JPH0740B2 - 感染症原因菌の検出および同定のための方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、感染症の診断システム及び当該システムに用
いるための微生物の検出と微生物の同定の方法に関す
る。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

感染とは、病理学的に、病原性の微生物（以下「菌」と
称する）が生体内に侵入し、増殖の足がかりを確立する
ことを指す。その感染による発症は宿主生体の抵抗力と
菌の毒力との相互関係に依存する。

感染症の中でも、菌血症の治療方法の改善は、下記の通
り重要課題とされている。

すなわち、菌血症は、特定の細菌による病気ではなく様
々な菌が血液中に出現して棲息することにより始まり、
臨床的には40度近い熱が２日以上続いた場合にその発病
を疑う。

症状が高熱であり、また、放置すれば、数日あるいは、
特に小児、癌の末期で生体の抵抗力が弱まった状態の患
者の場合では１〜２日で死亡に至る、という重症かつ緊
急な病気である。

感染症において、生体組織内では第一義的には好中球、
単球及びマクロファージ系の食細胞がその防御に働いて
いる。

菌血症での血液中への菌の出現とは、食細胞との戦い
で、優勢になった菌が組織から血液中に侵出してきたこ
とと考えられる。

菌血症は、このような菌の出現に至った状態を言い、治
療に際しては、起因菌に感受性のある抗生物質を大量に
投与することになる。

ところが抗生物質は一般に、肝臓など生体（臓器）の機
能を低下させるものであるから、危険な状態にある患者
に有効でない抗生物質を与えることは極力避けなければ
ならない。

一般に、細胞の食菌力が菌の毒力に及ばず、菌が全身の
血流中に拡がる場合を菌血症（bacteremia）と定義すれ
ば、菌の産生する毒素の働きで、重い症状を示す菌血症
を、敗血症（sepsis）と言う。そして、敗血症の証明
（すなわち、診断の確立）には、（１）臨床症状、
（２）培養、（３）グラム染色、及び（４）ショック状
態の確認が重要項目であり、これらの項目が満たされて
初めて治療方針が決定される。

したがって、治療には、迅速かつ確実な菌の同定が不可
欠とされている。

この菌の同定の現行方法によると、菌血症を疑われた検
体の検査室での菌の検出・同定において、ルーチンとし
て、カルチャー・ボトル（以下、「Ｃ・Ｂ」と称する）
陽性の検体に限って、選択培地を用いて起因菌の同定が
行われるのが一般的な手順である。しかしながら、実際
にはこれらの血液検体からの菌の培養の成功率は極めて
低い。しかも、菌血症を疑われた時点で、大量に抗生物
質を投与されている場合には、たとえ血液中に菌が含ま
れていたとしても、増菌・発育できない場合が多く、そ
れ故、Ｃ・Ｂ陽性になる割合は極めて小さい。

また、サブルーチンとしての方法として、菌体成分や菌
の代謝産物の機器分析法〔辨野義己、ガスクロマトグラ
フィーによる細菌同定の迅速化、臨床検査、vol.No.12,
1985年11月、医学書院参照〕、特異抗体を利用した方法
〔特開昭60−224068号参照〕、さらには、DNAの特異性
を利用したハイブリダイゼーションによるもの〔特表昭
61−502376号参照〕でその特異性に基づいた正確性の高
い方法等が開発されているが、いずれも、菌の分離及び
増菌培養が不可欠である。

一方、感染症における食細胞の働きに着目したものに、
血液試料中の白血球成分が集中しているバフィーコート
（Buffycoat）の塗抹染色標本を検鏡する方法がある。

一般にバフィーコート標本で菌が検出される頻度は、成
人菌血症では耳朶血とそれと同様に30％にとどまるが、
新生児では、10例中７例（70％）で菌を検出している報
告もあり、塗抹標本の検鏡により末梢血中菌の有無に関
する情報は治療に大きな指針となっている。

このように、本来、迅速性・確実性が要求される診断分
野にもかかわらず、従来法は、ほとんど治療に寄与して
いるとは言えない。

従来技術の前段における前処理では、少なくとも検体か
らの選択的分離に１〜２日、増菌に１日、固定操作で１
日以上、合計で３〜４日は十分かかり、現実にはこの培
養を菌が発育するまで続けるわけであるので、Ｃ・Ｂ陽
性になった場合ですら一週間以上かかる場合が多い。従
って、このことが従来法でのＣ・Ｂ陽性での死亡率を高
くしている要因となっている。例えば、「日本感染症学
誌」、vol.58,No.2,pp.122、1984年の報告によれば、血
液培養陽性率が28.6％（163/569件）でも、その内死亡
率が84.6％（138/163件）にまで到っていることが報告
されている。

