎｇ／ｍｌ、斑点上のターゲット配列は６
６０〜５ｎｇである。陰性非操作斑点以外は全ての斑点
が着色される。これら斑点の着色度はＡＡＩＦで修飾し
たプローブを用いた時の方が強い。
Ｆで修飾し得るため、一重鎖Ｍ１３ＤＮＡプローブと免
疫核ＲＮＡ（ｉｍｍｕｎｏｎｕｃｌｅｉｑｕｅ ＲＮ
Ａ）プローブとをハイブリッド形成テストで使用する可
能性を調べた。一重鎖Ｍ１３ＤＮＡを用いるハイブリッ
ド形成では各フィルタにλファージＤＮＡの非操作斑点
１つと種々の量のプラスミド４ｐ７−７ＤＮＡ斑点とを
与える。ゼータグロビンの４６４の塩基対が同様に挿入
されたＭ１３組換え体ファージの一重鎖ＤＮＡをＡＡＦ
又はＡＡＩＦで修飾する（５％の修飾塩基対）。プロー
ブ濃度を１２５〜１５００ｎｇ／ｍｌまで様々に変えて
テストする。ハイブリッド形成及び洗浄は６５℃で行な
う。この場合、プローブのハイブリッド形成可能配列の
濃度は約３３ｎｇ／ｍｌ、斑点上のターゲット配列は６
６０〜５ｎｇである。陰性非操作斑点以外は全ての斑点
が着色される。これら斑点の着色度はＡＡＩＦで修飾し
たプローブを用いた時の方が強い。
【００６５】ＡＡＩＦで修飾したＲＮＡプローブを用い
て同様のテストを行なう。
て同様のテストを行なう。
【００６６】ウシ肝臓リボソームＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、
Ｒｅｆ．Ｒ５５０２）をクエン酸塩緩衝液（２ｍＭ，ｐ
Ｈ６．７）中に溶解し、短時間音波処理して約１０００
塩基の断片に細分し、ＡＡＩＦで修飾する。ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（１００ｎｇ）を用いて陰性対照斑点を形成
し、６．６ｋｂのマウス４５ＳリボソームＤＮＡが挿入
された組換え体プラスミドｐＷＥ６のＤＮＡを用いて種
々の量の斑点を形成する。これら斑点上のハイブリッド
形成可能配列の量は約３０ｎｇ〜２３０ｐｇである。プ
ローブ濃度は２００〜２３００ｎｇ／ｍｌまで様々に変
える。これ以上高い濃度にしても着色度は殆ど変わらな
い。高濃度免疫核プローブを使用するとフィルタのバッ
クグラウンド放射活性が極めて低い状態に保持される。
高いプローブ濃度を使用し得るとハイブリッド形成操作
を短時間で行ないたい時に有利である。
Ｒｅｆ．Ｒ５５０２）をクエン酸塩緩衝液（２ｍＭ，ｐ
Ｈ６．７）中に溶解し、短時間音波処理して約１０００
塩基の断片に細分し、ＡＡＩＦで修飾する。ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ（１００ｎｇ）を用いて陰性対照斑点を形成
し、６．６ｋｂのマウス４５ＳリボソームＤＮＡが挿入
された組換え体プラスミドｐＷＥ６のＤＮＡを用いて種
々の量の斑点を形成する。これら斑点上のハイブリッド
形成可能配列の量は約３０ｎｇ〜２３０ｐｇである。プ
ローブ濃度は２００〜２３００ｎｇ／ｍｌまで様々に変
える。これ以上高い濃度にしても着色度は殆ど変わらな
い。高濃度免疫核プローブを使用するとフィルタのバッ
クグラウンド放射活性が極めて低い状態に保持される。
高いプローブ濃度を使用し得るとハイブリッド形成操作
を短時間で行ないたい時に有利である。
【００６７】これらの結果全体から判断するとＡＡＩＦ
で修飾した核酸は特定配列の検出に適した性質を有する
と考えられる。
で修飾した核酸は特定配列の検出に適した性質を有する
と考えられる。
【００６８】ＡＡＦに代えてヨウ素含有誘導体ＡＡＩＦ
を用いると感度は１０倍になる。
を用いると感度は１０倍になる。
【００６９】また、使用する第２抗体がアルカリホスフ
ァターゼに結合する場合は感度がピコグラムの範囲にな
る。
ァターゼに結合する場合は感度がピコグラムの範囲にな
る。
【００７０】本発明は勿論以上説明してきた非限定的実
施例には限定されず、その範囲内で種々の変形が可能で
ある。
施例には限定されず、その範囲内で種々の変形が可能で
ある。
【００７１】本発明のプローブと共に形成したハイブリ
ッドを検出するために使用し得る別の方法として、例え
ば抗体に固定されるヨウ素１２５もしくは１３１又放射
性プロテインＡで放射能を保持させた抗ＤＮＡ−ＡＡＦ
抗体を使用することなどにより、形成されたハイブリッ
ドの（放射能による）顕現行なってもよい。
ッドを検出するために使用し得る別の方法として、例え
ば抗体に固定されるヨウ素１２５もしくは１３１又放射
性プロテインＡで放射能を保持させた抗ＤＮＡ−ＡＡＦ
抗体を使用することなどにより、形成されたハイブリッ
ドの（放射能による）顕現行なってもよい。
【００７２】また、本発明のプローブは別の使用例とと
して、出発組成物に含まれる相補的ＤＮＡの精製に用い
ることもできる。その場合は主に、 −固体サポート（例えばアガロース球で構成したもの）
に結合したプロテインＡ， −固体サポート（アガロース球、ラテックス球等）に固
定された又は固定されていない沈降作用抗体 を用いて形成されたハイブリッドの選択的沈降を生起せ
しめる。
して、出発組成物に含まれる相補的ＤＮＡの精製に用い
ることもできる。その場合は主に、 −固体サポート（例えばアガロース球で構成したもの）
に結合したプロテインＡ， −固体サポート（アガロース球、ラテックス球等）に固
定された又は固定されていない沈降作用抗体 を用いて形成されたハイブリッドの選択的沈降を生起せ
しめる。
【００７３】このように本発明は次式
【００７４】
【化１】
【００７５】で示されるＮ−２−アセチルアミノ−７−
ヨードフルオレン基と等価の修飾基によって標識した全
てのプローブをその範囲内に包含する。
ヨードフルオレン基と等価の修飾基によって標識した全
てのプローブをその範囲内に包含する。
【００７６】これらマーカー基の等価物としては、７位
のヨウ素原子がヨウ素と同様にフルオレン核の挿入を不
可能にする別の単一原子又は複数の原子からなる置換基
で置換された全ての基が挙げられる。この場合フルオレ
ン核は２つの塩基対間で前記置換原子又は置換基と結合
する。このような置換基はたとえばアルキル基、特にメ
チル基又は好ましくは３級ブチル基で構成される。ペプ
チド基を用いてもよい。また、フルオレン核上の置換を
例えば９位など別の部位で任意に行なってもよい。例え
ば９位の二重メチル化がこれに当たる。
のヨウ素原子がヨウ素と同様にフルオレン核の挿入を不
可能にする別の単一原子又は複数の原子からなる置換基
で置換された全ての基が挙げられる。この場合フルオレ
ン核は２つの塩基対間で前記置換原子又は置換基と結合
する。このような置換基はたとえばアルキル基、特にメ
チル基又は好ましくは３級ブチル基で構成される。ペプ
チド基を用いてもよい。また、フルオレン核上の置換を
例えば９位など別の部位で任意に行なってもよい。例え