その上、培養では常在する菌が混入しても区別できない
場合もある。

例えば、菌血症の起因菌として有力視されている１つで
ある、ブドウ球菌のなかの表皮ブドウ球菌（エピデルミ
ーデス（Epidermides）とよばれるものは、正常人の皮
膚にもある菌なので、注射針を皮膚に刺す時にこれを取
り込み検体中に混ざってしまう虞がある。

そして重要なことは、前述した事情から培養すべき検体
中では多くの菌は前記食細胞に取り込まれ、抗生物質投
与のため死んでいるか静止状態にあるため、培養条件下
であるとしても増殖できる菌の数は少ない。このため、
実際に臨床検体を用いての培養による菌の検出率は10％
前後と、非常に低くくなっている。

つまり、臨床的に菌血症を疑うべき患者の血液をさらに
一昼夜以上培養して検査しても結局、その90％は菌の存
在すら判明しないのが現状である。そこで現在では、臨
床的に敗血症を疑った段階で、検出結果が出るのを待た
ずに治療を開始していることは前述の通りである。すな
わち、最も広範囲な種類の菌に効く、抗生物質を投与
し、１、２日様子を見て、効果が現れないと別の抗生物
質に切換えるという試行方法である。

また、先述した染色法では、生体成分も菌と同様に染色
されるから、その像の中から形態によってのみ、迅速に
菌を判別するのは熟練が必要であり、判定が困難な場合
もある。

一般に細胞は染色して見ることができる。そして、細胞
は、入ってきた菌の外側を被う蛋白質を消化しようとす
る。入りたての菌は外側蛋白質がそのまま残って染色さ
れるが、次第に外側の蛋白質は分解され、次いでDNA又
はRNAが壊れると推定されるが、これらの蛋白質やDNA又
はRNAがどの程度まで分解されているか明らかではな
い。

いずれにせよ、このようにDNA又はRNAの方がより長く維
持されていると推定されるので、細胞内の菌を同定する
のであれば、細胞内消化程度の大きい蛋白質にではな
く、より変性程度の低く保存程度の高いDNA又はRNAに注
目すれば効率がよく正確であろう。また、取り込まれ
て、菌自体が抵抗性を持ち、残存している場合は言うま
でもない。例えば、敗血症の主要起因菌ではないが食細
胞内で生存することができる、例えば、マイコバクテリ
ウム（Mycobacterium）、ツベルクローシス（Tuberculo
sis）、リステリア（Listeria）、サルモネラ（Salmone
lla）、ブルセラ（Brucella）、レジオネラ・ニューモ
フィラ（Lationella pneumothila）等があり、本発明の
診断方法に適用可能である。

実験によっても、細胞が菌を取り込んだのち、菌のDNA
またはRNAの特異性は保持されていることが裏付けられ
ている。

〔問題点を解決するための手段〕

感染症の治療のための診断において、検体中の菌を確定
することが検査の最終の目的である。

本発明においては、その作業を効率的に進めるために、
下記方法（１）及び該方法（１）に適用可能な下記方法
（２）および（３）の提供を目的とする。

（１）食細胞に菌が取り込まれていることを確認した検
体について、その菌を同定する。

（２）食細胞に取り込まれた状態の菌を検出することに
より、高率に検出する。

（３）食細胞に取り込まれた菌を増菌せずに直接検出す
ることにより、菌を迅速にかつ正確に同定する。

すなわち、本願発明の要旨とするところは： ［１］感染症原因菌の同定方法であって、 （ａ）血液、腹水、透析液、尿、および膿からなるグル
ープから選択された生体成分から調製した食細胞を多量
に含む検体を固定し、 （ｂ）感染症原因菌の遺伝子断片を含む細菌DNAプレー
ブと、前記検体とのハイブリダイゼーションを行い、お
よび （ｃ）前記ハイブリダイゼーションにて、前記食細胞画
分に対してハイブリッドを形成した前記細菌DNAプロー
ブを検出する、 工程を含むことを特徴とする感染症原因菌の固定方法； ［２］感染症原因菌の検出方法であって、 （ａ）血液、腹水、透析液、尿、および膿からなるグル
ープから選択された生体成分から調製した食細胞を多量
に含む検体を固定し、 （ｂ）前記検体に、アジピン様蛋白質を接触させ、 （ｃ）前記アビジン様蛋白質を接触させた検体に、酵
素、抗体、色素、および金からなるグループから選択さ
れた標識分子を結合したビオチンを接触させ、および （ｄ）前記アビジン様蛋白質を介して前記検体に結合し
ている前記ビオチンに結合した前記標識分子を検出す
る、 工程を含むことを特徴とする感染症原因菌の検出方法： および ［３］感染症原因菌の検出方法であって、前記検出方法
［２］に、 （ｅ）前記工程（ｄ）にて前記標識分子が検出された、
感染症原因菌を含む食細胞画分を分離し、 （ｆ）前記食細胞画分と、感染症原因菌の遺伝子断片を
含む細菌DNAプローブとのハイブリダイゼーションを行
い、および （ｇ）前記ハイブリダイゼーションにて、前記食細胞画
分に対してハイブリッドを形成した前記細菌DNAプロー
ブを検出する、 工程をさらに付加した感染症原因菌の検出方法、にあ
る。

〔作 用〕

本発明者は、ストレプトアビジン又はアビジンに標識分
子を結合したものを用いれば、酵母をも含む菌体成分の
種類にかかわらず、定量的に検出できることを見出し
た。そして、これらの分子は食細胞とは親和性がない。

これはアビジンが、ビオチンに対して、他の物質との結
合力の数百倍も高い親和性があり、菌体成分の外膜が一
様にビオチンを取り込んでいる可能性が考えられ、アビ
ジンを介して、細胞内の菌の存在を非常に高感度に標識
分子により視覚化できるわけである。

しかも、アビジン・ビオチンの生体との結合速度が従来
用いていた検出試薬としての抗体より格段に早く、２〜
３時間以内に検出できるという利点をも持っている。

例えば、菌に結合するストレプトアビジンにビオチンを
介して酵素を結合させて呈色反応を行い、検体中の菌を
特定な色として検出することができる。

また、前述したように食細胞が菌を取り込み集菌してい
ることに着目し、そのままサンプルとして適当な処理を
施して増菌をしないでインサイテュ（in situ）ハイブ
リダイゼーションを実施することにより、取り込まれて
破壊されつつある菌においてなお維持されているDNAを
十分検出できる。従って、増菌の必要なしに行えるか
ら、検出が迅速かつ確実である。

なお、このインサイテュ（in situ）ハイブリダイゼー
ション法は、組織病理学の分野で、感染したウィルスの
検出に用いられているが、以下の事情により菌感染症へ
の応用は確立されていなかった。

つまり、ウィルスは細胞内で増殖し、ハイブリダイゼー
ションにより検出できるDNA又はRNAがフリーな状態で十
分存在しているが、菌の場合、そのような宿主依存的な
増殖方法はとらず、保存されているDNA（RNA）は菌体に
よって保護されているか、破壊された蛋白質と密着して
いるか等、細胞内に取り込まれた状態はいろいろに考え
られ複雑であり、未だ試みた例はない。

以上をさらにまとめると、 （１）菌のDNA又はRNAの存在状態は、ウィルスのDNA又
はRNAの存在状態とは本質的に異なるが、食細胞の中で
も最も濃縮されている。

（２）そのDNA（RNA）は、菌蛋白質よりはダメージが小
さく、場合によってはかなり保存されている可能性が高
い。

結局上記２点に着目した結果、本発明によって、菌にお
いても初めてハイブリダイゼーションによる検出方法が
確立されることになった。

ハイブリダイゼーションに用いるプローブを非放射性の
もの、例えば、ビオチン化したものにすれば、放射性同
位元素使用施設のない一般検査室でも光学顕微鏡を用い
て検出できるから、迅速、簡便になる。

本発明による感染症の診断方法は、従来の例えば、培養
法による検出では、陽性の場合ですら菌の有無を確認す
るだけで、24時間以上さらにその菌を同定（属、種の決
定）するために24〜48時間以上かかり、全体として３〜
４日を要したことに比し、上記の作用を有する両方法を
単独で又は組み合わせて用いることにより、菌の有無を
僅か２〜３時間、精々１〜２日で迅速かつ明瞭に検出で
き、さらにこの検出された検体についても、上記作用を
有するインサイテュ（in situ）ハイブリダイゼーショ
ン法により迅速かつ正確に菌を同定するから、全体とし
て精々１〜２日でずっと的確な検出を実現するという作
用を有し、画期的である。また、菌体成分がほとんど消
化されて検出されない場合でも、その未変性DNA（RNA）
をハイブリダイスし検出できる。

〔実施態様〕

A.検体の調製法 以下の方法（１）に従って調製した検体を、下記方法
（２）によりスライドグラスに固定し、本発明の各実施
例に用いるサンプルとした。

（１）塗抹法における各種臨床検体の調製法 血液（ヒト及び動物のヘパリン加全血）からのサン
プル調製血液からのサンプル調製は、以下の２通りのい
ずれかの方法により行った。

−1:モノ−ポリ溶液（Ｍ−PRM:Flow Laboratories,In
c.）法 3mlのＭ−PRMを13×100mmの試験管に入れ、その上に検
体であるヘパリン加全血（採取後２時間以内）3.5mlを
注意深く重層し、室温で30分間、スイングロータを用い
て300gで遠心し、多核白血球のバンドのみを採り、これ
をPBS（等張化リン酸バッファー）で洗浄遠心する。得
られた細胞沈澱物を適量（約1ml）のPBSで懸濁し、検体
とする。