ば９位の二重メチル化がこれに当たる。
【００７７】フルオレン基に他の置換基を導入するか又
は本質的免疫特性を変化させない置換基でフルオレン基
を修飾しても、このように修飾されたＤＮＡプローブが
Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−アセチルアミノフ
ルオレン又は該基の修飾の結果得られる分子に対して予
め形成した抗体により必ず認識される以上は、等価物し
か構成されれ得ない。但しこれらの修飾は前記タイプの
分子に対する抗体の産生に必要な範囲の水溶液への可溶
性を損なうものであってはならない。周知の如くこの免
疫化は問題の分子をその免疫性の強化に役立つ担体分
子、例えば血清アルブミンと結合させた後で行なうのが
普通である。前記可溶性を損なうことのない別の就職法
として、Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−２−アセ
チルアミノフルオレンにおけるＮ−２−アセチル基をＮ
−２−ホルミル基又はＮ−２−プロピオニル基で置換す
る方法も挙げられる。
は本質的免疫特性を変化させない置換基でフルオレン基
を修飾しても、このように修飾されたＤＮＡプローブが
Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−アセチルアミノフ
ルオレン又は該基の修飾の結果得られる分子に対して予
め形成した抗体により必ず認識される以上は、等価物し
か構成されれ得ない。但しこれらの修飾は前記タイプの
分子に対する抗体の産生に必要な範囲の水溶液への可溶
性を損なうものであってはならない。周知の如くこの免
疫化は問題の分子をその免疫性の強化に役立つ担体分
子、例えば血清アルブミンと結合させた後で行なうのが
普通である。前記可溶性を損なうことのない別の就職法
として、Ｎ−２−（グアノシン−８−イル）−２−アセ
チルアミノフルオレンにおけるＮ−２−アセチル基をＮ
−２−ホルミル基又はＮ−２−プロピオニル基で置換す
る方法も挙げられる。
【００７８】
【表１】
【００７９】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09
Claims (4)
- 【請求項１】 所定核酸の配列又は断片をこれを含み得
る組成物中で検出し且つ特徴を明らかにするための方法
であって、前記組成物の核酸を、ハイブリッド形成が生
起し得るような条件下で、所望の核酸の相補的配列を含
み、且つその塩基の少なくとも１つに共有結合で固定さ
れた７−ヨード−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン基
（ＡＡＩＦ基）を少なくとも１つ有するプローブと接触
させ、次いでこのプローブと前記組成物中に当初から含
まれている核酸との間で形成され得るハイブリッドを視
覚化することを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】 視覚化を、Ｎ−２−（グアノシン−８−
イル）−アセチルアミノフルオレンと反応し得る抗体か
又はＮ−２−アセチルアミノフルオレン基で修飾された
核酸配列に対し予め形成された抗体（ＡＡＦ抗体）を用
いて行なうことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 視覚化を、抗ＡＡＦ抗体と反応し得且つ
酵素もしくは螢光分子の如きマーカーを担持している別
の抗体又は別のポリペプチドをさらに用いて行なうこと
を特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 プローブが、前記相補的配列である特定
核酸配列を含むクローン化されたプローブであって、こ
の特定配列が異種であるベクター又はその断片に挿入さ
れており且つＡＡＩＦ基で修飾されているプローブであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
か一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8400607A FR2558172B1 (fr) | 1984-01-16 | 1984-01-16 | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissance par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde et de ces anticorps specifiques pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| FR8400607 | 1984-01-16 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60005610A Division JPH0740960B2 (ja) | 1984-01-16 | 1985-01-16 | 核酸検出用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07246100A true JPH07246100A (ja) | 1995-09-26 |
Family
ID=9300153
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60005610A Expired - Lifetime JPH0740960B2 (ja) | 1984-01-16 | 1985-01-16 | 核酸検出用キット |
| JP6228365A Pending JPH07246100A (ja) | 1984-01-16 | 1994-09-22 | 核酸の検出方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60005610A Expired - Lifetime JPH0740960B2 (ja) | 1984-01-16 | 1985-01-16 | 核酸検出用キット |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4963477A (ja) |
| EP (1) | EP0158758B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0740960B2 (ja) |
| AT (1) | ATE37551T1 (ja) |
| CA (1) | CA1258623A (ja) |
| DE (1) | DE3474305D1 (ja) |