−2:6％デキストラン法 検体であるヘパリン加全血１容（1ml）に６％デキスト
ラン1/3〜1/4容を加えて混和し、37℃１時間静置し、上
層を採り、これをPBSで希釈したのち遠心し、得られた
細胞沈澱物を適量のPBSで懸濁し、検体とする。

尿からのサンプル調製 尿からの検体をそのまま塗抹する。

腹水からのサンプル調製 腹水を試験管に採り、800r.p.m.又は3,000r.p,m.で15〜
30分間室温で遠心し、得られた細胞沈澱物を適量のPBS
で懸濁し、検体とする。

膿からのサンプル調製 膿からの検体をそのまま塗抹する。

（２）スライドグラス固定サンプル塗抹法 上記（１）の操作によりそれぞれ得られた検体を適当
量、２％ゼラチンによりコートしたスライドグラス（望
ましくは、「H.T.Coating Slide」,Boxy Brown社製を使
用）に載せ、ピペットの腹等で延ばし、完全に乾くまで
風乾させる。次に、カルノア固定数（エタノール：クロ
ロホルム：酢酸＝6:3:1）中にスライドグラスを10分間
浸し、細胞の固定を行う。

その後スライドグラスを70％エタノール中で軽く洗浄
し、風乾する。

実施例1:アビジン様蛋白質による菌検出法 （以下、「ストレプトアビジン法」と称する） 本実施例では、アビジン様蛋白質としてストレプトアビ
ジンを用いた。

上記Ａの方法により作製した各スライドグラス固定サン
プルをPBS溶液中に室温で10分間以上再水和し、その固
定サンプル上に適当量の、５μg/mlスレプトアビジン
（Amersham）、１％ウシ血清アルブミン（Sigma フラク
ション Fraction V）及び0.1％トゥウィーン20（Tween
20,商品名）（Sigma）を含むPBSを載せ、湿潤箱中37℃
で60分間反応させたのち、適当量の0.1％トゥウィーン2
0を含むPBS中で軽く振盪させながら室温で10分間の洗浄
を３回行う。

次に、５μg/mlビオチン化アルカリフォスファターゼ
（E.Y LABS.Inc.）、１％ウシ血清アルブミン及び0.1％
トゥウィーン20を含むPBSをスライドグラス固定サンプ
ル上に載せ、湿潤箱中37℃で60分間反応させたのち0.1
％トゥウィーン20を含むPBS中で軽く振盪させながら室
温で10分間の洗浄を１回行い、0.05％トリトン（Triton
X−100,Sigma）（以下TXという）を含むAP7.5（100mM
Tris.HCl pH7.5,100mM CaCl）中で軽く振盪させなが
ら、室温で10分間の洗浄を２回行い、さらにAP9.5（100
mM Tris・HCl pH9.5,100mM NaCl,10mM MgCl₂）中で軽く
振盪させながら室温で10分間の洗浄を３回行う。

次に、0.3mg/ml NBT（ニトロブルーテトラゾリウム、Be
thesda Research Laboratories）及び0.17mg/ml BCIP
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル フォフェ
ート、Bethesda Research Laboratories）を含むAP9.5
中で37℃暗所で適当な時間発色を行う。反応の停止は10
mM EDTAに数分間浸けることにより行い風乾させる。

最後に適当な濃度のナフトールブルーブラック（Sigm
a）を用い対比染色を行い、流水中で洗浄し、完全に乾
くまで風乾したものに油浸を用い顕微鏡下で菌の有無
（シグナル）を観察する。

なお、菌は紫色のシグナルに、好中球などの細胞は水色
〜青色として観察できる。

以下に、各プレートについて実施した実験例についてそ
の結果を各プレートの顕微鏡写真に付した引き出し線に
従い説明する。

光学顕微鏡は倍率1000倍のものを用いた。

プレート１…尿（臨床検体）中の菌（淋菌）； ヒト細胞中の淋菌がブルーに染まった粒子状のシグナル
となって見える（第１図）。

プレート２…ヒト血液（臨床検体）から検出された菌
（未同定）；血液調製法はデキストラン法によった。

ヒト白血球中に取り込まれている細菌を示すシグナルが
見える（第２図）。

プレート３…ヒト血液（in vitro）から検出されたブド
ウ球菌；血液調製法はモノ−ポリ溶媒法により、血液と
ブドウ球菌とを20分間インキュベートして実施した。

ヒト白血球中に取り込まれたブドウ球菌を示すシグナル
が見える（第３図）。

プレート４…ヒト血液（in vivo）から検出されたブド
ウ球菌；マウスにブドウ球菌を静脈注射し、４時間後、
常法に従い血液をサンプリングした。

マウス白血球中に取り込まれたブドウ球菌を示すシグナ
ルが見える（第４図）。

プレート５…腹膜潅流後の透析液から検出された酵母；
透析患者から得た。

透析患者の透析液からの酵母を示すシグナルが見える
（第５図）。

なお、プレート２、３、４の調製法は、いずれも、デキ
ストラン法、モノ−ポリ溶媒法どちらでも実施できる。

実施例2:ビオチン化プローブを用いたインサイテュハイ
ブリダイゼーションによる細胞内外における菌（感染
菌）の検出・同定（以下、「プローブ法」と称する） 上記Ａの方法に従って作成した各スライドグラス固定サ
ンプルを、PBS溶液中に室温で10分間以上浸して再水和
を行い、サポニン及びTX−100を各々0.25％（w/v）含む
PBS溶液に10分間軽く振盪させながら室温で10分間処理
する。

次にリゾチーム（Sigma）とリゾスタフィン（商品名、S
igma）5mg/mlと、Ｎ−アセチルムラミディスSG（商品
名、生化学工業社製）0.5mg/mlを含むPBS−サポニン
（0.05％）溶液を、１ウェルにつき約100μｌ滴下し、1
20分間室温又は37℃で湿潤箱中に放置する。その後、0.
2N酸塩を含む生理食塩液で20分間洗う。次に、0.1Mトリ
エタノールアミン−HCl緩衝液（pH 8.0）に0.5％無水酢
酸を含む溶液中に20分間浸す。

その後、各スライドグラスを、70％、次に95％のエタノ
ールで洗い、十分風乾する。次に、70mM NaOHを含む生
理食塩水溶液に、３分間浸し、ただちに、70％次に95％
エタノールで洗い、その後、十分風乾したものをインサ
イテュハイブリダイゼーションのサンプルとする。

続いて、スライドグラス上に固定したサンプル上に以下
の組成のハイブリダイゼーション用溶液を適量載せ、湿
潤箱中37℃で一昼夜反応させる。

組 成 ・45％ホルムアミド、 ・２×SSC、 ・１×デンハート液（0.02％ポリビニルピロリドン（Si
sma）、 0.02％ファイコール（Pharmacia Fine Chemicals））、 0.02％ウシ血清アルブミン）、 ・250μg/mlサケ精子DNA（予め100℃５分間熱し、氷中
で急冷し、変性させておく、（Pharmacia Fine Chemica
ls）、 ・10％デキストランスルフェート（Pharmacis Fine Che
micals）、 ・適当量のビオチン化プローブDNA（予め変性させてお
く） プローブDNAのビオチン化はニックトランスレーション
法により行う。例えば、ニックトランスレーションキッ
ト（Bathesda Resesrch Laboratories）を用いる。

次に、50％ホルムアミドを含む２×SSC中で37℃、30分
間洗浄し、50％ホルムアミドを含む１×SSC中で37℃以
上の温度、30分間洗浄する。さらに、１×SSC中で軽く
振盪しながら室温で20分間３回洗浄した後PRS中に室温1
0分間浸ける。

続いて、ブロッキングを行うためにスライドグラス固定
サンプル上に10％正常ウサギ血清（Vector Laboratorie
s Inc.）を含むPRSを載せ、湿潤箱中37℃で60分間保温
処理し、PRS中で室温数分間浸す。

次に、２μg/mlのストレプトアビジン、１％ウシ血清ア
ルブミン、0.1％トゥウィーン20を含むPRSをスライドグ
ラス固定サンプル上に載せ、湿潤箱中37℃で60分間保温
し、0.1％トゥウィーン20を含むPBS中で軽く振盪しなが
ら室温10分間で３回洗浄する。

次に、２μg/mlのビオチン化アルカリフォスファター
ゼ、１％ BSA、0.1％トゥウィーン20を含むPBSをスライ
ドグラス固定サンプル上に載せ、湿潤箱中37℃で60分間
保温し、 0.1％トゥウィーン20を含むPBS中で軽く振盪しながら室
温10分間で洗浄し、0.05％トリトンＸ−100を含むAP7.5
中で軽く振盪しながら室温10分間で２回洗浄し、さらに
AP9.5中で軽く振盪しながら室温10分間で３回洗浄す
る。

つぎに、330μg/ml NBT、170μg/ml BCIPを含むAP9.5中
で37℃暗所で適当な時間発色を行う。反応の停止は10mM
EDTAに数分間浸けることにより行い、風乾させる。

最後に適当な濃度のナフトールブルーブラックを用い対
比染色を行い、流水中で洗浄し、完全に乾くまで風乾し
たものに油浸を用い、顕微鏡下で発色と特異形態から菌
の有無を判定する。