| ES (1) | ES8605862A1 (ja) |
| FR (1) | FR2558172B1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3431536A1 (de) * | 1984-08-28 | 1986-03-13 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Derivatisierte nucleinsaeure-sequenz, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum nachweis von nucleinsaeuren |
| FI72146C (fi) * | 1985-01-02 | 1987-04-13 | Orion Yhtymae Oy | Foerfarande foer identifiering av nukleinsyror. |
| AU558846B2 (en) * | 1985-06-21 | 1987-02-12 | Miles Laboratories Inc. | Solid-phase hydridization assay using anti-hybrid antibodies |
| US4876187A (en) * | 1985-12-05 | 1989-10-24 | Meiogenics, Inc. | Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences |
| AU1070588A (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-04 | Diagnostic Products Corporation | Measuring anti-dna antibodies |
| US5552541A (en) * | 1990-06-20 | 1996-09-03 | Beckman Instruments, Inc. | Haptenic probes for detecting capture polynucleotides |
| JP2649100B2 (ja) * | 1990-10-30 | 1997-09-03 | Nitsuhon Deii Pii Shii Corp | 標準曲線における抗原結合率と抗二本鎖ｄｎａ抗体価の比例関係を改善するためのｓｌｅ疾患の検知法及び検知用キット |
| US5329461A (en) * | 1992-07-23 | 1994-07-12 | Acrogen, Inc. | Digital analyte detection system |
| US5523208A (en) * | 1994-11-30 | 1996-06-04 | The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Method to discover genetic coding regions for complementary interacting proteins by scanning DNA sequence data banks |
| US5846729A (en) * | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
| US6046004A (en) * | 1997-02-27 | 2000-04-04 | Lorne Park Research, Inc. | Solution hybridization of nucleic acids with antisense probes having modified backbones |
| US6060242A (en) * | 1997-02-27 | 2000-05-09 | Lorne Park Research, Inc. | PNA diagnostic methods |
| US6251591B1 (en) | 1997-02-27 | 2001-06-26 | Lorne Park Research, Inc. | Quantitative method for detecting nucleotide concentration |
| US6255050B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-07-03 | Lorne Park Research, Inc. | Dynamic hybridization system |
| US6858390B2 (en) | 1998-12-31 | 2005-02-22 | Ingeneus Corporation | Aptamers containing sequences of nucleic acid or nucleic acid analogues bound homologously, or in novel complexes |
| US6403313B1 (en) | 1999-12-21 | 2002-06-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity assay for duplex and triplex nucleic acid hybridization solution utilizing fluorescent intercalators |
| US6656692B2 (en) | 1999-12-21 | 2003-12-02 | Ingeneus Corporation | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US6420115B1 (en) | 1999-12-21 | 2002-07-16 | Ingeneus Corporation | Cation mediated triplex hybridization assay |
| US6645733B1 (en) | 1999-06-25 | 2003-11-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity method for assaying binding between proteins or peptides |
| US6927027B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-09 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid multiplex formation |