以下に、各実験例についてその結果を各プレートの顕微
鏡写真に付した引き出し線に従い説明する。なお、光学
顕微鏡は、倍率1000倍のものを用いた。

実験例1:ブドウ球菌由来のDNAプローブの調製 下記実験例２及び３に用いたブドウ球菌由来のDNAプロ
ーブの性質は、以下のとおりである。

その調製方法は、テキスト、例えば分子クローニング技
術ガイド（Guide to Molecular Cloning Techniques）
（酵素学の手法（（Method in Enzymology））中のvol.
152）Academic Press 1987年において確立されたクロー
ニング技術を用い、ブドウ球菌を染色体DNAをベクター
（例えば、PBR）に挿入する。

得られた各クローンからブドウ球菌特有のDNA断片を保
有するものを選びそれらをプローブとした。

これらのプローブは、他の細菌（例えば、大腸菌、クレ
ブシェラ、シュードモナス（Pseudomonas）、エンテロ
バクタ（Enterobacter）等または同属の表皮ブドウ球
菌）とはクロスしない。

これらの、プローブの制限酵素地図は、第14図のとおり
である。

また、各プローブと臨床株（黄色ブドウ球菌と表皮ブド
ウ球菌（この２種は、感染症の原因菌のトップであり、
類縁菌であるところから、優先的に実験した）との反応
性を以下の通り調べた。

〔調製法〕

調製法は、前記のテキストにしたがい臨床菌株を培養し
そのDNAを抽出する。

これを一定量（例えば、５μｌ）ナイロンフィルタにス
ポットし、アルカリ変性後ハイブリダイゼーションのサ
ンプルとする。

〔ドット ブロット ハイブリダイゼーション〕

同テキストにしたがい、50％ホルムアミド５×SSC、42
℃で上記³²Pラベルしたプローブで終夜ハイブリダイゼ
ーションを実施する。

その後洗いとして、0.1×SSC、0.1％SDS、55℃、20分を
２回処理し、−70℃で終夜放射線照射した後、現像し
た。

これらの各プローブと臨床株（黄色ブドウ球菌と表皮ブ
ドウ球菌）との反応性を、プレート10、11、12、13に示
す。

いずれも、黄色ブドウ球菌をスポットした箇所（第10、
11、12、13図の上２段のスポット）にシグナルが見え、
表皮ブドウ球菌をスポットした箇所には見えない（同各
図の下２段のスポット）。すなわち、これらのプローブ
は、黄色ブドウ球菌を明確に検出するが、黄色ブドウ球
菌の類縁菌である表皮ブドウ球菌とクロスしない。

実験例2:マウス腹水中のブドウ球菌の検出 マウス腹腔にブドウ球菌を注入後、４〜６時間経過後に
開腹し、腹水をとり上記Ａ（１）の調製法に従って得
られた遠心沈澱物を、100μｌのPBSで懸濁し、その20〜
50μｌをスライドグラスのウェルに載せで固定サンプル
を作成し、前記実施例２に記載した方法に従って、下記
のプローブを用いてハイブリダイズした。

この実験結果を、以下に各実験プレート毎に示す。

プレート６…腹水中に取り込まれたブドウ球菌とブドウ
球菌由来のDNAプローブとのハイブリダイゼーション； 拡散した白血球にてハイブリッドのシグナルが見える
（第６図）。

プレート７…大腸菌由来とクレブシェラ（Klebsiella）
由来のDNAプローブを用いたハイブリダイゼーション； ハイブリッドのシグナルが検出されない（第７図）。

実験例3:ヒト横隔膜下膿瘍中のブドウ球菌検出 ヒト横隔膜下膿瘍を生理食塩水で懸濁し、その20μｌ
を各ウェルに塗抹して拡げた後風乾（40分）し、その
後、前記プレート６および７の場合と同様に前処理し
て、実施例２の方法に従って、インサイテュハイブリダ
イゼーションを実施した。

この実験結果を、以下に各実験プレート毎に示す。

プレート８…プレート６および７で用いたDNAプローブ
とのハイブリダイゼーション； ハイブリッドのシグナルが見える（第８図）。

プレート９…プレート６および７と同様のプローブを用
いたハイブリダイゼーション； 大腸菌由来、クレブシェラ由来のDNAプローブを用いた
場合では、ハイブリッドのシグナルは検出されない。

実施例3:インサイテュハイブリダイゼーション法と血液
培養法との比較実験 前述した実施例１のストレプトアビジン法によって菌が
検出されなかった患者から、上記Ａ（１）−２の６％
デキストラン法及びＡ（２）のスライドグラス固定サン
プル塗抹法に従って、固定サンプルを作成してヒト血液
サンプルを調製した。

これを、前記実施例２に記載した方法に従って、実験例
１で調製したブドウ球菌由来のDNAプローブを用いてハ
イブリダイズした（下記の表Ｉのプレート16〜19、及び
第16図〜19図参照）。

また、縁膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来のDNAプ
ローブを、実験例１のDNAプローブ調製法と同様な方法
で調製した。具体的には、縁膿菌（Pseudomonas aerugi
nosa）の染色体DNAを制限酵素HindIIIで断片化し、適当
なベクター（例えば、pBR322）を入れて増幅させ、他の
バクテリアDNA（例えば、大腸菌、クレブシェラ、エン
テロバクタ（Enterobacter）、スタヒロコッカス（Stap
hylococcus）等）とクロスしないものを選択し、この中
から適当な長さのもの（例えば、10kb、5kb、4.5kbな
ど）を用いてプローブとする。

これを前述したように調製したヒト血液サンプルと前記
実施例２に記載した方法に従ってハイブリダイズした
（下記の表Ｉのプレート15、第15図参照）。

また、上記のヒト血液サンプルを調製した同じ患者の静
脈から、ブラッド コレクティング ユニット「ロシ
ュ」を用いて、リコンドBCボトル「ロッシュ」（日本ロ
ッシュ（株）社製）に血液を無菌的に各々10ml採取し、
これを室温でインキュベートし、経日的に観察した。そ
の結果、下記の表Ｉに示したように、ボトル15〜19では
それぞれ菌が検出されなかった。（顕微鏡写真示さ
ず）。

以上の結果を下記の表Ｉに示した。

上記の表Ｉの結果から明らかなように、従来の血液培養
法ならびに直接ストレプトアビジン法によって菌が検出
されなかったものでも、プローブ法を用いれば菌が検出
でき、その検出能が優れていることが判明した。

〔発明の効果〕

まず第一に、血液培養で陽性でなかつた検体につき、食
細胞に着目したインサイテュハイブリダイゼーション法
では、迅速・確実に菌の同定が可能であった。従って、
この診断法の確立は、菌血症の治療に対して画期的な指
針を与えることができ、これにより、死亡率の低減が期
待される。

さらに、従来の血液培養法では、その検体の調製におい
て、患者より血液サンプルを、菌が検出されるまで経日
的に約５〜10ml採取しなければならず、患者に対して肉
体的にあるいは精神的に苦痛を強いるのに比較して、本
発明の診断方法では、患者よりの血液サンプルの採取が
一度で良く厳密な無菌操作も不要で、しかもその採取量
も例えば、デキストラン法では約1mlと極めて少量で良
いので、患者に及ぼす肉体的に或いは精神的な苦痛が低
減できる。

また、プローブ法のみを用いる本発明による感染症の診
断方法では、上記の診断方法においてストレプトアビジ
ン法によって菌が検出されなかった検体でも菌が検出・
同定可能であり、さらにその検出・同定能が格段に優れ
ている。

さらにまた、ストレプトアビジン法のみを用いた本発明
の検出方法は、非常に明確な検出結果を迅速に与えるも
のである。すなわち、この発明はそれ自体、従来の臨床
的に菌血症らしいということで抗生物質治療を試み始め
ざるをえなかった状況に対して、菌血症であることを確
定できるという点で、大きな進歩である。

さらに、プローブ法のみを用いた本発明の検出及び同定
方法は、菌血症の起因菌の同定に関連しても次の効果が
ある。すなわち、本ハイブリダイゼーション法によれ
ば、１回分の検体で菌の種類の同定まで実施でき、所要
時間は従来法によれば３〜４日は十分かかった（しかも
検出される率は低い）ものが、本方法で精々１〜２日と
飛躍的に短縮でき、しかもその検出率も格段と高い。

特に、非放射性標識のうち、特に、ビオチン化プローブ
を用いれば、簡便にかつ場所を選ばず実施できる。

しかしながら、このDNAのハイブリダイゼーション法で
は、なるべく特異的なプローブを探すことが研究課題で
ある。

すると例えば、黄色ブドウ状球菌だけに特異的なDNAを
開発して用い、検体に黄色ブドウ状球菌がない場合、検
出結果は陰性になる。そして、次々にDNAの種類を替え
て検出し、用意していた全てのDNAに検体が陰性であっ
たとした場合でも、菌の有無自体は依然不明である。

そこで、本発明による感染症の診断方法で、ストレプト
アビジン法とプローブ法とを併用した診断方法は、菌の
有無を迅速に検出した検体について、迅速に正確に菌を
固定するから、全体として迅速的確であるという効果を
もたらす。

すなわち、ストレプトアビジン法で菌の有無を確認する
ことが、菌がない検体にハイブリダイゼーションを繰り
返すという不経済を防ぐ上で非常に有用である。

さらに、従来の染色法のように生体成分には染色せず、
塗抹染色標本中の菌等に特異的に染色するので、感染状
況を熟練を要せずに迅速かつ的確に判断できる。

図面の簡単な説明 第１図は、プレート１における、検出されたヒト細胞中
の淋菌（粒子状のシグナル）の形態を示す写真である。

第２図は、プレート２における、検出されたヒト白血球
中に取り込まれている菌（同定されていないもの：臨
検）の形態を示す写真である。

第３図は、プレート３における、検出されたヒト白血球
中に取り込まれているブドウ球菌（in vitro）の形態を
示す写真である。

第４図は、プレート４における、検出されたマウス白血
球中に取り込まれているブドウ球菌（in vivo）の形態
を示す写真である。

第５図は、プレート５における、検出された透析患者の
透析液からの酵母の形態を示す写真である。

第６図は、プレート６における、検出されたマウス腹水
に取り込まれたブドウ球菌由来DNAとのハイブリッド
（ブドウ球菌由来のプローブとのハイブリッドシグナ
ル）を示す写真である。