| US7052844B2 (en) * | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
| US6924108B2 (en) | 1999-12-21 | 2005-08-02 | Ingeneus Corporation | Nucleic acid binding enhancement by conjugation with nucleotides, nucleosides, bases and/or their analogues |
| US6911536B1 (en) | 1999-12-21 | 2005-06-28 | Ingeneus Corporation | Triplex and quadruplex catalytic hybridization |
| US7309569B2 (en) | 1999-12-21 | 2007-12-18 | Ingeneus, Inc. | Parallel or antiparallel, homologous or complementary binding of nucleic acids or analogues thereof to form duplex, triplex or quadruplex complexes |
| US20030181412A1 (en) * | 1999-12-21 | 2003-09-25 | Ingeneus Corporation | Method for modifying transcription and/or translation in an organism for therapeutic, prophylactic and/or analytic uses |
| US20030170659A1 (en) * | 2000-01-24 | 2003-09-11 | Ingeneus Corporation | Electrical treatment of binding media to encourage, discourage and/or study biopolymer binding |
| US7220541B2 (en) * | 2000-01-24 | 2007-05-22 | Ingeneus, Inc. | Homogeneous assay of biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
| US6982147B2 (en) * | 2000-01-24 | 2006-01-03 | Ingeneus Corporation | Apparatus for assaying biopolymer binding by means of multiple measurements under varied conditions |
| US6613524B1 (en) | 2000-01-24 | 2003-09-02 | Ingeneus Corporation | Amperometric affinity assay and electrically stimulated complexes of nucleic acids |
| EP2511380B1 (en) * | 2011-04-15 | 2013-12-25 | Diagenode S.A. | Method and apparatus for fragmenting DNA sequences |
| WO2015025862A1 (ja) * | 2013-08-21 | 2015-02-26 | 富士レビオ株式会社 | 異種核酸プローブを用いた修飾核酸塩基の測定方法およびキット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| FR2518755B1 (fr) * | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
| DE3485811T2 (de) * | 1983-05-31 | 1993-01-07 | Orgenics Ltd | Molekulare genetische sonde und verfahren zu ihrer herstellung, testmethode und satz in denen diese molekulare genetische sonde gebraucht wird. |
| US4623627A (en) * | 1983-08-19 | 1986-11-18 | Cetus Corporation | Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same |
-
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- 1984-01-16 FR FR8400607A patent/FR2558172B1/fr not_active Expired
- 1984-12-28 EP EP84402765A patent/EP0158758B1/fr not_active Expired
- 1984-12-28 AT AT84402765T patent/ATE37551T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-12-28 DE DE8484402765T patent/DE3474305D1/de not_active Expired
-
1985
- 1985-01-15 CA CA000472097A patent/CA1258623A/en not_active Expired
- 1985-01-15 ES ES539560A patent/ES8605862A1/es not_active Expired
- 1985-01-16 JP JP60005610A patent/JPH0740960B2/ja not_active Expired - Lifetime
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- 1989-03-28 US US07/330,987 patent/US4963477A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-22 JP JP6228365A patent/JPH07246100A/ja active Pending
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