第７図は、プレート７における、プレート６の方法にお
いて他のプローブを用いた結果を示す写真である。

第８図は、プレート８における、検出されたヒト横隔膜
下膿瘍中のブドウ球菌由来DNAとのハイブリッド（ブド
ウ球菌由来のプローブとのハイブリッドシグナル）を示
す写真である。

第９図は、プレート９における、プレート８の方法にお
いて他のプローブを用いた結果を示す写真である。

第10図は、プレート10における、プローブ24を用いたド
ットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。

第11図は、プレート11における、プローブ77を用いたド
ットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。

第12図は、プレート12における、プローブ７を用いたド
ットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。

第13図は、プレート13における、プローブ36を用いたド
ットハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。

第14図は、本発明の実施例に用いたブドウ球菌由来のプ
ローブの制限酵素地図である。

第15図は、プレート15における、検出されたヒト血液サ
ンプルと縁膿菌由来由来DNAプローブとのハイブリッド
を示す写真（倍率1000倍）である。

第16図は、プレート16における、ヒト血液サンプルとブ
ドウ球菌由来のDNAプローブとのハイブリッドを示す写
真（倍率1000倍）である。

第17図は、プレート17における、ヒト血液サンプルとブ
ドウ球菌由来のDNAプローブとのハイブリッドを示す写
真（倍率1000倍）である。

第18図は、プレート18における、ヒト血液サンプルとブ
ドウ球菌由来のDNAプローブとのハイブリッドを示す写
真（倍率400倍）である。

第19図は、プレート19における、ヒト血液サンプルとブ
ドウ球菌由来のDNAプローブとのハイブリッドを示す写
真（倍率1000倍）である。

第20図は、プレート20における、ヒト血液サンプルとブ
ドウ球菌由来のDNAプローブとのハイブリッドを示す写
真（第17図の倍率400倍）である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】感染症原因菌の同定方法であって、下記工
   程、すなわち： （ａ）血液、腹水、透析液、尿、および膿からなるグル
   ープから選択された生体成分から調製した食細胞を多量
   に含む検体を固定し、 （ｂ）感染症原因菌の遺伝子断片を含む細菌DNAプレー
   ブと、前記検体とのハイブリダイゼーションを行い、お
   よび （ｃ）前記ハイブリダイゼーションにて、前記食細胞画
   分に対してハイブリッドを形成した前記細菌DNAプロー
   ブを検出する、 工程を含むことを特徴とする感染症原因菌の固定方法。
2. 【請求項２】前記細菌DNAプローブが、ビオチン化DNAプ
   ローブである請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】感染症原因菌の検出方法であって、下記工
   程、すなわち： （ａ）血液、腹水、透析液、尿、および膿からなるグル
   ープから選択された生体成分から調製した食細胞を多量
   に含む検体を固定し、 （ｂ）前記検体に、アビジン様蛋白質を接触させ、 （ｃ）前記アビジン様蛋白質を接触させた検体に、酵
   素、抗体、色素、および金からなるグループから選択さ
   れた標識分子を結合したビオチンを接触させ、および （ｄ）前記アビジン様蛋白質を介して前記検体に結合し
   ている前記ビオチンに結合した前記標識分子を検出す
   る、 工程を含むことを特徴とする感染症原因菌の検出方法。
4. 【請求項４】前記検出方法が、下記工程、すなわち： （ｅ）前記工程（ｄ）にて前記標識分子が検出された、
   感染症原因菌を含む食細胞画分を分離し、 （ｆ）前記食細胞画分と、感染症原因菌の遺伝子断片を
   含む細菌DNAプローブとのハイブリダイゼーションを行
   い、および （ｇ）前記ハイブリダイゼーションにて、前記食細胞画
   分に対してハイブリッドを形成した前記細菌DNAプロー
   ブを検出する、 工程をさらに含む請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】前記細菌DNAプローブが、ビチオン化DNAプ
   ローブである請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記感染症原因菌が、菌体成分の外膜にビ
   オチンを有する菌もしくは酵母である請求項３乃至５の
   いずれかに記載の方法。
7. 【請求項７】前記アビジン様蛋白質が、ストレプトアビ
   ジンである請求項３乃至６のいずれかに記載の方法。